Souris
Preuve de concept et étude de toxicocinétiques non règlementaires de candidats médicaments de thérapies ciblées anticancéreuses sur modèle souris porteuses ou non de tumeur, humanisées ou non.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Un prélèvement sanguin terminal qui peut provoquer un arrêt cardiaque, pratiqué sous anesthésie sans réveil, c'est la fin prévue pour la plupart des 3 870 souris de ce projet, utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. 774 d'entre elles sont réutilisées ailleurs, celles qui n'entrent pas dans le protocole étant reversées à l'entraînement du personnel aux gestes techniques. Greffées de tumeurs, injectées dans la veine de la queue, elles subissent des prélèvements répétés destinés à mesurer combien de temps un candidat médicament anticancéreux reste dans le sang et à quelle dose il devient toxique. Le porteur revendique là une "avancée majeure dans le respect des 3R", ces souris humanisées remplaçant selon lui les primates non humains habituellement utilisés pour ce type de composés.
Objectifs
Ce projet consiste à mettre au point des modèles d'étude de toxicocinétiques non réglementairement pour des candidats médicaments de thérapies anticancéreuses ciblées par des antiticorps. Ces modèles de souris permettront ainsi de remplcer d'autres éspèces plus grandes (commes les primates non humains généralement utilisé pour les études de toxicocinétiques de ce type de composés), tout en étant plus pertinents que ces derniers. # Les études de toxicocinétiques sont les études précliniques les plus importantes pour pouvoir accéder à une première étude clinique sur l’homme pour de nouveaux candidats médicaments. Elles consistent à interpréter en parallèle les effets toxiques et l’exposition sanguine de candidats médicaments et ainsi à définir les paramètres de dose, de distribution et d’élimination qui peuvent être utilisés dans l’évaluation des risques pour l’homme. # Ce projet ce divise en trois parties distinctes: (1) Une mise au point et preuve de concept du modèle constituée d’une étude de toxicocinétique sur un médicament de référence connu, testé à une dose forte, en comparaison direct sur les différents modèles testés. Cette étape permettra de comparer les données sur l'ensemble des modèles avec leurs contrôles. (2) Des études de toxicocinétique de candidat médicament en injection unique à trois doses (faible, moyenne et haute) sur les modèles retenus lors de la preuve de concept. Cette étude sera répétable pour 3 candidats médicaments. (3) Des études de toxicocinétique de candidat médicament en injections répétées et à trois doses (faible, moyenne et haute), sur les modèles retenus lors de la preuve de concept. # L'ensemble de ces études réalisées précocement sur des modèles simples et pertinents permettront d’éviter des essais réglementaires lourds si des toxicités majeures sont identifiées précocement. Elles sont cruciales pour les médicaments comme les anticancéreux.
Bénéfices attendus
Il s'agit ici d'un protocole de mise au point et d'utilisation de modèles de substitution à l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées aux composés anticancéreux dérivés d'anticorps. Les études toxicocinétiques de composés thérapeutiques sont essentielles pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine (temps de demi-vie, biodisponibilité, clairance, exposition plasmatique…), et à relier ce comportement à des effets toxiques pour établir des relations dose-effet pour prédire la toxicité chez l’humain de définir des marges de sécurité et déterminer un choix de dose dans les premiers essais cliniques chez l’homme. La mise au point de nouveaux modèles à la fois plus éthique, plus fiables et plus pertinents pour préparer au mieux une phase clinique chez l’homme est une priorité mondiale, récemment annoncées par les autorités de controle des médicaments. Les modèles murins testés ici permettront, non seulement de substituer l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées à ce type de composés, mais également de leur être supérieur en matière de pertinence (modèles porteurs de tumeur) et de calcul des doses cliniques (modèle humanisé pour le récepteur aux anticorps), constituant ainsi une avancée majeure dans le respect des 3R dédiés aux thérapies anticancéreuses dérivées d’anticorps.
Procédures
Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésies fixes ou gazeuses. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors: (a) de la greffe tumorale, (b) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue des candidats médicament, et (c) de chacun des prélèvements sanguins. # Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. # Un prélèvement de sang terminal, sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil pouvant durer plusieurs minutes.
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésies fixes ou gazeuses. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors: (a) de la greffe tumorale, (b) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue des candidats médicament, et (c) de chacun des prélèvements sanguins. # Les souris ayant des tumeurs atteignant les points limites seront mises à mort. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les candidats médicaments peuvent induire des évènements indésirables en cas de surdosage (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, neutropénie, diarrhées, perte de poils…). Ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal, la dose maximale de cette étude étant plafonnée à une dose considérée comme la mieux tolérée en clinique pour cette classe thérapeutique. # Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. # Un prélèvement de sang terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil pouvant durer plusieurs minutes.
Devenir
# La majorité des animaux entrés en experience, seront euthanasiés après un prélèvement sanguin terminal (sous anesthésie/analgésie générale, profonde et sans réveil), pour permettre une étude toxicocinétique du composé dans le sang, une numération, formulation sanguine, une chimie du sang, une étude de biomarqueurs plasmatiques et des prélèvements d'organes. # Les animaux non entrés en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à celui désiré, tumeur inadéquate...), seront reformées pour entraînement aux gestes techniques permettant la formation du personnel ou pouront etre réutilisés dans d'autres experiences sur décision vétérinaire.
Remplacement
Les analyses hors organisme vivant de ces candidats médicaments ont déjà été effectuées avec succès avant de passer à une étude toxicocinétique. A cette étape, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. Ainsi, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle vivant. En revanche, ce projet consiste à mettre au point un modèle de substitution de l’espèce utilisée (essentiellement primate non humain pour ces types de composés), par une espèce rongeur humanisée ou non, et/ou porteuse de tumeur, afin d’être le plus transposable et pertinent possible par rapport aux futures études clinique sur l’humain . Les études toxicocinétiques de composés thérapeutiques sont essentielles pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine et à relier ce comportement à des effets toxiques pour établir des relations dose-effet pour prédire la toxicité chez l’humain, de définir des marges de sécurité et de déterminer un choix de dose dans les premiers essais cliniques chez l’homme. La mise au point de nouveaux modèles à la fois plus éthique, plus fiables et plus pertinents pour préparer au mieux une phase clinique chez l’homme est une priorité mondiale. Les modèles murins testés ici permettront, non seulement de substituer l’utilisation de primates non humains pour les études de toxicocinétiques dédiées à ce type de composés, mais également de leur être supérieur en matière de pertinence et de calcul des doses cliniques, constituant ainsi une avancée majeure dans le respect des 3R dédiés aux thérapies anticancéreuses dérivées d’anticorps.
Réduction
# Une première étude de mise au point et de preuve de concept permettra (1) de valider le nombre d'animaux nécessaire par modèle et (2) de déterminer quels sont les modèles les plus adéquats pour les études suivantes. # Le nombre d’animaux par groupe est en accord avec la guideline de l’agence européenne du médicament, et nos connaissances sur cette classe thérapeutique : - Pour l’étude de tolérance, 4 à 5 animaux par groupe et par sexe sont considérés comme le nombre minimum à la fois nécessaires et suffisants. - Pour l’étude de toxicocinétique, les prélèvements par micro-échantillonnage seront privilégiés. Ce procédé permettra d’avoir autant que possible l’ensemble des valeurs provenant d’un même animal, augmentant ainsi l’homogénéité et la fiabilité des résultats permettant la réduction du nombre d’animaux. # Des méthodes statistiques adaptées aux petits nombres seront utilisées augmentant ainsi considérablement la significativité et la pertinence de ces statistiques, permettant la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe sociaux (jusqu’à 5 par cage et jamais isolés) dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté et un enrichissement de l’environnement. Les souris seront acclimatées pendant une période minimale de 5 jours. Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions asceptiques. Selon les modèles, une greffe tumorale dans le tissu mammaire sera préférée car plus homogène et moins sujette aux nécrose. Chaque nouvel essai de dose sera séparé du précédent de 1 à 2 semaines, ce qui permettra de ne pas passer à la dose supérieure si une dose toxique est trouvée précocement. Les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque geste expérimental. Les animaux seront pesés et leurs tumeurs mesurées (si nécessaire) minimum 2 fois par semaine. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, incluant une surveillance physiologique et comportementale, permettra d'éviter la souffrance des animaux. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux le week-end et les jours fériés. Les prélèvements sanguins seront effectués préférentiellement par micro-échantillonnage sans jamais dépasser les doses recommandées. # Un prélèvement de sang terminal sera pratiqué sous anesthésie et analgésie générale sans réveil.
