Souris
Projet matrice témoin chez les rongeurs
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 90
Saignés à blanc sous anesthésie puis tués, 900 souris et 81 rats fournissent du sang et du plasma exempts de molécule active, destinés à calibrer des méthodes de dosage. 100 souris et 9 rats, placés jusqu'à 24 heures en cage individuelle pour un recueil d'urine et de fèces, sont gardés vivants et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de disposer de cette matrice témoin et qu'aucune méthode alternative ne permet de la produire. Il précise qu'aucune approche statistique n'a été faite pour réduire le nombre d'animaux, le seul levier étant d'abaisser le seuil de quantification de la méthode analytique.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de fournir la matrice témoin (par exemple du sang, du serum, du plasma, urine , fécès) en utilisant les animaux contrôles et/ou les animaux de remplacement afin de permettre le dosage des échantillons. Si ces animaux ne sont pas suffisants pour recueillir les quantités nécessaires, exceptionnellement des animaux pourront être commandés dans ce but et devra être préalablement validé par la SBEA. Il est indispensable d'avoir à disposition de la matrice témoin, exempte de molécule active, pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages.
Bénéfices attendus
Les matrices témoins permettent de réaliser une gamme ou des contrôles qualités pour quantifier la molécule dans le même type d'échantillon pour éviter un "effet matrice" (réponse de la molécule différente selon l'échantillon). Ainsi la moléculde d'intérêt se comporte de la même manière dans les échantillons qui servent à quantifier que dans ceux qui doivent être dosés. Cela valide le rendement d'extraction de la molécule d'intérêt et permet d'assurer l'exactitude de la méthode. Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 90 rats, 1000 souris sur 5 ans soit 18 rats et 200 souris par an. Cela représente environ 6 études rats et 20 études souris par an. C'est le nombre d'animaux minimal pour pourvoir fournir les quantités des différentes matrices témoins nécessaires.
Procédures
Pour un prélèvement de sang: Les animaux seront soumis à une anesthésie générale (anesthésie gazeuse) et un prélèvement terminal sera réalisé. Les animaux seront euthanasiés à la suite du prélèvement. La durée du prélèvement sera de l'ordre de la minute. Ce prélèvement sanguin servira à fournir de la matrice témoin en plasma ou en sang. Pour générer de la matrice témoin de féces ou d'urine, la collection d'échantillons se fera de manière individuelle dans des hébergements dédiés, sans manipulation. Les échantillons d'urine et de fecès seront collectés sans aucune manipulation des animaux, en individuel dans une cage prévue pour une durée maximale de 24h.
Impact sur les animaux
Pour réaliser le prélèvement de sang terminal, le placement de l'animal dans la boite d'anesthésie peut engendrer du stress. Pour effectuer des recueils d'urine ou de fècès de façon individuelle, l'animal sera placé dans une cage de recueil prévu à cet effet. Il aura un contact visuel et olfactif avec ses congénères et la durée maximale inférieure à 24h. Cela peut également engendrer un stress pour l'animal.
Devenir
Les animaux ayant eu un prelèvement sanguin terminal seront tous mis à mort. Le prélèvement terminal correspond à un prélèvement sanguin trop important correspondant la l'exsanguination de l'animal. La survie des animaux et leur réutilisation n'est pas possible. Le prélèvement sanguin terminal sera réalisé selon les bonnes pratiques vétérinaires et la réglementation en vigueur. Les animaux ayant eu seulement un recueil d'urine et de fèces pourront être gardés en vie et être réutilisés dans un autre projet ou pour générer de la matrice témoin sang, plasma, serum.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de générer de la matrice témoin, il est indispensable de recourir à l’animal. En effet la non utilisation de matrice témoin entraine un biais dans la méthode. Si l'échantillon qui permet la quantification est différent de celui à quantifier, la méthode n'est pas exacte.
Réduction
Pour ce projet, il est envisagé d'utiliser environ 90 rats et 1000 souris sur 5 ans soit 18 rats et 200 souris par an. C'est le nombre d'animaux minimal pour générer de la matrice témoin sur une durée de 5 ans. Aucune approche statistique n'a été faite pour réduire le nombre d'animaux dans ce projet. La seule méthode pour réduire ce nombre est de diminuer le seuil de quantification de la méthode analytique ce qui diminue les besoins en matrice et donc les besoins en animaux. Pour chaque demande, un formulaire justifiant les volumes et le nombre d'animaux nécessaire est demandé au Donneur d'Ordre.
Raffinement
Le prélèvement terminal et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie générale en absence d'autres congénères. Les animaux sont placés dans le compartiment d'anesthésie un par un et le délai entre la mise dans le compartiment et le moment de l'endormissement de l'animal est inférieur à 2 minutes. La mise à mort des animaux se fait dans une autre salle pour éviter tout contact visuel ou olfactif chez les autres animaux en attente d'anesthésie, pouvant provoquer un stress pour eux. Pour les recueils d'urine ou de fécès, les animaux seront placés en cage de recueil individuellement mais auront toujours un contact visuel et olfactif entre eux. Une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Les animaux hébergés en groupe auront, dans leurs hébergements, la présence d'enrichissements variés et renouvelés (buchettes et balles en bois, cachettes, tunnels ...). Un visite des hébergements est réalisée à minima 1 fois par semaine par le vétérinaire responsable. Dans ce projet les points limites sont : - Animal présentant une perte de poids supérieur à 20 % par rapport à son poids basal; - Animal ayant un comportement inhabituel (prostré, poils ébouriffé, signes d'agressivités); - Animal présentant des fèces liquides, diarrhéiques. Si l'un des points limites est atteint, alors l'animal sera exclu du projet et sera pris en charge par le vétérinaire désigné. L'animal pourra être euthanasié, décision prise par le vétérinaire désigné, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Dans les études précliniques, le rat et la souris sont les espèces de référence pour les études réglementaires, il est très souvent nécessaire d'avoir de la matrice témoin (sang, serum, plasma, excretas). Ceci est indispensable pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Jeunes adultes ayant un âge entre 7 et 12 semaines environ. Cela dépendra des objectifs de l'étude pour laquelle la ou les matrices témoins seront collectées.
