Souris

4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection destinée à déclencher un cancer du foie, d'un volume équivalant à environ 9 % de leur poids corporel, qui dilate le foie et augmente le volume sanguin, puis jusqu'à quinze échographies hépatiques sous anesthésie et huit injections de traitements immunomodulateurs sur trois à six mois. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut dégrader l'état général des animaux, fatigue et perte de poids comprises. Les retombées annoncées se limitent à de futurs outils de diagnostic et de pronostic, le porteur affirmant que la souris est le "seul modèle préclinique" permettant d'éteindre ou d'activer des gènes tissu par tissu.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC, Carcinome Hépato-Cellulaire) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent à caractériser fonctionnellement les populations immunitaires notamment celles impliquées dans la réponse anti-tumorale. Ce projet sera axé sur les cellules lymphocytes. La compréhension de la fonctionnalité des cellules immunitaires servira de bases fondamentales pour le développement d’immunothérapie pour combattre le cancer du foie. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle d’acteurs clés de la réponse immunitaire, lors du développement du cancer du foie. Ces travaux pourraient ainsi permettre le développement de nouveaux outils diagnostic/pronostic pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Des animaux recevront une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer l’initiation tumorale (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs (4 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer la progression du cancer du foie (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 10 échos maximum) jusqu’à l’euthanasie à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons une injection qui peut provoquer un léger inconfort de courte durée, lié au passage de l’aiguille à travers la peau. De plus, le fait de maintenir l’animal pendant l’injection peut entraîner un stress temporaire. L’injection intra-veineuse comporte des risques de saignement local et/ou d’hématome. L’injection correspond à un volume de liquide équivalant à environ 9 pourcents du poids de l’animal. Elle peut provoquer une douleur passagère et entraîne une dilatation importante mais temporaire du foie (moins de 30 minutes), ainsi qu’une augmentation du volume total de sang. Lors de l’anesthésie par gaz utilisée pour l’échographie du foie, une baisse de la pression sanguine et de la température corporelle peut survenir. Enfin, la croissance prévue de la tumeur au niveau du foie pourrait entraîner une dégradation de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids, etc.).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 4032 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

Congeler du sperme et des embryons pour disposer d'un stock de secours des lignées de l'établissement : 550 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles subissent une vasectomie, les femelles un transfert embryonnaire par ouverture de l'abdomen, avec un risque d'hémorragie et d'arrêt cardiaque sous anesthésie que le porteur classe parmi les effets pouvant aller jusqu'au grave. Les mâles vasectomisés sont ensuite accouplés à des femelles pour déclencher leur ovulation et sont tués après plusieurs échecs successifs, les femelles porteuses étant gardées jusqu'au sevrage des petits. Le porteur présente cette gestion de stock comme une "alternative plus éthique" au maintien de lignées non utilisées, la finalité réelle restant l'intendance des lignées de l'animalerie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de cryoconserver des lignées murines de l'établissement utilisateur afin de disposer d’un stock dit de « backup » en cas de perte de la lignée ou pour toute autre nécessité, telle que la non-utilisation prolongée des lignées. Ces lignées pourront ainsi être redérivées ultérieurement dès que nécessaire (nouveaux projets, rafraîchissement ou perte de la lignée, etc.).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de proposer une alternative plus éthique au maintien ou au stockage de lignées non utilisées, autre que par la génération d’individus, afin de limiter fortement le nombre d’animaux mis à mort. Il en est de même pour le rafraîchissement de lignée, où plusieurs croisements (backcross) et donc plusieurs générations d’individus sont nécessaires avant l’utilisation des nouveaux animaux dits « rafraîchis » ou « backcrossés ».

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule de ces interventions (Procédures chirurgicales): vasectomisation ou transfert embryonnaire soit une seule chirurgie par animal et une fois seulement.

