Souris
Rôle de l’inflammation dans un modèle de maladie cardiovasculaire chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.
Objectifs
Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.
Procédures
Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.
Remplacement
L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.
Prélèvement de tissus de souris transgéniques pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'extrémité de la queue, moins de trois millimètres, est coupée aux ciseaux sur des souriceaux âgés de cinq à dix jours, maintenus une trentaine de secondes. 37 750 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le geste sert à repérer celles qui portent la mutation cardiovasculaire recherchée, lesquelles partiront en reproduction ou vers d'autres protocoles, les autres étant tuées ou utilisées comme contrôles. Le porteur affirme que la douleur est moindre avant ossification "car le système nerveux n'est pas totalement développé", sans mentionner d'anesthésie ni indiquer combien de souriceaux seront tués faute de porter la bonne mutation.
Objectifs
Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de pathologies cardiovasculaires. L'objectif est de définir une méthode de prélèvement pour le service d'élevage. L’objectif de ce projet est l'élevage de plusieurs modèles de souris présentant des modifications génétiques permettant de reproduire des pathologies humaines. Cet élevage implique d'identifier les animaux et d'identifier ceux qui expriment les mutations génétiques d'intérêt. Cette étape est essentielle pour identifier les animaux qui seront ensuite utilisés à des fins expérimentales dans d’autres projets de recherche.
Bénéfices attendus
L'objectif est de définir une méthode de prélèvement pour le service d'élevage. Les animaux seront ensuite utilisés dans divers protocoles autorisés qui s'inscrivent dans le domaine de la recherche cardiovasculaire.
Procédures
Afin d’identifier et de caractériser les souris exprimant les gènes modifiés. Celle-ci nécessitera le maintien de l’animal pendant une trentaine de seconde. Au moment d’être replacé dans sa cage d’hébergement, l’extrémité de la queue (moins de 3 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Cette manipulation très rapide ne dure pas plus de quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 3mm) peut conduire à une légère perte de sang ainsi que du stress et une douleur limitée.
Devenir
Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus postmortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt seront euthanasiés ou utilisés comme contrôles dans les projets de destinations ou en prélèvement post mortem. Les souris présentant des signes de souffrances seront euthanasiées. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.
Remplacement
Les pathologies cardiovasculaires sont complexes et font intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, les modèles murins nous permettent de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler des gènes particuliers.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des équipes de recherche. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris génétiquement modifiées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. De plus nous réalisons les prélèvements de manière raisonnée. S'il s'agit d'une lignée établie, le prélèvement est réalisé uniquement sur la première portée afin de contrôler qu'il n'y ai pas de dérive génétique.
Raffinement
La manipulation se fera systématiquement sous une hotte afin d'éviter leur contamination par des agents pathogènes. Le prélèvement est réalisé entre 5 et 10 jours afin de limiter la douleur. En effet le système nerveux n'étant pas totalement développer la douleur est moindre que sur un animal adulte. Les instruments utilisés sont désinfectés avant chaque utilisation et leur aiguisage est contrôlé avant utilisation. Après le prélèvement une compression du bout de la queue est effectuée afin de favoriser l'arrêt du saignement. Les souris seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance liés à une éventuelle infection en tenant compte de leur apparence et de leur comportement. Des contrôles sanitaires (3 à 4 fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Nous avons comme enrichissement dans les cages, des battons de coton, du kraft, des igloos, des tunnels et des bâtonnets de bois. En cas de signes cliniques pouvant entrainer un mal-être comme une modification du comportement, d’apparence, de poids, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
De nombreux modèles murins ont déjà été décrits, développés et validés pour les pathologies cardiovasculaires. Le modèle murin permet d'invalider des gènes particuliers donc d'étudier les mécanismes physiopathologiques sous jacent à ces gènes. Le bout de queue est sectionné avant ossification entre 5 et 10 jour, stade auquel la perception de la douleur est moindre. Les animaux utilisés pour les projets de recherche ultérieurs sont adultes (7-10 semaines), pour obtenir des résultats sur des animaux matures au regard de l'immunité et de la formation des organes, et pertinents vis-à-vis de pathologies qui affectent majoritairement des individus adultes.
Etude de la toxicité de traitements en dose unique et en doses répétées chez le rat et la souris
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2184
Tester la toxicité de composés avant un éventuel passage chez l'être humain conduit ici à utiliser 3 276 souris et 2 184 rats, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les substances sont administrées par injection ou par gavage, d'une fois par semaine à deux fois par jour, avec mise à jeun possible et jusqu'à cinq séances d'imagerie hebdomadaires. Le porteur décrit des prélèvements sanguins allant jusqu'à 15 % du volume sanguin total, une perte de poids possible, une léthargie et une altération de l'état général selon le composé testé. Il détaille un raffinement fait d'enrichissement et d'anesthésie, et précise dans le même texte qu'"aucune analgésie n'est possible au cours des études", parce qu'elle masquerait les symptômes de toxicité recherchés.
Objectifs
Le développement préclinique fait appel à l’expérimentation animale, qui est une étape indispensable à la connaissance d’un futur médicament avant de l’administrer à l’homme. Les recherches précliniques sont imposées par le Code de la santé publique comme préalable obligatoire à toute expérimentation sur la personne humaine (Article L1121-2). Ces études précliniques ont pour but d’évaluer l'efficacité, la pharmacocinétique et la toxicité du produit avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements. Ce projet est une nouvelle soumission d’un projet précédemment accepté et arrivant à expiration auquel a été apporté quelques modifications, notamment l’ajout de modes d’administration supplémentaires du composé, l’ajout de modes de prélèvements de sang supplémentaires, la possibilité de mettre les animaux à jeun pour le traitement, ou le suivi de la distribution du produit dans le corps des animaux en usant d’imagerie non-invasive. Ce projet permettra de définir le niveau de toxicité du produit en ayant une indication sur la relation dose-réponse, la réversibilité des potentiels effets adverses observés et en déterminant la concentration sans effet nocif observé, afin de poursuivre ou non son étude préclinique. L’évaluation de cette toxicité se fera selon 2 procédures, la première visant à déterminer la dose maximale tolérée après administration unique chez le rat ou chez la souris, la seconde étudiant la toxicité de traitements en doses répétées chez le rat ou chez la souris, en suivant respectivement les lignes directrices OCDE 420 et 407.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la toxicité du composé avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements, et de répondre aux exigences du Code de la santé publique, fournissant un préalable nécessaire à toute expérimentation sur l’humain (Article L1121-2).
