Souris

Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie pendant une trentaine de minutes pour une électroporation in utero qui modifie le cerveau des embryons qu'elles portent. 288 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées, les souriceaux pour prélèvement de tissus, les femelles opérées parce que le porteur écarte une seconde intervention "pour raison éthique", les reproducteurs âgés faute de possibilité de replacement. Deux mutations d'un gène du développement cérébral produisent chez ces souris des défauts de comportement social que le porteur rapproche des troubles du spectre autistique. Il indique que les tests de comportement social sont bien établis dans cette espèce, sans nommer un seul de ceux qu'il emploiera.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris. Le projet nécessite une prolongation dans son exécution sans ajout d’animaux et un changement des deux Etablissements Utilisateurs (MODIFICATION).

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.

Identifiées par une puce sous la peau, anesthésiées, puis infestées dans l'abdomen par la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, 500 souris voient la masse parasitaire grossir pendant cinq mois au moins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque mois puis chaque semaine jusqu'à un poids limite de 65 grammes, et le porteur indique que la masse abdominale finit par gêner leur locomotion. Une ulcération de la peau du ventre frottant contre la cage entraîne la mise à mort immédiate. Les autres sont tuées pour récolter le parasite, qui servira à infester des renards en captivité et à produire des œufs.

Objectifs

L’échinococcose alvéolaire due à une infection par le parasite Echinococcus multilocularis est une maladie rare en France. Cependant, elle est fatale si non traitée et nécessite un traitement quotidien à vie qui peut entrainer des effets secondaires importants. La longue période asymptomatique (5-10 ans) rend extrêmement difficile l’identification des sources de contamination (contact avec carnivore, sol, aliments souillés, …) par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques excrétés dans l’environnement par les carnivores infestés. La disponibilité de matériel biologique du stade larvaire du parasite permet notamment l’infestation de renards. La production de fèces de renards contenant des œufs est indispensable pour la mise au point, validation et matériel de référence pour la réalisation d’analyses de diagnostic chez l’animal dans le cadre de la surveillance du parasite mais aussi la détection de la contamination environnementale et alimentaire ainsi que l’évaluation de la viabilité des œufs dans ces matrices ou le test de molécules en vue d’améliorer le traitement chez l’humain. L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat du parasite Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires afin de pouvoir disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire des larves parasitaires pour les infestations de renards (hôtes définitifs).

Bénéfices attendus

L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à la contamination de l’homme par ce parasite. Les larves de parasite produits permettront de compléter, suite à l’infestation des renards en captivité, le cycle parasitaire d’Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.

Procédures

identification par puce sur animaux anesthésiés par voie sous-cutanée :

Impact sur les animaux

L'infection par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. En cas d’ulcération cutanée lié aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage les animaux seront immédiatement mis à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la masse parasitaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour produire des protoscolex en laboratoire, en dehors de l’infestation des hôtes intermédiaires.

Réduction

Le projet utilisera environ 100 souris par an, soit 500 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de développement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de larves parasitaires qui est d’environ 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des trois souches larvaires de répéter l’infestation tous les trois/quatre mois sur des lots d’environ 15 souris. Aucune analyse statistique n'est prévue.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois dans les cages... Les animaux sont surveillées tous les jours et seront pesés mensuellement jusqu’à 3 mois, puis à partir du 4eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 65 gr. De la nourriture et de l'hydrogel seront disposés au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Une anesthésie par isoflurane est assurée pour les infestations par voie intra-péritonéale. Une grille de score est mise en place pour vérifier l'atteinte des points limites définis dans le projet, et l'atteinte d’un score supérieur ou égal à 60, entrainera l’administration d’un analgésique dans l’eau de boisson.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires du parasite Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement les campagnols. Comme il n'existe pas de méthode alternative pour produire des parasites, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le développement de la forme larvaire. Les animaux seront commandés au stade adulte et au poids de 30-35 gr.

Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, encore affaibli par un traitement supplémentaire, pour que des cellules de leucémie humaine se développent dans leur corps. 1 945 d'entre elles reçoivent cette greffe puis jusqu'à huit prélèvements de sang sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles développent la maladie transplantée et sont toutes tuées à la fin, pour mesurer où en était la progression du cancer. L'établissement se présente comme prestataire de services et vend ces modèles à des laboratoires publics ou privés, une biobanque de leucémies humaines entretenue dans des corps de souris.