Impact sur les animaux

Pour la partie cryoconservation, des nuissances ou effets indésirables possibles de type légères à modérées sont attendues tels que: des douleurs ou du stress lié à l'injection, des effets liés aux hormones utilisées, ou des gênes dues à la stimulation de l’ovulation. Pour la partie redérivation (procédure chirurgicale), les effets secondaires peuvent aller de légers à graves, comme : un refroidissement important du corps pendant l’opération, pouvant provoquer un arrêt cardiaque à cause de l’anesthésie, des douleurs à cause de l’ouverture du ventre (gérées par des médicaments contre la douleur), un risque de saignement important si les vaisseaux sanguins ou les organes sont mal manipulés. Si cela arrive, l’animal est euthanasié. Après l’opération, les effets attendus sont en général légers à modérés : perte de poids importante (plus de 15 % en 3 jours), souvent causée par un manque d’activité ou d’appétit, signes de douleur ou d’inconfort (comme du stress ou un comportement apathique). Un outil spécial (le "Mouse Grimace Scale") est utilisé pour évaluer la douleur. Si l’animal souffre trop, il est euthanasié.

Devenir

Les animaux vasectomisés serviront tous à l'accouplement de stimulation des femelles ou seront mis au repos en vue du prochain accouplement. Les mâles ne donnant plus de résultats ( plusieurs échec successif aux accouplements) seront mis à mort. Les femelles ayant subit un transfert embryonnaire seront gardées jusqu'au sevrage des petits. Les femelles n'ayant pas subit de FIV seront réaccouplées jusqu'à l'obtention d'un bouchon vaginal.

Remplacement

Dans ce projet, nous cherchons à conserver et restaurer des lignées de souris génétiquement modifiées en congelant du sperme, des embryons ou des ovocytes, puis en les réimplantant pour faire naître de nouveaux animaux. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (en laboratoire, sur ordinateur ou sur tissus isolés) permettant de créer un animal vivant et fertile uniquement à partir de matériel génétique. Des techniques comme la culture cellulaire, la modélisation informatique ou les analyses moléculaires sont utilisées en amont pour vérifier la qualité du matériel et éviter de recourir inutilement à l’animal. Toutefois, pour obtenir des souris vivantes, le transfert d’embryons dans des femelles reste indispensable. L’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire à cette étape. Tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et leur souffrance : des méthodes alternatives (PCR, analyses informatiques, bases de données) sont privilégiées dès que possible pour réduire les procédures. La souche CBA/C57 a été choisie car elle s’occupe bien de ses petits, même en cas de petite portée, ce qui n’est pas toujours le cas chez d’autres souches.

Réduction

Ce projet vise à conserver des lignées de souris génétiquement modifiées ou présentant un intérêt particulier, en congelant leur sperme ou leurs embryons. À chaque étape, tout est fait pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant une conservation fiable du matériel génétique. a) Détermination du nombre d’animaux : Le nombre d’animaux nécessaires est basé sur les recommandations de réseaux spécialisés (EMMA, INFRAFRONTIER), les données historiques et les besoins techniques pour assurer une conservation réussie. Pour congeler du sperme : 2 à 3 mâles fertiles par lignée sont utilisés. Pour les embryons : les accouplements sont planifiés pour obtenir 40 à 50 embryons, en accord avec les standards (avec un taux de survie après décongélation supérieur à 90 %). b) Approche statistique : Aucune analyse statistique formelle n’est requise, car le projet ne teste pas d’hypothèses scientifiques. Le nombre d’animaux est défini de manière raisonnée, en s’appuyant sur l’expérience, des protocoles optimisés et les bonnes pratiques partagées dans la communauté scientifique. c) Réduction du nombre d’animaux : Plusieurs mesures concrètes permettent de réduire le recours aux animaux : Études pilotes pour vérifier à l’avance la qualité des échantillons, selection du génotype le plus adapté (homozygote ou hétérozygote) pour éviter de produire des animaux inutilisables, mutualisation des procédures entre équipes travaillant sur les mêmes lignées, réutilisation d’animaux quand c’est possible, production limitée aux seuls animaux nécessaires ; par exemple, les femelles ne sont produites que si elles sont requises pour une procédure.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera vérifié deux fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, par du personnel formé. Lors des interventions chirurgicales, une anesthésie générale et des traitements contre la douleur seront systématiquement appliqués et adaptés au cas par cas après l’intervention. Une attention particulière sera portée à la phase de réveil : les animaux seront placés dans un environnement chaud, sécurisé et confortable. Un suivi post-opératoire régulier sera effectué à l’aide d’outils validés pour évaluer leur état de santé et ajuster les soins si nécessaire. Des mesures de confort seront systématiquement mises en place : cage chauffée, enrichissement du milieu de vie, réduction du stress et des manipulations. En cas de douleur persistante ou de souffrance malgré les soins, des actions complémentaires seront envisagées, y compris une euthanasie si nécessaire, dans le respect des règles en vigueur.

