Souris

Pendant 24 semaines, une partie des souris subit chaque semaine une prise de sang et un jeûne de cinq heures pour mesurer la glycémie, ainsi qu'un test à l'insuline de 3 h 30 à jeun et, pour un second lot, un test de tolérance au glucose de six heures à jeun la semaine de la mise à mort. D'autres sont isolées pendant 18 h 30 à 22 heures et privées de nourriture pendant 15 h 30 à 19 heures, une fois par semaine sur cinq semaines au plus, ou gavées chaque jour pendant huit jours, et un régime hypercalorique doit en rendre certaines obèses, et une privation de nourriture doit imiter chez d'autres une anorexie. 6 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré, pour comparer aux sucres et édulcorants du marché un substitut breveté issu de fruits fermentés et de fibres, avec trois tests de l'attention et un test de comportement dont la nature n'est pas précisée. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, pour prélever leur appareil digestif, leur foie, leur rate, leurs reins, leur pancréas, leurs muscles, leur tissu adipeux, leurs dents et leur cerveau.

Objectifs

Le sucre, et plus particulièrement le saccharose, occupe une place centrale dans notre alimentation en raison de ses propriétés organoleptiques (goût sucré, texture…) et fonctionnelles (conservation, structure...). Toutefois, sa consommation excessive est associée à de nombreuses pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, l’obésité, les troubles du comportement alimentaire ou encore l’inflammation. Au-delà des impacts physiopathologiques, plusieurs études mettent en évidence un lien entre consommation excessive de sucre et troubles du comportement, en particulier chez les enfants. En effet, la consommation de sucre serait associée à des troubles de l’attention, de l’impulsivité, voire à une augmentation de l’agressivité. Face à ces enjeux de santé publique, la recherche de substituts sucrants plus sains devient essentielle. L’objectif est double : maintenir les caractéristiques sensorielles et fonctionnelles du sucre tout en réduisant son impact sur la santé. Dans ce contexte, un nouveau substitut de sucre, un complexe sucrant breveté issu de fruits fermentés et de fibres, apparait comme prometteur dans cet enjeu. Ce substitut présente une particularité majeure : il possède des propriétés physiques similaires à celles du sucre, ce qui lui permet de s’intégrer aisément dans les préparations culinaires classiques, tout en limitant l’impact sur la santé. Au-delà de ces propriétés, ce substitut de sucre suscite un intérêt croissant pour son potentiel à limiter les pics glycémiques postprandiaux. Il permettrait aussi de palier aux dysrégulations émotionnelles et cognitives induites par le sucre. Par ailleurs, sa faible valeur énergétique pourrait jouer un rôle dans le contrôle du poids corporel et des apports caloriques, éléments clés dans la lutte contre l’obésité. Ce projet, à l’interface entre nutrition, physiologie et comportement, a pour objectif de déterminer si le substitut de sucre représente une alternative crédible au sucre classique du point de vue de la santé à court et long terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances sur les effets d’un substitut sucrant innovant. Les bénéfices attendus sont : scientifiques, sanitaires et sociétaux. 1-Avancées scientifiques : Ce projet permettra d’approfondir la compréhension des effets des substituts du sucre sur la régulation de la glycémie, la sécrétion d’insuline et les marqueurs d’inflammation de bas grade. Il explorera également les effets neurocomportementaux d’une consommation chronique ou aiguë de sucre et de ses substituts, notamment en ce qui concerne la concentration, l’impulsivité et les comportements agressifs. Par ailleurs, les mécanismes de régulation de la satiété feront l’objet d’une attention particulière, en lien avec la fermentation colique et la production d’acides gras à chaîne courte. Enfin, le rôle de ce substitut de sucre sera évalué dans des contextes de surconsommation alimentaire (modèle d’obésité) et de réalimentation après une phase de dénutrition (modèle post-anorexique). 2-Bénéfices sur la santé humaine : Les retombées potentielles pour la santé sont significatives. Le bénéfice principal réside dans la réduction des risques associés à une consommation excessive de sucre, tels que le diabète de type 2, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et certaines dysrégulations neurocognitives. Une attention particulière sera portée à l’amélioration de la régulation des fonctions cognitives et émotionnelles, en lien avec les variations de neurotransmetteurs observées lors de la consommation de sucre chez certains individus sensibles. 3- Impact sur la santé publique : Ce projet répond à une demande croissante de la population et des acteurs de l’agroalimentaire pour des produits alimentaires à la fois plus sains et sensoriellement satisfaisants. Il pourrait ainsi contribuer à la formulation de nouvelles recommandations nutritionnelles et à la reformulation de produits à moindre impact métabolique. En apportant des données robustes sur les effets d’un substitut sucrant à faible index glycémique, ce projet ambitionne de participer à la transition vers une alimentation plus favorable à la santé métabolique et mentale, tout en préservant le plaisir alimentaire.