Développement et caractérisation des effets d’un nouveau traitement innovant de la maladie d’Alzheimer à l’aide de modèles murins.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour accumuler dans leur cerveau les protéines de la maladie d'Alzheimer, les souris de ce projet développent vers six à huit mois des lésions entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement. 1 284 souris vont être utilisées, 924 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de queue au génotypage, puis jusqu'à dix-neuf administrations intranasales sous anesthésie, une à trois séances d'imagerie de trois heures et des tests de mémoire dont une épreuve de nage. Toutes sont tuées à six ou sept mois pour prélever le cerveau, le porteur ajoutant qu'elles ne pourraient de toute façon pas être placées ni réutilisées du fait de leur modification génétique.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre et se dépose sous forme de plaques ou s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière sang-cerveau qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau, cependant, elle rend aussi difficile le passage de molécules thérapeutiques. Ces dernières années, une technologie de petites molécules thérapeutiques, appelée nano-anticorps a été développée, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Une approche complémentaire pour contourner cette barrière, consiste à administrer les médicaments par voie nasale. En effet, certaines zones situées à l’avant du cerveau, près du bulbe olfactif (zone du cerveau impliqué dans l’odorat), au-dessus des fosses nasales, offrent un passage plus accessible grâce à de petites ouvertures dans l’os du crâne et permettent ainsi la pénétration accélérée de molécules thérapeutiques. Par ailleurs, il existe des types de matériaux particuliers appelés thermogel qui à température ambiante sont liquides, ce qui les rend faciles à appliquer et qui au contact de la chaleur du corps, se transforment en gel. Cette transformation permet au médicament de rester en place et d’être libéré progressivement sur plusieurs heures. Cela en fait une excellente option pour ce projet, car ils aident les petites molécules thérapeutiques, comme les nano-anticorps, à adhérer à la muqueuse nasale et à atteindre le cerveau plus efficacement. En résumé, ce projet vise à évaluer la combinaison de ces différentes technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Des nano-anticorps visant les agrégats de protéines seront diffusés à partir de thermogels appliqués dans les fosses nasales. Nous déterminerons si cette stratégie, testée chez l’animal modèle de maladie d’Alzheimer (souris génétiquement modifiées pour reproduire des accumulations de protéines), permet de freiner la propagation des lésions et d’améliorer les capacités de mémoire des animaux traités.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante pour le diagnostic et le traitement de la maladie d’Alzheimer. Si les résultats s’avèrent concluants cela pourrait contribuer à évaluer cette nouvelle méthode de diagnostic de la maladie et cette nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme. Ainsi, à plus long terme, ces recherches pourraient donc permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes pour les patients et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Tous les jeunes souriceaux produits auront un prélèvement, à l’état vigile, d'un fragment de l’extrémité de la queue pour définir leur patrimoine génétique (moins d’une minute par animal, une fois). Une partie des animaux recevra une seule administration de notre thérapie ou son contrôle. Cette administration sera réalisée (durée de l’administration : 45 secondes environ) sous anesthésie générale pour une durée de maximum 5 minutes Pour une partie de ces animaux des séances d’imagerie par résonance magnétique (IRM) seront effectuées avant et, ou, après l’administration : 1 à 3 séances d’IRM (3 heures maximum par séance, à 44h d’intervalle minimum), le tout sous anesthésie générale. Si la mise en place du thermogel est validée sur les procédures précédentes, une autre partie des animaux recevra plusieurs administrations de notre thérapie ou son contrôle (19 administration au total, durée de chaque administration : 45 secondes environ), le tout sous anesthésie générale (durée de maximum 5 minutes).Ces animaux réaliseront ensuite des tests comportementaux visant à évaluer leur mémoire (des objets et des lieux) : 2 tests répartis sur une durée de 9 jours. Le premier test sera composé de 3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours, et le deuxième test consistera en 4 essais par jour pendant 5 jours (essais de 90 secondes maximum) puis 1 essai de 90 secondes maximum le sixième jour. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 6 à 8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur patrimoine génétique. Un léger saignement est à prévoir. Les administrations et examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale et donc sont associés aux risques anesthésiques suivants : risque d’hypothermie, risque de déshydratation et risque d’anomalies cardiaques et respiratoires. Le risque sera très faible pour les administrations puisque la durée d’anesthésie sera inférieure à 5 minutes. Les administrations pourront générer une légère douleur et un inconfort et possiblement des saignements locaux limités. Les tests comportementaux impliqueront un stress lié au placement dans un nouvel environnement et un risque d’hypothermie lorsque l’animal sera mouillé.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux post-mortem à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études in vitro, dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Dans le cadre de ce projet les études vitro ont permis de sélectionner les meilleurs agents thérapeutiques à tester sur l’animal. Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permis ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux pour ce projet (1284 souris) est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature. Les résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Les animaux surnuméraires produits seront cédés, dans la mesure du possible, pour être utilisés dans d’autres projets.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un établissement agréé, dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (coton ou kraft pour faire un nid, bâtonnets de bois à ronger, maisonnettes). Un programme de suivi rapproché des lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer est mis en place afin de détecter l’apparition de symptômes cliniques liés à la modification génétique. Ce suivi sera réalisé à partir de 5 à 6 mois en fonction de la lignée et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées. Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir le plus précocement possible pour minimiser toute souffrance animale. La biopsie de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible, elle sera réalisée dans un endroit calme et le petit sera replacé immédiatement après le geste avec sa mère et le reste de la portée. Il sera surveillé immédiatement puis environ 30 minutes après pour s’assurer qu’il ne saigne pas et qu’il soit bien pris en charge par sa mère. Pour prendre en charge les différents risques liés à l’anesthésie générale des animaux plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-anesthésie sera également mise en place. Pour vérifier l’innocuité et la tolérance de nos administrations intranasales, nous ferons un suivi rapproché des animaux traités afin d’assurer une prise en charge rapide des éventuelles gênes ou douleurs qui pourraient être visibles avec l’avis du vétérinaire. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel environnement avant les tests pour minimiser le stress induit. Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés d’une heure minimum pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles particulièrement pertinents et largement utilisés dans la recherche, notamment pour l’étude du système nerveux. Leur génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines. Dans le cadre de notre projet 2 lignées transgéniques d’intérêt nous permettront de mener à bien nos recherches. Nous utiliserons ces souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux produits seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours après leur naissance. Cet âge est choisi car il permet de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre très tôt leur génotype. Toutes les expérimentations visant à évaluer notre thérapie seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les administrations seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 2 à 7 mois). Dans le cadre diagnostique, les administrations intranasales et examens d’imagerie associés seront initiés à 6 ou 7 mois (lésions denses). Les traitements thérapeutiques seront eux initiés à 2 ou 3 mois (début des lésions) sur une durée de 4 mois avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 6,2 ou 7,2 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.
Etude de la formation des cellules responsables de la réponse immunitaire médiée par les anticorps
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Gavées à deux et trois jours de vie, amputées d'un fragment de queue entre le cinquième et le onzième jour, puis soumises adultes à une injection et à six prélèvements sanguins, 1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 1 728. Toutes sont tuées à la fin pour analyse. Le porteur précise que seule l'injection sous-cutanée se fait sous anesthésie, les autres gestes étant pratiqués sur animal vigile parce qu'ils sont courts et maîtrisés par l'opérateur. Il justifie l'effectif par la seule affirmation d'avoir retenu le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans donner ni calcul ni taille de groupe.
Objectifs
La production d’anticorps protège contre des pathogènes mais provoque aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique un type de cellule particulier, appelé cellules dendritique folliculaire, qui se retrouve dans les ganglions lymphatiques et la rate. L’origine de ces cellules et leur mécanisme de différenciation ne sont pas bien connus, ce qui empêche la découverte de nouveaux médicaments contre ces maladies autoimmunes. Ce projet vise à mieux comprendre l’origine de cette cellule et à étudier l’implication d’un récepteur, qui pourrait alors être ciblé par de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur le développement du système immunitaire et la réponse immune. Etant donné que la protéine étudiée est actuellement ciblée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.
Procédures
Des souris nouveau-nés sont soumises à un gavage à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Les juvéniles (entre jour 5 et jour 11 après naissance) sont soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique (durée < 1 min). Les souris adultes sont soumises à une injection (durée < 1 min) et à 6 prélèvements de sang (durée du prélèvement < 2 min). L’injection par voie sous-cutanée s’effectue sur animal anesthésié. Les autres interventions se feront sur animal vigile car il s'agit de gestes courtes et qui sont parfaitement maitrisés par l'opérateur.
Impact sur les animaux
Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin peuvent être source de stress et de l’anxiété pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre l’origine des cellules dendritiques folliculaires et tester la fonction d’un récepteur dans leur formation. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes, les ganglions et la rate, où se trouvent ces cellules. Chez la souris, les structures des ganglions et de la rate sont bien connues et en plus sont identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement le du système immunitaire impliquant la formation des cellules folliculaires dendritiques.
Utilisation de faibles doses d’interleukine 2 dans un modèle murin d’autisme médié par une activation immunitaire maternelle pendant la grossesse
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue pour prélèvements et 60 femelles réutilisées dans d'autres accouplements ou d'autres projets. Trente femelles gestantes reçoivent une injection destinée à activer leur système immunitaire, pour que leur descendance développe un phénotype autistique. Une partie des 180 petits reçoit ensuite de la vitamine D dans son alimentation pendant six semaines et passe un test comportemental de quatorze heures, l'autre partie est opérée sous anesthésie et tuée sans réveil. Le porteur écrit que le projet répond aussi à la "nécessité" d'obtenir des données complémentaires in vivo en vue d'une publication, ce qui rend selon lui l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet,nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients
Procédures
Dans le cadre de ce projet, des femelles gestantes recevront une injection (animal vigile, 1 fois, quelques secondes) afin d’induire le modèle de troubles du spectre autistique dans la descendance qui sera étudié. Une partie de la descendance recevra une injection (animal vigile, 1 fois, quelques secondes) ou une supplémentation en vitamine par l'alimentation à visée thérapeuthique (animal vigile, 6 semaines en continu) et suivra un test comportemental non stressant (animal vigile, 1 fois, 14h avec enrichissement, accès à l'eau et la nourriture et en groupe). L'autre partie sera soumise à une chirurgie sans réveil (animal sous anesthésie et analgésie, 1 fois, 5 minutes) a des fins de meilleurs compréhension des mécanismes pathologiques.