Choix des espèces

Les lignées transéniques à conserver étant murines, cette espèce n'est donc pas rempaçable. Les mâles pour la vasectomie seront utilisés à 8 semaines de vie et les femelles entre 8-10 semaines, la maturité sexuelle devant être atteinte pour pouvoir réaliser la procédure.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant huit anesthésies gazeuses totalisant quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées dans le cerveau au cours d'une intervention de trente-cinq minutes, suivies de deux injections d'un virus modifié et de trois séances d'imagerie nucléaire avec produit radioactif. Le porteur retient la souris parce que sa petite taille permet de réduire les quantités de radioactivité injectées. Il annonce comme bénéfice attendu une régression tumorale sans perte de poids ni effet secondaire notable, alors que les nuisances listées dans le même document comprennent une perte de poids, une encéphalite induite par le virus et des troubles de l'équilibre.

Objectifs

Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes (tumeur cérébrale) repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales. L’objectif du projet est de montrer que l’utilisation de ce vecteur viral conduit à l’élimination ou la régression de tumeurs obtenues par l’injection des cellules tumorales directement dans le cerveau via une administration intraveineuse. Ceci représenterait une avancée importante pour le traitement des patients. Le suivi de l'effet théraputique ce traitement sera réalisés en imagerie nucléaire avec l'injection de molécules radio-actives ciblant spécifiquement la tumeur.

Bénéfices attendus

Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005 avec un taux de survie à 5 ans qui n’excède pas 5%. Il est donc indispensable d’améliorer la prise en charge de cette maladie. Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus testé (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable lors d'une administration systémique.

Procédures

Chaque animal sera sourmis à 1) 8 anesthésies gazeuses d'une durée de 3 à 30 minutes soit un total de 90 minutes sur la durée de l'étude, 2) une intervention chirurgicale (injection de cellules cancéreuses ) d'une durée de 35 minutes maximum, 3) 3 séances d'imagerie sous anesthésie d'une durée de 14 minutes chacune, 4) 2 injections de virus d'une durée de 4 minutes maximum

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection (72h maximum) , - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus, - trouble de l’équilibre induit par la tumeur grossissante

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus utilisés a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le virus non modifié n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus modifié permet une infection 210 fois plus sélective des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des 2 virus à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire

Réduction

L’imagerie TEP (Tomographie à Emission de Positon) est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. les injections de cellules et les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie générale. Une analgésie pré et post opératoire est également administrée lors de la chirurgie. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.

Choix des espèces

Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 semaines conformément à la littérature et aux protocoles expérimentaux déjà réalisés dans les projets précédents pour valider l'efficacité de ces virus dans le traitement du glioblastome

Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 6 030 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections, subissent une chirurgie sous anesthésie et sont placées jusqu'à cinq fois en cage métabolique pendant six heures pour la collecte d'urine, avec une échographie cardiaque dans un second établissement. L'hypertension artérielle maligne induite peut atteindre le cœur, les reins et la rétine, et les souris hypertendues urinent assez pour imposer un changement de cage fréquent. Le porteur justifie l'effectif de 6 030 par un plan expérimental stéréotypé et conclut que le recours au modèle animal est "nécessaire", la culture cellulaire ne reproduisant pas les interactions entre organes.

Objectifs

L’hypertension artérielle maligne est définie par l’association d’une tension artérielle élevée à des signes objectifs de l’atteinte des organes cibles de l’hypertension artérielle : reins, cerveau, rétine, coeur. Les objectifs du projet seront d'étudier une voie protectrice des vaisseaux sanguins dans l'hypertension artérielle. L’intérêt de ce projet est donc de comprendre deux systèmes modifiant la tolérance des vaisseaux sanguins à l’hypertension artérielle en particulier dans le coeur et les reins. Le projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aboutir à l'identification de paramètres sanguins et de variants génétiques qui pourraient être des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. Si l'hypothèse proposée se confirme, ceci pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'une hypertension artérielle maligne.