Choix des espèces
Les études de toxicocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Les animaux seront des souris femelles et/ou mâles en fonction des besoins de l’étude. Ils seront livrés à partir de 7 à 8 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une toxicocinétique physiologiquement pertinente.
Production de lignées à phénotype dommageable et génotypage par une méthode invasive
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Produire et entretenir des lignées de souris reproduisant l'amyotrophie spinale, dans ses formes sévère et modérée, 4 105 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, celles qui portent le génotype recherché partant ensuite vers des projets de test de traitements. Les nouveau-nés susceptibles de porter la forme sévère subissent dès la naissance une analyse génétique invasive. Ceux qui l'ont vivent une dizaine de jours, incapables de se déplacer, de s'alimenter ou de respirer normalement. Dans la forme modérée, le porteur décrit des nécroses sèches qui apparaissent au bout de la queue vers trois à quatre semaines, gagnent les oreilles puis quelques orteils, et qu'il note sur une échelle où le grade 2, nécrose sévère avec infection, déclenche la mise à mort.
Objectifs
L’amyotrophie spinale (SMA) est une maladie rare affectant les muscles suite à un problème génétique : un gène absent. Ce problème empêche la production d’une protéine importante pour les cellules nerveuses, ce qui entraîne une faiblesse musculaire. Un autre gène peut produire un peu de cette protéine en quantité plus ou moins importante : plus il y a cette protéine, plus la maladie est légère. Pour mieux comprendre la SMA et tester des traitements, des chercheurs utilisent des souris qui ont différentes versions de ce gène afin de reproduire la maladie et chercher des solutions, comme des traitements basés sur l'ADN ou l’ARN, pour améliorer la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique est important pour la recherche de traitements contre l’amyotrophie spinale (SMA). Il commence par créer des modèles de souris qui reproduisent bien la maladie, avec des formes légères à sévères, pour mieux comprendre comment elle fonctionne. Le projet assure aussi que ces modèles soient cohérents d'une étude à l'autre, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables pour comparer différentes solutions et valider les traitements plus facilement.
Procédures
Il s'agit d'une procédure de maintien et d’élevage de souris génétiquement altérées porteuses de la maladie SMA, afin de tester des traitements par la suite : seules les portées de nouveau-nés potentiellement porteurs de la forme sévère de la maladie subiront une analyse génétique invasive à la naissance pour déterminer s'ils sont malades (environ 25% des naissances) ou sains. Ce ne sera pas le cas pour ceux porteurs de la forme plus légère, issus d'un autre type d'accouplement, qui naissent tous avec la même version de la maladie.
Impact sur les animaux
Les souris SMA type 1 ont une espérance de vie très courte (environ 10 jours). Cela limite les études à long terme sur la maladie ou les traitements. Ces souris présentent des anomalies sévères dès la naissance (faiblesse musculaire extrême, incapacité à se déplacer, à s’alimenter ou à respirer normalement, poids moindre), donc les manipuler n'est pas un acte anodin car ils sont extrêmement fragiles. Le modèle SMA type 3 (forme modérée à légère) présente une progression plus lente. A partir de 3 à 4 semaines de vie environ, ces souris présentent des nécroses sèches au bout de la queue, puis les nécroses évoluent au niveau des oreilles, et beaucoup plus tard (1 an environ) à quelques orteils. Ces nécroses sèches sont attendues chez ces animaux, sans automutilation et qui n’entravent pas le comportement normal de l’animal (alimentation, déplacements, survie …). En outre, la fertilité de cette lignée décroit rapidement, il est donc nécessaire de renouveler les accouplements régulièrement.
Devenir
Les souris obtenues par cet élevage seront utilisées pour tester des traitements sur cette pathologie. En fonction des résultats de nos études expérimentales, les accouplements pourront être réduits ou arrêtés plus tôt que prévus.
Remplacement
Dans le cas de la SMA, les modèles animaux, notamment les souris, restent essentiels pour étudier les aspects physiologiques complexes de la maladie et tester les traitements dans un organisme entier, donc aucun remplacement n'est possible à ce stade.
Réduction
Dans le cadre de l'élevage de souris utilisées pour l'étude de la SMA, la stratégie de réduction vise à limiter au maximum le nombre d'animaux tout en garantissant la validité scientifique des travaux. Cette réduction est mise en œuvre par l'optimisation des protocoles d'élevage et des plans expérimentaux. Cela inclut une gestion rigoureuse des colonies, avec un suivi précis des lignées génétiques pour éviter les reproductions excessives ou inutiles. Des techniques précoces et fiables sont utilisées afin d’identifier rapidement les animaux malades, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, les animaux de sain en surplus seront utilisés autant que possible sur d'autres projets. Ces mesures garantissent une utilisation éthique et raisonnée des souris tout en répondant aux objectifs scientifiques.
Raffinement
De la nourriture en gelée pourra être ajoutée dans la cage pour les animaux jeunes ou faibles, afin de faciliter leur accès à la nourriture. Si un animal ne prend plus de poids dans sa phase de croissance, ou en perd 15% il sera séparé (si possible avec d'autres animaux de même gamme de poids de sa fratrie pour éviter la solitude). Les manipulations des animaux sont réalisées par un personnel formé, avec des techniques atraumatiques (nouveau-nés placés sur plaque chauffante pour le génotypage, avec un échantillon de nid et de litière pour l'odeur afin d'éviter le rejet ; les adultes ne sont jamais attrapés par la queue) et adaptées à leur bien-être. De plus, une surveillance rigoureuse de l'état de santé des souris est mise en place avec une mesure de l'évolution des nécroses chaque semaine, permettant une détection précoce des signes de détérioration liés à la maladie, afin de leur prodiguer des soins appropriés (désinfectant en cas de saignement, ou mise à disposition de gelées alimentaires) ou d’envisager une euthanasie si nécessaire. S’il y a des nécroses avec saignement, celles-ci seront désinfectées quotidiennement et évaluées selon les critères suivants : grade de 0 : légère, 1 : modérée désinfection quotidienne, 2 : sévère avec infection, euthanasie. La litière sera également changée s’il y a du sang dans la cage
Choix des espèces
Nous utilisons deux modèles de souris SMA pour nos études : SMA de type 1 (forme sévère de la maladie) ou de type 3 (forme modérée de maladie). Ces modèles animaux sont les plus appropriés pour évaluer l’efficacité thérapeutique de nos molécules sur cette pathologie ainsi que leur éventuelle toxicité. Les modèles de souris que nous employons sont de tous âges puisqu'il s'agit d'une DAP d'élevage. Ils sont bien décrits et documentés depuis de nombreuses années et reproduisent les différentes sévérités de la maladie humaine.
