Souris
Etude de la perturbation de production de derives reactifs de l’oxygene sur la maturation astrocytaire au cours du developpement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 180 mises à mort dans les quarante-cinq minutes suivant une injection sous anesthésie générale. Les autres reçoivent une injection à un, deux, trois ou quatre jours de vie, sur nouveau-né vigile, que le porteur déclare sans douleur et sans nécessité d'anesthésie. Ces animaux sont modifiés génétiquement pour altérer la production de dérivés réactifs de l'oxygène dans leurs seuls astrocytes, et leurs cerveaux sont prélevés à cinq stades, de cinq à soixante jours après la naissance. Le bénéfice annoncé se limite à des connaissances nouvelles sur le développement cérébral et vasculaire et à l'identification de cibles mitochondriales, sans application énoncée.
Objectifs
Le cerveau contient différents types de cellules, dont des cellules appelées astrocytes. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en particulier dans la communication entre les neurones et l’apport de nutriments depuis les vaisseaux sanguins. Certaines substances produites naturellement par les cellules, appelées dérivés réactifs de l’oxygène (ou ROS), sont impliquées dans le bon développement et le fonctionnement des astrocytes. Bien que souvent associées au stress cellulaire, ces molécules ont aussi des effets bénéfiques, que ce projet vise à mieux comprendre. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris modifiées génétiquement, dans lequel la production de ROS est altérée uniquement dans les astrocytes. Dans ce projet nous souhaitons évaluer le rôle des ROS dans la maturation des astrocytes en analysant le réseau mitochondrial, le niveau d’expression de gènes impliqués dans la maturation ; mais également la morphologie de ces cellules. Toutes nos analyses seront réalisées à plusieurs stades le naissance jusque chez l'adulte et prendra en compte le sexe de l'animal. Le projet nécessite l'utilisation de 340 animaux sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Aucune étude à ce jour n'a étudié l'importance des ROS astrocytaires sur le développement du système nerveux central. Or les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme des cellules et permettent leur bon développement. Cette étude permettra d'identifier de nouvelles cibles spécifiques de ces mitochondries astrocytaires et ainsi apporter de nouvelles connaissances sur le développement cérébral et vasculaire.
Procédures
Deux interventions seront utilisées dans ce projet. 1) Injection chez des nouveaux-nés de 1, 2 et 3 jours ou au 4ème jour après la naissance en fonction du modèle utilisé. L'injection dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. Nombre d'animaux concernés : 340 animaux. 2) Injection à différents temps de développement après la naissance sous anesthésie générale pour visualiser le système vasculaire. Les animaux seront ensuite immédiatement mis à mort sous anesthésie générale. Nombre d'animaux concernés : 180 animaux. Le temps de procédure comprend à la fois l'induction (analgésie et anesthésie), l’injection et la mise à mort, cette procédure n'excède pas 45 minutes.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront une injection pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. Les lignées d'animaux sont déjà existantes et n'induit pas de changement de phénotype.
Devenir
Les animaux utilisés pour les différentes étude (histologiques, cytométrie en flux et biochimique) seront mis à mort afin de préléver les cerveaux et de faire nos analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. De plus l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées à cette étude est uniquement chez la souris. Il n’existe pas d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. Ces points évaluent le bien-être des animaux en se basant sur leur apparence physique, leur mobilité, la prise alimentaire et la présence de nid. Une note de 0 à 3 est attribuée pour chaque critère et le score total permet d’établir un plan d’action pour maintenir/rétablir le bien-être de l’animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. Une observation particulière des animaux les jours suivants une intervention sera réalisée. La manipulation des nouveau-nés sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Leur génome est entièrement caractérisé, ce qui permet la création de lignées génétiquement modifiées spécialement adaptées pour l’étude de nos questions biologiques. De tels modèles n’existent pas chez d’autres espèces. Les animaux seront utilisés à 4 ou 5 stades de développement post-natals : 5 jours, 10 jours, 15 jours, 30 jours et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moments clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de modèles murins génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Coupe de l'extrémité de la queue ou de l'oreille, sur animal vigile, cinq secondes : 600 souris subissent ce prélèvement dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Cinq cents d'entre elles passeront ensuite dans d'autres projets, les autres sont tuées après avoir servi à maintenir la lignée. Ces prélèvements servent à génotyper des souris modifiées pour quantifier l'élimination des mitochondries anormales, une lignée que l'établissement veut obtenir et conserver dans un fond génétique pur. Le porteur écarte les méthodes non invasives par follicules pileux, fèces ou écouvillonnage buccal, qu'il déclare "pas toujours adaptées" et "souvent sources de contaminations", sans dire lesquelles ont été essayées ni sur quelles données il conclut.
Objectifs
Ce projet a pour objectif l'obtention et le maintien d'une lignée murine dans un fond génétique pur. Cette lignée murine permet de quantifier le processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales. Les mitochondries sont de petites structures à l'intérieur d'une cellule qui jouent un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires. L'obtention et le maintien de cette lignée nécessitent obligatoirement le recours au génotypage (= méthode utilisée pour la caractérisation génétique de modèles murins génétiquement modifiés) et au marquage des souris, permettant ainsi une identification unique de chaque souris en évitant le risque de confusion quant à l'identité et au génotype de l'animal. Il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins expérimentaux. Pour ce faire, il est nécessaire d'identifer les animaux et de les génotyper. Cependant, dans certaines situations, il n'est pas possible de réaliser les actes d'identification et de prélèvement de tissus indispensable au génotypage en un seul geste. Le reccueil de tissus pour le génotypage par des méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fécès ou par un écouvillonnage buccal ne sont pas toujours adaptées aux conditions de diagnostics moléculaires utilisés et sont souvent sources de contaminations affectant les résultats. Cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter les prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L'objectif de ce projet est donc de permettre l'identification et le prélèvement de tissus pour réaliser le génotypage des animaux génétiquement modifiés lorsque celui-ci ne peut pas être couplé à une méthode de marquage.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvement de tissus pour génotypage et identification des animaux à l'aide d'une bague mise à l'oreille (avec un numéro unique permettant d'identifier de manière individuelle tous les animaux) permet une sélection des animaux d'intérêt et permet également d'optimiser la gestion et l'élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront utilisés pour les expérimentations. De plus, le génotypage par prélèvement de l'extrêmité de la queue ou de l'oreille permet de minimiser les risques de contamination entre échantillons. Ces prélèvements sont des méthodes de génotypage de gravité légère. Lorsqu'ils sont scientifiquement justifiés, ils représentent le meilleur compromis en accord avec les principes de réduction et de raffinement.