Procédures

Etablissement 1: Injections (5 x 30 secondes), chirurgie légère sous anesthésie générale avec analgésie (1 x 5 minutes), prélèvement d'urine en cage métabolique ( jusqu'à 5 fois, 6h à chaque fois), prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois au moment de la mise à mort). Etablissement 2: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (1 fois 20 minutes)

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines). Stress lié au transport des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus

Remplacement

Différentes approches sont utilisées pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'hypertension artérielle comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi le recours au modèle animal est nécessaire, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un maximum d'organes d'intérêt par animal est prélevé afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront élévés en cages enrichies et surveillés quotidiennement pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées dès que nécessaire. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasives, sont réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, le modèle d'hypertension artérielle utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Nous utilisons des souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux

Des cellules tumorales leur sont injectées dans le cerveau, puis la tumeur est retirée par chirurgie et remplacée par un gel chargé de médicaments : 1 512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à six injections thérapeutiques et quatre injections d'agents d'imagerie, avec deux prélèvements sanguins par séance. Le porteur décrit une combinaison de radiothérapie, d'immunothérapie et d'ultrasons destinée à traiter les récidives de glioblastome après opération, les retombées pour les patients restant annoncées comme une survie prolongée et une meilleure qualité de vie. Il annonce quatre sessions d'imagerie au maximum et écrit dans le même paragraphe que chaque animal pourra être examiné jusqu'à six fois.

Objectifs

Le glioblastome est la forme la plus fréquente et la plus agressive de tumeur cérébrale primaire. Son taux élevé de récidive, associé à une survie médiane inférieure à un an, souligne la difficulté à traiter efficacement cette pathologie. Bien que la résection chirurgicale demeure la principale approche pour réduire la masse tumorale et soulager les symptômes, elle ne permet jamais une élimination complète de la tumeur. En effet, des cellules tumorales résiduelles, souvent localisées aux marges de la zone réséquée, contribuent inévitablement à la récidive du cancer. De plus, la chirurgie engendre des modifications substantielles de l’environnement tumoral, favorisant la prolifération, la migration et la résistance des cellules tumorales, ce qui rend encore plus complexe la mise en place d’un traitement efficace. C’est dans ce contexte que le projet proposé cherche à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour traiter le glioblastome. L’objectif est de combiner différentes approches : notamment la radiothérapie externe et interne, ainsi que des immunothérapies administrées soit localement sous forme de gel biodégradable, soit par injection. Une dimension supplémentaire de ce projet est l’utilisation d’une technique d’ultrasons thérapeutiques, qui doit favoriser le passage dans le cerveau des médicaments immunothérapeutiques et ainsi renforcer leur efficacité. Deux approches principales seront visées par la radiothérapie: d’une part, en ciblant le côté prolifératif et immunosuppresseur de la tumeur, et d’autre part en ciblant certaines voies métaboliques de la tumeur. Ces thérapies seront testées en combinaison ou non à des immunothérapies ciblées combinées ou non à des ultrasons thérapeutiques. L'efficacité de ces approches sera évaluée grâce à des techniques d’imagerie avancées, qui permettront de suivre de près la réponse biologique des tumeurs et d’ajuster le traitement de manière personnalisée. L’objectif final est de proposer une solution qui combine diagnostic et thérapie, les deux supervisés par l’imagerie, afin d’optimiser l’efficacité des thérapies tout en surmontant les résistances aux traitements traditionnels du glioblastome.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à répondre à des enjeux cliniques cruciaux concernant le glioblastome Bénéfices pour la recherche : • Compréhension accrue des mécanismes tumoraux post-chirurgie : La première phase du projet permettra d’étudier comment la chirurgie influence le microenvironnement tumoral. Ces données permettront de développer des stratégies pour minimiser les récidives tumorales après la chirurgie. • Évaluation préclinique de nouveaux outils thérapeutiques : Grâce à des technologies avancées, telles que l’imagerie TEP, l’imagerie optique et les gels vectorisant les traitements, ce projet validera de nouvelles combinaisons thérapeutiques associant immunothérapie, immunostimulation et radio-immunothérapie interne, offrant ainsi des alternatives aux traitements conventionnels. • Mise au point des traitements personnalisés : Les résultats obtenus contribueront à l’élaboration de thérapies plus ciblées et plus efficaces contre les cellules tumorales résiduelles, réduisant ainsi les récidives post-chirurgicales. • Validation et Optimisation des ultrasons thérapeutiques : L'intégration des ultrasons thérapeutiques avec des traitements ciblés pourrait améliorer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, augmentant ainsi la concentration d’agents thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales et l’efficacité du traitement. Cette approche peut s’adresser à d’autres pathologies du système nerveux central. Bénéfice pour le patient : • Prolongation de la survie des patients . • Améliorer la qualité de vie des patients. L'utilisation de gels biodégradables pour une administration localisée, ainsi que l’optimisation des traitements systémiques, permettra de réduire les effets secondaires liés à l’utilisation de molécules toxiques.