Apprentissage des gestes techniques de base chez la souris, pour les nouveaux entrants
- Formation professionnelle
Une contention, une injection dans l'abdomen ou sous la peau, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis une mise à mort réglementaire, 1 200 souris subissent cet enchaînement pour que de nouveaux arrivants s'exercent aux gestes de base, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Quatre animaux au maximum par personne formée, avec des anesthésies pouvant durer une heure pour les gestes les plus complexes. Ce qui est produit ici, c'est l'habileté manuelle de gens déjà titulaires d'une habilitation en expérimentation animale, que le porteur juge trop théorique. Il décrit une souris en silicone permettant d'apprendre la contention, l'administration orale et l'injection, avant de conclure que la formation sur animal vivant reste "indispensable".
Objectifs
Chaque année, de nouveaux étudiants, techniciens, ingénieurs et chercheurs arrivent dans les établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est d’apprendre à ces nouveaux entrants, titulaires d’une habilitation en expérimentation animale à maitriser les gestes techniques dont ils auront besoin pour leurs projets scientifiques. L’apprentissage technique dispensé lors de l’habilitation en expérimentation animale n’est pas suffisant d’un point de vue technique pour maitriser les gestes en autonomie. Cet apprentissage technique est essentiel pour manipuler les animaux sans stress et réaliser dans de bonnes conditions les protocoles auxquels ils sont associés. Pour les nouveaux entrants non formés aux gestes techniques, il est important de proposer une formation leur permettant de pouvoir acquérir les gestes techniques de base sur la souris (contentions des animaux sans stress, injections, prélèvements sanguins, anesthésies…), notamment dans les zones à risque infectieux. En effet, ces nouveaux entrants sont destinés à la manipulation d’animaux en zone à risque infectieux, le risque biologique pour le personnel doit donc être pris en compte. Une maitrise des gestes techniques sur les animaux est primordiale et doit être enseignée et évaluée pour s'assurer de travailler dans des conditions optimales, autant pour le manipulateur que pour l'animal.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de pouvoir former les nouveaux entrants aux bonnes pratiques, notamment ceux qui entrent dans les zones à risques infectieux. À court terme, la formation des nouveaux entrants permet le respect des bonnes pratiques et la prise en compte du bien-être animal au laboratoire. À long terme, un geste réalisé de manière sûre et maitrisée sera reproductible et donc bénéfique pour les protocoles scientifiques menés.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d’injections et de prélèvements sanguins, selon les besoins d’apprentissage des nouveaux entrants dans leurs protocoles scientifiques. Pour la majorité des cas, la formation technique se limitera à l’apprentissage de la contention, d’une injection et d’une méthode de mise à mort réglementaire. Les autres gestes seront enseignés selon les besoins, au cas par cas. Deux types d’injections simples peuvent être réalisées sur des animaux vigiles : dans l’abdomen et sous la peau (une fois, 15 secondes). Pour des protocoles nécessitant l’administration de substances par la voie orale, les nouveaux entrants pourront être formés à l’administration volontaire, sur des animaux vigiles (une fois, 30 secondes). Quatre autres types d’injections, plus complexes à mettre en œuvre seront enseignées. Ces injections seront réalisées sur des animaux sous anesthésie locale ou générale (une fois, 15 secondes, avec durée d’anesthésie variable, de 2 minutes à 1h,selon le geste enseigné). Trois types de prélèvements sanguins pourront être réalisés, sous anesthésie (une fois, 30 secondes). Chaque animal ne subira pas plus d’une injection et un prélèvement sanguin par session de formation (en excluant les injections nécessaires pour l’anesthésie et/ou l’analgésie).
Impact sur les animaux
Les injections peuvent provoquer une douleur transitoire de faible intensité au point d’injection. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer chez les animaux une douleur transitoire et un inconfort de faible intensité. La réalisation de ces gestes par des personnes peu expérimentées peut provoquer un stress et un inconfort passager pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Les animaux utilisés pour cet apprentissage sont des animaux initialement destinés à la mise à mort, car leur patrimoine génétique ne correspond pas aux besoins des projets scientifiques. Ces animaux ne peuvent pas être replacés en raison de leur caractère OGM (organisme génétiquement modifié).
Remplacement
Avant la mise en œuvre de gestes effectués sur l’animal vivant, les nouveaux entrants seront formés sur des souris de simulation ou sur des animaux morts. La souris de simulation est une souris en silicone permettant l’apprentissage de quelques gestes techniques (contention, administration orale volontaire et injection). La limite de ces méthodes de remplacement est que les gestes réalisés dans les protocoles scientifiques sont réalisés sur des animaux vivants, qui sont mobiles. Les animaux vivants ne seront utilisés qu’en cas de besoin, pour des gestes techniques que les nouveaux entrants doivent maitriser en autonomie pour leurs protocoles expérimentaux. Les habilitations à l’expérimentation animale sont essentiellement théoriques. Cette formation pratique est donc indispendable pour améliorer les conditions de manipulation des animaux et la fiabilité des résultats obtenus.
Réduction
Les animaux utilisés ne seront pas produits pour ces entrainements mais sont des animaux destinés à la mise à mort. En effet, les animaux utilisés seront des animaux anciens reproducteurs ou qui ne possèdent pas les caractéristiques génétiques leur permettant d’être inclus dans des projets scientifiques. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est limité à 4 par nouvel entrant. Si le nouvel entrant est déjà à l’aise avec les gestes qu’il doit effectuer, les animaux ne seront pas utilisés. Le nombre d’animaux utilisé sera adapté à la demande d’acquisition de gestes techniques. Ce nombre est réduit au maximum tout en permettant l’acquisition des actes techiques.
Raffinement
Les gestes de base en expérimentation qui seront réalisés lors de cette formation ne seront réalisés qu’après une bonne maitrise de la contention des animaux, sans stress. La supervision de cet apprentissage sera réalisée par un formateur expérimenté. La majorité des gestes techniques est réalisée sous anesthésie locale ou générale. Pour les gestes qui le nécessitent, des analgésiques adaptés seront utilisés. Des points limites prédictifs d’un échec de la maitrise du geste ont été définis afin d’éviter toute souffrance pour les animaux utilisés.
Choix des espèces
Les expérimentations réalisées au sein de notre établissement utilisateur sont essentiellement réalisées sur des souris. Former les nouveaux entrants sur la même espèce est essentiel pour mener à bien leurs expérimentations selon les bonnes pratiques. Les animaux utilisés seront des animaux de réforme adultes dont l’âge est compris entre 8 semaines et 9 mois. Pour les projets nécessitant l’entrainement sur un âge non prévu dans ce projet, le protocole d’entrainement sera décrit dans le projet scientifique affilié.
Etude du stroma FT2 muté
- Recherche fondamentale
- Oncologie
8 564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 816 d'entre elles boivent pendant six semaines une eau additionnée de doxycycline, 160 subissent jusqu'à cinq prélèvements de moelle osseuse au cours de leur vie, et les autres sont irradiées puis greffées de moelle avant de recevoir des injections dans le péritoine et des prélèvements mensuels. Certaines sont suivies jusqu'à 24 mois, soit une vie entière. Le porteur veut comprendre ce que devient, des années après une greffe, un environnement de moelle resté porteur d'une mutation, et affirme avoir "besoin" de travailler sur un "organisme entier" parce que les cultures cellulaires ne reproduisent pas ces échanges.