Procédures
Le prélèvement de l'extrémité de la queue ou de l'oreille (durée 5 secondes) est réalisé sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l'extrêmité de la queue ou de l'oreille entraine une douleur légère de courte durée. Dans de très rares cas, un saignement léger de la plaie peut survenir. La contention de l'animal lors du prélèvement peut engendrer un stress léger. De manière exceptionnelle, une infection au niveau du tissu prélevé peut survenir.
Devenir
- Une partie des animaux sera gardée en vie pour être utilisés dans d'autres procédures expérimentales (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - Une partie des animaux sera utilisée pour maintenir la lignée, puis mis à mort.
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition pour des projets scientifiques de modèles génétiquement modifiés. Le remplacement ne se situe donc pas directement à ce niveau mais en amont lors du choix du modèle. Dans nos conditions de production et de maintien de lignées génétiquement modifiées, la biopsie à l'extrêmité de la queue ou de l'oreille pour le génotypage, associée à la pose d'une bague auriculaire pour l'identification, constitue la méthode la plus performante, fiable, unique et durable.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les plans d'élevage et de maintien de la lignée murine sont définis en amont dans le but de réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux génotypés.
Raffinement
Le raffinement pour ces techniques est de s'assurer d'avoir un process cadré et éprouvé qui sera appliqué par des techniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l'intensité et la durée de la douleur induite par la biopsie. Les outils de prélèvements sont soigneusement nettoyés et désinfectés. Les bagues d'identification sont à usage unique et désinfectées. Une fois le prélèvement réalisé, l'animal est remis dans sa cage et observé pour vérifier qu'il se déplace correctement et qu'aucun signe de souffrance ou de détresse n'est visible. Un suivi quotidien post-biopsie sera réalisé. Si une infection survient au niveau de la plaie, une solution antiseptique de type vétédine sera appliquée sur la plaie jusqu'à la guérison.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui permettra, dans la mesure du possible, d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux âgés d'au moins 21 jours.
Analyse de la fonction musculaire : étude pré-clinique des effets de produits alimentaires ou de molécules pharmacologiques sur le modèle de la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages ou des injections sous-cutanées, intrapéritonéales ou intramusculaires jusqu'à sept jours par semaine pendant quatre semaines, et un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les quinze jours. Le porteur annonce des tests moteurs et comportementaux susceptibles de provoquer un stress léger à modéré et une fatigue passagère, sans préciser lesquels. L'objet réel du projet reste l'évaluation préclinique de quinze produits en cinq ans pour l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, un passage chez la souris que le porteur qualifie d'"indispensable" pour mesurer les effets sur "l'ensemble de l'organisme".
Objectifs
Les muscles squelettiques assurent de nombreuses fonctions au sein de l’organisme. Aussi, leurs altérations peuvent avoir des répercussions sur la fonction motrice et la qualité de vie des patients. L’industrie du secteur agroalimentaire ou pharmacologique s’oriente vers le développement de produits qui visent à diminuer les états de fatigue ou de faiblesse musculaire. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer au niveau pré-clinique l’efficacité de nouveaux produits, alimentaire ou pharmacologique, pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, nous envisageons de tester 15 produits en 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à évaluer les effets d’approches thérapeutiques innovantes sur la fonction musculaire chez la souris, dans un objectif de transfert vers des populations humaines souffrant de troubles musculaires, notamment les patients atteints de pathologies neuromusculaires et les personnes âgées présentant une perte de la fonction musculaire. L'utilisation du modèle murin permettra également de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dégradation de la fonction musculaire. Les connaissances acquises contribueront à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'élaboration de stratégies innovantes pour préserver ou restaurer la masse et la fonction musculaire. À terme, les résultats obtenus pourront ainsi déboucher sur le développement de traitements efficaces, améliorant significativement la qualité de vie des patients concernés.
Procédures
(1) Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse - Fréquence maximale : 1 prélèvement tous les 15 jours ; durée : 5 min maximum (pous tous les animaux) (2) Gavage - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par gavage) (3) Injection sous-cutanée - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection sous-cutanée) (4) Injection intrapéritonéale - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection intrapéritonéale) (5) Iinjection intramusculaire sous anesthésie gazeuse : fréquence maximale : 5/7j sur une semaine, 1/7j sur 4 semaines ;- durée : 10 min maximum (pour les animaux traités par injection intramusculaire).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus aux modalités d’administration retenues ou aux prélèvements de sang réalisés au cours du protocole. Les nuisances attendues sur les animaux sont : (1) inflammation transitoire au niveau du site d’injection (2) fausse-route ou blessure du tractus digestif dans le cas d’administration par gavage (3) traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang (4) risque infectieux liés à la réalisation de gestes invasifs. Les tests moteurs et comportementaux peuvent induire un stress léger à modéré du fait de la manipulation des animaux et leur isolement temporaire, ainsi qu'un fatigue passagère du fait de la répétition des mesures.
Devenir
A la fin de la durée du traitement, les animaux seront euthanasiés. Plusieurs muscles squelettiques seront ensuite rapidement prélevés pour étudier leur fonctionnalité.
Remplacement
Dans le cadre d’évaluation préclinique d’une nouvelle approche thérapeutique, le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est limité autant que possible, tout en garantissant des résultats fiables. En raison de la variabilité attendue des réponses aux traitements testés, 15 souris par groupe ont été prévues. Ce nombre permet de détecter des différences significatives entre groupes tout en respectant le bien-être animal et en limitant le nombre d'animaux. Il est basé sur nos expériences passées, où des différences de 20 à 30 % entre groupes ont pu être observées avec ce type d’effectif. Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter encore le nombre d’animaux : (1) Utilisation de produits déjà connus comme sûrs (2) Choix réfléchi des groupes de comparaison (3) Suivi répété des mêmes paramètres chez chaque animal (4) Réalisation de tests multiples sur les mêmes animaux, sans nuire à leur bien-être (5) Combinaison de tests in vivo et in vitro sur les mêmes animaux (6) Réutilisation des données de groupes témoins dans des expériences similaires (7) Mutualisation des données issues de groupes recevant un produit de référence.