Procédures

Les interventions suivantes auront lieu : • Mise en place du modèle tumoral (45 minutes, 1 injection par animal) : Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau pour induire la formation de tumeurs. Cette intervention est réalisée sous anesthésie générale. • Injection d’agents d’imagerie (5 minutes par injection, maximum 4 injections par animal au total car 4 sessions d'imagerie, séparées de 2 à 3 jours minimum) : • Injection d’agents thérapeutiques (5 minutes par injection, maximum 6 injections par animal) : Les traitements seront administrés tous les deux à trois jours pendant environ deux semaines, sous forme d'injections systématiques pour tester l’efficacité des thérapies ciblées. • Ablation tumorale (environ 30 minutes) : Une ablation tumorale sera réalisée sous anesthésie pour retirer la tumeur, avec une vérification de l’étendue de la résection tumorale via des techniques d’imagerie. • Application d’un gel biodégradable (15 minutes) : Après la résection tumorale, un gel biodégradable contenant des agents thérapeutiques sera appliqué directement dans la cavité tumorale avant la fermeture chirurgicale. Ce gel permettra une libération localisée et prolongée des traitements, ciblant les cellules tumorales résiduelles. • Sessions d’imagerie (15 à 70 minutes, maximum 4 sessions) : elles servent à surveiller la progression tumorale et évaluer l’efficacité des traitements. Elles sont réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal pourra être examiné jusqu’à six fois à des moments différents pour un suivi dynamique des agents thérapeutiques et des marqueurs tumoraux. • Prélèvement sanguin (maximum 5 minutes, 2 fois par session d’imagerie);

Impact sur les animaux

Les procédures prévues dans ce projet peuvent entraîner différentes formes de nuisances pour les animaux, qui seront attentivement surveillées et documentées. Ces effets sont inhérents aux expérimentations et varient en fonction des interventions spécifiques : - Douleur et inconfort liés aux procédures chirurgicales Les résections tumorales et implantations nécessitent des interventions chirurgicales, potentiellement associées à des douleurs post-opératoires modérées. Une réduction temporaire de la mobilité et une inactivité peuvent être observées pendant les 2 à 3 jours suivant la chirurgie. Les douleurs post-opératoires devraient s’estomper dans les 48 à 72 heures suivant la chirurgie. - La croissance tumorale peut impliquer des problèmes neurologiques notamment quand la tumeur atteint un volume ou une prolifération trop importante pouvant induire une inactivité ou une mobilité réduite.Effets secondaires des traitements Les traitements immunostimulateurs peuvent induire une inflammation locale ou systémique, avec des symptômes comme la fièvre, la fatigue ou un stress métabolique (déséquilibre entre les besoins énergétiques et les ressources disponibles). La radio-immunothérapie interne peut provoquer une toxicité systémique légère à modérée, avec une possible perte de poids transitoire (jusqu’à 10 %), une diminution de l’activité et un changement comportemental. - Effets liés aux techniques d’imagerie Les anesthésies répétées pour l’imagerie multimodale peuvent générer un stress physiologique, une inactivité temporaire et un ralentissement de la reprise alimentaire après chaque session. Les ultrasons thérapeutiques, bien que non invasifs, pourraient entraîner des douleurs légères ou un inconfort transitoire au niveau des tissus ciblés. Les effets secondaires des traitements et des imageries seront surveillés et devraient se résorber en 2 à 3 jours, selon la gravité. - Stress général et comportements anormaux Les animaux peuvent présenter du stress comportemental (agitation, repli, diminution de l’interaction sociale) en raison des manipulations répétées et des injections. Une acclimatation rigoureuse aux conditions expérimentales est prévue pour réduire ces effets.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d’extraire les organes et réaliser les différentes analyses ex vivo pour améliorer les compréhensions mécanistiques.