Procédures
Les animaux pourront être soumis à des administrations de composés par injection ou gavage, de manière aiguë (une seule administration) ou répétée sur une durée allant de quelques minutes à environ 15 minutes par séance (temps nécessaire à la contention, l’injection et l’observation immédiate). Le nombre d’administration dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérée, cela pourra être une fois par semaine jusqu’à deux fois par jour. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours de l’étude, en utilisant un analgésique et un anesthésique, tout en respectant le volume maximal autorisé ainsi que le temps de récupération par animal. Chaque prélèvement dure environ 5 minutes. Des séances d’imagerie non invasive sous anesthésie gazeuse pourront être effectuées, avec un maximum de 5 par semaine et cela jusqu’à la fin de l’étude ou alternativement jusqu'à disparition du signal. Chaque séance dure environ 5 à 10 minutes, incluant l’induction, la mesure et le réveil. Enfin, une mise à jeun pourra être envisagée selon le protocole : pré-injection (pendant la nuit pour les rats, 3 à 4 heures pour les souris) et/ou post-injection (3 à 4 heures pour les rats, 1 à 2 heures pour les souris).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dépendront du type d’administration employée. Ainsi, les injections peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’administration par gavage peut entraîner un inconfort, une irritation de l’œsophage et du stress lié à la contention. Les administrations répétées, quel que soit le mode, peuvent générer une appréhension de la manipulation et un stress accru. Deux types de prélèvements sanguins pourront être effectués : d’une part des prélèvements intermédiaires réalisés sous anesthésie, en mandibulaire ou en sublingual, qui peuvent causer une douleur passagère, une petite hémorragie locale ou un stress lié à la contention ; d’autre part des prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie et analgésie, en rétro-orbital, réalisés uniquement en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Selon la nature du composé testé, des effets indésirables systémiques peuvent également apparaître, tels qu’une perte de poids, une modification du pelage ou une altération de l’état général (léthargie, diminution de l’activité, troubles digestifs).
Devenir
Euthanasie : les organes seront recupérés pour évaluation de la toxicité organe-dépendante.
Remplacement
Notre projet se focalise sur un modèle intégré d’étude de toxicologie nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier et imposé par le Code de la santé publique comme préalable obligatoire à toute expérimentation sur la personne humaine (Article L1121-2). Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur la toxicité du traitement. Pour les études en traitement aigu, l’analyse des données entraînera la comparaison au maximum de 7 groupes d’animaux (groupe contrôle négatif, groupes traitement avec jusqu’à 6 doses de produit testées). Chaque dose sera choisie en fonction de la toxicité observée après administration de la dose précédente (arbre décisionnel). Pour les études en traitement répété, l’analyse des données entrainera la comparaison de 6 groupes d’animaux (groupe contrôle négatif, groupe traitement avec dose faible, groupe avec dose intermédiaire, groupe traitement avec dose forte, groupe « recovery » contrôle négatif, groupe « recovery » traitement avec dose forte). Une analyse statistique sera réalisée à l’aide d’un test non paramétrique. Un nombre de 14 animaux par groupe (7 mâles et 7 femelles) est requis pour obtenir une puissance statistique minimale et connaitre l’impact du traitement en fonction du sexe.
Raffinement
Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, de l’imagerie non- invasive pourra être effectuée pour suivre le profil de distribution du produit, permettant d’augmenter la quantité d’informations recueillies sur l’animal sans dégrader le bien-être animal. Les conditions d’hébergement respecteront le respect de l’animal ; il y aura 2 à 3 rats ou 5 à 6 souris par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Lors de l’imagerie, comme lors des administrations du produit par les voies les plus invasives ou lors des prélèvements sanguins intermédiaires (15 % du volume sanguin total de l’animal, 1 fois au cours de l’étude), les animaux seront anesthésiés avec un inducteur chimique ou gazeux. Lors d’une anesthésie chimique, cette dernière sera antagonisée pour favoriser le réveil et la récupération des animaux. En revanche, aucune analgésie n’est possible au cours des études, puisqu’elle pourrait masquer l’apparition et/ou le maintien de symptômes liés à la toxicité du composé étudié. A la fin des procédures, lors des prélèvements de sang en rétro-orbital avant euthanasie, une analgésie sera en revanche réalisée par l’ajout d’un collyre analgésique en plus de l’anesthésie gazeuse. Un tableau de suivi a été mis en place permettant de définir les points limites adaptés.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d'étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de toxicité en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Le choix de l'espèce utilisée dépendra en particulier de la molécule utilisée, des objectifs et des besoins de l'étude. Si une molécule s'avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l'autre espèce afin de montrer un efficacité espèce-indépendante. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, à un stade de jeune adulte pour permettre de déterminer l’impact du traitement sur des animaux à maturité sexuelle dont les organes et le système immunitaire sont pleinement développés.
Cryo-préservation, redérivation et reproduction assistée pour un archivage et une gestion sanitaire de lignées murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 545
Injectées deux fois à deux jours d'intervalle pour provoquer une superovulation, des femelles sont tuées à la fin de la procédure. D'autres souris sont stérilisées par une chirurgie de vingt minutes, les mâles vasectomisés étant ensuite isolés puis accouplés chaque semaine aux futures mères porteuses. 8 960 souris et 545 rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 6 300 d'entre eux et modéré pour 3 205. Le service revendique un "changement de paradigme" au bénéfice des animaux non-humains grâce à la congélation des gamètes, et prévoit de tuer les mâles vasectomisés et les femelles stérilisées "lorsque trop âgés pour assurer la fonction".
Objectifs
Les prestations de reproduction contrôlée et cryoconservation (congélation de semence ou d’embryons) offrent aux unités de recherches un soutien dans la gestion de leurs projets de productions expérimentales. Elles permettent d’intégrer les étapes inhérentes à l’introduction des lignées dans le plan de production global du projet. Le service répond aux besoins des projets des équipes de recherches concernant les méthodes d’archivage (stockage de semence/gamètes) et de reproduction assistée (FIV : Fécondation in Vitro) de lignées murines (souris & rat). Il réalise des importations & exportations de lignées vivantes ou congelées (semence). Les missions sont : -Prise en charge systématique des lignées murines arrivant dans les animaleries du site universitaire pour protéger leur patrimoine génétique originel et garantir un environnement sanitaire général de qualité nécessaire au bon déroulé des projets de recherche. –Congeler le sperme ou les embryons de l’ensemble des lignées murines de la communauté scientifique afin d’assurer un archivage sécurisé et remplacer des animaux par des produits congelés lors des imports/exports. Limiter l’élevage aux lignées impliquées dans des projets de recherche les autres étant en stock congelé. -Proposer la FIV comme technique de reproduction assistée ou la décongélation d’embryons préalablement stockés en masse pour produire des lots expérimentaux. -Remplacer des rafraichissements génétiques par croisement naturel par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération antérieure qui seront réveillés lorsque nécessaire. Ces missions s’inscrivent dans la réduction du nombre d’animaux utilisés et présents.
Bénéfices attendus
Par l’ensemble de ces techniques nous assurons un changement de paradigme dans la gestion de la production animale au bénéfice de tous ; : chercheurs, hébergeurs/producteurs et surtout animaux. Celles-ci permettent d’appliquer pleinement les 3Rs à différents niveaux de la gestion de colonies et surtout réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques.
Procédures
1/Superovulation : Douleur légère & stress lors des injections. durée deux fois 30 secondes.2/ Males vasectomisés : Douleur légère ou modérée lors de la chirurgie. Une seule fois, durée 20 minutes de chirurgie. Pas d’effet à long terme. 3/Mères porteuses & femelles stérilisée : Douleur légère ou modérée lors de la chirurgie. Pas d’effet à long terme.Une seule fois, Durée de la chirurgie 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les actions de contention lors des injections (hormones, anesthésie, analgésie) génèrent du stress. Nous effectuons pour les superovulations, deux contentions à deux jours d’intervalles. Pour la chirurgie deux contentions à l’initiation du protocole (anesthésie, analgésie) Les conséquences des chirurgies : sutures, cicatrisations génèrent un inconfort limité, une douleur légère. Les mâles vasectomisés sont isolés et accouplés aux futures mères porteuses chaque semaine. Les souris étant des animaux grégaires, leur isolement génère du stress. En période de non-activité de plus d’une semaine, une femelle de compagnie est ajoutée dans la cage du mâle isolé.