Raffinement
Les nuisances ou effets indésirables attendus étants principalement dus aux modalités d’administration des produits à tester, des méthodes moins stressantes et moins invasives seront utilisées, tout en tenant compte des contraintes liées au composé à tester (solubilité, stabilité, dose/volume…), les objectifs de l’étude et la pharmacocinétique souhaitée : Liste des actions pour réduire la douleur et le stress des animaux liées au traitement : - Conditionnement positif des animaux à la manipulation/méthode d’administration - Utilisation préférentielle des voies orales volontaires (eau de boisson/alimentation) - Remplacement du gavage par la technique d'administration guidée par micropipette dès que possible - Remplacement des injections intrapéritonéales par des injections sous-cutanés, sans contention. Les méthodes utilisées pour étudier la fonction musculaire des animaux sont validées et non invasives, des périodes d’acclimatation et d’habituation sont systématiquement effectuées. Lors de la réalisation des tests, un renforcement positif par récompense est mis en place pour limiter le stress des animaux. Liste des actions pour réduire la douleur et souffrance des animaux liées aux tests d’exploration de la fonction musculaire - Choix de tests non invasifs pour analyse in vivo de la fonction musculaire, - Prélèvement de sang effectué sous anesthésie générale, - Observation quotidienne des animaux : définition de points d’arrêts anticipés pour identification des souris souffrantes (aspect et comportement général, poids…), exclusion du protocole et euthanasie des animaux ayant atteints ces points d’arrêt. Liste des actions pour réduire l’angoisse des animaux tout au long du protocole - condition d’hébergement selon réglementation, - réalisation des tests fonctionnels et prélèvements dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement, - familiarisation des animaux avec dispositifs expérimentaux avant les essais, - renforcement positif : récompense de l’animale suite à la réalisation des essais, - un expérimentateur et un soigneur dédiés.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul permettant une évaluation de la fonction motrice dans sa globalité. Au stade préclinique, ce modèle permet également de voir non seulement les effets d’un composé sur le système ou une fonction d’intérêt mais également les effets sur l’ensemble de l’organisme. La souris est également un bon modèle pour ce type d’étude incluant de nombreux tests in vivo d’exploration fonctionnelle du fait de sa docilité et de son aptitude à effectuer les différents exercices. Aussi, sa longévité en fait un modèle de choix pour l’analyse des conséquences du vieillissement, modèle validé par des études antérieures. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction de la nature du projet : Souris de 5-6 semaines pour les souris adultes Souris âgées de de 18 à 24 mois d’âge, pour le modèle d’altération lié à l’âge avec une fonte importante de la masse musculaire (degrés d’atteinte en fonction de l’âge retenu).
Evaluation de l’effet de candidats médicaments sur la fonction cardiaque dans un modèle rongeur d’insuffisance cardiaque diastolique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
Rats : 1170
2 340 rongeurs, 1 170 souris et 1 170 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Une injection d'un composé qui bloque la production de monoxyde d'azote et un régime riche en graisses leur provoquent une insuffisance cardiaque : leur cœur se remplit mal, ils prennent du poids, se fatiguent, ont du mal à bouger et peuvent peiner à atteindre mangeoires et biberons. Ils subissent des prises de sang éveillés, dont certaines après une incision du bout de la queue, une échographie cardiaque mensuelle sous anesthésie, un jeûne de six heures, puis une ouverture du thorax sous anesthésie pour mesurer la pression dans le cœur avant leur mise à mort. Le bénéfice annoncé est une "preuve de concept", avec de nouvelles stratégies thérapeutiques qui "pourront être testées en clinique", indique le porteur. Sur le remplacement, il écrit : "L'utilisation d'un modèle animal est essentielle pour étudier l'insuffisance cardiaque", parce qu'elle permet d'analyser un composé "dans un organisme entier".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une maladie progressive qui se caractérise par une incapacité du cœur à assurer un débit de sang suffisant pour couvrir les besoins du corps en oxygène, d’abord en cas d’effort puis même au repos. Il existe 2 formes d’insuffisance cardiaque. La première due à un défaut de la contraction cardiaque, généralement consécutive à un infarctus. La seconde forme d’insuffisance cardiaque est due à un défaut de relaxation du muscle cardiaque et ses causes sont multiples : âge, hypertension, obésité, diabète… Malgré les nombreuses recherches et études cliniques menées ainsi que l’arsenal thérapeutique déployé et testé, aucune thérapie ne semble être efficace en termes d’allongement de la durée de vie pour cette forme d’insuffisance cardiaque. Afin de pouvoir tester de nouveaux composés médicaments, le développement et l’utilisation de modèles animaux aux plus proches des atteintes cardiovasculaires de l’insuffisance cardiaque est nécessaire. Le modèle rongeur mimant cette pathologie est obtenu en combinant une injection d'un composé qui bloque la production de monoxyde d’azote (une molécule essentielle pour la dilatation des vaisseaux sanguins), et un régime alimentaire riche en graisses. Cette combinaison entraîne une insuffisance cardiaque où le cœur a du mal à se remplir correctement entre deux battements en raison d’une rigidité accrue du muscle cardiaque. Ainsi, l’objectif du projet est d’utiliser ce modèle d’insuffisance cardiaque pour évaluer l’efficacité de nouveaux composés à visée thérapeutique sur la progression de l’insuffisance cardiaque et la fonction cardiaque.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur un modèle animal d’insuffisance cardiaque. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d’insuffisance cardiaque.
Procédures
Au cours du protocole, plusieurs prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de l'une des veines de la mâchoire pour la souris ou d’une veine de la queue pour le rat ainsi qu’au niveau de la pointe de la queue après une légère incision (1min par prélèvement). Les animaux sont soumis mensuellement à une analyse d'imagerie cardiaque (30min par analyse) réalisée sous anesthésie générale. Une mise à jeun de 6 heures est appliquée pour explorer la glycémie à jeun. A la fin du protocole, les animaux sont à nouveau anesthésiés et mis sous analgésie dans le but d'exposer le coeur par chirurgie et d'évaluer la pression sanguine directement dans le coeur (15min).