Objectifs
La moelle osseuse joue un rôle essentiel en produisant toutes les cellules du sang à partir de cellules immatures appelées cellules souches. Ce processus, très précisément contrôlé, dépend de signaux envoyés par l’environnement de la moelle, qui influencent le comportement de ces cellules. Quand des anomalies génétiques héritées viennent perturber ce mécanisme, cela peut mener à des maladies graves comme les leucémies. Le projet se concentre sur un gène particulier, impliqué dans la régulation de ces cellules souches. Des mutations héritées dans ce gène augmentent le risque de développer une leucémie. Ce gène est actif à la fois dans les cellules du sang et dans celles de l’environnement de la moelle osseuse. Ainsi, même après une greffe de cellules souches — qui permet de remplacer les cellules du sang — les cellules de l’environnement de la moelle osseuse restent porteuses de la mutation. L’objectif de cette recherche est de mieux comprendre comment ces mutations influencent les échanges entre les cellules du sang et leur environnement, surtout chez des patients greffés depuis plusieurs années. Pour cela, des souris génétiquement modifiées ont été créées pour reproduire ces mutations, afin d’observer leur impact au fil du temps (en particulier en mimant les évènements de la vie comme des infections).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un facteur de transcription dans l'hématopoïèse normale et leucémique. Une mutation de ce facteur entraîne une leucémie, qui ne peut être soignée que par une greffe de cellules souches. Cependant, lors de cette greffe, seules les cellules sanguines sont remplacées, tandis que les cellules de la moelle osseuse, qui produisent ces cellules sanguines, ne le sont pas. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l'impact à long terme de cet environnement muté de la moelle osseuse sur les cellules greffées, afin d'évaluer comment cet environnement pourrait affecter l’efficacité et la durabilité de la greffe.
Procédures
2816 animaux seront soumis a l'ingestion d'eau supplémentée de doxycycline ,pendant 6 semaines (non toxique à la dose utilisée). 160 animaux subiront un prélèvement de moelle osseuse maximum 5 fois au cours de leur vie sous anesthesie et analgésie. Lles autres animaux subiront une transplantation de moelle osseuse necessitant une irradiation de 2 minutes maximum et une injection de cellules (en anesthesie et analgésie, maximum 20 secondes). Au bout d’un mois pour permettre la prise de greffe, ces animaux subiront une injection de certaines drogues dans le péritoine (moins de 20 secondes en contention) à des doses non mortelles pour une souris sauvage. Ces souris seront ensuite étudiées par prélèvement régulier (maximim une fois/mois) de moelle osseuse et de sang.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de moelle osseuse, réalisés sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et ne sont effectués qu’une fois par mois maximum au cours de la vie de l’animal. Cette procédure est considérée de sévérité modérée. Les expérimentations impliquant une transplantation nécessitent une irradiation préalable, également de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de l’animal pour une durée inférieure à deux minutes. Une greffe de moelle osseuse est ensuite effectuée quelques heures après l’irradiation afin de garantir la survie de l’animal et de greffer les cellules d’intérêt, cette procedure dure moins de 2 minutes anesthesie comprise. Une surveillance étroite est assurée dans les heures qui suivent, et du gel hydratant est ajouté dans les cages durant la première semaine post-procédure.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour permettre l'analyse des tissus de ces animaux
Remplacement
Nous avons validé au laboratoire, in vitro et in vivo , que les mutations hétérozygotes du gène d'interet impactent la différenciation des cellules hématopoïétiques et induisent un état qui pourrait précéder une leucémie. Les mutations que nous étudions sont des mutations germinales et donc exprimées à la fois dans les cellules sanguines et dans les cellules du microenvironnement médullaire. Afin de déterminer la part intrinsèque (aux cellules sanguines) et extrinsèque (stroma) dans ce dysfonctionnement des cellules hématopoïétiques nous avons besoin de le faire sur un organisme entier et en particulier en créant des chimères ayant des cellules du microenvironnement muté et des cellules hématopoïétiques normales (comme après une greffe chez les patients mutés) et inversement. Pour remplacer l’utilisation des animaux, nous allons également utiliser les cellules de ces souris pour réaliser des tests de différenciation ex vivo (coculture des différentes combinaisons de cellules). Les modèles murins sont utilisés majoritairement par la communauté scientifique internationale pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans des pathologies hématologiques. De nombreux outils d’analyse moléculaire sont mis en place dans ces modèles : Le modèle murin est un modèle d'étude en cancérologie et particulièrement dans les cancers du sang. En effet, la production des cellules du sang se fait grâce à des protéines très conservées entre l'espèce humaine et murine.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et une analyse statistique adaptée aux petits échantillons, optimisant ainsi nos protocoles et réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Les travaux de la littérature et des test statistiques adaptés au petits echantillons nous aident à déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour garantir la valeur scientifique de l'expérience et éviter qu'elle ne doive être reproduite. De plus, les études longitudinales nous permettent de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental comprenant l'utilisation de cylindres de coton pour réduire le stress potentiel et la présence d'igloos rigides rouges dans toutes les cages pour offrir un abri sécurisé. En cas de comportement inhabituel tel que la prostration, un pelage terne et hirsute, ou des signes de blessures infligées par d'autres animaux, l'individu concerné est isolé et reçoit une attention renforcée. Une perte de poids soudaine dépassant 20% du poids initial de l’animal est également surveillée (selon une grille de scoring en annexe). Des soins appropriés sont alors prodigués, incluant la désinfection des plaies ou un accès facilité à la nourriture si nécessaire. Si aucune amélioration n'est constatée malgré ces mesures, des décisions seront prises pour mettre fin à la vie de l'animal de la manière la plus humaine possible afin de prévenir toute souffrance inutile, en accord avec les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les souris immunodéficientes NSG sont hébergées dans un environnement répondant aux normes « Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) » pour prévenir l'apparition de phénotypes dommageables). Les prélèvements médullaires (de degré de sévérité modérée) sont réalisés sous anesthésie et analgésie, avec l'animal placé sur une plaque chauffante et surveillé attentivement jusqu'à son réveil. Les personnes effectuant ces prélèvements sont formées à cette technique et possèdent les compétences nécessaires pour manipuler les souris et effectuer les gestes techniques dans le respect du bien-être animal. L'animal est surveillé et une grille de «scoring » est appliquée: ses critères principaux sont: le poids corporel et la taille; l’apparence physique, la posture et démarche, les signes cliniques, l’environnement (état de propreté de la cage par exemple), le comportement non provoqué et le comportement après stimulation. Ces critères sont notés de 0 à 3, 0 étant normal, 1 à surveiller attentivement, 2 soins si nécessaires et 3 mise à mort .
Choix des espèces
La communauté scientifique internationale privilégie l'utilisation de modèles murins pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans les pathologies hématologiques, en raison de la conservation des gènes et des voies de signalisation entre l'Homme et la souris. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris en hématopoïèse sont souvent extrapolables à l'humain. De nombreux outils d'analyse moléculaire et cellulaire sont déployés dans ces modèles, permettant une analyse fine à l'échelle de la cellule unique Nous réaliserons des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, en incluant des périodes à différents âges (1, 3, 6 et 12 mois) ainsi que durant le vieillissement (souris âgées de 24 mois minimum). Ces différentes étapes permettront d’observer l’évolution de l’hématopoïèse, chez la souris pouvant être extrapolée chez l’Homme (hématopoïèse jeune, adulte et clonale) dans des conditions basales. Les patients ayant notre gène d'interet muté sont soumis tout au long de leur vie à des stimulations répétées de l’hématopoïèse par des virus, des bactéries, etc. Nous allons les mimer par injection de certains produits stimulant la formation des cellules sanguines.
Nouvelles stratégies pour inverser l’immunosuppression des glucocorticoïdes et améliorer le traitement du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à seize injections en vigile, deux injections sous anesthésie, cinq gavages et dix séances d'imagerie de vingt minutes. Des tumeurs leur sont greffées dans un flanc ou dans les deux, puis mesurées tous les deux ou trois jours. Le projet teste si neutraliser une protéine restaure la réponse immunitaire antitumorale chez des patients sous corticothérapie, un bénéfice que le porteur place au conditionnel et à long terme. Il écrit par ailleurs que les chimiothérapies employées, dont l'oxaliplatine et la mitoxantrone, "n'entraînent pas de nuisances chez la souris aux doses utilisées".