Devenir
Superovulation : mise à mort à la fin de la procédure. Mâles vasectomisés : mise à mort lorsque trop âgés pour assurer la fonction Mères porteuses : mise à mort à la fin de la procédure Femelles stérilisée : mise à mort lorsque trop âgée pour assurer la fonction
Remplacement
La congélation d’ovocyte permet de remplacer des femelles superovulées par des lots d’ovocytes pour les FIV. Ajustement plus précis entre besoin et consommation. Les différentes congélations de gamètes (sperme –ovocytes-embryons ) permettent de réduire le nombre de lignées respirantes en congelant les lignées non utilisées, tout en ayant la possibilité de la réveiller ou d’assurer une fécondation via la FIV. Congélation/décongélation : Remplacer des étapes de production et de croisements par des FIV ou des décongélations. Réduire les étapes de rafraichissements génétiques par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération plus faible.Remplacer des producteurs par des paillettes de spermes/embryons : Congeler des lots d’embryons et les réveiller par petite quantité pour répondre a des besoins précis. Exemple une femelle gestante issue de la réimplantation d’embryons congelés pour disposer tous les 2mois de petits sans avoir de colonie respirante. Produire une cohorte par an par décongélation ou FIV /réimplantation massive sans avoir de colonie respirante.
Réduction
Archivage : Les différentes congélations de semences (sperme –ovocytes) permettent de réduire le nombre de lignées respirantes en congelant les lignées non utilisées, tout en ayant la possibilité de la réveiller ou d’assurer une fécondation via la FIV. Congélation/décongélation : Réduire les étapes de rafraichissements génétiques par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération plus faible. FIV : Réduire le nombre de mâles en fécondant massivement via des paillettes. Amplifier rapidement en utilisant peu d’animaux Superovulation : réduire le nombre de femelles donneuses d’ovocytes en superovulant. Synchronisation . Le cheptel de femelles nécessaire est ainsi réduit de 30 à 40%. Idem pour les mâles vasectomisés car il faut moins de couples pour avoir autant de femelles porteuses. Stérilisation des femelles de disposer de femelles compagne pour mâles isolés, permet de valoriser ces femelles plutôt que de les mettre à mort .
Raffinement
L’utilisation d’aiguilles 30G : permet de limiter la douleur lors des injections. Congélation d’ovocytes Lorsque la production commune destinée à l’ensemble des usagés produit un excédent de femelles mais qu’aucune FIV n’est programmée à la même période, nous pouvons superovuler les femelles et congeler les ovocytes. Lors d’un besoin pour FIV ces stocks serviront à affiner les quantités ou remplacer une superovulation. FIV : Une paillette de sperme permet de féconder plusieurs lignées d’ovocytes en même temps, ceci accélère et synchronise les croisements. Un sperme d’animal homozygote permet d’accroitre les rendements
Choix des espèces
Nous avons développé nos compétences sur les deux modèles animaux expérimentaux présents dans nos structures de productions et d’expérimentations. Ils sont les plus Les équipes de recherche pour lesquelles nous avons développé ce service travaillent sur les espèces rat et souris. Nous avons donc développé nos compétences sur les deux modèles animaux expérimentaux présents dans nos structures de productions et d’expérimentations. Elles sont les plus fréquemment utilisées en recherche animale et pour lesquels les techniques de manipulation et congélation des gamètes sont les plus abouties. La vasectomie s’effectue à l’âge de 6 semaines. Après 3 semaines de récupération post opératoire les mâles sont mis en accouplement pour confirmer la stérilité pour être utilisé jusqu’à environ l’âge de 26 semaines – 6 mois. Réimplantation –transfert d’embryons : Les mères porteuses sont utilisées dès l’âge adulte (8 semaines), jusqu’à l’âge de 3 mois (15 semaines) période qui est optimale entre 8 et 12 semaines d’âges Superovulation : Les femelles doivent de préférence être pré-pubères pour que l’effet de contrôle du cycle hormonal soit optimum. Selon les fonds génétiques cela se situe entre 4 et 6 semaines d’âge. Mais la stimulation d’adulte est envisageable en cas de nécessité.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les comportements dépendants de la dopamine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Nées de femelles auxquelles un composé mimant une infection virale a été injecté pendant la gestation, une partie des 1 016 souris de ce projet sert à mesurer les effets comportementaux de cette activation immunitaire. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 474 d'entre elles et modéré pour 542, et toutes sont tuées à l'issue pour des analyses de biochimie. Elles subissent quatre semaines de restriction alimentaire destinée à les motiver pendant les tests, trois semaines de séances comportementales quotidiennes d'une heure, et pour certaines une chirurgie cérébrale de 45 minutes pour injecter un virus dans le cerveau. Le porteur indique travailler par ailleurs sur des modèles in vitro pour les bases neurobiologiques de la schizophrénie, et conclut pourtant que l'étude du comportement "ne peut pas être reproduite in vitro".
Objectifs
L’activation du système immunitaire de la mère au cours de la grossesse (activation immunitaire maternelle), par exemple par des virus communs comme le virus de la grippe, est un facteur de risque pour plusieurs troubles psychiatriques et neurologiques, en particulier l’autisme et la schizophrénie. Les animaux utilisés à des fins scientifiques sont des modèles puissants et indispensables pour étudier les liens entre activation imunitaire maternelle et altérations du comportement chez la descendance. Les rongeurs dont la mère a reçu pendant la gestation un composé qui induit une activation immunitaire maternelle en simulant une infection virale, présentent des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. La dopamine est un neurotransmetteur notamment impliqué dans la physiopathologie de la schizophrénie. Cependant les conséquences comportementales des dysfonctions de ces neurones sont inconnues. Dans ce projet, nous tenterons d’identifier les conséquences comportementales des dysfonctions des neurones dopaminergiques dans un modèle d’activation immunitaire maternelle chez la souris.
Bénéfices attendus
Parmi les pathologies dont le risque est augmenté par l’activation immunitaire maternelle, la schizophrénie est une pathologie très courante (500 000 à 600 000 patients en France) directement associée à des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. Ainsi, presque tous les traitements pharmacologiques de la schizophrénie disponibles actuellement sont basés sur l’inhibition d’une molécule sur laquelle se fixe la dopamine. Ces thérapies traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Le ciblage des voies de la dopamine dans la schizophrénie est issu de découvertes fortuites et n’est pas fondé sur une compréhension fine des dysfonctions sous-jacentes. Notre projet permettra de comprendre le lien entre un facteur de risque identifié de la schizophrénie (l’activation immunitaire chez la mère), des dysfonctions du système dopaminergique et des altérations des phénotypes comportementaux liés à la dopamine.
Procédures
Une injection unique de solution est administrée par voie intraveineuse aux femelles gestantes vigiles sur une durée de 5 minutes. Un traitement antibiotique est également administré par prise volontaire orale via l’eau de boisson à un lot de femelles allaitantes vigiles, pendant une période de 15 jours. Un protocole comportemental sur un lot d’animaux vigiles durant 1h par jour (ou 1h20 le dernier jour) est réalisé pendant 3 semaines. Ce protocole inclut une restriction alimentaire modérée de 4 semaines (dont une semaine de mise en place) permettant de motiver les animaux à obtenir une récompense lors du test. Une intervention chirurgicale est réalisée sur un lot d’animaux sous anesthésie générale et analgésie, consistant à administrer un virus ou une solution contrôle dans le cerveau, durant 45 minutes. Une chirurgie sans réveil (sous anesthésie et analgésie) de moins de 5 minutes sera réalisée sur un lot d’animaux.