Impact sur les animaux
L'injection d'une molécule pourra induire une douleur légère de courte durée aux femelles gestantes et va induire un phénotype de comportement autistique dans la descendance. Le changement de régime pourra induire une baisse de la consommation alimentaire de manière transitoire en raison de la néophobie du modèle animal. Une partie des animaux aura une chirurgie sans réveil. L'anesthésie lors de cette chirurgie pourra entrainer une hypothermie ou encore une détresse respiratoire. L'autre partie des animaux recevra une injection et suivra un test comportemental. L'injection peut induire un stress et une douleur légère de courte durée. Le test comportemental peut générer un stress transitoire.
Devenir
Une partie des femelles impliquées et produites dans le projet pourra être réutilisée. Les autres animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements nécessaires pour des analyses.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement du cerveau et la mise en place des processus comportementaux de socialisation. Ils sont donc nécessaire dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans les processus d'interactions sociales. Ce projet répond également à la nécessité d'obtenir des données complémentaires in vivo en vue d'une publication, rendant l'utilisation d'animaux indispensable.
Réduction
Au total 30 femelles et 180 petits de la descendance seront utilisés pour ce projet. Le nombre total d’animaux impliqués sera réduit au minimum. Les 15 mères n'ayant pas reçu d'injection induisant de l'inflammation, seront réutilisées pour d'autres accouplements programmés. De plus les 45 femelles issues de mère contrôle pourront être réutilisées dans d'autre projets. Concernant les tests comportementaux nous avons utilisés le nombre minimum d'animaux afin d'assurer la fiabilité des résultats avec une puissance suffisante. Par ailleurs, dans la suite, seuls les males seront utilisé pour la biologie et le comportement.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections sont réalisées rapidement par du personnel formé afin de limiter le stress des animaux. Les croquettes supplémentées en vitamine D sont de consistance normale et ne nécessite donc pas d'enrichissement particulier. Le système du test comportemental permet de maintenir les animaux en groupe ce qui réduit aussi le stress des animaux en procédure. La procédure chirurgicale sera effectuée sous anesthésie et analgésie et elle sera sans réveil. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris est un modèle validé en immunologie et particulièrement pour les études de développement de nouvelles immunothérapies. De plus, les comportements pro-sociaux de la souris commencent à être de mieux en mieux connus, même si les aspects liés à la communication chez ce modèle demandent à être approfondis, elle représente un modèle de choix pour l'analyse des comportements autistiques Les femelles seront utilisées entre 10 et 12 semaines pour la reproduction, à cet âge les femelles sont robustes et fertiles. Afin de compléter nos précédents résultats les mâles seront ensuite utilisés entre 8 semaines pour compléter nos précédents résultats et assurer la reproductibilité et 24 semaines afin de completer nos résultats pour évaluer le maintien de l'éfficacité clinique à long terme
Inflammation et autophagie : etude de la modulation de l’inflammation et l’autophagie sur la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et les transformations hémorragiques lors des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour des analyses post-mortem du cerveau, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties en vingt-quatre groupes de trente. Chacune subit une craniotomie de soixante-dix minutes pour accéder à l'artère cérébrale moyenne et provoquer un accident vasculaire ischémique, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie, à 24 heures et à cinq jours. Trente souris âgées de dix-huit mois sont incluses pour observer l'effet du vieillissement. Le porteur affirme que des techniques de remplacement n'apporteraient pas le même niveau d'information et présente la souris comme le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’inflammation et certains mécanismes cellulaires favorisent la fragilisation des vaisseaux cérébraux et les saignements lors des AVC ischémiques. En utilisant des inhibiteurs ciblant l’inflammation et les réponses cellulaires, nous analyserons leur impact sur la fragilité des vaisseaux après un AVC. Nous étudierons aussi le rôle d’une protéine produite par les cellules des vaisseaux sanguins en cas de stress ischémique, ainsi que l’influence du vieillissement. Ce dernier étant un facteur de risque clé dans les AVC, régulant les mécanismes cellulaires d’intérêts dans cette étude. Ce projet vise à mieux comprendre ces mécanismes pour proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour les traitements de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans la perméabilité de la BHE et les transformations hémorragiques après un AVC ischémique afin de pouvoir proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h et 5 jours après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale. Une partie des animaux seront soumis à la pose de cathéters intraveineux, et une autre partie des animaux recevront des injections intrapéritonéales.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effet indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - une perte de poids anormale (nuisance modérée associée à l'état post chirurgie) - des douleurs post-chirurgie (nuisance modérée associée à la chirurgie) - du stress induit par les déplacements des cages, la chirurgie, la manipulation des animaux par l'expérimentateur, les situations de réveil (nuisance modérée) - des déficits fonctionnels et/ou cognitifs (nuisance modérée associée à la chirurgie)
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours du projet (720) seront mis à mort pour les analyses post-mortem.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 720 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 720) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8). Notre projet comporte 24 groupes expérimentaux de 30 souris, soit 720 souris.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique pour prévenir toute douleur occasionnée par la procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés, et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable : signes de douleurs extérieures indexés sur le grimace-scale souris, absence de réaction, perte de poids. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l'issue de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. es souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte (n=690) ainsi que des souris agées (18 mois) (n=30). Ces stades sont classiquement utilisés dans la littérature pour l’étude de la neuroinflammation et des AVC.
Évaluation par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) de l’innocuité et de l’efficacité de molécules innovantes pour le traitement des AVC chez la souris et le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 5000
Venus des autres autorisations du même laboratoire, où des accidents vasculaires cérébraux leur sont provoqués, 9 600 souris et 5 000 rats sont transportés vers un appareil d'IRM installé dans un laboratoire partenaire. Cette autorisation ne couvre que les examens d'imagerie, déclarés en niveau de souffrance léger, et tous ces animaux seront tués pour prélever le cerveau. Chaque examen se fait sous anesthésie générale de dix à quarante-cinq minutes, répétée à cinq dates après l'accident vasculaire, avec pose d'un cathéter dans la veine de la queue pour injecter un agent de contraste. Le porteur qualifie l'IRM de méthode non invasive garantissant une approche respectueuse du bien-être des animaux non-humains, et affirme qu'aucune méthode alternative n'atteint le niveau d'information de l'expérimentation animale.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC), qu'ils soient hémorragiques ou ischémiques, constituent des pathologies neurologiques majeures, causées respectivement par la rupture ou l'occlusion d'un vaisseau cérébral. À ce jour, il n'existe aucune stratégie pharmacologique efficace pour atténuer les conséquences d'un AVC hémorragique, et les traitements de l'AVC ischémique sont limités par des effets secondaires et une efficacité variable. Notre laboratoire a développé et validé plusieurs modèles murins (souris et rats) qui reproduisent fidèlement les différentes formes d'AVC. Ces différents modèles sont essentiels pour refléter la diversité étiologique et épidémiologique observée chez l'Homme, permettant ainsi d'évaluer l’innocuité et l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques proposées par les industriels. Chaque modèle d’AVC a fait l’objet d'une DAP spécifique, regroupant des projets de recherche distincts avec des paramètres d'évaluation communs. Toutes les procédures expérimentales décrites dans ces DAP sont réalisées au sein de l’établissement principal, à l'exception de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) faisant l’objet de la présente DAP. L'IRM, réalisé dans un laboratoire partenaire, est un outil central dans toutes nos études et pour l’intégralité de nos modèles d’AVC. Elle permet de mesurer la taille et la localisation des volumes lésionnels et hémorragiques, d'évaluer l'intégrité de la barrière hématoencéphalique, le niveau d’inflammation parenchymateux ainsi que la diffusion sanguine et tissulaire dans des zones cérébrales précises. Ces informations sont essentielles pour comprendre les mécanismes de réponse aux traitements et leur efficacité. Cette DAP concerne l'ensemble des animaux des DAP précédemment déposées et acceptées, décrivant l’utilisation de l’IRM.