Procédures

Procédure 1 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 24 fois) et durera 1 min. - Le test de l’attention sera réalisé 3 fois par souris et durera 30 à 40 min - Le test de comportement sera réalisé 1 fois par souris et durera 23min divisé en 3 sessions sur 2 jours. - le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par groupe et durera 3h30 (à jeun) - le test de tolérance au glucose sera réalisé 1 fois par souris (sur un second lot) la semaine de la mise à mort et durera 6h (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 2 : -La période de jeun durera entre 15h30 et 19h selon la phase. -La période d’isolement durera entre 18h30 et 22h selon la phase -Le prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par phase (1 par semaine) soit 5 fois maximum durera 1 min. -Le gavage sera réalisé 1 fois par phase (1 par semaine) soit 5 fois maximum, et durera 2 min. Procédure 3 : -Le gavage sera réalisé 1 fois par jour pendant 8 jours soit 8 fois et durera 2 min. -L’injection sera réalisé 1 fois par souris et durera 2 min. -Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 4 fois), et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) Procédure 4 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. -Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 4 fois) et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 5 : - La pesée, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 24 fois) et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun) -la mise à jeun pour la prise de la glycémie sera réalisé chaque semaine, soit 24 fois par souris et durera 5h Procédure 6 : - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 24 fois) et durera 1 min. -le test de l’insuline sera réalisé 1 fois par souris et durera 3h30 (à jeun)

Impact sur les animaux

Les techniques de contention et l'administration de substances peuvent induire un stress significatif chez la souris. En particulier, l'administration sous-cutanée ou par gavage, ainsi que les prélèvements sanguins, peuvent être traumatisants si effectués par du personnel insuffisamment expérimenté, entraînant des complications telles que des hématomes ou une administration incorrecte, comme dans la trachée au lieu de l'estomac. Les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger. Les souris devront être isolées, or l’isolement social peut causer du stress et de l’anxiété chez les souris, qui sont des animaux sociaux par nature. Un régime hyper calorique sera administré aux souris afin de mimer une obésité, leur prise de poids va entraîner une réduction de leur mobilité, ce qui pourrait provoquer un inconfort. Une privation de nourriture sera mise en place afin de mimer une anorexie chez les animaux, une perte de poids trop élevée entraînera une sortie des animaux de l’étude. Les périodes de jeûne pourraient provoquer un stress et un inconfort modérés. Les pesées réalisées plusieurs fois par semaine pourraient générer un stress léger.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet de la consommation de ce substitut de sucre. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins, le pancréas, les muscles, le tissu adipeux, les dents et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas d’alternative aux tests sur les animaux qui permette de comprendre de manière fiable et complète comment ce substitut de sucre agit sur l’ensemble du corps. Les méthodes en laboratoire (sur cellules ou par modélisation informatique) ne suffisent pas à reproduire la complexité des réactions de notre organisme, notamment en ce qui concerne le métabolisme, la satiété, l’inflammation ou encore le comportement alimentaire. C’est pourquoi les études sur l’animal, en particulier la souris, restent nécessaires. Elles permettent d’observer comment ce substitut de sucre influence la sensation de satiété, la régulation du sucre dans le sang, les réponses inflammatoires et ses effets dans des situations comme l’obésité ou l’anorexie. L’utilisation de la souris offre une vision globale et sur la durée, ce qui est essentiel pour mener à bien ce projet de recherche dans un cadre scientifiquement pertinent.