Impact sur les animaux
Ce modèle de maladie du cœur chez les rongeurs est causé par deux choses : une substance empêchant le bon fonctionnement des vaisseaux sanguins et causant de l'hypertension, et un régime très gras, qui rend les animaux plus gros et perturbe leur métabolisme. À cause de cela, leur cœur fonctionne moins bien, ils sont plus fatigués et ont du mal à bouger. Ils mangent différemment et sont plus stressés. Pour vérifier leur état de santé, des prises de sang et des tests de glycémie sont faits, ce qui peut être stressant. Les échographies du cœur nécessitent une anesthésie gazeuse qui peut irriter leur respiration. L’épilation des animaux pour l'échographie peut entrainer une irritation cutanée. À la fin, une opération sous anesthésie permet de mesurer la pression du sang. Enfin, le médicament testé peut avoir des effets secondaires, surtout s’il s’agit d’une nouvelle substance encore peu connue. Le traitement par injection intra-péritonéale peut entrainer une inflammation de l'abdomen et le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car les mesures effectuées en fin de procédure sont des mesures terminales nécessitant l’ouverture de la cage thoracique pour les mesures de pression.
Remplacement
Ce projet vise à démontrer l’efficacité de nouveaux composés chez le rongeur. L’utilisation d’un modèle animal est essentielle pour étudier l’insuffisance cardiaque, car il prend en compte les comorbidités influençant la maladie et pouvant être ciblées par les traitements. Contrairement aux modèles cellulaires, il permet d’analyser les effets du composé dans un organisme entier et d’évaluer son action sur les organes de manière réaliste.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=15) est basé sur des données issues de la littérature (n=12), en tenant compte des critères d’inclusion stricts et d’une possible mortalité liée aux procédures. Les différences entre groupes sont analysées statistiquement. Les animaux sont randomisés après les pesées et mesures de glycémie à jeun. L’échocardiographie permet un suivi d'un même individu au cours du temps réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Des échantillons de plasma et/ou de tissus des animaux contrôles sont conservés pour d’autres recherches, limitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux pourrait être ajusté à la baisse.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux. Les cages des animaux sont transparentes et disposées les unes à côtés des autres afin que les animaux puissent se voir et se sentir. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole approprié est mis en place si besoin. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sur animaux calmés et endormis. Ce protocole entrainant une prise de poids, les animaux peuvent avoir des difficultés à atteindre les mangeoires et les biberons. Ainsi, l’hydratation et la bonne nutrition des animaux sont surveillées avec une prise en charge adaptée : tétines plus longues sur les biberons et nourriture au sol. Les animaux sous anesthésie lors de l’échographie sont placés sur un plateau chauffant et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Après chaque prélèvement, une injection de solution saline est réalisée (au moins 2 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volume sanguin. Les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques, calmants et de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses, volume). Les mesures de la pression sanguine réalisées en fin de protocole nécessitent une chirurgie et se font sous anesthésie et calmants.
Choix des espèces
Les rongeurs, souris et rats, classiquement utilisés en laboratoire, présentent des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et du fonctionnement vasculaire et cardiaque. La réponse corporelle dans les insuffisances cardiaques est comparable à celle des humains notamment en termes de remodelage cardiaque et de modification des pressions. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines permettant qu’ils soient matures sexuellement.
Etudes d’un gène impliqué dans la génération et la disparition des neurones transitoires chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 140 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. L'essentiel se joue sur des souriceaux de sept à dix jours, coussinets des phalanges tatoués, bout de queue coupé, puis pour certains une chirurgie du cerveau sous anesthésie et analgésie profondes. Le bénéfice annoncé est d'étendre les connaissances sur le rôle des deux formes d'un gène dans l'apparition et la disparition des neurones transitoires, sans application thérapeutique évoquée. Le porteur justifie le chiffre de 4 140 par une seule phrase, l'emploi du minimum d'animaux déterminé par une approche statistique adaptée, sans donner ce calcul.
Objectifs
Le projet porte sur les neurones transitoires qui sont essentiels pour un développement correct du cerveau, ils permettent de coordonner la mise en place des circuits neuronaux. Le rôle d’un gène qui est fortement exprimé dans ces neurones, et qui peut s’exprimer sous deux formes, sera étudié. L'expression de ces deux formes alterne au cours du développement. Le projet vise ainsi à étudier les deux formes du gène afin de comprendre leur impact sur la génération des neurones, leur survie au cours du développement et sur la mort cellulaire après la naissance.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la physiologie des neurones transitoires ainsi que sur le rôle des deux conformations de notre gène d’intérêt dans le développement du cerveau
Procédures
Les souriceaux subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue, ses actes seront réalisés avec une contention de l’animal de quelques secondes. Certains animaux subiront une injection intrapéritonéale pour anesthésie et analgésie profonde sous contention pendant quelques secondes suivie d'une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie profonde.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue et le tatouage des phalanges provoque une légère douleur de courte durée. Les injections de l’anesthésie peuvent induire une légère douleur de courte durée. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses prévus dans le projet
Remplacement
Il s’agit d’études portant sur le développement et le fonctionnement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites que dans le contexte du mammifère. À ce jour, aucun modèle in vitro ne peut reproduire l’ensemble des étapes de son développement dans toute leur complexité, ni la richesse des interactions entre les nombreux types cellulaires qui y participent.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminés par une approche statistique spécifique adaptée.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec accès illimité à l’eau et à la nourriture et sont gardés en groupe social. La souffrance des animaux sera réduite au maximum par l'utilisation d'anesthésie et analgésie adaptée. Pour toutes les expériences des points limites strictes adaptés ont été mis en place pour assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de la similarité du cerveau entre les rongeurs et l’Homme. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes. La chirurgie est menée sur des stades postnataux pour nous permettre de suivre la génération et la migration des neurones et d’observer leur disparition après la naissance et les conséquences éventuelles à long terme.
Etude de l’effet d’une mort inflammatoire des cellules tumorales comme traitement vaccinal contre le cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une tonte, une injection de cellules tumorales tuées dans le flanc gauche sous anesthésie, puis huit jours plus tard une injection de cellules cancéreuses vivantes dans le flanc droit sur animal vigile, 70 souris subissent cette séquence, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tumeurs. Les cellules viennent d'un adénocarcinome du pancréas de souris, modifié pour qu'on puisse en déclencher la mort à volonté. L'hypothèse testée est qu'une mort cellulaire inflammatoire vaccine l'organisme contre la tumeur qui suit. La croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse pendant 28 jours, et le porteur annonce des points limites établis sans indiquer à quelle taille de tumeur ils se déclenchent.