Objectifs
Le système immunitaire est fortement influencé par des facteurs tels que les glucocorticoïdes, dont les taux augmentent notamment en situation de stress psychologique. Ces interactions jouent un rôle déterminant dans la réponse immunitaire, y compris dans le contexte oncologique. Le succès des traitements anticancéreux, qu’il s’agisse de chimiothérapie, de thérapies ciblées ou d’immunothérapie, repose en grande partie sur leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale efficace. Certaines chimiothérapies, comme la mitoxantrone et l’oxaliplatine, induisent une mort cellulaire immunogène, capable de stimuler puissamment le système immunitaire contre les cellules tumorales. Cependant, l’utilisation des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICIs) est souvent associée à des effets secondaires inflammatoires ou auto-immuns nécessitant une corticothérapie. Par ailleurs, les glucocorticoïdes sont également largement prescrits en oncologie pour contrôler des symptômes tels que la douleur, la dyspnée ou les œdèmes associés aux traitements comme la radiothérapie et la chimiothérapie. Leur action immunosuppressive peut compromettre les effets bénéfiques des traitements anticancéreux en inhibant l’immunité antitumorale. Dans des expériences in vitro récentes, nous avons observé que les glucocorticoïdes induisent la sécrétion et l’expression d’une petite molécule spécifique et que la neutralisation extracellulaire de celle-ci inhibait les effets secondaires induits par les glucocorticoïdes. Le présent projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle la neutralisation de notre protéine pourrait non seulement restaurer ou renforcer la réponse immunitaire antitumorale induite par la chimiothérapie et l’immunothérapie, mais aussi contrecarrer les effets immunosuppresseurs des glucocorticoïdes administrés en parallèle des traitements antinéoplasiques.
Bénéfices attendus
Si nos hypothèses se vérifient, ce projet permettra de valider dans des modèles précliniques une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d'autres thérapeutiques et immunothérapies. À long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie au développement de combinaisons thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées, en particulier chez les patients nécessitant une corticothérapie pour le contrôle des effets secondaires des traitements anticancéreux.
Procédures
Les animaux seront soumis à : Soit 1 injection sous anesthésie générale (2min), 15 injections sur animaux vigiles (
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention peuvent stresser transitoirement et légèrement les animaux, au cours des injections, gavages et avant les séances d'imagerie. Il peut apparaitre une irritation au niveau du point d’injection induisant un prurit léger. La croissance des tumeurs peut provoquer une gêne mécanique et induire une perte de poids modérées.Les chimiothérapies n'entraînent pas de nuisances chez la souris aux doses utilisées.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est indispensable car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire. Actuellement, il est, en effet, impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel et mature in vitro/ex vivo ou in silico (modélisation mathématique et informatique).
Réduction
Une analyse statistique a été effectuée afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie générale (isoflurane). Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. En effet, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Ensuite, notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Et pour finir, la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques en oncologie. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris femelles de cinq semaines, choisies parce que le projet porte sur le lymphœdème qui suit la chirurgie du cancer du sein, elles sont 370, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une opération d'une vingtaine de minutes sous anesthésie leur provoque un lymphœdème, puis trois injections dans le derme leur administrent des vecteurs à ARN circulaires censés faire repousser les vaisseaux lymphatiques. Le porteur reconnaît que la chirurgie et le lymphœdème provoquent des douleurs modérées. Les souris sont ensuite transportées vers un second établissement où on les tue pour prélever les tissus, une modification que le porteur présente comme se faisant sans ajout d'animaux.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué́ dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphœdème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphœdème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. La réalisation de la dernière étape des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphœdème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphœdème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphœdème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permette de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphœdème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Etudes d’efficacité d’un médicament vétérinaire par suivi de la réponse immune : évaluation chez des espèces alternatives (MODIFICATION 2)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Cochons d'Inde : 50
Hamsters dorés : 50
350 rongeurs, 250 souris, 50 cochons d'Inde et 50 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun pouvant être suivi jusqu'à cinq mois, entre administrations d'un vaccin vétérinaire et prises de sang, avant un prélèvement sanguin terminal, tous étant tués à l'issue. Le site, la voie, la dose, le nombre et l'intervalle des injections sont ajustés d'une étude à l'autre, et des souris sont aussi immunisées pour produire des anticorps monoclonaux ou du sérum polyclonal comme réactifs de laboratoire, sans que le nombre de prises de sang ni la méthode de production des anticorps soient précisés. Le bénéfice décrit se limite à connaître le niveau de réponse immunitaire induit par le vaccin, en vue de mettre sur le marché des médicaments vétérinaires. Le porteur présente ces rongeurs comme des "modèles alternatifs" aux études sur chiens, chats et chevaux, qu'il range parmi "les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur".
Objectifs
Dans le cadre du développement d’un nouveau vaccin à tester, le nombre de souris doit être augmenté à 250 individus. Le projet consiste à immuniser des rongeurs (espèces modèles) avec un vaccin dans le but de : - Evaluer l’efficacité d’un vaccin par suivi de la réponse immune chez l’animal. - Produire, chez la souris, des anticorps monoclonaux ou du sérum polyclonal en tant que réactifs de laboratoire
Bénéfices attendus
Les études d’efficacité permettent de connaitre le niveau de réponse immunitaire induit par le vaccin chez l’animal grâce à des paramètres évalués par des analyses de laboratoires.
Procédures
Après l’administration du produit selon les recommandations établies, les paramètres cliniques (état général, poids, température…) et la réponse immune sont suivis (prélèvements sanguins). En fonction de la bibliographie et des connaissances acquises sur les produits, les conditions d’administration du produit (site et voie d’administration, doses, nombre d’injection, et intervalle entre les injections) sont optimisées. Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. La finalité de ce projet est de mettre sur le marché des médicaments vétérinaires présentant un risque minimal et de permettre aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations. La durée des études peut aller jusqu’à 5 mois et dépend de l’objectif de l’étude, du type de produit étudié et de l’avancement du projet (étapes de recherche amont ou développement).
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide et moins douloureuse et traumatisante possible. L’administration du produit et les prélèvements sanguins peuvent occasionner un stress et une douleur légère de quelques minutes
Devenir
Les animaux font l’objet d’un prélèvement sanguin terminal et sont euthanasiés en fin d’étude. Dans des cas exceptionnels, pendant l’étude, si l’animal atteint les points limites, il est euthanasié.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’efficacité par suivie de la réponse immune doit être évaluée sur l’animal. De même, la production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux nécessitent l’utilisation de l’animal. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un produit consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à minimiser le nombre d’animaux utilisés en limitant le risque d’études non conclusives.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal est réalisée lors de certains prélèvements. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
Ces études sur rongeurs sont des modèles alternatifs pour les études sur chien, chat et cheval. Les chiffres sont donc basés sur l’expérience (études antérieures et bibliographie) et les référentiels du modèle canin, félin et équin. Cette utilisation s’applique dans le cadre des 3R afin d’utiliser les espèces les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l’angoisse ou de subir des dommages durables en préservant l’objectif scientifique et la qualité du résultat. D’autant que l’efficacité d’un produit par suivi de la réponse immune ne peut pas être testées in vitro. La production de sérum polyclonal ou d’anticorps monoclonaux chez la souris est un modèle de référence largement reconnu dans la bibliographie. Les procédures utilisant des rongeurs sont réalisées après le sevrage (dès 21 jours). Les caractéristiques de ces animaux sont bien connues à cet âge ; il s’agit de l’âge qui offre une meilleure sensibilité pour le modèle. Ces animaux sont communément utilisés à cet âge (bibliographie, données fournisseurs agréés).