Réduction

Cette étude, qui s’étalera sur cinq ans, vise à mieux comprendre les effets du substitut de sucre en le comparant aux sucres et édulcorants déjà disponibles sur le marché. Elle prendra en compte les différences entre les sexes en étudiant ses effets à la fois chez les mâles et les femelles, car le métabolisme peut varier selon le genre. Pour évaluer les effets d’une consommation prolongée, un grand nombre de souris est nécessaire. Certaines seront analysées à différentes étapes de l’étude afin de détecter, le cas échéant, des effets sur des organes comme le foie, les reins ou les intestins. Toutefois, si aucun impact n’est observé après 24 semaines chez un premier groupe de souris, les autres groupes ne seront pas utilisés. Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables : 20 souris par groupe permettront notamment de tester la réponse du corps au sucre (tolérance au glucose et à l’insuline).

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre ou cinq dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles animaux largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de leur similitude biologique avec l'homme. Elles ont des systèmes digestifs, hormonaux et métaboliques assez proches de ceux de l’homme, ce qui permet d'étudier les effets physiopathologiques des aliments, tels que les substituts de sucre. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces. Nous allons utiliser des souris de 8 semaines afin de regarder l’impact de la prise du substitut de sucre au cours de la vie adulte.

6 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Hautement immunodéprimées et maintenues en hébergement stérile, elles reçoivent des injections quotidiennes plusieurs jours de suite, des cellules leucémiques humaines ou murines, une chimiothérapie cinq jours d'affilée, puis des prélèvements de sang et de moelle dans le fémur. Le porteur décrit ce que produit l'inhibition de l'autophagie, une perte de poids puis, vers six semaines, des tremblements et une paralysie des pattes arrière, et signale que les cellules leucémiques injectées dégradent rapidement l'état général. Les bénéfices annoncés pour les malades atteints de leucémie aiguë myéloïde passent par des thérapies encore à développer, et le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'avoir des preuves d'efficacité in vivo avant tout passage en clinique.

Objectifs

L’hématopoïèse est responsable de la génération de l'ensemble des cellules sanguines. En condition physiologique, l’hématopoïèse est soutenue par les cellules présentent dans la moelle osseuse (MO). Des dérégulations de ces cellules peuvent conduire à la survenue d'hémopathies malignes (maladies du sang) telles que les leucémies. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont les cancers du sang et de la moelle osseuse les plus courants chez l’adulte. Malgré un taux élevé de rémission après traitement par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes. L’autophagie est un processus impliqué dans l’homéostasie cellulaire, la régulation du métabolisme mais également l’hématopoïèse. Ainsi, des dérégulations de l’autophagie sont impliquées dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’autophagie des cellules du microenvironnement a également été mise en évidence comme favorisant la croissance de différents cancers en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie des cellules du microenvironnement de la MO dans la régulation de l’hématopoïèse et de la chimiorésistance des LAM. Mieux comprendre ces mécanismes nous aidera à mieux prévenir et soigner les hémopathies malignes.