Impact sur les animaux
L’injection du composé mimant un virus induit une activation immunitaire transitoire, corrélée à une perte de poids d’environ 1 à 2 pour cent du poids total par rapport au poids des animaux témoins deux jours après l’injection. Cependant, cette perte de poids ne persiste pas : dès le troisième jour après l’injection, les poids des souris ayant reçu le composé et celui des souris ayant reçu l’injection contrôle redeviennent similaires. Pendant la période transitoire d’activation immunitaire (c’est-à-dire dans les 24h après injection), il est attendu que les souris présentent un comportement modérément altéré, avec prise de nourriture amoindrie. Le traitement antibiotique peut entraîner une altération du microbiote intestinal qui peut se traduire par des troubles digestifs modérés. La restriction alimentaire imposée dans un objectif motivationnel pour le test comportemental entraîne une sensation de faim. L’anesthésie lors de la chirurgie peut entraîner des risques de détresse respiratoire, cardiaque et d’hypothermie. Des effets indésirables comme le stress ou la douleur peuvent persister après l’opération et sont dans ce cas pris en charge.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés selon des méthodes réglementaires pour des expériences de biochimie, après la fin du protocole comportemental ou après sevrage de la progéniture. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.
Remplacement
Une partie de notre travail (bases neurobiologiques de la schizophrénie) est axée sur l’utilisation de modèles in vitro pour des caractérisations d’effets génétiques. Cependant, pour ce projet portant sur le même thème, l’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à des pathologies psychiatriques, nécessite d’avoir recours à des animaux. En particulier, l’étude du comportement ne peut pas être reproduite in vitro.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre de souris incluses dans le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Le nombre total d’animaux impliqués est de 1016.
Raffinement
Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. Un enrichissement (bâtonnets à ronger) est prévu pendant la durée de la restriction alimentaire. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement anti-inflammatoire/antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. Les conditions d’hébergement (luminosité, température, etc.) seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans des pathologies humaines. Les souris gestantes recevant une injection sont de jeunes adultes fécondes (8-15 semaines). Les souris soumises aux expériences comportementales sont également de jeunes adultes (jour postnatal 90 à 120) afin d’étudier les conséquences comportementales de l’activation immunitaire maternelle sur le long terme.
Effet de l’expression ectopique de PAX8 dans les cellules de Sertoli chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Rendues stériles par l'expression forcée d'un gène dans les cellules du testicule, 102 souris subissent une injection de traceur cellulaire puis une chirurgie terminale de dix minutes. 48 d'entre elles sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 54 autres relevant de procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit que les animaux générés "ne souffrent pas" puisque le défaut se limite à une stérilité, tout en décrivant une perfusion intracardiaque de fixateur et une hypothermie possible liée à l'anesthésie. Toutes sont tuées pour prélever leurs testicules, l'un pour l'histologie, l'autre après perfusion pour l'immunohistochimie.
Objectifs
PAX8 est un facteur de transcription dont on veut étudier si il détermine le destin des cellules. Nous cherchons à savoir si l’expression forcée de PAX8 dans les cellules de Sertoli du testicule est capable de provoquer leur différenciation anormale en cellules épithéliales d'un autre type. Pour se faire nous croisons deux lignées de souris pour nous permettre d’induire la surexpression de Pax8 uniquement dans les cellules de Sertoli chez la descendance sans pour autant impacter leur état de santé et de bien-être à l’exception d’un défaut de fabrication de gamètes (spermatogénèse).
Bénéfices attendus
Notre projet augmente les connaissances concernant le rôle de PAX8 dans la physiologie testiculaire. De plus, les résultats de ces recherches permettent d’identifier certains problèmes d’infertilité chez l’homme et d’envisager des thérapies.
Procédures
Les interventions sur la souris nécessitent de les immobiliser par une contention non traumatisante de 20 à 30 secondes. Les souris reçoivent l' injection d'un traceur cellulaire (1 fois, quelques secondes), d’un analgésique (1 fois, quelques secondes) et d’un anesthésique (1 fois, quelques secondes). La procédure de chirurgie terminale sans réveil dure 10 minutes et résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les mâles ne présentent aucun phénotype dommageable, seul une stérilité liée à un problème de différenciation de l’épithélium est attendue. Les procédures expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La douleur résultant de l’administration de substance (traceur cellulaire, analgésique et anesthésique) est légère et de courte durée, elle entraine une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau. La chirurgie terminale sans réveil sera réalisée sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. L’anesthésie peut engendrer une hypothermie.
Devenir
tous les animaux de ce projet sont mis à mort afin de prélever des organes pour les analyses histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Notre étude vise à comprendre le rôle d'un gène dans la différenciation des cellules de Sertoli du testicule. La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Le contexte physiologique, les interactions entre les cellules somatiques et les cellules germinales sont essentielles pour assurer une production continue de spermatozoïdes. L’utilisation d’un système in vitro basé sur un type cellulaire unique ne suffit pas à se placer dans un contexte physiologique aussi complexe que celui de l’animal. Seule une approche expérimentale avec des animaux nous permet de répondre à nos recherches.
Réduction
Le nombre d’animaux requis est le minimum nécessaire pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. La stratégie des accouplements fait en sorte que la totalité des mâles produits serviront à l’analyse. 50% des mâles produits sont transgéniques et les autres 50% sont des mâles contrôles. Il s’agit du croisement d’animaux de deux lignées ne présentant pas de phénotype. Pour les analyses morphologiques (histologie et immunohistochimie), ainsi que pour le suivi du destin des cellules par administration d’un traceur à différentes étapes de la spermatogénèse, nous utilisons 3 mâles contrôles et 3 mâles transgéniques. Sur un même animal, nous prélèverons un testicule pour les analyses histologiques et le deuxième testicule après perfusion de fixateur pour les études immunohistochimiques.
Raffinement
Les animaux générés (exprimant PAX8 dans les cellules de Sertoli) ne souffrent pas car le phénotype attendu se limite à une stérilité due à un défaut de production de spermatozoïdes lors de la différenciation de l’épithélium séminifère ce qui ne provoque pas l’obturation du système uro-génital. Les animaux sont injectés avec une solution de Brdu à température ambiante et sont surveillés 1H, 2H et 3H après injection et une fois par jour pendant 4 jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement, en cas d’inconfort ou de souffrances constatés des mesures correctives adaptés seront prises après consultation auprès de la SBEA et du vétérinaire (soins, analgésie, euthanasie…). En cas d’atteinte de points limites l’animal sera immédiatement mis à mort. Les injections, la perfusion et les mises à mort sont réalisées par un expérimentateur qualifié ayant suivi une formation à la manipulation des rongeurs et à la chirurgie afin de minimiser les nuisances sur les animaux. La douleur générée par la perfusion intra-cardiaque est minimisée grâce à l’administration d’un analgésique 30 minutes avant l’anesthésie.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des modifications dans le génome : temps de génération court ; génome connu, outils moléculaires). Pour les études par histologie et immunohistochimie nous analysons 8 stades de la spermatogénèse qui correspondent à des étapes clés de la spermatogénèse. Pour étudier le destin et le rythme de différenciation des cellules nous analysons par immunohistochimie 3 vagues déterminantes de la spermatogénèse avec des prélèvements à 3 points dans le temps après l’administration d’un traceur moléculaire.