Objectifs
Afin de tester l’effet vaccinal d'une mort inflammatoire des cellules issues d'adénocarcinomes du pancréas (PDAC) murines, sur l’induction d’une immunitée anti-tumorale, nous avons introduit dans une lignée de PDAC ( isolées de tumeurs d’animaux mutants portant les mutations sur l'oncogène K-ras et le gène suppresseur de tumeur TP53) une construction permettant d'actionner la mort des cellules sur commande. Sept jours après leur acclimatation, les souris sauvages seront injectées en sous-cutanée avec ces cellules qui auront été préalablement stimulées à mourir puis 8 jours plus tard les cellules PDAC vivantes seront injectées dans le flanc droit des souris. La croissance tumorale sera suivie sur 28 jours avec un pied à coulisse en mesurant la longueur et la largeur de la masse tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la mort inflammatoire des cellules de PDAC active une réponse immunitaire contre la tumeur en fournissant à la fois les signaux inflammatoires et l’antigène tumoral. Si cette hypothèse est validée par ce test, elle ouvrira la voie d’une étude plus complète sur la séquence de recrutement et d’activation des cellules immunitaires dans ce contexte précis, mais également au développement d’approche thérapeutique basée sur l'outil que nous avons déveoloppé et qui permettra de tuer les cellules cancéreuses de patients de façon ciblée.
Procédures
Les animaux recevront une ou deux injections en sous-cutanée précédées d'une tonte à une semaine d’intervalle l'injection flanc gauche aura lieu sous anesthésiant l'injection flanc droit aura lieu sur animal vigile.Le geste dure moins d’une minute
Impact sur les animaux
Différentes nuisances peuvent être attendues : Stress liés à la contention des animaux et l’injection, et une douleur est éventuellement possible liée à l’injection des cellules mortes et à la pousse tumorale
Devenir
Les animaux entrés dans la procédure développeront des tumeurs. Ils ne pourront pas être ré-utilisés, ils seront mis à mort, et les tumeurs seront collectés pour une analyse anatomopathologique.
Remplacement
Nous avons généré des données solides in vitro en démontrant l’activation des cellules immunitaires humaines qui nécessitent une validation in vivo. A ce jour, pas de méthode alternative possible que le modèle animal car nous avons besoin de tous les acteurs de la réponse immunitaire pour évaluer la réponse anti-tumorale. Néanmoins nous travaillons en parallèle à mettre au point des modèles cellulaires 3D humains dans le but de remplacement futur.
Réduction
L'effet minimal souhaité de l’approche vaccinale serait une réduction de 50% de la pousse tumorale. Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience a été calculé sur la base d’un test statisitqie non paramétrique, non pairé avec un risque de 5% ainsi qu'une puissance de 80%. La simulation projette 20 animaux par groupe. Pour la procédure n°1 qui prépare la procédure N°2, le nombre d’animaux est réduit de moitié car il s’agit d’estimer le comportement de différentes conditions de culture cellulaire afin de déterminer la condition la plus appropriée pour la procédure N°2. Il s’agira de 3 groupes avec 10 animaux par groupes.
Raffinement
Les tumeurs PDAC injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases. Les animaux sont hébergés en groupe, dans un milieu enrichi pour limiter le stress. En cas d’agressivité, surtout des mâles, des bâtonnets de bois seront mis dans les cages. Si l’agressivité persistait le mâle agresseur sera hébergé individuellement de façon temporaire. Des points limites ont été établis entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si necessaire Les souris seront suivies quotidiennement, en cas de douleur de la buprenorphine sera administrée par injection sous-cutanéee. Si une alteration de l’état general de l’animal est observée des aliments gélifiés ou de l’eau gélifié sera utilisé.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis chez la souris. De nombreuses lignées cancéreuses syngéniques sont disponibles comme celles du PDAC. Des animaux adultesmâles et femelles âgés de 8-10 semaines seront utilisés. Pour ces expériences de vaccination des animaux adultes avec un système immunitaire mature sont requis
Evaluation de traitements susceptibles d’augmenter les taux de facteurs de la coagulation dans des pathologies hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris génétiquement modifiées pour être déficientes en facteurs de coagulation, donc exposées à saigner, elles sont 1 210, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une partie du protocole, biopsie de l'oreille, jusqu'à quatre injections réparties sur cinq semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins. Le test central consiste à sectionner les trois derniers millimètres de leur queue sous anesthésie et à mesurer pendant trente minutes le sang qui s'écoule, avant de les tuer sans les réveiller. Le porteur écrit que toutes sont tuées en fin de procédure en raison du volume de sang prélevé ou perdu, pour une approche destinée aux patients dont la forme de la maladie est jugée trop modérée pour justifier les traitements existants.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines, appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Des traitements existent et ont démontré leur efficacité pour les patients atteints des formes graves de ces pathologies. Du fait de la lourdeur de ces traitements, ils ne sont pas administrés aux patients, plus nombreux, qui présentent des formes plus modérées. Ces patients ont en général un défaut partiel en facteur de la coagulation (et non un déficit total comme pour les formes graves). En absence de solution adaptée à leurs besoins bien spécifiques, les patients avec les formes modérées voient leur qualité de vie significativement altérée. L'idée du projet est donc de tester une nouvelle approche thérapeutique dédiée à ces populations de patients, basée sur l'idée d'utiliser leurs facteurs de coagulation résiduels et d'en augmenter la disponibilité.