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de l'AVC ischémique repose sur l'administration de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à une thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la complexité de la procédure de thrombectomie, seule une minorité de patients (
Procédures
Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux se limitent principalement à l’anesthésie générale nécessaire pour les examens d'IRM. Cette procédure, bien que potentiellement répétée dans le temps, reste relativement courte : entre 10 et 45 minutes environ. La randomisation et l’équilibrage des groupes expérimentaux permettra de réduire la fréquence d’examen et donc la durée de l'anesthésie pour chaque animal. En dehors de cet aspect, l'IRM offre un avantage majeur : c'est une méthode non invasive, qui permet de déterminer l'efficacité des traitements sur de nombreux paramètres sans intervention chirurgicale ou prélèvement. Ainsi, les contraintes pour les animaux restent limitées, garantissant une approche respectueuse du bien-être animal. Les acquisitions IRM, programmées aux moments clefs de chaque projet (J0, J1, J2, J5 et J14), se dérouleront sous anesthésie générale. Après une, l’animal sera installé sur le berceau de l’IRM, où l’anesthésie sera maintenue. Pour éviter la sécheresse ophtalmique, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de l'animal. Durant l’examen, une surveillance continue sera assurée grâce à un module de contrôle respiratoire, et le berceau sera chauffé pour maintenir le confort thermique. L’administration d’un agent de contraste intraveineux sera nécessaire pour certaines séquences spécifiques, impliquant la mise en place d’un cathéter dans une veine de la queue de l’animal sous anesthésie générale. Cette procédure chirurgicale est légère.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux se limitent principalement à l’anesthésie générale nécessaire pour les examens d'IRM. Cette procédure, bien que potentiellement répétée dans le temps , reste relativement courte : entre 10 et 45 minutes environ. La randomisation et l’équilibrage des groupes expérimentaux permettra de réduire la fréquence d’examen et donc la durée de l'anesthésie pour chaque animal. Il convient de noter qu’au cours du transport des animaux entre nos locaux et l’appareil d’IRM situé à Cyceron, le trajet inclut un passage extérieur d’une dizaine de mètres. Pour minimiser le stress, nous utilisons un chariot de transport adapté, totalement fermé, maintenant les animaux dans l’obscurité complète. En dehors de cet aspect, l'IRM offre un avantage majeur : c'est une méthode non invasive, qui permet de déterminer l'efficacité des traitements sur de nombreux paramètres sans induire de douleur à l’animal. Ainsi, les contraintes pour les animaux restent limitées, garantissant une approche respectueuse du bien-être animal.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort selon la DAP correspondante permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ces projets représentent des étapes cruciales des tests d'innocuité et d'efficacité de nouvelles thérapies in vivo, faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations menées in vitro par nos partenaires industriels financeurs. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d'atteindre le niveau d'information fourni par l'expérimentation animale. Les connaissances actuelles, issues de la littérature et de l'expérience de notre laboratoire, positionnent la souris et le rat comme modèles de choix pour nos projets. Les rongeurs sont en effet parmi les espèces les plus étudiées dans le domaine de l'AVC, permettant ainsi une analyse comparative et critique fiable des résultats. L’utilisation de l’IRM constitue en lui-même une réduction et raffinement dans la mesure où il permet d’avoir un diagnostic de façon non invasive, répété longitudinalement sur le même animal. Obtenir les mêmes informations que celles produites par l’IRM utiliseraient un nombre d’animal beaucoup plus important puisque l’équivalent des données fournies par chaque séquence IRM équivaut à une analyse immunohistochimique du cerveau de l’animal. De plus, les données fournies sont translationnelles avec la clinique.
Réduction
Les données issues de la littérature préclinique, combinées à une analyse de puissance régulièrement actualisée avec nos propres résultats, permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux par groupe, en fonction du modèle d’AVC et des procédures expérimentales. Cette estimation repose sur une analyse de puissance et une répartition équilibrée entre les groupes. Cette approche garantit la détection de différences significatives tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Pour limiter le nombre d’acquisition IRM par animal, nous avons réparti les animaux en sous-groupes, chacun passant les examens à des jours spécifiques selon les besoins de l'étude. Cela permet de réduire la fréquence des anesthésies pour chaque animal tout en garantissant des données complètes et pertinentes pour chaque projet. Cette approche nous permet d'obtenir des données robustes tout en respectant les principes éthiques de réduction du nombre d'animaux utilisés, garantissant ainsi la validité scientifique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards conformes aux normes européennes et isolés des bruits extérieurs. Chaque cage sera équipée d’enrichissements variés dépendamment des souches animales et donc des projets. Ils auront également un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de leur séjour dans nos locaux. Leur bien-être sera suivi par du personnel qualifié, avec des contrôles biquotidiens cinq jours par semaine et quotidiens les week-ends et jours fériés. De plus, les animaux seront régulièrement pesés, au moins deux fois par semaine. Les animaux seront transportés de nos locaux à l’IRM situé dans le laboratoire partenaire dans un chariot adapté et fermé, garantissant un environnement sombre pour limiter leur stress. Ce transport, qui s’effectue en environ 5 minutes, inclut un passage extérieur d’une dizaine de mètres. Pendant les examens IRM, les animaux seront anesthésiés et un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle sera contrôlée grâce à une couverture chauffante. La fréquence et l’amplitude respiratoire seront surveillées en continu, permettant à l’expérimentateur d’ajuster l’anesthésie si nécessaire. Bien que la surveillance soit continue durant l'examen IRM, elle sera intensifiée pendant les premières heures suivant le réveil. En cas de signes de stress ou de souffrance non anticipés, la procédure sera immédiatement interrompue. Si les points limites définis dans cette DAP sont atteints, l’animal sera euthanasié conformément aux protocoles établis.
Choix des espèces
La souris et le rat occupent une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rongeur, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de ces espèces des modèles animaux privilégiés pour la recherche préclinique. Les souris utilisées seront âgées d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 35g pour les SWISS et OF1 et de 25g pour les C57BL/N. Les rats seront quant à eux âgés de 6 à 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 350g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Evaluation de l’efficacité de vésicules issues de cellules souches génétiquement modifiées sur deux modèles murins d’atteinte cornéenne
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 450 souris vont être utilisées, chacune opérée d'un œil sous anesthésie générale pendant trente minutes, puis soumise jusqu'à neuf séances d'imagerie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées à l'issue pour prélèvements. L'opération vise à reproduire une blessure de la cornée, avec pour effet attendu l'opacification de cet œil et une baisse de l'acuité visuelle, le second œil servant de témoin. Le porteur annonce des thérapies pour des pathologies oculaires mal prises en charge, alors que l'étape en jeu ici consiste à vérifier si des vésicules issues de cellules souches modifiées atteignent la cornée et en limitent les cicatrices.
Objectifs
L’objectif central de ce projet est le développement de thérapies pour l’œil. Physiologiquement, les cellules de la cornée assurent le maintien de sa transparence et participent à la préservation de la surface oculaire. Dans certaines maladies de la cornée (qu’elles soient génétiques ou inflammatoires) ou dans les cas de blessures cornéennes, ces cellules ne remplissent pas leur rôle ou peuvent être complètement détruites, ce qui entraine une opacification de la cornée et une perte – partielle ou totale – de la vision. Pour remplacer ces cellules détruites ou pathologiques, nous souhaitons évaluer le potentiel régénératif de cellules souches génétiquement modifiées et de dérivés de ces cellules (qu'on appelle vésicules), que ce soit pour le traitement de cicatrices cornéennes ou la préservation de la surface oculaire pathologique. Plus précisément, nous souhaitons valider la capacité des vésicules issues cellules souches modifiées génétiquement à (i) intégrer la structure de la cornée, (ii) limiter ou traiter les cicatrices cornéennes et (iii) évaluer leur capacité à restaurer un profil génétique normal dans un modèle d’atteinte de la surface oculaire. L’un des avantages d’une thérapie basée sur les vésicules par rapport à la thérapie cellulaire est que les vésicules peuvent être utilisées comme un médicament standard et ne présentent pas de risque de rejet. Afin de mettre à bien ce projet, nous aurons recours au modèle murin. La souris est en effet un modèle particulièrement adapté aux études des pathologies oculaires liées à la cornée. Malgré sa petite taille, la souris est proche de l'homme sur le plan de la physiopathologie des affections cornéennes, de la formation de cicatrices cornéennes ainsi que du renouvellement des cellules de la surface oculaire.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet de recherche est d’établir la possibilité de stabiliser, voire restaurer la transparence cornéenne dans un contexte pathologique. Le bénéfice de mettre en évidence la potentialité thérapeutique de nos particules génétiquement modifiées est multiple ; il permettra d’améliorer d’une part la description et compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la régénération cornéenne et d’envisager de nouvelles voies thérapeutiques pour des pathologies oculaires non ou mal prises en charge. Il s’agit d’une problématique de grande importance : en effet, on estime que les plaies de cornée représentent environ 7 à 14 pourcents des blessures traumatiques oculaires vues en unité d’urgence ophtalmologique.