Développer un vaccin candidat contre les flavivirus EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Exposées sous anesthésie à la piqûre de moustiques porteurs du virus de la fièvre du Nil occidental pendant une trentaine de minutes, 1 606 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 286 d'entre elles et modéré pour 1 320 autres. Une partie est rendue immunodéficiente par manipulation génétique ou par injection d'anticorps détruisant certaines cellules immunitaires. Le porteur annonce ensuite quatorze jours d'observation et de pesée, et indique attendre des symptômes métaboliques et neurologiques liés à l'infection flavivirale, sans les décrire. Il justifie le choix de la souris par sa petite taille et la facilité de manipulation, en ajoutant que cette taille "permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l'effet de l'infection".
Objectifs
Le projet vise à promouvoir le développement d’un vaccin contre les flavivirus transmis par les moustiques. La cible du vaccin candidat a été identifiée et correspond à un facteur de transmission dans la salive du moustique. L’équipe de recherche a déjà démontré que l’immunisation contre ce facteur de transmission protège contre l’infection par le virus de la fièvre du Nil Occidental dans un modèle murin de type sauvage. Pour soutenir le développement vaccinal, le projet décrit ici a deux objectifs : (i) décrypter le(s) mécanisme(s) de protection ; et (ii) évaluer la protection contre plusieurs flavivirus transmis par les moustiques. Ces deux objectifs nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés. (i) Pour décrypter les facteurs immunitaires responsables de la protection, nous évaluerons l’efficacité de la vaccination dans différentes colonies de souris où les diverses branches de l’immunité ont été supprimées par des manipulations génétiques ou par l’injection d’anticorps ciblant différentes cellules. (ii) Les souris de type sauvage ne sont pas susceptibles d’être infectées par d’autres flavivirus que le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’infection par des flavivirus tels que ceux de la dengue, du Zika, de la fièvre jaune et de l’encéphalite japonaise nécessite des souris dont l’immunité innée a été génétiquement altérée. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1/2 et EU2/2).
Bénéfices attendus
Ce projet soutiendra le développement d’un vaccin contre plusieurs flavivirus. Ces flavivirus infectent plus d’un demi-milliard de personnes dans le monde et causent la mort d’environ 200 000 personnes chaque année. Pourtant, il n’existe actuellement aucune méthode de protection contre tous. En soutenant le développement d’un vaccin contre les flavivirus, ce projet contribuera à étoffer l’arsenal thérapeutique contre ces maladies.
Procédures
Dans un premier temps, nous évaluerons les facteurs immunitaires nécessaires pour la vaccination. Nous injecterons à deux reprises des souris présentant différents types de déficiences immunitaires avec le candidat vaccin. Les injections dureront quelques minutes. Deux semaines après la dernière injection, les souris seront anesthésiées pour prélever du sang, puis euthanasiées pour prélever la rate afin d’analyser la réponse immunitaire. Ensuite, nous évaluerons l’effet des facteurs immunitaires sur la protection conférée par le vaccin. Des souris présentant les mêmes types de déficiences immunitaires que précédemment seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’exposition aux moustiques, sous anesthésie, durera moins de 30 minutes. Nous effectuerons ensuite un seul prélèvement sanguin pour vérifier l’infection et évaluerons les symptômes pendant 14 jours en observant et pesant les souris. Enfin, nous évaluerons l’effet de la vaccination sur la protection contre l’infection par les virus de la dengue, du Zika, de la fièvre jaune et de l’encéphalite japonaise. Des souris génétiquement modifiées, susceptibles à ces flavivirus, seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par ces virus. Nous procéderons de la même manière que pour le virus du Nil Occidental pour la vérification de l’infection et le suivi des symptômes. Toutes les immunisations seront conduites dans l’EU2/2. Toutes les infections et les procédures sur animaux infectées seront conduites dans l’EU1/2.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection lors de l’administration du vaccin candidat et des anesthésiques, ainsi que lors des prélèvements sanguins. Développement de symptômes métaboliques et neurologiques associés à l’infection flavivirale.
Devenir
Les animaux utilisés pour l’étude de la réponse immunitaire à notre vaccin candidat seront euthanasiés afin de permettre la collecte de sang et d’organes. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur la transmission par piqûre de moustique. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
Pour évaluer l’effet de la réponse immunitaire dans les différentes conditions de déficiences immunitaires, nous utiliserons 5 souris par groupe car ce nombre est le minimum pour obtenir des données fiables selon des travaux préliminaires. Pour quantifier l’effet de la vaccination sur l’infection nous utiliserons 15 souris par groupe, nous avons effectué des calculs statistiques de puissance à partir d'expériences préliminaires pour connaitre le nombre minimum d'individus nécessaire.
Raffinement
Les souris auront accès à des enrichissements variés. Les souris seront anesthésiées avant leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler de possibles anomalies liées à la narcose. Entre autres, nous suivront les grandes fonctions. En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera quotidiennement en se basant sur la grille de scoring des symptômes. Des points limites seront mises en place suivant ce score.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris. Les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler, avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6-8 semaines car ils ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection. Leur taille facilite leur manipulation.
Développement d’une immunothérapie basée sur des vecteurs lentiviraux contre le cancer du foie dû au virus de l’hépatite B dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tuées à la fin de chaque procédure parce qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, 1 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la rate par chirurgie, puis viennent jusqu'à dix injections, dix prises de sang et neuf séances d'imagerie sous anesthésie par animal, pour tester un vaccin contre le cancer du foie lié au virus de l'hépatite B. Le porteur écrit que la croissance de la tumeur hépatique "est tolérée par les souris" tout en indiquant qu'elle peut affecter leur capacité à s'alimenter. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'immunogénicité des vecteurs et que la complexité des réponses vaccinales dans un "organisme entier" impose l'animal.
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement certaines cellules immunitaires capables de tuer des cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur de nouveaux candidats vaccins pourrait être particulièrement efficace pour activer ces cellules immunitaires et contrôler la prolifération tumorale. Dans un premier temps, le but est d'établir des lignées tumorales exprimant des antigènes du virus de l'hépatite B au niveau du foie des souris. En cas de succès, l’objectif sera d'évaluer l’efficacité des candidats vaccins seuls, ou en combinaison avec des molécules anticancéreuses, à éliminer ces tumeurs. Cela permettra d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du foie et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une vaccination thérapeutique basée sur ces nouveaux candidats vaccins. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité antitumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de la preuve du concept préclinique d'utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des candidats vaccins, avec ou sans combinaison avec d’autres molécules anticancéreuses, dans l’immunothérapie du cancer du foie lié à l'infection par le virus de l'hépatite B. L’avantage à long terme du projet actuel sera l'utilisation de ces vaccins d’immuno-oncothérapie dans le contexte d’une co-administration en clinique dans le but d’obtenir un effet additif ou synergique de la réponse immunitaire contre des tumeurs hépatiques.