Bénéfices attendus
Ce projet a vocation à améliorer la prise en charge des patients souffrant de formes modérées de différentes pathologies hémorragiques. Une approche similaire dans une pathologie autre que celles faisant l'objet du projet présenté ici devrait être testée prochainement chez des patients, ouvrant la voie à des essais cliniques à moyen terme pour les patients avec maladies hémorragiques congénitales.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs interventions pendant la durée des procédures mais chaque souris individuelle ne subira qu'une partie de ces gestes: 1) 1 biopsie à l'oreille. Ce geste dure 2 secondes. 2) 1 ou plusieurs injections. Le nombre maximal est de 4 injections réparties sur 5 semaines. Chaque injection va durer 1-2 secondes. 3) 1 ou plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie. En cas de plusieurs prélèvements, leur nombre maximum sera de 3 dont le dernier qui sera terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires. Ces prélèvements durent entre 5 et 45 secondes. 4) 1 test de saignement sur souris anesthésiées, test consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires sans retour préalable à la conscience
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le génotypage peut être généré. Les injections peuvent être associées à une légère douleur transitoire, de courte durée. Le prélèvement sanguin peut être associé à une douleur moyenne et une légère hémorragie, nécessitant d'exercer un point de compression. Le test de saignement est réalisé sous anesthésie pendant 30 minutes et les souris sont sous surveillance permanente.
Devenir
En fin de procédure et en raison du volume sanguin prélevé ou perdu, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires et le constat de mort sera établi par des signes évidents de mort.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être étudié de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de techniques qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Seules 3 associations de molécules seront testés in vivo. Une dizaine de combinaisons sera produite et caractérisée in vitro et seules les combinaisons avec les profils biochimiques les plus prometteurs seront injectés aux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne montrent pas de signes de souffrance auquel cas un calcul de score permettra de définir les mesures à mettre en place.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui ont prouvé leur pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui sont déficients pour différents facteurs de la coagulation, reproduisant ainsi les pathologies humaines. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine, susceptible de souffrir de ces pathologies.
Manipulation pharmacologique d’agents anti-agrégats chez un modèle murin du syndrome d’Ondine (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
1 182 souris porteuses de la mutation du syndrome d'Ondine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant de la mise à mort sous anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nées et les juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie de leur système nerveux central. Les autres reçoivent des solutions dans le nez sous anesthésie et dans l'abdomen en vigile, avant soixante minutes enfermées dans une enceinte de mesure respiratoire, jusqu'à trois fois. Le porteur note que ces souris supportent mal l'anesthésie et risquent alors une défaillance respiratoire, tout en pratiquant sous anesthésie les administrations intranasales qui peuvent obstruer leurs voies aériennes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC. MODIFICATION : l'ajout d'administration de molécule et de test physiologique nécessite une modification du projet initial sans ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles (1 fois entre 12 et 15 jours) puis adultes (3 fois entre 1-6 mois) recevront une administration de deux solutions (48 heures séparent les 2 administrations) selon deux techniques : une sur animal sous anesthésie générale (10 minutes maximum) et l’autre sur animal vigile (moins de 10 secondes). Une mesure non invasive de la ventilation sera réalisée 1 fois chez les souris juvéniles puis 3 fois chez ces souris adultes pendant 60 min à chaque fois (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. L’acclimatation des animaux à ces enceintes a lieu pendant 1 heure par jour pendant les 5 jours qui précèdent l’enregistrement (hors week end). L’hébergement individuel des animaux est limité au maximum.
Impact sur les animaux
Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée. L'acclimatation aux enceintes de pléthysmographie et les mesures de ventilation pourront entrainer un stress social de courte durée chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. Lors des administrations intranasales d’agents pharmacologiques, sous anesthésie gazeuse, avant l’enregistrement de leur ventilation, les souris sont sous surveillances accrue, jusqu’à leur réveil complet pour ainsi éviter l’arrivée de points limites (irrégularités respiratoires, obstruction des voies aériennes, arythmie cardiaques) et prévenir le décès non souhaité des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude de la respiration et de son contrôle nerveux. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour le gène responsable de la maladie. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès, chez ces souris mutées, au réseau de neurones qui contrôle la respiration à différents âges (stade nouveau-né et juvénile) pour l’étude de l’influence des agents anti-agrégats sur l’activité de ce réseau ; et d’étudier la respiration des souris (juvéniles et adultes) vigiles et de l’effet des agents anti-agrégats sur celle-ci, appliqués de deux façons différentes aux souris.
Mise au point et criblage de candidats médicaments en efficacité antitumorale sur des modèles de tumeurs syngéniques ou de xénogreffes tumorales en ectopique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées en fin d'étude ou dès qu'elles atteignent les points limites, et pour 928 d'entre elles réutilisées ailleurs, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Celles qui n'entrent pas dans le protocole sont reversées à l'entraînement du personnel aux gestes techniques, puis mises à mort. Une tumeur est greffée à chaque animal vigile, mesurée deux fois par semaine puis tous les jours à l'approche des points limites, avec jusqu'à trois injections de composés et deux prélèvements sanguins dont le dernier est terminal. Le porteur signale que les nids et les rouleaux de carton sont retirés des cages pour éviter que les tumeurs ne s'ouvrent, et conclut qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris pour ce criblage de candidats médicaments.
Objectifs
Ce projet dans son ensemble consiste à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine. Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représente ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet s’effectuera en 3 temps : # une étude de tumorogénicité permettra de mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # Une étude Pilote d’efficacité antitumorale permettra de tester un/des médicament/s contrôle/s de référence sur les meilleurs modèles précédemment validés. #Une étude d’efficacité permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés précédemment.
Bénéfices attendus
Ce projet dans son ensemble consiste à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine. Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représente ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleure fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleure efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. Une partie du projet permettra ainsi de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux alors que l’autre partie permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés précédemment.
Procédures
# Greffe tumorale sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Prise de mesure des tumeurs sur souris vigiles minimum deux fois par semaine et quotidiennement en cas d’approche des points limites (2-3 minutes), # Injection des composés sur souris vigile (2-3 minutes_maximum 3 fois) # Un prélèvement sanguin intermédiaire sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Un prélèvement de sang terminal sur souris sous anesthésie et analgésie générale sans réveil (2-5 minutes_ 1 fois).
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésie fixe ou gazeuse. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (a) de la greffe tumorale sur animal vigile, (b) de l’injection des composés sur souris vigiles et (c) de prélèvements sanguins intermédiaires. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.
Devenir
Pour chacune des trois procédures : Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation#50826) avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Remplacement
Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en termes de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle Souris.