Procédures
La chirurgie de l’œil sera réalisée une unique fois sur chacun des animaux sous anesthésie générale. La durée moyenne de l’intervention est d’environ 30 minutes (valable pour l’ensemble des animaux qui seront inclus dans le projet). Outre l’anesthésie générale, une anesthésie locale sous forme de goutte sera appliquée sur l’œil étudié et, en fin de chirurgie, des analgésiques seront administrés à l’animal. Les imageries seront réalisées sur tous les animaux. Le temps moyen d’une imagerie se situe entre 5 et 20 minutes. Les imageries d’une partie des animaux seront réalisées immédiatement après la chirurgie, puis à 24h et 48h, et enfin à 1, 2 et 4 semaines, soit au maximum 6 fois/animal et pour le restant des animaux avec d’autres techniques d’imageries 2 fois par jour les trois premiers jours suivant la chirurgie, puis à 1, 2 et 4 semaines ; soit au maximum 9 fois/animal (valable pour l’ensemble des animaux qui seront inclus dans le projet). Le traitement (à base de cellules ou de vésicules) est applicable localement, typiquement sous forme de gel ou de collyre. En gel, le traitement sera appliqué une unique fois suite à la chirurgie. En collyre, le traitement sera appliqué 2 fois par jours les 3 premiers jours puis une unique fois à 1 semaine puis 2 semaines. Le temps d’une application de collyre est inférieur à 1 minute, celui du gel autour de 5 min (durée typique de polymérisation du gel). (Valable pour l’ensemble des animaux qui seront inclus dans le projet). En fin de procédure, les animaux seront systématiquement euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des prélèvements pour analyse.
Impact sur les animaux
Le modèle étant celui d’une blessure cornéenne, il est attendu des nuisances similaires à celles de la pathologie humaine, à savoir une opacification de la cornée, entraînant sur cet œil une baisse de l’acuité visuelle. Les anesthésies générales gazeuses, ou fixes pour les expérimentations le nécessitant, peuvent générer un court stress à l’endormissement. Pour les anesthésies fixes, les animaux recevront une unique injection au niveau de l’abdomen ; cette injection peut générer une légère douleur au moment de l’introduction de l’aiguille. Il existe un risque très léger de péritonite en cas d’injections répétées. De plus, l’anesthésie peut entraîner un risque d’hypothermie ou, dans de très rares cas, un risque de décès. A la suite de la chirurgie, il peut arriver que les animaux ressentent transitoirement de légères démangeaisons au niveau de l’œil.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront euthanasiés immédiatement après la dernière session d’imagerie et des prélèvements seront systématiquement effectués pour des analyses post-mortem complémentaires.
Remplacement
En parallèle, des études in vitro sur des modèles cellulaires cornéens sont actuellement en cours : nous avons déjà mis en évidence que les cellules cornéennes étaient capables de capter correctement les vésicules et leur contenu. Toujours in vitro, nous avons également montré le bénéfice thérapeutique des vésicules (en particulier, leur activité cicatrisante et anti-fibrotique). Cependant, la complexité de la cornée et, a fortiori, sa régénération ne peut être complètement récapitulée in vitro. Il n’existe en effet pas à ce jour de modèles capables de reproduire l’ensemble des structures complexes cornéennes. Ainsi, afin de pouvoir prendre en compte la globalité des mécanismes de régénération (entre autres, les interactions cellules-cellules, la réponse immunitaire, etc.) et d’établir les mécanismes biologiques de cicatrisation impliqués, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. De plus, la finalité de cette étude étant le développement de stratégies thérapeutiques, la mise en place des voies d’administration adéquates des composés et leur biodisponibilité ne peuvent être seulement étudiées sur un modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et de pouvoir répondre à la question scientifique posée, tout en tenant compte de la volonté de limiter au maximum le nombre requis. Ce projet impliquera au maximum un total de 1450 souris. Le nombre d’animaux a été estimé à l’aide d’un logiciel statistique adapté. Toutes nos expériences seront analysées grâce à des logiciels statistiques dédiés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages avec un enrichissement tel qu’un tunnel en carton, des bâtons en bois, du coton,), avec nourriture et eau à volonté. Le nombre d'animaux par cage est limité à 5. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Un seul œil sera traité durant l’expérimentation. Le second œil sera systématiquement utilisé comme contrôle de référence. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être. Toute modification physique/comportementale anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux. L’application de l’échelle décisionnelle définie par notre Structure Chargée du Bien-Etre des Animaux permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement anti-douleur, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. De plus, afin de limiter tout stress et toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire.
Choix des espèces
La souris est un modèle particulièrement adapté aux pathologies liées à la cornée. Malgré sa petite taille, la souris est proche de l'homme sur le plan de la physiopathologie et des affections de la cornée mais également sur la formation des cicatrices cornéennes. De plus, il existe déjà un modèle murin de la pathologie ayant montré d’importantes similitudes physiopathologiques avec l’homme lors d’études histologiques préalables de leurs cornées. Au sein de notre équipe, nous possédons une bonne connaissance du comportement des souris et sommes donc aptes à juger de leur bien-être. La structure dans laquelle nous travaillerons est une structure possédant tout l’équipement spécifique pour réaliser l’imagerie de l’œil des souris. Les expérimentations se dérouleront sur des souris adultes (6-8 semaines) car il s’agit d’une période optimale pour la fonction cornéenne et sa régénération. De plus, à partir de 6 semaines, le tissu cornéen est mature et la taille de la cornée maximale.
« Le rôle d’IKAROS dans une forme pédiatrique de leucémie : facteur de la maladie ou cible pour la soigner ? »
- Recherche appliquée
- Cancers
Immunodéprimées et maintenues en cages individuelles ventilées pour éviter les infections, 200 souris vont être utilisées dans une étude sur une leucémie de l'enfant, 188 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de cellules leucémiques puis jusqu'à huit prises de sang hebdomadaires, et 160 souris reçoivent en plus vingt injections de chimiothérapie sur quatre semaines. Le porteur annonce que toute perte de poids sera traitée comme un signe de souffrance et un effet sévère, entraînant la mise à mort de l'animal concerné. Toutes sont tuées à la fin, sang, moelle osseuse et rate étant analysés pour y compter les cellules leucémiques.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d'une protéine dans un type de leucémie qui touche principalement les enfants. Nos études suggèrent que, contrairement aux autres formes de leucémie, cette protéine d'intérêt pourrait ici aider les cellules cancéreuses à survivre. Nous allons donc examiner si la disparition de la protéine d'intérêt dans ces cellules pourrait freiner la progression de la maladie. Pour ce faire, nous testerons un médicament déjà utilisé chez d’autres patients cancéreux afin de voir s’il pourrait devenir une nouvelle option de traitement pour ce type de leucémie. Auparavant, nous allons comparer deux modèles de souris afin de choisir celui qui se prête le mieux à notre étude. Ce travail pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques afin de mieux traiter certains enfants atteints de leucémie.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans un type spécifique de leucémie chez l’enfant. À court terme, il pourrait permettre d’identifier une nouvelle cible pour le traitement de cette maladie. Cela ouvrirait la possibilité d’utiliser un médicament déjà disponible en clinique, ce qui faciliterait une mise en application rapide pour les patients. Avantages à long terme : À plus long terme, cette recherche pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces et mieux ciblés contre la leucémie, avec moins d’effets secondaires. Cela améliorerait la qualité de vie et les chances de guérison des patients. En réduisant l’utilisation de traitements lourds et généralisés, elle pourrait également limiter l’impact environnemental lié à certains médicaments de chimiothérapie.