Bénéfices attendus

La résistance aux chimiothérapies représente un enjeu clinique majeur dans les LAM. Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans l’hématopoïèse mais également la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM et ainsi diminuer les récidives.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Pré-conditionnement des animaux : une injection par jour pendant 1 ou 2 jours, 48h avant injection des cellules. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. – Inhibition de l'autophagie : une injection par jour pendant 4 jours. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. – Traitements par chimiothérapie : 1 injection par jour pendant 5 jours, durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. - Test cibles thérapeutiques : leur fréquence d’administration sera déterminée selon la littérature, en respectant scrupuleusement les recommandations des volumes limites. Ces procédures dureront de quelques secondes à 1 minute. - Injection des cellules hématopoïétiques. Durée : quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles - Injection des cellules leucémiques. Durée : quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles. - Prélèvements sanguins : Toutes les 4 semaines si besoin. Durée : environ 1 minute. Sur animaux anesthésiés ou vigiles. - Prélèvements de moelle : Si absence de cellules aux prélèvements sanguin. Durée : environ 1 minute. Sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

L’inhibition de l’autophagie conduit à une perte de poids puis plus tardivement (6 semaines) à une neurodégénérescence caractérisée par des tremblements et paralysie des pattes arrière. Le pré-conditionnement des animaux permettant la greffe des cellules conduit à des nuisances temporaires : déshydration et perte de poids. L’injection de lignées cellulaires de LAM qui prolifèrent rapidement engendre une détérioration rapide de l’état général des souris : déshydratation, perte de poids, paralysie des pattes arrière. Nuisances concernant les points des expériences : contention : stress, injection IP : stress, douleur modérée, Prélèvements veineux : douleur légère (sous anesthésie), prélèvements intra-fémoraux : douleur modérée, notamment au niveau du genou (sous anesthésie + analgésiques/antalgiques).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les échantillons à analyser (sang, cellules de la moelle osseuse et de la rate).

Remplacement

Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans l’hématopoïèse et la résistance leucémique, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.

Réduction

Les cohortes décrites ont été calculées de manière à utiliser le nombre juste d’animaux. C’est-à dire un nombre suffisant pour observer l’effet attendu, mais suffisamment réduit pour ne pas utiliser de façon injustifiée des animaux. Pour cela, nous utilisons un logiciel paramétré pour pouvoir détecter des différences entre les groupes égales ou supérieures à 30%, en utilisant des tests statistiques appropriés en fonction des expériences et des groupes expérimentaux.

Raffinement

L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des animaux, adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement (par le personnel de la zootechnie et les expérimentat.eurs.rices) et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les souris utilisées dans le projet étant des animaux hautement immunodéprimés, ils sont maintenus dans un hébergement stérile. Les cages sont disposées sur des portoirs ventilés et toute personne pénétrant dans les hébergements doit porter les équipements de protection individuelle (EPI) suivants: masque chirurgical, charlotte, surchaussures, combinaison, gants. Les protocoles ont été étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection (des cellules, des composés) et la durée de traitement. Des anesthésiques et analgésiques seront également utilisés lors des prélèvements veineux et intrafémoraux. Lors des expériences (chimiothérapie ou autres composés, ainsi qu’après injection de lignées cellulaires), qui pourraient engendrer une dégradation de l’état de santé des animaux, celui-ci sera évalué grâce à une grille de score adaptée (état général, poids, pelage, réflexes…). En cas d'approche d'un point limite, le responsable de l'étude prendra une décision dans les 24h après le signalement, afin de choisir une éventuelle suspension du traitement, réhydratation ou un soin. L’expérience sera stoppée (et les animaux mis à mort) lorsque le score atteindra un score trop élevé. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies et dans l’hématopoïèse. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ce modèle intègre les caractéristiques de la pathologie humaine et aide à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Il présente des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. L’injection de cellules hématopoïétiques (cellules du sang) murines ou humaines permet de reproduire l'hématopoïèse, processus permettant la génération de l'ensemble des cellules du sang et permet ainsi d'étudier toutes les cellules de ce processus. L’injection des cellules leucémiques dans la circulation sanguine des souris est actuellement le modèle préclinique le plus utilisé pour étudier la leucémie aiguë myéloïde in vivo puisqu'il permet de reproduire de manière relativement fidèle la maladie telle que retrouvée chez l’homme. Au début des expériences, les animaux seront âgés d’environ 7 à 12 semaines car les transplantations de cellules hématopoïétiques ou cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là.