Remplacement

Actuellement, aucune alternative totalement fiable et valide aux modèles animaux n’existe pour reproduire la complexité du microenvironnement tumoral et et de tous les mécanismes pathologiques mis en jeu dans le glioblastome. Les modèles in vitro (lignées cellulaires ou organoïdes) et in silico permettent d’étudier des aspects isolés que nous exploitons afin de sélectionner au mieux les traitements que nous proposons. Mais ils ne peuvent pas reproduire cette complexité propre aux organismes vivants. Pour bien évaluer les rechutes de tumeur après une opération, il faut que le système immunitaire fonctionne normalement. Cela n’est pas possible dans des modèles en laboratoire (in vitro), car ils ne reproduisent pas toute la complexité du corps humain. Par exemple, la façon dont les cellules immunitaires atteignent la tumeur ou réagissent aux traitements (comme l’immunothérapie ou la radiothérapie ciblée) dépend de structures importantes comme la barrière qui protège le cerveau (barrière hématoencéphalique). Les techniques d’imagerie biomédicale que nous employons requièrent un fonctionnement organique préservé pour permettre une analyse fiable de la distribution des traitements et de leur efficacité.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour être le plus petit possible tout en étant suffisamment grand pour garantir une puissance statistique suffisante des données qui seront collectées. Les groupes sont composés de 12 animaux, un effectif défini pour détecter des différences significatives dans les paramètres mesurés (volume tumoral, biomarqueurs d’imagerie, survie). De plus, le choix a été fait de suivre les paramètres mesurés par imagerie longitudinale, qui contrairement à d’autres méthodes permet de faire plusieurs mesures des paramètres au cours du temps sur un seul animal. Un soin particulier est apporté à la sélection des modèles tumoraux de manière à limiter l’étude sur animal aux modèles les plus pertinents. Enfin, les protocoles expérimentaux sont standardisés pour minimiser la variabilité inter-individuelle et limiter le nombre de groupes nécessaires.

Raffinement

Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures : - Surveillance accrue : Les animaux seront monitorés régulièrement pour détecter rapidement tout signe de douleur ou de stress. Des grilles de score validées seront utilisées pour évaluer leur état général. - Gestion de la douleur : Des analgésiques adaptés, seront administrés systématiquement en postopératoire, en complément des anesthésiques utilisés pendant les procédures. - Soins postopératoires : Une attention particulière sera portée aux soins après chirurgie, avec hydratation, alimentation enrichie et contrôle des plaies pour éviter toute infection. - Habituation préalable : Les animaux seront habitués aux manipulations et à l’environnement expérimental, réduisant ainsi leur stress lors des procédures. Ces mesures assurent en plus la qualité des données recueillies. Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures. Des points limites ont également été définis afin de permettre une prise en charge rapide ou un arrêt anticipé si nécessaire.

Choix des espèces

Les espèces utilisées dans ce projet sont des souris, qui sont largement reconnues pour leur pertinence dans les recherches sur le glioblastome. Sur le plan scientifique, les souris utilisées dans nos recherches permettent de reproduire différentes situations proches de ce qui se passe chez l’humain. Certaines souris ont un système immunitaire affaibli: elles permettent d’implanter des tumeurs humaines et de tester des traitements ciblés sans que leur système immunitaire ne les rejette. D’autres, avec un système immunitaire intact, sont utiles pour étudier la réaction du corps face à une tumeur ou à un traitement. En combinant ces différents modèles, on peut mieux comprendre la maladie et évaluer les thérapies dans des contextes variés. Du point de vue technique, les souris sont particulièrement adaptées aux systèmes d’imagerie utilisés dans ce projet, tels que la tomographie par émission de positrons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et l’imagerie par fluorescence. Leur taille permet d’intégrer des équipements d’imagerie avancés, tout en facilitant des manipulations chirurgicales précises et reproductibles. En outre, ces animaux sont bien caractérisés en termes de biologie et d’éthologie, ce qui garantit une évaluation éthique rigoureuse et une minimisation des nuisances associées aux expérimentations. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris âgées de 6 à 10 semaines au moment de la chirurgie. L’âge choisi permet de travailler avec des animaux à un stade de développement adolescent à adulte, ce qui est en adéquation avec l’âge moyen des sujets humains concernés par la pathologie. Les animaux seront reçus à un âge minimal de 4 semaines et bénéficieront d’une période d’acclimatation d'au moins une semaine après leur livraison. Cela permettra de réduire le stress et d’assurer que les animaux sont dans un état optimal avant les interventions expérimentales.