Procédures
Dans cette étude, plusieurs procédures sont réalisées sur des souris pour évaluer l’efficacité de traitements contre la leucémie. Jusqu’à 188 souris peuvent être concernées par des prises de sang, effectuées une fois par semaine pendant un maximum de huit semaines. Chaque prélèvement dure environ deux minutes et est réalisé par du personnel expérimenté. Une injection unique est également prévue au début de l’étude, pour chacune des souris. Cette intervention, qui dure environ vingt minutes par animal (temps de préparation compris), est suivie d’une observation quotidienne pour vérifier l’état de santé des animaux. Un autre traitement, sous forme de chimiothérapie, nécessite jusqu’à 160 souris. Il consiste en vingt injections réparties sur quatre semaines. Chaque injection dure environ deux minutes, et les souris sont observées juste après pour s’assurer qu’elles vont bien. Toutes les manipulations sont réalisées par groupes de cinq souris. L’expérimentation peut être arrêtée plus tôt que prévu si des résultats suffisamment clairs sont obtenus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Impact sur les animaux
Douleur : Certaines procédures, comme les prélèvements sanguins ou les injections, peuvent provoquer une douleur légère à modérée. Cette douleur est généralement brève et disparaît quelques minutes après l’intervention. L’apparition de la leucémie peut également entraîner des douleurs quelques jours ou semaines après l’induction, une fois la maladie installée. En cas de signes de douleur après l'établissement de la leucémie, les animaux seront immédiatement euthanasiés et examinés. Perte de poids : Les animaux seront pesés chaque semaine. Perte de poids sera considérée comme un signe de souffrance et un effet sévère, et l’animal concerné sera euthanasié. Réduction de l’activité ou de la mobilité : Certains animaux peuvent devenir moins actifs à cause de la maladie ou si le système nerveux est affecté. Une surveillance quotidienne sera mise en place. Si une forte réduction de la mobilité ou une incapacité à se déplacer persiste plus de deux jours, cela sera considéré comme un signe de détresse. Stress : Des manipulations comme les injections ou les prélèvements peuvent provoquer un stress léger et temporaire. Celui-ci dure en général moins d’une heure après la procédure. Un stress prolongé pourra être suspecté en cas de changements persistants dans le comportement. Changements comportementaux : Des modifications telles que léthargie, agitation ou agressivité peuvent apparaître après certaines interventions. Elles sont en principe transitoires, durant quelques jours. Si ces troubles persistent ou s’aggravent, une évaluation sera faite pour décider d’une éventuelle euthanasie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et analysés à la fin des procédures. Plus précisément, le sang, la moelle osseuse et la rate seront analysés pour détecter la présence de cellules leucémiques par cytométrie de flux.
Remplacement
Cette analyse in vivo est essentielle pour déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt dans les leucémie aiguë lymphoblastique, car elle permet d’étudier le comportement des cellules leucémiques dans un environnement biologique complexe, ce qui ne peut être réalisé par des techniques in vitro à ce stade du projet. En effet, les modèles in vitro ne reproduisent pas fidèlement les interactions biologiques et les mécanismes physiopathologiques présents dans un organisme vivant, limitant leur pertinence pour cette étude spécifique. Dans ce cadre, la souris constitue un modèle privilégié pour l’analyse des traitements en onco-hématologie, permettant de modéliser les interactions complexes entre les tumeurs, le système immunitaire et le microenvironnement — interactions impossibles à étudier de manière aussi complète avec des cultures cellulaires seules. De plus, les souris présentent des réponses thérapeutiques proches de celles observées chez les patients humains, ce qui les rend particulièrement adaptées pour tester et valider de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux sera ajusté en fonction des besoins expérimentaux, en s’appuyant sur des calculs préalables permettant d’optimiser la taille des groupes. Les expériences d’induction de la leucémie seront réalisées avec des groupes de 5 animaux, répétées 2, 3 ou 4 fois selon les résultats obtenus. Si la première série montre des résultats significatifs, les autres ne seront pas effectuées. Sinon, nous poursuivrons avec la deuxième série, et ainsi de suite, jusqu’à l’obtention de résultats significatifs, avec un maximum de quatre séries. Cette approche séquentielle permet d’interrompre l’étude dès que des données robustes sont disponibles, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires non nécessaires. Ainsi, la conception expérimentale suit rigoureusement le principe de Réduction des 3R : le nombre d’animaux est limité à ce qui est strictement nécessaire pour obtenir des résultats fiables, les données sont exploitées au maximum, et toute expérimentation redondante est évitée. Cette stratégie permet de concilier la validité scientifique avec un impact réduit sur les animaux.
Raffinement
Afin de minimiser les perturbations liées aux prélèvements sanguins, aux injections, au phénotype délétère induit et à l'induction de la leucémie, des mesures spécifiques seront mises en œuvre. Les animaux seront étroitement surveillés afin de détecter tout signe de souffrance ou effet secondaire du traitement avant d'atteindre le seuil de mortalité. Les méthodes suivantes seront utilisées : Suivi du phénotype délétère : Les souris sont immunodéprimées et donc gardées dans des cages individuelles ventilées pour éviter les infections. Induction de la leucémie : Les animaux seront surveillés quotidiennement et toute détérioration de leur état sera immédiatement évaluée. Si des signes de douleur ou de détérioration physique apparaissent (critères de douleur : perte de poids, modifications du pelage, comportement, etc.), les animaux seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance et analysés directement.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l’analyse des traitements en onco-hématologie. Modélisation d'interactions complexes : Les souris permettent d'étudier les interactions entre les tumeurs, le système immunitaire et le microenvironnement de manière bien plus fidèle que les cultures cellulaires seules. Évaluation de la réponse thérapeutique : Les souris présentent des réponses thérapeutiques proches de celles observées chez les patients humains, ce qui les rend précieuses pour tester de nouveaux traitements. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines, ce qui correspond à une phase de maturité du système hématopoïétique comparable à celle de l’adolescence, en accord avec le fait que nous étudions un cancer pédiatrique. Comme les deux sexes sont affectés par le sous-type de leucémie étudié, nous utiliserons des souris mâles et femelles
Etudes de maladies cérébrovasculaires héréditaires humaines chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
Une biopsie de queue de dix secondes et moins de trois injections par animal : ce sont les seuls actes déclarés pour 1 098 souris, dont 366 en niveau de souffrance léger et 732 en niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever leur cerveau à différents âges. Ce qu'elles subissent vient d'abord de leur génome, modifié pour reproduire deux formes héréditaires de maladie des petits vaisseaux cérébraux, la mort subite par accident vasculaire cérébral figurant parmi les effets annoncés. Le porteur remplace le tatouage par un poinçon à l'oreille pour limiter ce risque d'accident vasculaire, tout en rangeant la mort subite du côté des caractéristiques du modèle plutôt que des nuisances du projet.
Objectifs
Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont une cause majeure d’accidents vasculaires cérébraux récurrents chez l’homme, et aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Ce projet vise à étudier les lésions cérébrovasculaires dans des modèles souris reproduisant les anomalies génétiques de deux formes héréditaires fréquentes de ces maladies. Des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques seront effectuées sur des cerveaux prélevés à différents âges après la mise à mort des animaux, afin d’examiner l’évolution des lésions aux divers stades de la maladie. Ces études sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents et pour concevoir et évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Santé humaine : Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension et le traitement des maladies des petits vaisseaux cérébraux. À court terme : Valider la pertinence d’un modèle chez la souris pour évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant la protéine humaine mutée responsable de l’une de ces deux maladies. À moyen terme : Mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la seconde maladie afin de développer des approches thérapeutiques adaptées.
Procédures
Biopsie de queue, une fois, 10 seconde. Injections intrapéritonéales ou sous cutanées, moins de 3/animal, 10 secondes.
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors de la biopsie de queue. Stress et douleur légère de courte durée (environ 10 secondes) lors des injections intrapéritonéales ou sous cutanées. Mort subite de l’animal en lien avec la survenue possible d’accidents vasculaires cérébraux dans le modèle chez la souris de l’une des deux maladies.
Devenir
Les animaux des lots expérimentaux et de génotype d'intérêt sont mis à mort afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques.