Les souris utilisées sont privées, par manipulation génétique ou par injection d'anticorps, des défenses immunitaires qui les protégeraient des flavivirus. 1 606 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Vaccinées deux fois, elles sont anesthésiées puis exposées pendant une demi-heure aux piqûres de moustiques infectés par la dengue, le Zika, la fièvre jaune, l'encéphalite japonaise ou le virus du Nil occidental, avant quatorze jours de suivi des symptômes métaboliques et neurologiques. Toutes sont tuées, celles qui ont été infectées au titre d'une "obligation légale", les autres pour prélever leur sang et leur rate.

Objectifs

Le projet vise à promouvoir le développement d’un vaccin contre les flavivirus transmis par les moustiques. La cible du vaccin candidat a été identifiée et correspond à un facteur de transmission dans la salive du moustique. L’équipe de recherche a déjà démontré que l’immunisation contre ce facteur de transmission protège contre l’infection par le virus de la fièvre du Nil Occidental dans un modèle murin de type sauvage. Pour soutenir le développement vaccinal, le projet décrit ici a deux objectifs : (i) décrypter le(s) mécanisme(s) de protection ; et (ii) évaluer la protection contre plusieurs flavivirus transmis par les moustiques. Ces deux objectifs nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés. (i) Pour décrypter les facteurs immunitaires responsables de la protection, nous évaluerons l’efficacité de la vaccination dans différentes colonies de souris où les diverses branches de l’immunité ont été supprimées par des manipulations génétiques ou par l’injection d’anticorps ciblant différentes cellules. (ii) Les souris de type sauvage ne sont pas susceptibles d’être infectées par d’autres flavivirus que le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’infection par des flavivirus tels que ceux de la dengue, du Zika, de la fièvre jaune et de l’encéphalite japonaise nécessite des souris dont l’immunité innée a été génétiquement altérée. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2).

Bénéfices attendus

Ce projet soutiendra le développement d’un vaccin contre plusieurs flavivirus. Ces flavivirus infectent plus d’un demi-milliard de personnes dans le monde et causent la mort d’environ 200 000 personnes chaque année. Pourtant, il n’existe actuellement aucune méthode de protection contre tous. En soutenant le développement d’un vaccin contre les flavivirus, ce projet contribuera à étoffer l’arsenal thérapeutique contre ces maladies.

Procédures

Dans un premier temps, nous évaluerons les facteurs immunitaires nécessaires pour la vaccination. Nous injecterons à deux reprises des souris présentant différents types de déficiences immunitaires avec le candidat vaccin. Les injections dureront quelques minutes. Deux semaines après la dernière injection, les souris seront anesthésiées pour prélever du sang, puis euthanasiées pour prélever la rate afin d’analyser la réponse immunitaire. Ensuite, nous évaluerons l’effet des facteurs immunitaires sur la protection conférée par le vaccin. Des souris présentant les mêmes types de déficiences immunitaires que précédemment seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’exposition aux moustiques, sous anesthésie, durera moins de 30 minutes. Nous effectuerons ensuite un seul prélèvement sanguin pour vérifier l’infection et évaluerons les symptômes pendant 14 jours en observant et pesant les souris. Enfin, nous évaluerons l’effet de la vaccination sur la protection contre l’infection par les virus de la dengue, du Zika, de la fièvre jaune et de l’encéphalite japonaise. Des souris génétiquement modifiées, susceptibles à ces flavivirus, seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par ces virus. Nous procéderons de la même manière que pour le virus du Nil Occidental pour la vérification de l’infection et le suivi des symptômes. Toutes les immunisations seront conduites dans l’EU2/2. Toutes les infections et les procédures sur animaux infectées seront conduites dans l’EU1/2.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection lors de l’administration du vaccin candidat et des anesthésiques, ainsi que lors des prélèvements sanguins. Développement de symptômes métaboliques et neurologiques associés à l’infection flavivirale.