Tuées en fin de procédure pour que leurs tissus et organes passent en analyse post-mortem, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du foie de deux heures sous anesthésie et analgésie, une autre un jeûne de douze heures en hébergement individuel, une autre vingt-quatre heures en cage métabolique sur grille, avec un risque de lésions aux pattes reconnu par le porteur. Des traitements antibiotiques ou des polyamines sont administrés dans l'eau de boisson pendant sept ou vingt-huit jours. L'hépatite ischémique visée touche entre 0,5 et 1,3 % des admissions hospitalières, et les molécules testées, censées reproduire les effets du jeûne, n'ont pour l'instant été sélectionnées qu'in vitro.

Objectifs

L’autophagie est un processus naturel essentiel, présent chez tous les êtres vivants, qui permet aux cellules de se nettoyer et de fonctionner correctement. Elle aide aussi les cellules à s’adapter en situation de stress. Lorsque l’autophagie ne fonctionne pas bien, cela peut contribuer au développement de maladies comme le diabète, certaines maladies neurologiques ou certains cancers. Le jeûne (ou restriction calorique) est un moyen naturel d’activer l’autophagie. Dans nos recherches, nous avons identifié des composés capables de reproduire les effets bénéfiques du jeûne, en particulier sur l’activation de ce mécanisme. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de ces composés, appelés polyamines, sur le foie, et de voir s’ils pourraient aider à prévenir une atteinte grave du foie appelée hépatite ischémique, en utilisant des modèles expérimentaux chez la souris.

Bénéfices attendus

L’hépatite ischémique est une maladie grave du foie causée par un manque d’oxygène ou de sang. Il s’agit d’une affection relativement rare (incidence entre 0.5 et 1.3 pourcent des admissions hospitalières), mais qui entraîne la mort des cellules du foie et peut avoir des conséquences très graves : plus d’un patient sur deux décède dans les six mois. Il s’agit donc d’un véritable enjeu de santé publique. Ce projet vise à étudier si certaines molécules naturelles, appelées polyamines, peuvent protéger le foie contre ce type de lésion. L’objectif est aussi d’identifier de nouvelles pistes pour mieux prévenir ou traiter cette maladie à l’avenir.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à un jeun non strict de 12 heures et hébergés seule mais sans isolement sensoriel (une seule fois). Une partie des animaux sera soumise à des traitements antibiotiques ou avec des polyamines via eau de boisson pendant 7 ou 28 jours. Une partie des animaux recevra une seule administration d’un traitement (moins de 1 minute par animal vigile). Une partie des animaux sera mise pour 24 heures (une seule fois) dans des cages métaboliques (sur grilles) afin de recueillir les urines produites. Une partie des animaux sera soumise (une seule fois) à une procédure de chirurgie au niveau du foie (animal sous anesthésie et analgésie, acte de 2 heures /animal).

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeun (pour 12 heures) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une sensation de faim, une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. La stabulation sur grille pourrait induire des lésions aux pattes. L’hébergement individuel peut induire du stress. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie. Les animaux seront euthanasiés, à la fin des procédures, par une méthode réglementaire en vue des prélèvements d’organes.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nos recherches ont permis d’identifier et de sélectionner in vitro des molécules (des polyamines naturelles), capables de mimer les effets biochimiques du jeûne et d’activer l’autophagie, un mécanisme physiologique essentiel, qui joue un rôle clé dans le maintien de l’équilibre cellulaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines sur le foie et la réponse à la modulation du microbiote intestinal. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la chirurgie hépatique ainsi que la modulation du microbiote intestinal vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Pour sa réalisation, des groupes homogènes d’animaux seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis chauffants). Lors de la chirurgie, l’asepsie et la stérilité du matériel seront respectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant les procédures, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.