Réduction
Les études de tumorogénicité et de preuve de concept permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés dans l’étude d’efficacité. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogène, mieux vascularisée et de limiter les nécroses tumorales. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des études de tumorogénicité et de preuve de concept seront utilisés pour l’étude d’efficacité avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs, le fait de tester dans les 2 premières études une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés. Des tests statistiques adaptés à un petit nombre d’animaux permettront de suivre au cours du temps le volume tumorale, le poids corporel et la survie des souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger). Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscrit afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de celluloses et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’environ une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive, avec des points limites définis et qui seront appliqués, permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Cette surveillance sera renforcée à l’approche des points limites. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogène, mieux vascularisée et de limiter les nécroses tumorales. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Ainsi les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).
Choix des espèces
# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souche consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte.
Rôle du récepteur CB1R dans la polykystose rénale chez la souris : nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Un bout de queue coupé à cinq ou six jours pour lire leur génotype, puis un gavage quotidien pendant un mois, douze heures en cage métabolique, deux anesthésies gazeuses pour poser et retirer un capteur de fluorescence sur le dos, 1 400 souris atteintes de polykystose rénale enchaînent ces étapes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que le gavage peut irriter la gorge et provoquer des fausses routes, et que l'anesthésie peut entraîner une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire. Si le saignement de la queue dure plus d'une heure, la souris est tuée. Toutes le sont à la fin, y compris celles qui n'ont pas le génotype recherché, tuées sans qu'on leur prélève quoi que ce soit.
Objectifs
L'impact de l'insuffisance rénale chronique en Santé Publique est majeur puisque cette maladie touche des millions d'individus dans le monde. Malgré les efforts de recherche considérables, il existe toujours très peu d'options thérapeutiques. Nous nous intéressons dans ce projet à une insuffisance rénale particulière d’origine génétique : la polykystose rénale humaine. Cette maladie génétique correspond à dix pour cent des patients en insuffisance terminale en France. Il n'existe pas jusqu'à présent de traitement préventif ou curatif efficace en dehors d’un médicament dont l'efficacité est limitée et la tolérance, médiocre. Ce projet vise à étudier l’effet bénéfique potentiel dublocage de deux gènes impliqués dans le développement de cette maladie. Nous allons tester l'efficacité de deux nouvelles molécules sur le développement de cette maladie en les testant sur une lignée de souris qui développent spontanément la maladie kystique rénale.
Bénéfices attendus
Les traitements proposés aujourd'hui pour la prise en charge de la maladie rénale kystique ne sont pas efficaces et ne parviennet pas à freiner l'évolution de la maladie. Les stratégies thérapeutiques envisagées dans ce projet permettront de tester si nos deux inhibiteurs sont de bonnes options thérapeutiques pour la prise en charge de la maladie, en combiné ou séparément. Ces traitements pourraient avoir un impact de manière plus générale sur l'insuffisance rénale chronique et aboutir à un essai clinique chez l'homme.
Procédures
1) Dans le cadre du génotypage de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. (2) Une partie des animaux recevront un traitement ou un placebo par administration orale quotidienne pendant un mois. Cette étape est très rapide, environ dix secondes par animal et elle est effectuée sur animal vigile. (3) Les animaux seront placés pendant douze heures dans une cage métabolique pour le recueil urinaire, elles seront hydratées et nourries normalement dans une pièce dédiée de l’animalerie sous la surveillance du personnel. (4) Les souris seront soumises à la mesure de leur fonction rénale par une nouvelle technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure ne sera effectuée qu’une fois en fin de protocole. Pendant la mesure non invasive de la fonction rénale, les animaux sont placés dans des cages individuelles pour ne pas risquer d’abimer le matériel de mesure. Les animaux retournent dans leurs cages initiales deux heures après. (5) En fin de protocole, le sang est prélevé sous anesthésie et analgésie (trente secondes environ), sur un plateau thermostaté ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris mutées. L’accumulation de kystes entraîne le développement d’une insuffisance rénale à 6 mois. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 4 ou 8 semaines. Les protocoles durant 4 semaines, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d’urine en cage métabolique et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. La douleur liée à l'administration de traceur pendant la mesure de la fonction rénale sera de courte durée. Ces administrations peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. Les complications liées à l'anesthésie au moment de la mesure transcutanée de la fonction rénale et le prélèvement de sang : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt pour le projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire sans réalisation de prélèvement. Les animaux disposant du génotype d’intérêt seront euthanasiés sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements nécessaires postmortem pour les analyses.
Remplacement
Nos travaux préliminaires sur lignées cellulaires prouvent un rôle fonctionnel des deux gènes étudiés dans ce projet au cours du développement de la maladie, pré-requis indispensable à un test thérapeutique in vivo. En raison de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pouranalyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique des deux inhibiteurs est l'amélioration de la fonction rénale, qui est mesurée soit par dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire, par mesure transcutanée.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 1400 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En cas de saignemment lors de la biopsie un point de compréssion sera effectué sur le bout de la queue .Si le saignement persiste au delà d'une heure (problème de coagulation) l'animal sera euthanasié .Le rejet de la mère sera vérifié en regardant le lendemain s' il y a bien une poche de lait visible sur le nouveau né et éventuellement une adoption sera sera envisagée si possibilité . En dehors d'une courte période en cage individuel limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée hebdomadaire pendant tous les différents protocoles (et tous les deux jours pendant les périodes de gavage). Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, la prostration, l'hérissement du pelage. Il existe aussi un risque de saignement causé par les injections avant la mesure de la fonction rénale. Il peut survenir aussi des complications liées à l'anesthésie gazeuse (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique)
Choix des espèces
Le modèle de souris génétiquement modifié utilisé dans ce projet est un modèle reconnu dans la littérature comme modèle pertinent de la maladie kystique rénale chez l’homme. C'est donc le meilleur modèle pour une expérimentation à visée mécanistique et thérapeutique. Les animaux (mâles et femelles) seront utilisés entre 1 et 6 mois. Ils ne seront pas gardés au-delà du stade terminal de la maladie (6 mois). Les interventions thérapeutiques seront effectuées dans un groupe précoce de souris âgées d'1mois (Groupe préventif) et un sous-groupe plus tardif de souris âgées de 2 mois considéré comme âge adulte (Groupe curatif) : elles visent à diminuer la gravité de la maladie et à améliorer la survie des animaux. Le stade de 2 mois est choisi car les souris présentent déjà des kystes rénaux à cet âge. L'identification génétique est réalisée très précocement (5-6 jours) pour limiter la douleur.