Objectifs

Les leucémies et maladies apparentées sont aujourd’hui le plus mortel des cancers du sang. Ces pathologies, en tout premier lieu les leucémies aiguës myéloblastiques, affectent 2,3 millions de personnes dans le monde et font partie des cancers les plus dévastateurs. Pour une incidence annuelle de 467.000 cas, les leucémies tuent environ 310.000 personnes chaque année. Le besoin médical insatisfait concernant les hémopathies est donc considérable. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de mettre en place une stratégie expérimentale qui permettra de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles molécules innovantes avec un fort potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouvelles molécules avec un fort potentiel thérapeutique à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-cancérologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.

Procédures

L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules cancéreuses humaines (1 injection durant 2min / animal) puis subira des prélèvements sanguins (au maximum 8) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 14 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, une partie des animaux recevra l’injection de thérapies de référence de la pathologie dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du traitement (devenir du medicament après son administration dans l’organisme) choisi (au maximum 1 injection/jour/4semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une pathologie cancéreuse humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 8 espacés de 15 jours) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 2 procédures afin de pouvoir caractériser la progression de la pathologie développée.

Remplacement

La régulation de l’ensemble des mécanismes qui assurent la production continue et régulière des différentes cellules sanguines, que ce soit de façon normale ou pathologique, implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux et spécifiques à ces cellules. Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro . Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance des tissus voisins, du contexte immunitaire, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro. A l’inverse, sur le plan physiopathologique, la transplantation d’une leucémie se développant ensuite chez un animal présente des caractéristiques hautement similaires à celles de la pathologie humaine dont elle est issue, avec une complexité impossible à reproduire in vitro. Ainsi, le passage dans un modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettrait pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-cancéreuse ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir la mise en place et la caractérisation de modèles précliniques de pathologies malignes humaines. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons. Les échantillons générés dans le cadre de ce projet seront, une fois leur caractérisation effectuée, rendu accessible à la communauté scientifique, sous conditions strictes inhérentes à l'origine et à l'utilisation des prélèvements d'origine humaine, au travers d’un consortium de 27 entités académiques françaises qui a pour but de favoriser le développement de nouvelles solutions thérapeutiques et diagnostiques destinées aux leucémies et maladies apparentées. Cette mutualisation au sein de la communauté scientifique française sera un moyen efficace de réduire globalement le nombre d'animaux rentrant en expérimentation puisqu'ainsi, il ne sera plus nécessaire à chaque laboratoire de générer ses propres modèles précliniques de ces pathologies.

Raffinement

Afin de réduire au minimum l’inconfort qui pourrait être ressenti par les souris qui ont un phénotype dommageable lié à leur système immunitaire déficient, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes (portoir ventilés, enceinte de change stérile, alimentation stérile, boisson acidifiée…). L’induction supplémentaire mais transitoire de leur déficience immunitaire nécessaire à la transplantation de cellules humaines sera compensée par une antibiothérapie préventive. Le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie volatile. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines dont le système immunitaire est déficient constitue un avantage déterminant pour le développement de pathologies humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules cancéreuses humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

Privées de nourriture pendant vingt-quatre ou quarante-huit heures, soumises à différents régimes pendant quatre-vingt-dix jours, puis à un antibiotique dans l'eau de boisson et à un probiotique par voie orale, 1 700 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que le jeûne peut provoquer une perte de poids, un affaiblissement et parfois une hypothermie, et que les antibiotiques peuvent donner des diarrhées passagères. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leurs tissus et leurs organes. Le projet cherche des composés qui miment les effets du jeûne pour déclencher l'autophagie, le bénéfice invoqué visant l'obésité et les maladies métaboliques qui toucheraient, selon le porteur, un quart de la population mondiale.

Objectifs

L’autophagie est un processus physiologique, très conservée au cours de l’évolution, qui régule l’homéostasie cellulaire. L’autophagie est un mécanisme d’adaptation cellulaire en condition de stress et son absence est souvent observée dans des maladies métaboliques, neurodégéneratives et cancers. La restriction calorique est un inducteur physiologique majeur de l’autophagie. Nous avons identifié et sélectionné in vitro des composés capables de mimer les effets biochimiques du jeûne, et qui sont capables, donc, d’induire l’autophagie. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les liens entre nutrition et santé sont de mieux en mieux connus, et le risque de développer de nombreuses maladies - cancer, maladies cardiovasculaires, obésité ou encore de diabète de type 2 – peut être réduit en suivant les recommandations nutritionnelles nationales. Ces résultats permettront d’identifier des nouvelles cibles pour les traitements des pathologies métaboliques et de l’obésité, qui affectent dans le monde environ le 25 pour cent de la population et qui deviennent des problématiques de santé significatives.