Remplacement
La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, un modèle in vitro ou computationnel ne peut pas être substitué au modèle animal
Réduction
Les âges auxquels les animaux seront analysés ainsi que la taille des échantillons ont été déterminés en se basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes. Ainsi il ressort que 15 animaux/ groupe seront nécessaires pour les études histologiques ou biochimiques ; 12 à 24 animaux/ groupe seront nécessaires pour les analyses moléculaires sur cellules uniques selon l’âge étudié. Des tests statistiques adaptés aux types de comparaison intergroupes seront utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Pour minimiser le risque d’accident vasculaire cérébral chez les souris mutées mimant une des 2 maladies, les souris sont identifiées par poinçon à l’oreille et non par tatouage/biopsie de queue. Une grille de score et une liste de points limites ont été établis. Les différents actes réalisés chez la souris sont réalisés par des expérimentateurs chevronnés. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nouveaux nés de 1 et 7 jours, prépubères, jeunes adultes et adultes de 2 mois à 9 mois pour étudier les différents stades de la maladie
Ischémie-reperfusion rénale chez la souris : rôle des transporteurs de métabolites.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Anesthésiées, saignées jusqu'à cinq fois, opérées pendant une heure pour interrompre puis rétablir la circulation sanguine dans un rein, 360 des 480 souris de ce projet subissent une ischémie-reperfusion rénale. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les douleurs postopératoires peuvent se manifester pendant environ 72 heures et annonce des antalgiques. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes, ensuite placés dans une banque mutualisée avec d'autres projets.
Objectifs
La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque un manque d'oxygénation et des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la transplantation. Il est donc primordial de développer des stratégies thérapeutiques afin de limiter ces lésions. Des travaux précédents ont montré que la régulation de certaines molécules énergétiques appelées métabolites permettrait de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. Ce projet cherche à mieux comprendre comment certains métabolites et les transporteurs qui les font circuler, protègent les reins de souris contre les dommages causés par un manque temporaire de circulation sanguine et donc d’oxygènation.
Bénéfices attendus
A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par les transporteurs de métabolites afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion rénales. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le coeur, le pancréas. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.
Procédures
Tous les actes décrits se feront sous anesthésie. Tous les animaux (480) subiront au maximum 5 prélèvements de sang (durée de moins de 1 minute) et 1 injection (durée de moins de 1 minute) ou 1 chirurgie (durée de moins de 15 minutes) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'au moins 2 jours. Une partie des animaux (360) aura en plus une chirurgie d'une durée de 1 heure pour provoquer une ischémie-reperfusion et auront un maximum de 2 injections (durée de moins de 1 minute) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites.
Impact sur les animaux
Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un stress transitoire peu intense et un léger inconfort au réveil d'une quinzaine de minutes. Suite au prélèvement sanguin sous anesthésie, un stress de moins de 5 minutes peut être observé chez l'animal. Suite à la chirurgie sous anesthésie générale, les douleurs, qui peuvent se manifester pendant environ 72 heures, seront minorées par l'utilisation d'antalgiques. De plus, après chirurgie, peuvent être observées une légère perte de poids, une fatigue et une légère perte d'activité qui disparaissent sous 72 heures. Les prises de sang répétées sous anesthésie (acte de moins de 2 minutes) peuvent induire des douleurs qui peuvent se manifester pendant moins de 4 heures, ces douleurs seront minorées par l'utilisation d'antalgiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédures. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie rénale. Il est donc nécessaire d’évaluer sur un organisme entier, en utilisant un modèle animal, l'impact d'une réponse systémique suite à une séquence d’ischémie-reperfusion.
Réduction
Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire.
Choix des espèces
Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude nécessitant des reins matures notamment au niveau du réseau de vaisseaux sanguins.
Évaluation de la toxicité et de la pharmacocinétique de composés anti-infectieux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 210
Chercher la dose la plus forte qu'un animal peut recevoir avant que la toxicité devienne sévère : 760 souris et 210 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever organes et fluides. 45 études sont prévues sur cinq ans. Les animaux subissent des injections, un cathétérisme urétral qui peut enflammer la vessie, des administrations intranasales et des prélèvements sanguins répétés, avec pour effets annoncés une posture voûtée, un poil hérissé, des diarrhées, une gêne respiratoire et des hématomes. Le porteur présente le projet comme un moyen d'accélérer le développement de traitements contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et les délais des programmes de recherche et développement.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer la concentration maximale tolérée et à caractériser les profils pharmacocinétiques de nouvelles molécules anti-infectieuses chez la souris et le rat. L’objectif principal de l’étude est de déterminer la dose la plus élevée d’un composé pouvant être administré sans provoquer d’effets toxiques sévères chez les animaux, et ce, selon une voie d’administration donnée. Cette étape est essentielle pour évaluer la tolérance aiguë ou subaiguë d’un composé chez l’animal. Les traitements évalués incluent des antibiotiques, des antifongiques, des antiviraux, ainsi que des biothérapies innovantes comme les anticorps. Des observations cliniques et des analyses biologiques permettront d’évaluer les éventuels signes de toxicité ou d’effets secondaires. Les études de pharmacocinétique visent à déterminer comment un composé anti-infectieux est absorbé, distribué, métabolisé et éliminé dans l’organisme. Elle permet de mesurer l’exposition systémique après administration, notamment dans les tissus ciblés. Ces données servent à optimiser la posologie et à établir la relation entre la concentration et l’efficacité. Elle est essentielle pour prédire les conditions dans lesquelles le traitement sera le plus efficace. 45 études sont prévues pour la totalité du projet de 5 ans
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de sélectionner les doses maximales tolérées et les schémas d’administration optimaux des candidats thérapeutiques, afin de sécuriser leur usage dans les modèles infectieux. La concentration maximale tolérée constitue une étape fondatrice de la caractérisation préclinique ; elle assure à la fois la sécurité des animaux, la pertinence des doses testées, et la robustesse des données biologiques qui en découleront. Ce projet génèrera également des données de pharmacocinétiques robustes permettant de modéliser précisément la relation dose-exposition-efficacité. Ces informations orienteront le choix des molécules à prioriser et réduiront le recours inutile à des expérimentations ultérieures inefficaces. À moyen terme, les résultats obtenus renforceront la prédictibilité des études précliniques et amélioreront la transposabilité des données vers l’Homme ou l’animal. Cela contribuera à accélérer le développement de traitements innovants contre des infections graves ou résistantes, tout en optimisant les coûts et délais des programmes de recherche et développement.
Procédures
Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections et les douleurs liés au traitement. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). L'administration par voie urétrale nécessite l'installation d’un cathéter et peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes).
Impact sur les animaux
Dans le cadre des études de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, les composés anti-infectieux testés peuvent induire certains effets indésirables transitoires chez la souris et le rat. Des réactions légères sont attendues, telles qu'une diminution temporaire de l’activité, une perte de poids modérée ou une légère réaction inflammatoire au point d’injection. En fonction des doses et de la voie d’administration, des signes de toxicité plus marqués peuvent apparaître, comme un poil hérissé, une posture voûtée, une réduction de la mobilité, ou une altération de la respiration. Des troubles digestifs (comme une diarrhée), une irritation locale ou des complications liées aux prélèvements sanguins (hématome, saignement) peuvent également survenir. Tous les animaux seront suivis au moins quotidiennement, et en cas de signes cliniques sévères, des soins adaptés seront appliqués par le responsable du projet (sur avis du vétérinaire).
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers.
Remplacement
Plusieurs approches alternatives sont utilisées en amont pour limiter le recours à l’expérimentation animale pour l'évaluation des effets secondaires ou de la biodistribution. Les tests ex vivo, comme les coupes de poumon ou les explants intestinaux, permettent de tester localement des anticorps monoclonaux ou des peptides antimicrobiens, mais ne reflètent pas les effets systémiques, ni la diffusion du traitement. Les organoïdes intestinaux ou pulmonaires humains, ou les organes sur puce permettent d’étudier les effets localisés d’un traitement, mais ne modélisent pas la pharmacocinétique, la biodistribution ou l’immunité adaptative. Les modélisations informatiques, comme les simulations de liaison médicament-récepteur, ou les réseaux d’interactions immunitaires, sont utilisées pour affiner les posologies ou prédire des toxicités, mais nécessitent toujours une validation expérimentale. Seule l’expérimentation animale permet d’intégrer la complexité de la réponse immunitaire, de la clairance, de la toxicité systémique et de l’efficacité dans un organisme complet. Ces approches non animales sont néanmoins systématiquement mobilisées en phase précoce pour sélectionner les meilleurs candidats et optimiser les doses.