Devenir

Les animaux utilisés pour l’étude de la réponse immunitaire à notre vaccin candidat seront euthanasiés afin de permettre la collecte de sang et d’organes. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur la transmission par piqûre de moustique. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

Pour évaluer l’effet de la réponse immunitaire dans les différentes conditions de déficiences immunitaires, nous utiliserons 5 souris par groupe car ce nombre est le minimum pour obtenir des données fiables selon des travaux préliminaires. Pour quantifier l’effet de la vaccination sur l’infection nous utiliserons 15 souris par groupe, nous avons effectué des calculs statistiques de puissance à partir d'expériences préliminaires pour connaitre le nombre minimum d'individus nécessaire.

Raffinement

Les souris auront accès à des enrichissements variés. Les souris seront anesthésiées avant leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler de possibles anomalies liées à la narcose. Entre autres, nous suivront les grandes fonctions. En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera quotidiennement en se basant sur la grille de scoring des symptômes. Des points limites seront mises en place suivant ce score.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris. Les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler, avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6-8 semaines car ils ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection. Leur taille facilite leur manipulation.

Tuées en fin d'étude pour récupérer dans des conditions stériles le liquide accumulé dans leur ventre, 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit deux à quatre injections destinées à déclencher une inflammation du péritoine, puis une gêne abdominale que le porteur qualifie de transitoire. L'objet réel est de tester des microbulles d'oxygène censées calmer les cellules immunitaires du sang, les retombées annoncées pour les malades chroniques étant renvoyées à des traitements futurs. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit cette complexité et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

Les maladies chroniques inflammatoires représentent aujourd’hui une des plus grandes menaces pour la santé humaine selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS). Environ 5 % de la population mondiale en est atteinte. Ces maladies provoquent des poussées inflammatoires qui nuisent fortement à la qualité de vie et peuvent mettre en danger la santé à moyen et long terme. Malgré de nombreux traitements disponibles, ces poussées restent difficiles à contrôler et les médicaments actuels ont souvent des effets secondaires importants. Une piste prometteuse réside dans la régulation du métabolisme des cellules immunitaires, en particulier des monocytes, des cellules du sang qui jouent un rôle clé dans l’inflammation. Quand elles manquent d’oxygène, comme c’est souvent le cas dans le sang, ces cellules adoptent un comportement pro-inflammatoire. Leur fournir de l’oxygène pourrait donc permettre de limiter leur activité inflammatoire. Mais distribuer de l’oxygène aux bonnes cellules est complexe. Les méthodes actuelles sont peu efficaces, peu ciblées ou présentent des risques. Notre projet propose une solution innovante : utiliser de petites bulles d’oxygène compatibles avec l’organisme. Ces bulles, conçues pour rester dans le sang et être reconnues par les monocytes, pourraient leur fournir de l’oxygène de manière ciblée. En les absorbant, les monocytes réduiraient ainsi leur capacité à entretenir l’inflammation.

Bénéfices attendus

1_ Réduction ciblée de l'inflammation : Diminuer les poussées inflammatoires en agissant directement sur les cellules en partie responsables (les monocytes). 2_Moins d'effets secondaires : Limiter les effets indésirables grâce à une approche localisée. 3_Nouvelle stratégie thérapeutique : Ouvrir la voie à des traitements innovants pour les maladies inflammatoires chroniques résistantes aux thérapies actuelles.

Procédures

les souris vont être soumises aux interventions suivantes : injections (1 minute 2 à 4 fois).

Impact sur les animaux

un stress léger pourra survenir lors de la prise en main des animaux pour les injections. Une douleur légère et passagère pourra survenir sur la zone d’injection et une gêne abdominale transitoire due à l'irritation.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin d’étude est indispensable afin de récupérer le liquide dans le ventre dans des conditions stériles et optimales, permettant une analyse précise de la réponse cellulaire inflammatoire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier in vivo l’impact d’une modulation métabolique ciblée des monocytes au cours d’une inflammation systémique. Ce type de réponse immunitaire est complexe, impliquant des interactions dynamiques entre cellules circulantes, tissus, médiateurs inflammatoires et des facteurs généraux comme l’oxygène ou les nutriments. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement cette complexité dans un organisme vivant. Des modèles cellulaires sont utilisés en parallèle pour affiner nos hypothèses, mais le recours à l’animal est indispensable pour valider l’efficacité, la spécificité et la tolérance d’une délivrance ciblée d’oxygène via microbulles dans un contexte physiologique pertinent.