Gestion de la production de souris immunodéficientes à phénotype dommageable pour l’étude de la réponse immunitaire dans le cancer
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un poinçon d'un millimètre dans l'oreille sous anesthésie, ou un millimètre de queue coupé sur animal vigile, 2 600 souris immunodéficientes vont être utilisées ainsi, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour produire et trier une lignée destinée à l'étude du mélanome. Les reproductrices et les petits qui n'ont pas le génotype recherché sont tués à la fin de la période d'accouplement. Ceux qui l'ont sont gardés vivants pour un projet ultérieur. Le porteur affirme que le phénotype dommageable de ces souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie, sans indiquer combien d'animaux relèvent de chacun de ces deux sorts, ni comment le chiffre de 2 600 a été établi.
Objectifs
Malgré les progrès récents dans la prise en charge du mélanome, il s’agit toujours d’une maladie de mauvais pronostic. Les cellules du système immunitaire, en particulier les lymphocytes T et B, émergent comme des acteurs importants du contrôle de la progression tumorale et sont les cibles des immunothérapies du cancer. Nous proposons d’élever des souris immunodéficientes afin d’évaluer le rôle des lymphocytes dans le contrôle de la progression des cancers. Ces travaux pourraient à terme mettre en évidence des biomarqueurs prédictifs de réponse aux immunothérapies et/ou permettre de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques .
Bénéfices attendus
Malgré un intérêt grandissant dans le domaine de l’immunologie et des immunothérapies des cancers, les mécanismes orchestrant la fonction des lymphocytes sont encore peu connus. Nos travaux pourraient mettre en évidence des biomarqueurs de réponse/résistance aux thérapies du cancer, et de nouvelles cibles potentielles d’immunothérapie.
Procédures
Un morceau de tissu (poinçon de 1mm) sera prélevé à l’oreille, sous anesthésie isoflurane, afin de marquer et génotyper certains animaux (1 minute environ). Sur certains animaux, un morceau de queue (1mm) sera prélevé sur animaux vigiles (5 secondes).
Impact sur les animaux
Stress dû à la contention et douleur légère due au prélèvement de tissu chez certains animaux. Stress et mal-être dû à des infections par pathogènes opportunistes (peu probable dans nos conditions d'hébergement).
Devenir
Les souris reproductrices ainsi que les petits non porteurs du génotype recherché, seront mis à mort à la fin de la période d’accouplement. Les petits porteurs du génotype recherché seront gardés en vie dans le cadre d’une utilisation continue dans DAP ultérieure.
Remplacement
Nous avons effectué de nombreuses expérimentations in vitro ainsi que des analyses bio-informatiques, des lymphocytes dans la progression tumorale. Cependant, la pertinence préclinique de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour confirmer cet effet. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes alternatifs fiables.
Réduction
Le nombre d’accouplements décrits dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir les souris nécessaires à nos expérimentations.
Raffinement
La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux une fois par semaine. L'environnement sera enrichi avec du coton cardé et des maisonnettes seront ajoutées dans la cage d'accouplement. Aussi, le phénotype dommageable des souris immunodéficientes ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées.
Choix des espèces
Le choix de la souris s’explique par l’existence de modèles tumoraux bien décrits et maîtrisés au laboratoire, et par l’existence de lignées transgéniques essentielles à nos travaux, et par les outils d’analyse (anticorps) disponibles. Nous utiliserons des souris de 8 à 9 semaines du fait de leur maturité sexuelle.
Neuroprotection des motoneurones de la moelle épinière dans des modèles SLA : mécanismes et biomarqueurs thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Constituer le dossier d'une demande d'essai clinique de phase I/II, voilà à quoi vont servir 1 732 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles portent trois lignées transgéniques de sclérose latérale amyotrophique, dont l'une où la souffrance s'installe à l'âge adulte et s'aggrave pendant trois à quatre mois. Chacune reçoit une injection dans le canal rachidien sous anesthésie, puis passe dix à quinze fois quatre tests moteurs, préhension, endurance musculaire, extension des membres et coordination. Le porteur indique que les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo, et renvoie au conditionnel le bénéfice pour des patients dont l'espérance de vie reste inférieure à cinq ans après le diagnostic.
Objectifs
Les motoneurones (MNs) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Nous avons identifié une protéine exprimée et sécrétée par les interneurones qui est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale de cette protéine synthétisée au laboratoire permet de bloquer la neurodégénérescence pendant 3 mois, et son injection répétée permet de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. En utilisant trois lignées transgéniques murines validées de la SLA présentant des impacts progressifs sur la survie des motoneurones nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine recombinante à court, moyen ou plus long terme, en analysant en parallèle le comportement ainsi que les données physiologiques et histologiques des animaux transgéniques et des groupes contrôles appropriés, soit un total de 1732 souris.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. Cette maladie est progressive et fatale. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. Une protéine recombinante humaine promeut la survie des MN. Ce projet évaluera l'activité de cette protéine dans plusieurs modèles animaux de la SLA. Il permettra notamment d'étudier les biomarqueurs putatifs et d'évaluer l'activité de la protéine par l'analyse d'échantillons de plasma. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission d’une demande d’essai clinique de Phase I/II.
Procédures
Une injection intrathécale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 15 minutes et sera effectuée une seule fois. Des évaluations de la capacité motrice par 4 tests moteurs seront réalisées 10-15 fois sur animaux vigiles. Les animaux seront soumis à un test de préhension qui durent 2 minutes, un test d’endurance musculaire qui durent 3 minutes, un test d’extension des membres qui durent
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voûtée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les modèles de souris SLA utilisés dans ces expériences perdent progressivement leur capacité motrice à des moments bien définis et prévisibles. Pour le premier modèle, les phénotypes durent plusieurs mois, sont modérés et se déclenchent uniquement après induction. Pour le deuxième modèle, la souffrance est légère et s’installe dans la durée à l’âge adulte. Pour le troisième modèle, la souffrance se déclenche à l’âge adulte et devient de plus en plus sévère pendant 3 à 4 mois.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau, moelle épinière et muscles seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques.
Remplacement
L’identification des biomarqueurs affectés par la PER pour utilisation dans des essais cliniques nécessite des modèles animaux de la SLA. Les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo de la SLA pour la validation de PER en tant que cible thérapeutique.
Réduction
Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à une injection intrathécale suivie de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses et/ou prélèvements sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.
Raffinement
Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine, pour éviter le stress de l'isolement, et sont observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours avec alimentation plus riche. Pour évaluer les points limites, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciale), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront une alimentation enrichie. Les animaux à mobilité réduite auront de la nourriture et de l’eau au sol pour leur faciliter l’accès.
Choix des espèces
La souris est majoritairement utilisée dans le domaine des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. La SLA est une maladie neurodégénérative mortelle qui affecte de nombreux systèmes chez l'homme. Il a été démontré que les modèles murins récapitulent un certain nombre de ces caractéristiques. Les souris présentent une atteinte multi-systémique, notamment du cerveau, de la moelle épinière, des jonctions neuromusculaires et des muscles, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation d'agents thérapeutiques potentiels pour la SLA. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de PER dans des modèles murins adulte de la maladie SLA étant donné que cette maladie neurodégénérative se déclare normalement chez l’adulte. La maladie sera déclenchée à 2 mois d’âge dans le modèle choisi. Nous prévoyons donc d’injecter la PER après ce stade afin d’évaluer sa capacité à bloquer le phénomène de dégénérescence progressive des motoneurones.