Procédures

Une partie des animaux sera soumis à un jeûne de 24h ou 48h. Une partie des animaux sera soumise à différents régimes pour 90 jours. Une partie des animaux sera soumise à des traitements administrés sur animal vigile (2 administrations au maximum en 48 heures, 2 minutes/animal). Une partie des animaux sera soumise (1 fois) à un traitement antibiotique via eau de boisson (pour 3 jours) et, la moitié de ces animaux (vigiles), recevra (1 fois par voie orale, 2 minutes/animal) l’administration d’un probiotique intestinale.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les régimes spéciaux peuvent induire une augmentation et/ou perte d’appétit et de poids. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeûne (pour 24h ou 48h) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. Le traitement avec des antibiotiques peut induire des diarrhées passagères.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines dans l’organisme pour l’induction efficace de l’autophagie en présence d’une modulation du métabolisme et du microbiote intestinal. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du métabolisme systémique et la réponse à la modulation du microbiote intestinal.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1700 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 10 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes, etc). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Les mâles qui se battent seront hébergés individuellement. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Jusqu'à huit anesthésies par animal, une injection d'aiguilles dans le derme suivie d'une décharge électrique, et sept injections dans le péritoine : 433 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les sites d'injection. Les nuisances attendues sont les douleurs des injections, celles liées à l'électroporation et le stress des anesthésies répétées. Le modèle retenu est une souris à peau saine, le projet visant à comparer dix candidats à base d'ARN messager destinés à traiter chez l'humain des ulcères et des brûlures. Le porteur annonce des groupes de trois animaux pour la première partie et de cinq pour la seconde, sans rapporter ces effectifs au total de 433 déclaré.

Objectifs

Cette étude a pour objectif dans un premier temps, de développer un modèle murin (non pathologique) d’administration par électroporation (micro choc éléctrique permettant au candidat de de rentrer plus facilement dans les cellules cibles) de nos candidats médicaments pour le traitement des problèmes de peau, comme par exemple des ulcères, brulures, lésions de peau etc. puis dans un deuxième temps, les comparer par dose réponse afin de sélectionner les meilleurs candidats. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 10 produits d’intérêt identifiés suite à nos travaux précédents.

Bénéfices attendus

Les problèmes de peau, pour certaines qui sont des pathologiques chroniques, handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La régénération des tissus de la peau est un processus très long et qui parfois ne permets pas totalement de retrouver l’état d’origine de la peau. Les patients attendent donc aujourd’hui des traitements efficaces et rapides. L’injection d’ARNm (=copie de l'ADN) pourrait permettre de régénérer la peau plus rapidement et plus longuement avec seulement une injection.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesies de 10-15 min. 1 injection intradermale (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intradermale, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intradermale puis maximum 7 intrapéritonéales) - Les douleurs et stress liés aux électroporations - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, dans ce projet, les sites d'injections seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion et du système immunitaire (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés).

Réduction

Nous utiliserons donc nombre minimal d’animaux par groupe (11 groupes de 3 animaux dans la première partie et 8 groupes de 5 animaux / constructions) permettant d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergées en groupe de 3 ou 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. L’injection intradermique sur le flanc est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Bien qu’il existe actuellement des modèles de peaux humaines reconstruites ou encore des modèles ex vivo permettant de tester la toxicité ou la pénétration de certains produits ou vecteurs, ceux-ci ne prennent pas en compte la totalité des conditions physiologiques de l’Homme. Ainsi, après vérification in vitro de la non toxicité (sur peau reconstruite) des vecteurs d’intérêts, nous souhaitons tester leur efficacité en condition « le plus proche de l’Homme » en reproduisant au mieux la complexité (avec des interactions cellulaires, une vascularisation et une réponse immunitaire similaires) de la peau humaine. De plus, la réponse immunitaire et l’inflammation, est un facteur clé dans l’évaluation de l’efficacité des peptides (élimination plus ou moins rapide par l’organisme) Souris swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (20g) et 8-9 semaines maximum en fin d’expérimentation (35-40g). La peau de ces animaux est parfaitement stable et n'évolue plus à cet age.