Impact d’amyloïdes protecteurs sur la pathologie Alzheimer chez des souris transgéniques de la maladie (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
3 561 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certaines subissant deux ouvertures du crâne de trente minutes chacune. La première injecte dans le cerveau un produit qui y déclenche la pathologie d'Alzheimer, la seconde y administre le médicament testé. Le porteur signale que cette induction peut provoquer des crises d'épilepsie fugaces et une perte de mémoire, et que les reproductrices sont tuées en fin de période de fertilité. La modification ajoute 120 souris pour examiner l'influence de l'environnement de l'établissement sur la maladie, quand le bénéfice attendu tient en une phrase, le projet "pourra mettre en évidence de nouveaux traitements".
Objectifs
Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie. L’examen de l’influence de l’environnement de l’établissement utilisateur sur le développement de la pathologie nécessite la modification du projet initial avec ajout de 120 animaux transgéniques devant être génotypés.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux (sauf les souris homozygotes) seront soumis à des prélèvements de queue pour génotypage (1 fois par souris, durée de l'acte : 1 seconde), certains animaux vieilliront sans recevoir de procédure supplémentaire. Certains animaux recevront une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter un produit qui induit la maladie d'Alzheimer (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Certains animaux recevront une deuxième chirurgie au niveau du crâne pour administrer un médicament (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Une partie des animaux recevra un médicament injecté dans les veines pour traiter la maladie d'Alzheimer (à 3 mois, duré de lacte : moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire légère et certaines souris peuvent développer des crises d’épilepsie fugaces. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h).
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin des procédures expérimentales, afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques. Les animaux reproducteurs utilisés pour générer les souris d'expérimentation seront euthanasiés en fin de période de fertilité.
Remplacement
La maladie d'Alzheimer est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe de 2 à 5 individus, nourris ad-libitum, et ayant accès à l'eau à volonté, dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être et de mettre en œuvre des traitements appropriés si besoin. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles de chirurgies ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des points limites précoces précis et stricts ont été définis. Des échelles cliniques, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts basés sur les points limites permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. La maladie se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits discrets apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les souris à un temps précoce et à un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin de maladie, soit entre 4 et 11 mois.
Étude longitudinale de l’impact de l’hypertension sur le développement des déficits cognitifs dans un modèle de maladie rénale chronique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Cinquante-cinq minutes d'opération pour implanter une sonde de mesure sur la carotide gauche, avec un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire, 130 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite pendant 28 jours un régime qui leur provoque une maladie rénale, des injections répétées dans la veine de la queue, deux mesures de filtration rénale de deux heures et des tests d'exploration, d'apprentissage et de mémoire dont aucun n'est nommé. Le porteur annonce des nuisances réduites au maximum, et compose dans le même texte des lots de dix animaux parce qu'il en attend jusqu'à 20 % de morts en cours de route. Toutes finissent exsanguinées sous anesthésie, organes et sang prélevés.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique est un mécanisme clé dans le développement des troubles cognitifs au cours de la maladie rénale chronique. Notre projet vise à évaluer l’influence de l’hypertension sur les troubles cognitifs dans un modèle animal de maladie rénale chronique. Nous utiliserons notamment une approche pharmacologique afin d’évaluer l’impact de la modulation de la pression sanguine sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la fonction cognitive.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le lien les atteintes cérébrales et l’hypertension au cours des maladies rénales chroniques, et de développer des stratégies de prévention de ces atteintes cérébrales via des approches pharmacologiques. La possibilité d’améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteints de maladie rénale chronique présente un bénéfice en santé humaine. Les troubles cognitifs pouvant être associés aux maladies rénales chroniques entraînent des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour placer un implant afin de pouvoir mesurer leurs constantes cardio-vasculaires (55 min). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). Les animaux seront soumis à l’administration de substances pharmacologiques (schéma d'administration dépendant des molécules). Les animaux seront soumis à deux reprises à une injection sous courte anesthésie de molécules fluorescentes, puis mesure pendant 2 heures de la décroissance de la fluorescence avec une caméra miniature afin de mesurer la filtration glomérulaire. Les animaux seront soumis à des imageries qui seront espacées d’au moins 24h pour une durée maximale de 30min. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux de l’exploration, de l'apprentissage et de la mémoire afin d'évaluer les troubles cognitifs (moins d'une heure pour l'ensemble des tests). Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie à la fin de l’étude.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut provoquer un stress de la manipulation, un risque de déshydratation et de détresse respiratoire lié à l’anesthésie, de la douleur et un risque d’hémorragie . L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids. L’imagerie et l’injection de molécules fluorescentes nécessiteront une anesthésie halogénée et pourront engendrer un stress, ainsi qu’une hypothermie. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes. L’administration de substances pharmacologiques pourra engendrer un stress. Plusieurs injections intraveineuses dans les veines caudales seront réalisées pouvant entrainer une douleur et un stress chez l'animal. L'exsanguination, pratiquée sous anesthésie et analgésie, provoquera la mort des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes et le sang seront prélevés pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
La pose d’implants au niveau de la carotide gauche chez la souris ne peut se faire que sur animaux vivants. C’est une méthode validée et utilisée chez la souris. Il n’y a pas d’alternative non animale. En partant de nos résultats observés chez la souris montrant une altération de la barrière hématoencéphalique en contexte de modélisation de maladie rénale chronique, nous étudions une communication entre des organes : le rein et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro et il n’existe actuellement pas de modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d'une substance sur la survenue de troubles cognitifs à la suite d’une insuffisance rénale. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles après une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluations neurocomportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro.
Réduction
Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant l’implantation des sondes télémétriques, des lots de 8 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots. La mortalité est estimée
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Toute atteinte de points limites amènera à la mise en place d'actions décrites dans cette annexe. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou une perte de poids trop importante.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car ce modèle est largement décrit dans la littérature concernant l’implantation de sondes télémétriques et la modélisation d’insuffisance rénale. Ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementales, d’imagerie cérébrale et d’immunohistochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Un stade de développement adulte est souhaité car cohérent avec le développement de cette pathologie chez l'être humain.