Participation des prostaglandines PGE2 et PGD2 dans la physiopathologie cardiaque secondaire au stress métabolique et au vieillissement chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Nourries pendant dix semaines d'un régime riche en gras et en sucre qui les rend obèses et peut les rendre diabétiques, 480 souris enchaînent trois séries d'examens aux semaines 1, 8 et 10, échographie cardiaque sous anesthésie, mesure de composition corporelle et test de tolérance au glucose de deux heures quinze. Sept injections dans l'abdomen s'y ajoutent pendant les deux dernières semaines, après des jeûnes de six heures. L'ensemble est rangé dans le niveau de souffrance le plus faible, alors que le porteur décrit des animaux qui se déplacent difficilement, boivent et urinent plus que la normale et ont le pelage graissé. Une partie de ces souris a 20 à 22 mois. Toutes sont tuées à l'issue, le cœur et les vaisseaux prélevés pour y chercher la fibrose.
Objectifs
Les études épidémiologiques montrent une forte augmentation des maladies cardiovasculaires associée au vieillissement de la population mondiale. Le vieillissement du tissu cardiaque s'accompagne d'une diminution progressive de la compliance du ventricule gauche, empêchant un remplissage passif correct. Le coeur est affecté par une perte significative de cardiomyocytes par nécrose et/ou apoptose, tandis que la prolifération des fibroblastes cardiaques augmente et la matrice extracellulaire s'accumule. Outre les caractéristiques de la fibrose, les coeurs des personnes âgées sont plus enclins à développer un dysfonctionnement cardiaque et une fibrose après une lésion de l'organe. D'autre part, le syndrome métabolique observé chez les patients diabétiques ou obèses génère également un remodelage cardiovasculaire et augmente fortement la prévalence de l'insuffisance cardiaque dans ces populations, surtout lorsqu'elles sont âgées. Un phénotype pro-inflammatoire chronique de bas grade apparaît dans le tissu cardiaque vieillissant et diabétique. Ce phénomène s'explique, en partie, par une perte de capacité à résoudre l'inflammation, créant un déséquilibre entre les mécanismes pro- et anti-inflammatoires, et est corrélé à un risque accru de développer des complications cardiovasculaires. Nos études préliminaires ont montré une augmentation importante de la signalisation de la prostaglandine E2 dans le coeur des souris âgées, mais également chez les souris âgées soumises à un régime riche en gras et en sucre. En ce qui concerne la prostaglandine D2, sa fonction n'est pas clairement définie, bien qu'elle soit fortement représentée dans le coeur murin et humain, des effets protecteurs et délétères ont été rapportés sur le coeur et les cardiomyocytes. Néanmoins, la prostaglandine D2, est décrite comme régulatrice du métabolisme et de la sensibilité à l'insuline. La biosynthèse de plusieurs oxylipines apparaît dans les cellules sénescentes et renforce l'arrêt prolifératif des cellules. Sachant qu'il existe une corrélation entre la présence de cellules sénescentes et le développement de l'insuffisance cardiaque, il est pertinent de déterminer le rôle de cette molécule dans le vieillissement cardiaque. A ce jour, le modèle murin est, à nos yeux, indispensable et doit faire suite à nos résultats préliminaires in vitro afin d'asseoir nos hypothèses. Valider notre concept in vivo nous semble obligatoire avant d'envisager toute application chez l'homme.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de la morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. La prévalence des maladies cardiaques dans les populations vieillissantes augmente fortement dans nos sociétés, malgré les progrès de la prise en charge. A long terme chez l'Homme, la description de ces atteintes et la compréhension des mécanismes pathologiques nouveaux lors de traitement. Le projet déploie les dernières avancées technologiques pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques.
Procédures
Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie, l'animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Pour les échographies, l'anesthésie est d'une durée de dix minutes et est répétée 2 à 3 fois selon les groupes ; à la semaine 1, à la semaine semaine 8 et à la semaine 10. Pour les mesures de la composition corporelle, l'acte d'une durée de 2 minutes est répété 2 à 3 fois, en vigile selon les groupes, à la semaine 1, à la semaine 8 et à la semaine 10. Pour le test de tolérance au glucose, l'acte d'une durée totale de 2 heures 15 est répété 2 à 3 fois, en vigile selon les groupes; à la semaine 1, à la semaine 8 et à la semaine 10. Pour le traitement en intrapéritonéal, l'acte d'une durée totale de 10 secondes est répété tous les 2 jours pendant les semaines 9 et 10, soit un total de 7 injections pour les groupes concernés.
Impact sur les animaux
Le régime riche en gras et en sucre induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche auront un suivi plus précis avec des remplissages de biberon et des changements de litières plus fréquents si nécessaire. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie, l'animal peut mettre quelques minutes à récupérer.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort. Les tissus/organes et le sang seront prélevés et analysés par différentes approches (histomorphologie, marquages immunohistologiques, expression de gènes et western blot) pour déterminer les processus physiopathologiques intervenant dans le remodelage tissulaire et l'apparition de la fibrose.
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s'affranchir du modèle animal pour les études de la fonction cardiaque en conditions physiopathologiques.
Réduction
Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s'affranchir du modèle animal pour les études physiopathologiques cardiaques. Les effets du régime seront évalués par différents tests statistiques, soit pour comparer les souris au sein d'un même groupe, soit entre deux groupes, soit entre plusieurs groupes.
Raffinement
Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l'animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, la perte de poids, l'absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à la mise à mort de l'animal. Les animaux sont hébergés dans une zootechnie agréée et sous surveillance quotidienne de zootechniciens qualifiés, avec un suivi régulier par notre responsable du bien-être animal.
Choix des espèces
Le remodelage cardiaque murin est bien décrit dans la littératur . Tout comme chez l'homme, la plupart des souris développent un coeur fibrotique et dysfonctionnel en vieillissant, aggravé lors d'un stress métabolique. Les mécanismes gouvernant le remodelage ventriculaire semblent proches de ceux proposés chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte, une partie d'entre eux de 5 à 7 mois et l'autre partie de 20 à 22 mois.
Étude de l’efficacité d’une molécule améliorant la fonction vasculaire dans des modèles de sepsis chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2 216 souris vont être utilisées dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever les organes vitaux. Un sepsis leur est provoqué, avec pour effets annoncés une baisse d'activité, un stress, une chute de température et la mort d'une partie des animaux. Chacune reçoit jusqu'à quatre injections et un prélèvement sanguin à la veine de la queue sur animal vigile, certaines une ponction cardiaque sous sédation profonde. Le porteur attend de cette molécule une preuve de concept sur la protection des vaisseaux sanguins, et ramène le nombre de 2 216 souris à des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés, sans autre précision.
Objectifs
Le sepsis est une complication grave d’origine infectieuse, qui peut être mortelle malgré des traitements souvent coûteux. Il provoque une réaction inflammatoire excessive qui détériore les vaisseaux sanguins et perturbe fortement la circulation. Aujourd’hui, protéger les vaisseaux est devenu une priorité pour mieux soigner cette maladie. Des chercheurs ont identifié une nouvelle molécule capable de renforcer les vaisseaux sanguins. Cette étude vise à évaluer l'efficacité de cette molécule à améliorer la prise en charge du sepsis, et à déterminer dans quelles conditions elle serait la plus bénéfique, seule ou en association avec des antibiotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la preuve de concept de l’efficacité de cette molécule à protéger les vaisseaux sanguins lors d’une infection grave. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de meilleurs traitements contre différentes infections du sang, en précisant comment et quand utiliser cette molécule. Il pourrait aussi permettre d’identifier un marqueur biologique associé, utile pour suivre son efficacité. Cette étape est essentielle pour envisager l’utilisation future de cette molécule dans la prise en charge du sepsis.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (maximum 4, durée 1 min), à 1 prélèvement sanguin à la veine de la queue (maximum 1, durée 1 min). Ces interventions seront réalisées à l’état vigile. Des animaux seront soumis à des ponctions cardiaques réalisées sous sédation profonde.
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvement sanguin réalisé peuvent occasionner un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Le sepsis provoqué peut entraîner une diminution d’activité, un stress, une baisse de température et la mortalité des animaux.