Procédures
Pour un groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 7x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 7x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 6x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 1 ou 2x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x Pour un autre groupe d’animaux : - Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Chirurgie sous anesthésie gazeuse (environ 1/2h): 1x - Injection d’analgésiques (20-30 secondes/souris) toutes les 8-12h jusqu’à disparition des symptômes de douleurs - Injections sur animaux anesthésiés (quelques secondes): 10x - Prélèvements de sang sur animaux vigiles (quelques secondes): 10x - Injections sur animaux vigiles (quelques secondes): 4x - Injection sur animaux vigiles (quelques secondes): 1x - Suivi en imagerie sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris): 9x
Impact sur les animaux
L'injection dans la rate des cellules tumorales nécessite une chirurgie et des complications post-opératoires comme des infections peuvent survenir pendant toute la période de suivi. La croissance de la tumeur au niveau hépatique est tolérée par les souris mais peut, dans certains cas, s’associer à une perte d'activité et affecter leur capacité à s'alimenter. Les animaux sont susceptibles de ressentir une légère douleur au moment des injections de vaccins, d'anticorps ou des prises de sang. Cette douleur sera de courte durée et sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général. Douleur au point de piqure et stress lors des prélèvements de sang sur animaux vigils.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité vaccinale antitumorale d’un vaccin thérapeutique, injecté seul ou en co-injection avec des molécules anticancéreuses, destiné ultimement à la thérapie de certains cancers du foie. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale, car aucun modèle in vitro ne permet d’évaluer l’immunogénicité des vecteurs d’immunisation. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité des réponses vaccinales et antitumorales au niveau d’un organisme entier. Les mécanismes en jeu sont multifactoriels et ne sont pas encore caractérisés de manière exhaustive. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité entre les individus, comme chez l’homme. En choisissant des animaux d’âge proche, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. Toujours pour réduire le plus possible le nombre de souris utilisées tout en s’assurant qu’un nombre suffisant sera inclus de façon à rendre les résultats concluants, le nombre d’animaux et de répétitions par expérience ont été définis en fonction de la nature de l’expérience et validés suite à l’exposé et à la discussion du projet avec un biostatisticien. Sur ses conseils, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la capacité d’implantation et de la variabilité de la croissance tumorale de manière à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Ce nombre pourra être réduit si la variabilité observée lors de la première procédure est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser notre protocole de vaccination et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vaccins utilisés dans cette étude ont été préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses spécifiques contre les tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si les tumeurs ne s'implantent pas ou si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
L'injection dans la rate des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie gazeuse avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l'injection. L’implantation de tumeurs hépatiques peut induire une gêne modérée qui sera spécifiquement monitorée 2 à 3 fois par semaine au cours des expériences. Selon notre expérience antérieure, l’injection des vecteurs lentiviraux vaccinaux n’induit aucun signe clinique chez les souris. Les animaux seront observés 2 à 3 fois par semaine pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises. Cela inclut l’ajout de gel hydrique, la réhydratation sous cutanée, le chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose pour éviter l’irritation par les copeaux de bois.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe un modèle de tumeur hépatique qui peut être utilisé chez la souris pour tester notre candidat vaccin. Nos études précédentes montrent que les vecteurs vaccinaux évalués sont immunogènes chez la souris. De plus, de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Hypothyroïdie & Fibrose hypophysaire
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour étudier la fibrose de l'hypophyse provoquée par l'hypothyroïdie, 7 756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 420 d'entre elles et modéré pour les 7 336 autres. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime pauvre en iode pendant cinq semaines au maximum. Jusqu'à 3 240 souris sont opérées pour implanter une fibre optique ou une lentille dans le cerveau, puis hébergées seules, l'isolement étant reconnu par le porteur comme une source de stress. Il écrit que les animaux implantés "ne présentent aucun signe de stress lors des séances d'imagerie", et annonce dans le même document que l'ensemble des expérimentations prévues ne sera pas réalisé, sans dire combien de souris seront effectivement utilisées.
Objectifs
L'hypothyroïdie est une maladie courante qui touche 5% de la population mondiale et plus particulièrement les femmes. Elle est causée par une baisse de la fonction thyroïdienne indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus métaboliques due à divers facteurs comme des maladies auto-immunes, des traitements médicaux ou simplement des carences en iode. Problème de santé publique majeur, elle entraine fatigue chronique, forte prise de poids incontrôlable, dépression, ... Non traitée, elle peut entraîner des complications graves, telles que des maladies cardiovasculaires, des troubles neurologiques ou encore des problèmes de fertilité. L'axe hypothalamo-hypophysaire contrôle la fonction thyroïdienne grâce à des boucles hormonales de rétrocontrôle au niveau de la thyroïde, de l’hypophyse et de l’hypothalamus. Lors d’études précédentes, nous avons mis en évidence une perturbation de la sécrétion d’une hormone clé hypophysaire de la fonction thyroïdienne, la thyréostimuline (TSH), chez des souris atteintes d’hypothyroïdie. En parallèle, nous avons observé un remodelage du collagène hypophysaire chez des souris présentant une hypothyroïdie. Ces résultats laissent supposer que cette pathologie entrainerait une inflammation au niveau de l’hypophyse conduisant à une fibrose dont les mécanismes et l’impact sont encore inconnus. Ce projet a pour but : o L’étude des mécanismes responsables de la sécrétion pulsatile de la TSH en conditions physiologique et pathologique (hypothyroïdie) et un potentiel dimorphisme sexuel, o L’étude de la mise en place et de l’impact d’une fibrose hypophysaire chez la souris hypothyroïdienne, o L’étude des relations intra-hypophysaires entre les différents types cellulaires impliqués dans l’hypothyroïdie dont en particulier les cellules régulant le flux sanguin (les vaisseaux étant largement impactés par la maladie), les cellules endocrines et les cellules produisant le collagène.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes associés à l’hypothyroïdie afin d’établir de nouvelles pistes de diagnostic et de thérapie en santé humaine, mais également comment les femmes sont plus touchées par la maladie à moyen terme. A plus long terme, le rôle de la fibrose potentiellement bénéfique lors de l’hypothyroïdie n’a encore jamais été exploré et pourrait permettre à la fois une meilleure compréhension des mécanismes de protection de l’hypophyse et l’ouverture d’une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
L’ensemble des animaux (excepté les souris contrôles) seront soumis à un régime spécifique pauvre en iode afin d’induire une hypothyroïdie. Ce régime est prolongé au maximum 5 semaines. Au très grand maximum, 3744 souris seront manipulées uniquement sous anesthésie générale associée à une analgésie. 420 souris seront prélevées de quelques microlitres de sang pendant 1 à 2 heures une fois par semaine pendant maximum 8 semaines. Au très grand maximum, 3240 souris seront opérées sous anesthésie générale et sous analgésie afin d’implanter une fibre optique ou une fine lentille dans le cerveau. Nous continuons l’analgésie pendant 2 à 3 jours. Cette opération permettra par la suite d’avoir accès à une zone d’intérêt dans le cerveau pour imagerie ou stimulation lumineuse. Ces animaux sont imagés libres de leurs mouvements après habituation et ne présentent aucun signe de stress lors des séances d’imagerie. Ils peuvent être utilisés pendant plusieurs mois et sont leur propre contrôle ce qui permet de diminuer drastiquement le nombre d’animaux utilisés.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus selon les procédures. Les injections sur souris vigiles vont entrainer une légère douleur au niveau de la zone d’injection. Les injections via le sinus rétro-orbital réalisées sous anesthésie peuvent entrainer une gêne au niveau de l’œil pendant 1 à 2 heures post-injection. Enfin les animaux implantés peuvent souffrir de douleurs post-chirurgicales et d’une perte de poids légère et temporaire, ainsi que d’une augmentation du stress due à leur isolement.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récupérer les organes.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les différentes composantes du remodelage cellulaire dans un système hormonal intégré. Les expérimentations prévues in vivo vont permettre de compléter ce projet par l’étude des interactions entre les différents types cellulaires, localisés à plusieurs niveaux dans l’organisme et communiquant entre eux via la circulation sanguine.