Réduction
Nous utilisons systématiquement des tests alternatifs comme le test de viabilité cellulaire, l’essai de cytotoxicité, l’analyse de paramètres inflammatoires, ou encore des modèles d’organoïdes humains pour sélectionner les composés les plus prometteurs avant toute phase expérimentale chez l'animal. Des modèles d'explant de poumon et de peau humaine reconstituée sont également utilisés pour évaluer la diffusion et l’irritation locale des produits candidats. Grâce à cette combinaison d’approches, nous réduisons significativement le nombre d’animaux utilisés tout en sécurisant la progression des thérapies testées.
Raffinement
Dans les études pharmacocinétiques, le raffinement repose sur des prélèvements sanguins peu invasifs (comme le micro-échantillonnage) et la réduction du stress par contention douce et habituation des animaux. L'utilisation de plans expérimentaux optimisés et de modèles bio-informatique permettent de raffiner nos protocoles. Le choix judicieux des temps de prélèvement et l'exploration de matrices alternatives (urine, salive) réduisent les interventions tout en assurant la qualité des données. Pour la détermination de la dose maximale tolérée, des protocoles adaptatifs avec escalade progressive des doses permettent de mieux contrôler l’apparition de toxicités. Des grilles d’évaluation clinique précises assurent l’arrêt rapide du traitement en cas de signes de souffrance. L’inclusion de biomarqueurs précoces permet d’anticiper les effets délétères avant qu’ils ne deviennent irréversibles. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. Par exemple, l’apparition de signes cliniques graves tels qu'une respiration difficile, ou une perte de réponse à un stimulus conduiront à l’interruption immédiate de l’expérience. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqûre...).
Choix des espèces
L’utilisation de la souris et du rat pour les procédures de détermination de la dose maximale tolérée et d’études pharmacocinétiques repose sur des considérations scientifiques, réglementaires et techniques. D’une part, la souris est l’espèce de référence en infectiologie préclinique, en raison de sa petite taille, de sa sensibilité bien documentée à de nombreux agents infectieux, et de la disponibilité de lignées standardisées. Elle permet une évaluation rapide de la tolérance aiguë d’un composé et de ses premiers paramètres pharmacocinétiques dans un modèle robuste, avec un nombre limité d’animaux et un faible volume de substance requis. D’autre part, le rat est utilisé en complément ou en seconde intention, car il permet des prélèvements sanguins en série plus volumineux, offrant une meilleure résolution temporelle dans l’analyse pharmacocinétique, et il est plus adapté à certaines voies d’administration. La complémentarité entre ces deux espèces permet donc d’obtenir des données fiables et conformes aux exigences des agences réglementaires. Dans le cadre des procédures de dose maximale tolérée et de pharmacocinétique, seuls des animaux adultes sexuellement matures ou jeunes adultes seront utilisés. Il s’agit d’un choix visant à garantir une réponse pharmacologique homogène, une tolérance physiologique suffisante, et une réduction des variables liées au développement ou au vieillissement. Chez la souris, les animaux seront âgés de 6 à 10 semaines, un stade où la croissance est stabilisée, la physiologie métabolique est mature, et le volume des fluides corporels est adapté aux manipulations et aux prélèvements sans risque excessif. Chez le rat, les animaux seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel les volumes sanguins autorisent des prélèvements sériels et où les capacités d’absorption, de métabolisme et d’élimination sont représentatives de l’âge adulte.
Rôle de l’exportine 7 associée à la schizophrénie dans la fonction et la maturation des cellules du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures quarante de tests comportementaux étalés sur un mois, puis dix jours de restriction alimentaire en cage individuelle : 1 911 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant 45 minutes pour modifier, chez leurs embryons, l'expression d'un gène associé à la schizophrénie dans le cortex frontal. Le porteur reconnaît que l'isolement social peut provoquer un stress modéré, une baisse de l'activité exploratoire et une apathie légère, et propose de le compenser par une roue d'activité et des bâtons à ronger. Il justifie le choix de la souris par la conservation des grandes étapes du développement cérébral entre souris et humain, pour une pathologie qu'il définit lui-même par des idées délirantes, un retrait social et des difficultés de planification.
Objectifs
Des études récentes montrent que les mutations de certains gènes augmentent considérablement le risque de schizophrénie, une pathologie invalidante qui touche environ un pour cent de la population adulte et se caractérise notamment par des idées délirantes, un retrait social, des difficultés de concentration et de planification. L’ensemble de ces symptômes de la schizophrénie sont mal traités par les médicaments actuellement disponibles, et les effets secondaires de ces traitements sont importants. L’impératif de trouver des traitements efficaces implique de mieux comprendre les fondements neurobiologiques de la schizophrénie. Bien que rares, les mutations génétiques qui confèrent un risque fortement accru de développer la schizophrénie permettent d’identifier des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la pathologie.
Bénéfices attendus
La schizophrénie est une pathologie courante (500 000 à 600 000 patients en France) et très invalidante. Les traitements pharmacologiques de la schizophrénie traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Les grandes classes d’antipsychotiques et leurs modes d’action ont très peu évolué au cours des 50 dernières années. Le manque de progrès dans le développement thérapeutique est en grande partie une conséquence de notre compréhension limitée des troubles moléculaires sous-jacents. Très récemment, des mutations rares mais pénétrantes (qui augmentent très fortement le disque de la pathologie) dans certains gènes spécifiques ont été identifiées. Ces mutations sont très informatives car 1) elles ciblent un gène donné et 2) elles peuvent être modélisées chez l’animal. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en modifiant l’expression d’un gène impliqué dans la schizophrénie dans les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont pertinents pour comprendre les mécanismes de la schizophrénie, et possiblement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
1) Femelles gestantes : chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur). Injection d’un composé par voie intrapéritonéale (5 minutes) 2) Souris transgéniques ou issues d’embryons modifiés génétiquement : Tests de comportement (6h40 en tout, répartis sur un mois). Pour le dernier test de comportement (1h48 minutes répartis sur 9 jours), les souris seront soumises à une restriction alimentaire modérée de 10 jours au total, commençant la veille du test, pour les inciter à aller chercher une récompense sous forme de nourriture. Une euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.
Impact sur les animaux
La perte d’expression du gène étudié par modification de gène au stade embryonnaire sera localisée uniquement dans le cerveau au niveau du cortex frontal. De ce fait, les changement du comportement liés à la perte d’expression devraient affecter sélectivement des comportements dépendants du cortex frontal (mémoire de travail, mémoire sociale). Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. La chirurgie peut induire un risque infectieux et de douleur associée à l’infection. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire. L’injection intrapéritonéale implique une contention et donc un stress momentané. Un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test des différents tests de comportements est attendu. Les souris sont placées en hébergement individuel durant la période de restriction alimentaire modérée destinée à inciter les souris à chercher une récompense lors d’un test de comportement. Cet isolement social pourrait entraîner un stress modéré, associé à des comportements comme une diminution de l’activité exploratoire ou une légère apathie. La restriction alimentaire peut entraîner une sensation de faim.
Devenir
Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie psychiatrique, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, notre étude de l'impact de la diminution d’expression d’un gène associé à la schizophrénie sur le fonctionnement du cortex nécessite d'utiliser des animaux pour pouvoir tirer des conclusions comportementales. Pour ces raisons, seule l’utilisation d’animaux permet d’aborder les mécanismes de régulation des fonctions corticales dans le cadre de cette étude. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la schizophrénie) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. En tout 1911 souris seront inclues dans le projet.
Raffinement
Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. La restriction contrôlée de nourriture chez certains animaux, destinée à accroître leur motivation pour effectuer un test comportemental, sera compensée par un environnement enrichi (fourniture de roue d’activité et de bâtons à ronger).
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale générée à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal prénatal sont des embryons à un stade de développement embryonnaire qui permet d’étudier à la fois les conséquences de la modification d’expression du gène étudié sur la prolifération et sur la migration des neurones immatures. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal posnatal sont des souris juvéniles (15 à 25 jours) ou jeunes adultes (60 à 100 jours).