Devenir
Une fois les animaux mis à mort, nous prélevons les organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Toutes les études préliminaires ont été conduites sur des modèles in vitro, cela nous a permis de sélectionner la molécule la plus pertinente à tester. Cependant le sepsis est une situation complexe impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux à utiliser a été calculé en se basant sur des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une surveillance stricte et rapprochée sera assurée. Les cages seront enrichies (coton, maison en carton) pour limiter hypothermie et stress. La réhydratation intrapéritonéale systématique visera à prévenir la déshydratation. Des points limites adaptés permettront l’euthanasie anticipée si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour mimer une infection sévère (sepsis) chez l’Homme. Elle permet de reproduire l’ensemble des complications associés à cette maladie, notamment le dysfonctionnement des vaisseaux et d’organes. Nous utilisons des souris femelles et mâles adultes âgés de 10 à 12 semaines. À 10–12 semaines, les souris ont un système immunitaire pleinement développé et stable. Les jeunes souris (moins de 8 semaines) ont des réponses immunitaires encore immatures, tandis que les souris âgées peuvent avoir des altérations immunitaires ou des comorbidités. L'âge de 10–12 semaines représente un compromis idéal pour limiter ces biais. De plus, cet intervalle d’âge est couramment utilisé dans les modèles animaux, ce qui facilite la comparaison des résultats avec ceux d'autres études publiées. Inclure des souris mâles et femelles permet de détecter d’éventuelles différences de susceptibilité, de réponse au traitement ou de physiopathologie entre les sexes — ce qui est important, car le sepsis affecte différemment les hommes et les femmes chez l'humain. Cela répond aussi aux exigences croissantes en matière de rigueur et d’équité biologique.
Le rôle d’une population de lymphocytes dans le développement de la sclérose en plaques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux injections sous-cutanées et deux injections intraveineuses, de cinq secondes chacune, suffisent à déclencher chez 162 souris une sclérose en plaques expérimentale, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Le porteur compare ces injections à une vaccination et évoque les douleurs neuropathiques et l'hypersensibilité au froid sur le mode de l'hypothèse, en écrivant qu'il a été "proposé" que les souris malades puissent les développer. Il annonce n'analyser qu'une seule poussée suivie d'une rémission. Toutes les souris sont tuées à l'issue, le porteur indiquant qu'il ne peut pas exclure une santé instable et qu'aucune adoption ni réutilisation n'est possible.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie au cours de laquelle notre système de défense, le système immunitaire attaque les cellules du cerveau et de la moelle épinière. Cette maladie très invalidante affecte les sujets entre 30 et 40 ans et le nombre de cas augmente considérablement. Elle s’établit par une poussée suivie d’une phase asymptomatique. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement contre cette maladie. Actuellement les approches cliniques consistent à réduire l’inflammation associée à la destruction du cerveau et de la moelle mais n’empêchent pas de nouvelles poussées. Il y a donc un besoin urgent de comprendre comment cette maladie est mise en place et de définir les molécules qui préviennent de son développement. Nous avons découvert un type de globules blancs qui in vitro attaquent les cellules du cerveau et de la moelle. Le développement de ces cellules est bloqué par une protéine que nous avons aussi identifiée. Ce projet vise à fournir la preuve que cette protéine prévient du développement de la sclérose en plaque par son action sur les globules blancs incriminés. Pour cela, nous conditionnerons les souris pour développer une sclérose en plaque par une approche standardisée qui consiste à deux injections favorisant l’activation des globules blancs, comme lors d’une vaccination et leur migration vers le cerveau et la moelle. Le suivi de signes cliniques et de la rémission sera pratiqué. Des approches in vitro et de modélisation informatique sont à l’origine de notre hypothèse. une validation chez un mammifère, tel que la souris, permettra de confirmer que la molécule que nous avons identifiée prévient de la maladie et donc d’ouvrir enfin la voie vers un traitement efficace de cette maladie.
Bénéfices attendus
L’application directe de ce projet est de proposer à la population une thérapie contre la sclérose en plaque en empêchant les globules blancs de détruire les cellules du cerveau et de la moelle.
Procédures
Les animaux recevront deux injections sous-cutanées et deux injections intraveineuses, toutes réalisées sous anesthésie. Un médicament sera administré par voie sous-cutanée. Chaque injection durera environ 5 secondes. À la fin de l’expérimentation, les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde, puis une chirurgie terminale sans réveil sera effectuée.
Impact sur les animaux
Comme chez l’homme, il a été proposé que les souris atteintes de sclérose en plaque peuvent développer des douleurs neuropathiques ainsi qu’une hypersensibilité froid. Certains actes d’injection sont assimilable à une vaccination et peuvent causer une douleur au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. En effet, la sclérose en plaque évoluant par pousser nous ne pouvons exclure que leur santé sera stable. Il n’est hélas pas possible de faire adopter ou de les replacer voire de les réutiliser.
Remplacement
Des tests in vitro et in silico ont été menés en amont pour évaluer si les cellules que nous pensons dangereuses pour les cellules du cerveau l’étaient. Malheureusement la maladie est complexe et implique le système immunitaire et le système nerveux ( le cerveau la moelle épinière) et seul une approche in vivo nous permettra de démontrer le rôle des cellules incriminées dans la sclérose en plaque et de valider le rôle de la molécule dans la prévention de la maladie
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit a son strict minimum tout en permettant de s’assurer que les résultats seront exploitables. Notre stratégie implique des groupes d’animaux contrôles communs et une réflexion optimale de la génération des animaux. Notre projet implique des étapes clés qui conditionnent la suite des autres étapes. Les organes des souris serviront aussi pour d’autres analyses in vitro ou seront congelés pour être proposés à la communauté scientifique et ainsi réduire le nombre d’animaux en expérimentation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité dans ce projet. Un suivi quotidien sera assuré par la structure du bien être animale afin de détecter rapidement tout signe de mal-être, comme l’isolement, des mouvements anormaux, un ralentissement de l’activité, des selles molles ou un manque de toilettage. Les gestes sont pratiqués régulièrement par du personnel certifié. Pour améliorer leur confort, les souris bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des nids en carton pour se cacher et des bâtonnets en coton cardé pour construire leur propre abri. Les souris étant des animaux sociaux, toutes seront maintenues en groupe afin de respecter leur comportement naturel. Si un isolement doit se faire pour le confort de l’animal, il sera fait au moyen d’un système ne coupant pas le contact olfactif sonore et visuel pour ne pas stresser l’animale et faciliter son retour. Nous sommes conscients que certaines procédures peuvent entraîner un stress ou une douleur. mais tout sera mis en œuvre pour les minimiser. L’anesthésie gazeuse, l’administration d’un antalgique et d’un anesthésique local seront systématiquement utilisés pour limiter la douleur. Une alimentation adaptée sera également mise à disposition avec de la nourriture gélifiée placée au fond de chaque cage pour faciliter l’accès en cas de besoin. Tout au long de l’expérimentation, l’état général des souris sera surveillé de près, en tenant compte de leur comportement, de leur hydratation, de leur poids et de toute réaction inflammatoire éventuelle au site d’injection. Ces mesures, associées à la manipulation des animaux par un personnel formé, garantiront une prise en charge attentive et adaptée afin de réduire au maximum toute souffrance. Il est à noter que comme chez l’homme la maladie comprend des poussées et des phases de rémission. Une seule poussée suivie de rémission sera analysée.
Choix des espèces
La souris, âgée de 2 à 6 mois et de sexe indifférent, développe une sclérose en plaques qui, anatomiquement parlant, est identique à celle de l’Homme. Son système immunitaire et nerveux sont très bien décrits et les outils pour les étudier sont mis en place.