Réduction

Le protocole est conçu pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire à la significativité statistique. Des pré-tests in vitro ont permis d’optimiser les formulations, doses et modalités de délivrance avant toute expérimentation animale. Des groupes témoins strictement limités sont prévus pour permettre une comparaison pertinente (thioglycollate seul, traitement sans microbulles, etc.). Des réplicats biologiques et des analyses croisées (biomarqueurs, cytométrie, histologie) sont mutualisés pour maximiser les données obtenues par animal. De plus, si dans la première phase du projet nous avons 100% d'inflamation homogène, nous n'utiliserons que 10 souris par groupe dans la seconde phase.

Raffinement

Tout a été mis en œuvre pour minimiser la douleur, le stress et les effets secondaires induits par les manipulations : L’injection de notre produit est une méthode standardisée et maîtrisée. Les animaux sont manipulés par un personnel formé et expérimenté. Le volume et la concentration du produit injecté ont été choisis pour provoquer une inflammation modérée, sans provoquer de souffrance prolongée. Une grille de suivi clinique est mise en place, avec des points limites définis. Une surveillance rapprochée est assurée. Les microbulles sont conçues pour être biocompatibles et non toxiques.

Choix des espèces

La souche de souris choisi est une souche de référence dans les études immunologiques et inflammatoires : son profil immunitaire est bien caractérisé. Cette souche est largement utilisée dans les modèles de péritonite, avec une cinétique bien connue de recrutement des cellules immunitaires, notamment des monocytes/macrophages, qui sont la cible principale de notre stratégie. À 7 semaines, les souris sont jeunes adultes : leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour étudier une réponse inflammatoire reproductible et physiologiquement représentative. De plus, la plupart des études publiées sur le modèle d’inflammation dans le ventre utilisent des souris de 6 à 10 semaines, ce qui garantit la comparabilité de nos résultats avec les données existantes.

Rendues parkinsoniennes par une injection intraveineuse censée détruire environ la moitié de certaines populations de neurones, 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau et d'organes périphériques. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 126 d'entre elles et modéré pour les 126 autres. Deux mois après l'induction, elles enchaînent sur trois jours des tests comportementaux dont la durée va de trois minutes à une heure, sans que le résumé indique lesquels. Parmi les bénéfices avancés, le porteur met en avant que sa méthode, une simple injection intraveineuse au lieu d'une chirurgie stéréotaxique, rendra ce modèle de la maladie de Parkinson "accessible à une plus grande communauté de chercheurs".