Réduction
Dans une logique de réduction, le nombre d’animaux nécessaire par groupe est proposé à partir d’un logiciel statistique permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour avoir une différence statistique significative. Une partie des expérimentations sera réalisée avec l'animal étant son propre contrôle (suivi de la pathologie et de la récupération) pour réduire le nombre d'animaux nécessaire. Nous ferons des études qui nous permettront de valider les lignées nécessaires et de faire des choix expérimentaux. Ainsi, l’ensemble des expérimentations proposées ne seront pas réalisées ; ce qui devrait réduire drastiquement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement. Cette étude impliquera l’isolement des souris ; pour diminuer le stress inhérent, ces dernières seront placées dans un milieu enrichi (frisottis de papier, bâtonnets de coton et abri en carton) sous surveillance régulière et en portoir ventilé et garderont un contact visuel avec leurs congénères. Pour les actes chirurgicaux, les animaux seront opérés sous anesthésie et analgésie et suivis par antalgie les 3 jours suivants l'opération toutes les 24 heures pendant les deux premiers jours post-opératoires). Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés sont installés dans les cages (cabanes, coton, mouchoir en papier, rouleau en carton…). Tous nos protocoles sur animaux vigiles sont réalisés sur animaux non stressés, nous attachons beaucoup d’importance à les habituer aux différentes manipulations pendant plusieurs semaines avec récompense (alimentaire) lors des premières séances d’entrainement. D’anciennes études réalisées dans notre équipe montrent que le taux de cortisol ne traduit aucun stress chez nos animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour plusieurs raisons : la physiologie des hormones thyroïdiennes fonctionne de manière très similaire chez l'homme et la souris, tant au niveau des structures que des hormones et de leur régulation, son patrimoine génétique est relativement proche de celui de l’être humain et il existe une très grande quantité disponible de lignées génétiquement modifiées qui nous permettrons dans ce projet d’étudier une grande variété de types cellulaires impliqués dans l’hypothyroïdie. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes (de 8 à 22 semaines) afin que la croissance et la puberté soit terminées. Les animaux seront hébergés une semaine avant le début des expérimentations pour s’acclimater avant le début des expérimentations.
Elevage de lignées murines présentant une inflammation chronique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Des lignées de souris sont élevées pour développer avec l'âge une inflammation chronique, une hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmonaire : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nuisances annoncées sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Le porteur écrit ensuite que les conditions d'élevage seront adaptées pour que les animaux ne développent pas de symptômes, alors que le phénotype dommageable est précisément ce que cet élevage produit, les souris atteintes n'étant pas gardées au-delà de vingt semaines. Une partie des petits sert au renouvellement des accouplements, les autres partent vers des expériences menées sur un autre site, et tous sont tués à terme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.
Procédures
Ces animaux developperont une inflammation chronique avec l'âge. Ces lignées murines modèles de maladies inflammatoires developpent avec le temps un hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.
Remplacement
L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.
Réduction
Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.
Raffinement
Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.
Choix des espèces
Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).
Rôle de la bactérie intestinale commensale Phascolactobacterium faecium G104 sur le comportement alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Dix semaines de gavage intragastrique et treize semaines de tests : 80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles doivent appuyer sur un levier pendant soixante minutes par jour pour obtenir une nourriture appétente, sous privation alimentaire, et leur prise de boisson est mesurée trente minutes par jour. Le porteur veut savoir si une bactérie intestinale humaine réduit la motivation pour le gras et le sucre, et si elle limite la prise de poids sous régime hypercalorique, en vue d'un usage comme probiotique contre l'obésité. Une perte de poids supérieure à 20 % associée à un score de souffrance maintenu plus de quarante-huit heures déclenche la mise à mort par dislocation cervicale.
Objectifs
Le but du projet est de caractériser l'effet de la bactérie intestinale commensale humaine Phascolarctobacterium faecium G104 sur le comportement alimentaire chez la souris (objectif 1) ainsi que de déterminer son rôle dans la prévention de la prise de poids en réponse à l'ingestion d'un régime hypercalorique (objectif 2).
Bénéfices attendus
Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : Administration des traitements par sonde intragastrique pendant 10 semaines (80 souris, vigiles) ; Mesures comportementales pendant 13 semaines (80 souris, vigiles). L'adminstration par gavage oral prend moins de 10 sec par animal. Lors des tests comportementaux les animaux peuvent librement se déplacer: on mesure la consommation de nourriture palatable après appui sur un levier pendant 60 minutes par jour. Test de préférence/ aversion gustative on mesure la prise hydrique pendant 30 minutes par jour. Rythmes circadiens du comportement alimentaire sera mesuré pendant 3 semaines.
Impact sur les animaux
L´injection intrapéritonéale et l´administration par gavage oral peuvent être cause de stress pour l’animal dû à la contention/préhension. – Le test comportemental pour évaluer la motivation pour la nourriture palatable nécessitent une déprivation alimentaire légère. L’exposition au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour l'étude des effets du traitement au probiotique sur le cerveau (80 animaux)
Remplacement
Notre projet de recherche vise à mieux comprendre comment une bactérie spécifique présente dans l’intestin influence les habitudes alimentaires. Plus précisément, nous voulons savoir si cette bactérie peut moduler la motivation pour des aliments palatables comme les aliments sucrés et gras et si cette bactérie peut réguler la prise de poids lors d’une exposition à une régime obésogène. Notre projet vise à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels cette bactérie intestinale module le comportement alimentaire. Pour étudier cette question de manière approfondie, nous devons utiliser des modèles animaux. Nous avons choisi d'étudier des souris de la souche C57BL/6J, car cette souche développe une obésité lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en graisses et en sucres. Il n'existe pas d'alternative à l'étude des effets de cette bactérie sur les comportements et le cerveau. Ce travail fournira des preuves scientifiques des effets de la bactérie intestinale commensale humaine P. faecium G104 sur le comportement alimentaire en explorant son rôle sur la motivation pour les aliments palatables. Ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), et nous permettra de mieux comprendre les avantages métaboliques de cette bactérie et son utilisation potentielle comme probiotique pour prévenir et traiter l'obésité.
Réduction
Les mêmes souris (80 au total) seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la caractérisation des effets. Le nombre d'animaux nécessaires (10 par groupes) est basé sur des expériences précédemment effectuées dans l'équipe permettant de révéler des différences statistiques entre groupes dans ce type de tâches comportementales . Il est nécessaire d'utiliser deux lots d'animaux pour obtenir des tissus frais et des tissus perfusés et fixés, la taille totale de l'échantillon incluant les deux lots est donc de 80 souris (40 x 2).
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille (foournie en annexe) : si un score supérieur à 3 (associé à une perte de poids >20%) persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé.Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Avant la mise à mort, les animaux recevront un traitement analgésique suivi d'un traitement avec un anesthesique.