Objectifs

La maladie de Parkinson est, après la maladie d’Alzheimer, la pathologie neurodégénérative la plus répandue. Elle touche actuellement environ 300.000 personnes en France et représente par conséquent un véritable enjeu de santé publique. Comme pour toutes les maladies, les modèles animaux représentent un outil essentiel pour répondre aux limites des modèles informatiques et cellulaires. Ils permettent notamment d’élucider de manière plus intégrée des mécanismes pathologiques et de tester l’efficacité de médicaments candidats. La majorité des modèles animaux présentent des avantages et des inconvénients. Il est donc essentiel de poursuivre leur optimisation. Dans le contexte de la maladie de Parkinson, les modèles de souris induits par expression d’une protéine impliquée dans le développement de la maladie de Parkinson, sont considérés comme les plus pertinents. Les souris transgéniques surexprimant cette protéine dès les stades embryonnaires présentent une pathologie tissulaire large mais peu de troubles comportementaux. Il faut donc poursuivre le développement de nouveaux modèles mimant le plus possible la pathologie humaine. Pour reproduire assez fidèlement la maladie de Parkinson chez le rongeur, les caractéristiques recherchés sont : une pathologie dans une large partie du système nerveux et des organes périphériques, une neurodégénérescence bilatérale et l’apparition progressive de symptômes moteurs et non-moteurs (olfactifs, digestifs,…). L’objectif de cette étude est de tirer avantage de nouveaux outils moléculaires (vecteurs viraux) pour développer un modèle murin de la maladie de Parkinson qui concilie de nombreux avantages des modèles précédents. En particulier, nous souhaitons générer un modèle pertinent, complet et plus accessible à la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Comme pour les autres maladies, les modèles animaux de la maladie de Parkinson sont des outils essentiels pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et développer des thérapies. Par le développement de ce nouveau modèle, nous espérons identifier de nouveaux mécanismes responsables de la pathologie aussi bien à l’échelle cellulaire qu’au niveau de la communication inter-organes. En effet, notre approche permettra l’apparition de signes pathologiques non seulement dans le système nerveux mais aussi dans des organes périphériques tels que l’intestin et le cœur comme ce qui est observé chez les patients parkinsoniens. Tous ces traits permettront une modélisation plus fidèle de cette maladie chez l’animal. Enfin, de nombreux chercheurs n’ont actuellement pas accès à des modèles animaux de la maladie de Parkinson, souvent car les chirurgies stéréotaxiques nécessitent beaucoup d’expertise et de matériel. Notre méthode de modélisation, obtenue par une simple injection intra-veineuse, permettra de rendre ce modèle accessible à une plus grande communauté de chercheurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale qui consiste en l’induction du modèle. Cette procédure dure environ 5 minutes entre l’induction de l’anesthésie et le réveil de l’animal. Deux et mois après cette procédure, les animaux réaliserons des test de comportements répartis sur 3 jours. Chacun de ces tests peut durer entre 3 minutes et environ une heure.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : 1- L’injection intra-veineuse qui peut induire un stress léger; 2- L’induction du modèle qui peut induire une dégénérescence d’environ 50% de certaines populations neuronales et l’apparition de légers troubles moteurs et non-moteurs; 3- Les test comportementaux qui peuvent induire des stresses légers, y compris lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour l’analyse du cerveaux et d’autres tissus périphériques

Remplacement

Ce projet a pour but de mesurer des marqueurs de la maladie, notamment comportementaux, au cours du développement de la maladie de Parkinson. De ce fait, il est impossible de reproduire la complexité d’un organisme vivant et de remplacer notre approche in vivo par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux est basée a priori sur nos études antérieures et celle d’autres équipes démontrant des résultats statistiquement significatifs avec une taille d’échantillon de 20 animaux par condition. Ce nombre pourra être corrigé après obtention des résultats des expériences pilotes qui nous fourniront une estimation de la taille de l’effet du traitement. Celle-ci nous permettra de calculer le nombre minimal théorique d’animaux nécessaires pour détecter une différence statistiquement significative (p

Raffinement

Suite à leur arrivée dans l'animalerie, les animaux auront une semaine d'acclimatation. Le projet implique ensuite la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur avec une approche lésionnelle de classe modérée. L'injection du vecteur virale sera réalisé sous anesthésie et anti-douleur. La mise au point de ce modèle a l’avantage de ne pas nécessiter de chirurgie. Cette approche est donc moins invasive et impactante pour l’animal. Les tests comportementaux ont été répartis sur plusieurs jours et les animaux seront acclimatés à la salle avant de réaliser les tests. La mise à mort des animaux sera réalisée selon un protocole d'anesthésie et de double analgésie adaptée. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau de la structure de la barrière hémato-encéphalique et des réseaux neuronaux impliqués dans la maladie de Parkinson. Le modèle sera induit chez des animaux jeunes adultes (10 semaines). À ce stade, les systèmes cérébraux sont matures et stables et le resteront tout au long des procédures expérimentales proposées.