Choix des espèces
la souris est un bon modèle pour l'étude du comportement alimentaire et la motivation. Le comportement sera étudié à l'âge adulte, qui constitue la population la plus exposée à l'obesité en clinique.
Etude du rôle de la branche ATF6a de la réponse UPR au cours du vieillissement dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes, 304 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six mois, sont pesées chaque semaine et passent une imagerie sous anesthésie deux fois par mois pendant les traitements, puis une fois par mois ensuite. Le porteur cherche à savoir si bloquer une voie de réponse au stress cellulaire retarde les effets du vieillissement, avec l'ambition affichée de développer des molécules anti-vieillissement. Le projet peut durer vingt-quatre mois, soit à peu près l'espérance de vie d'une souris de laboratoire, sans que cette durée soit justifiée autrement que par le suivi du vieillissement.
Objectifs
Bien que les mécanismes conduisant au vieillissement ne soient pas encore complètement connus, il est maintenant établi que les effets du vieillissement sont corrélés à une augmentation du nombre de cellules sénescentes dans les tissus. Les cellules sénescentes se distinguent par de nombreux changements morphologiques et métaboliques et leur élimination (génétiquement ou pharmacologiquement) peut prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et ainsi prolonger la durée de vie chez la souris. La sénescence a longtemps été considérée comme un mécanisme suppresseur de tumeurs via l’arrêt permanent du cycle cellulaire. Cependant, certaines molécules sécrétées par la cellule sénescente peuvent contribuer à un microenvironnement favorable à la transformation de cellules pré-cancéreuses. Ce rôle promoteur de tumeurs est également souligné par le fait que des cellules sénescentes sont trouvées dans des tumeurs bénignes et que des cellules épithéliales en culture peuvent échapper de façon spontanée à la sénescence et ré-entrer dans le cycle cellulaire avec des caractéristiques néoplasiques. Par ailleurs, la sénescence est également associée à de nombreuses pathologies liées au vieillissement comme les fibroses tissulaires conduisant à terme à des défaillances d’organe. Ainsi, l’étude des mécanismes de sénescence au cours du vieillissement nous semble particulièrement intéressante. La modulation de ces mécanismes pourrait ainsi permettre de bloquer dans le même temps le développement de pathologies fibrotiques et/ou cancéreuses ou plus généralement des pathologies liées à l’âge. Nous avons montré dans nos précédentes études dans des modèles de cellules que l’inhibition d’un certain nombre de facteurs associés à une voie de signalisation spécifique ("voie de réponse aux protéines mal conformées") provoque un retournement des caractéristiques observées dues à la sénescence. Une étude plus approfondie de ces différents acteurs pourrait permettre de mieux comprendre l’implication de cette voie au cours de la sénescence mais surtout pourrait potentiellement aboutir au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nous souhaitons, au travers de cette étude, déterminer si le ciblage de la voie de réponse aux protéines mal conformées dans un modèle animal pourrait avoir des effets et, ainsi, retarder ou réduire les pathologies liées au vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre les mécanismes régissant le vieillissement et pouvant conduire à la mise en place de processus pathologiques. Les résultats que nous obtiendrons pourraient permettre d’envisager l’inhibition spécifique d'une branche de la voie de signalisation impliquée dans les phénomènes de sénescence dans des conditions physiologiques et pathologiques et de déterminer quels inhibiteurs présenteront le meilleur potentiel thérapeutique. A terme, nous souhaitons développer des molécules « médicaments » ayant des effets anti-vieillissement et par conséquent des effets bénéfiques sur l’apparition de maladies liés au vieillissement, y compris la fibrose et le cancer.
Procédures
Après leur arrivée, tous les animaux (304 souris) seront acclimatés à leur zone d'hébergement pendant une semaine puis seront habitués à la manipulation humaine pendant une semaine supplémentaire. Les animaux recevront ensuite une injection de traitement ou de solution contrôle (durée : 1 min) à raison de 2 fois par semaine sur une durée de 6 mois. Les animaux seront pesés une fois par semaine (durée : 1 min) tout le long de la procédure. Dès la première semaine de traitements, l'effet de ces derniers sur la sénescence des cellules sera évalué par imagerie. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse, tondus pour faciliter l'imagerie (durée : 30 sec.) et l'injection d'une molécule facilitant la lecture des images sera réalisée (durée : 30 sec). Après la lecture, les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil (durée totale anesthésie : 30 minutes). Cette lecture sera réalisée deux fois par mois pendant les 6 mois de traitements puis une fois par mois jusqu'à la fin du projet. A la fin des traitements, les souris seront maintenues en hébergement pour suivre leur vieillissement (durée maximale du projet : 24 mois).
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un stress léger de courte durée au moment de la manipulation lié à la nécessité de réaliser une contention et une injection pour l'administration des traitements. Les étapes nécessitant une anesthésie gazeuse pourraient également être source d'un stress léger et de courte durée.
Devenir
Afin d'étudier les effets de nos traitements sur la sénescence des cellules de différents organes, il nous est nécessaire de pouvoir les récupérer à la fin du projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Avant de procéder à l'étude in vivo, nous avons évalué les différents inhibiteurs des effecteurs de la voie de signalisation qui nous intéresse ainsi que leur efficacité in vitro. Nous avons pu identifier et caractériser les cibles d'intérêt de notre projet. Ces étapes préliminaires réalisées dans des modèles n'impliquant pas d'animaux ont ainsi permis de réduire le nombre d'animaux impliqués dans cette étude. Afin de valider dans un modèle complexe les différents inhibiteurs identifiés, l'utilisation d'un modèle animal à la fois jeune et âgé demeure cependant nécessaire.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nos cibles d’intérêts ont déjà été identifiées et caractérisées et l’efficacité des inhibiteurs a déjà été évaluée dans un modèle n'utilisant pas d'animaux. Le nombre de souris par groupe a été déterminé par une approche statistique tout en se basant sur les connaissances et l'expertise du laboratoire sur la manipulation de ce type de souris dans une expérience à long terme afin d'obtenir des résultats robustes. De plus, l'utilisation d'un système permettant le suivi longitudinal par imagerie de l'expression de notre facteur d'intérêt permet de réduire le nombre total d'animaux en évitant la mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires.
Raffinement
Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 6 animaux par cage dans un environnement enrichi (carré de coton pour la nidification) et dans des conditions classiques d'hébergement (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés avant la mise en place de l’expérimentation afin de procéder à une habituation. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse ainsi qu’avant la mise à mort. Des points limites ont été définis préalablement à l’expérience et un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance excessive nécessitant l’arrêt de la procédure et leur mise à mort (qui sera réalisée à distance des autres animaux). Les souris vieillissantes risquant de développer des pathologies non rencontrées chez des souris jeunes, nous apporterons des points de vigilance supplémentaires à leur suivi. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence permettant la réalisation d’un score basé sur ce qui a été décrit dans la littérature
Choix des espèces
L’utilisation de souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques préexistants de manière à suivre l’évolution de la sénescence. De plus, la souris est un modèle largement étudié par la communauté scientifique ce qui permet de comparer les résultats avec les autres laboratoires et d’utiliser certaines conditions comme témoin de la validité de nos résultats. Les procédures expérimentales étant très encadrées, les paramètres de douleur ou de souffrance éventuelle sont plus facilement contrôlables. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable.