Souris
Implication du microbiote intestinal dans le développement de l’Arthrite Juvénile Idiopathique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Cinq injections intrapéritonéales espacées de deux jours déclenchent chez les souris un emballement du système immunitaire qui provoque une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée. 380 souris vont être utilisées, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 140 un niveau modéré, toutes tuées puis autopsiées. Une partie, née sans microbiote et maintenue en isolateur stérile, reçoit par gavage orogastrique le microbiote des souris précédentes avant de subir à son tour cinq injections. Le porteur décrit un modèle "pas mortel" et réversible, tout en indiquant qu'il est impossible de soulager ces effets par des antalgiques sans compromettre l'intérêt du modèle animal.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'implication du microbiote dans le développement de l'Athrite Juvenile Idiopathique au travers de la relation hôte-microbiote
Bénéfices attendus
Ce travail doit permettre de mettre en évidence l'implication du microbiote et/ou les groupes bactériens susceptibles d'être impliqués dans le processus d'inflammation chez les personnes souffrant d'Arthrite Juvénile Idiopathique, et ainsi, de mieux comprendre la relation hôte-microbiote dans ce contexte pathologique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours de projet : 1) 5 injections tous les 2 jours pour les souris conventionnelles avec soit d'ODN 1826 (nom de l'oligomère qui va entrainer un emballement du système immunitaire et reproduire les conséquences métaboliques que l'on retrouve dans l' Arthrite Juvénile Idiopatique) soit de l'eau stérile. ces injections seront réalisées en moins de 30 secondes en intra-péritonéale, sous contention du manipulateur, permettant ainsi l'induction du syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Athrite Juvénile Idiopathique. 2) les souris axéniques recevront les microbiotes des lots SHAM (lot ayant reçu l'eau stérile) et ODN (lot ayant reçu l'ODN 1826) par gavages orogastriques. 1 seule intervention, en tout début de procédure et d'une durée inférieure à la minute est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés et enfin 3) Des prelèvements de fecès seront réalisés avant implantation du microbiote, 15 jours après l'implantation, et de façon hebdomadaire pendant la durée du projet, cette intervention peut prendre quelques minutes ne fonction de l'animal mais il n'est tenu que le temps de récupération des fecès, soit une dizaine de seconde. 10 jours avant la fin du projet, 5 injections intrapéritonéales seront réalisées tous les 2 jours, en moins de 30 secondes, avec soit l'oligomère, pour les souris des lots ODNi (fecès ODN+ODN 1826), soit avec le véhicule (eau stérile) pour le lot Shami (fecès eau stérile + ODN 1826), enfin 4) les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane pour effectuer le prélèvement d'un maximum de volume sanguin puis seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale., cette intervention est réalisée en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Ce modèle infectieux de stimulation des TLR-9 mime la "tempête" inflammatoire retrouvée chez les patients souffrants d'AJI qui provoque un déréglement globale du système immunitaire, qui n'est pas mortel et qui est réversible quelques jours après l'arrêt des injections. Toutefois, il provoque chez l'animal une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée, de plus malgré la rapidité de l'intervention (une dizaine de seconde), les souris vont subir la douleur liée à l'introduction de l'aiguille en intrapéritonéale et le stress lié à la contention. En ce concerne le modèle de souris à microbiote contrôlé, les effets décrits ci-dessus seront potentiellement retrouvés chez les animaux recevant les injections d'ODN et potentiellement chez les animaux constituant les autres lots. Les animaux subiront également le stress dû à la contention lors du gavage orogastrique bien que cette manipulation ne dure que quelques secondes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI), plus particulièrement l’implication du microbiote intestinal et la relation dans le développement de la pathologie, ne peut être évaluée que sur un organisme vivant, pris dans sa globalité.
Réduction
Pour le respect de la règle des 3Rs, le nombre de chaque groupe d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour discriminer un effet statistiquement significatif entre les traitements. Les résultats obtenus dans les différents lots seront comparés à l’aide d'un test statistique adapté. Les animaux utilisés sont des souris mâles et femelles conventionnelles et axéniques (nées sans microbiote), ces dernières seront, hébergées dans des isolateurs stériles. Un projet pilote de 20 souris (10 femelles et 10 mâles) sera préalablement réalisé pour valider le modèle au sein de notre établissement utilisateur. 3 séries d’expérimentations seront réalisées sur 1) un modèle murin de stimulation de recepteurs,(les TLR-9) qui jouent un rôle très important dans les réponses immunitaires et qui, dans ce cas, permettent de déclencher le syndrome d'activation des macrophages, désordre immunologique caractéristique de l'Athrite Juvénile Idiopathique puis sur 2) un modèle murin axénique de transplantation du microbiote provenant du premier modèle. Chaque expérience sera constituée de 2 lots de 20 souris conventionnelles (10 femelles et 10 mâles pour chaque lot) - un lot de 20 souris (nommé ODN) recevra une injection d'un l'oligonucléotide (l'ODN 1826) qui se fixe sur TLR-9 déclenchant ainsi l'activation des macrophages - un lot de 20 souris (nommé Sham) qui recevra une injection du seul véhicule de l'ODN 1826 (Eau stérile). Le microbiote de chaque lot sera ensuite transplanté dans 4 lots de 20 souris axéniques (10 femelles et 10 mâles) : - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris ODN - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provanant des souris Sham - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris ODN plus une injection intrapéritonéale de l'oligomère (nommé ODN injec) - un lot de 20 souris qui recevra le microbiote provenant des souris Sham plus une injection intrapéritonéale de l'oligomère ( nommé Sham injec) Ainsi, 380 souris au total seront utilisés pour ce projet, 140 conventionnelles et 240 axéniques.
Raffinement
le modèle de stimulation des TLR-9 est un modèle communément utilisé pour les études concernant le syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI), cependant ce sera la première fois qu'il sera mis en place au sein de notre établissement utilisateur, c'est pourquoi nous souhaiterions, au préalable du projet, réaliser une étude pilote sur un effectif de 20 souris conventionelles C57Bl6 (10 femelles et 10 mâles) répartis selon les lots décrits ci dessus. La réalisation de cette expérimentation pilote nous permettra de valider le modèle, de l'induction aux analyses post mortem, dans notre contexte expérimental. Le modèle de souris à microbiote contrôlé est un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif. La souris est en effet reconnue pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote du donneur. La transfection de microbiote est réalisée, sous contention de quelques secondes, par du personnel formé et expérimenté. Ces modèles infectieux provoquent un déréglement globale du système immunitaire, qui n'est pas mortel et qui est réversible quelques jours après l'arrêt des injections. Toutefois, il provoque chez l'animal une perte de poids caractéristique et une fatigue généralisée. Il est cependant impossible de réduire ces effets par l'emploi d'antalgiques sans compromettre l'intêret du modèle animal. Dautre part, lors de l'étape de transfection et comme pour tout projet d'expérimentation réalisé au sein de l'établissement utilisateur, les animaux utilisés feront l’objet d’une surveillance quotidienne sur le temps d'implantation du microbiote (15 jours) pour détecter tout signe d'inconfort, de douleur, de détresse ou d'angoisse pour le réduire, le soulager, le supprimer. Dès l'apparition de ces signes, l'arbre décisionnel joint sera suivi et, à cette étape, l'animal pourra être sorti du projet sans euthanasie pour une phase de récupération sous protocole de soin visé par le vétérinaire.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des souris femelles et mâles C57BL6 âgés de 6 à 7 semaines conventionnelles ou axéniques. Le modèle de stimulation des TLR-9 est un modèle communément utilisé pour les études concernant le syndrome d'activation des macrophages caractéristique de l'Arthrite Juvénile Idiopathique (AJI). Ce modèle infectieux mime la "tempête" inflammatoire retrouvée chez les patients souffrants d'AJI. Le modèle de souris à microbiote contrôlé est communément utilisé pour les études concernant le tube digestif. L'animal est, en effet reconnu, pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote du donneur. Pour le modèle de stimulation des TLR-9, les souris seront âgés de 8 semaines au moment de l'injection de l'ODN1826. Pour le modèle de transfection fécale chez la souris axénique, les animaux seront âgés de 8 semaines. Pour les 2 modèles, ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour permettre une bonne reproductibilité de l'induction du syndrome d'activation des macropahges et bonne implantation des microbiotes transplantés.
Effet de traitements anti-obésité sur l’hérédité épigénétique intergénérationnelle de l’obésité et du diabète induits par l’alimentation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Nourries quatorze semaines avec un régime enrichi en graisses et en sucres, injectées une fois par jour pendant deux semaines, prélevées quatre à six fois au sang après quatre heures de jeûne, puis isolées 48 heures en cage individuelle : 591 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur descendance suit le même régime pendant neuf semaines, avec des lésions cutanées dues à un hypertoilettage que le porteur classe en nuisance légère. Le projet cherche à savoir si traiter des parents obèses protège la génération suivante de l'obésité et du diabète. Toutes sont mises à mort en fin de procédure pour prélever leurs organes.
Objectifs
La fréquence de l'obésité et du diabète a atteint les proportions d'une pandémie au cours des dernières décennies et l'obésité est désormais considérée comme l'un des principaux facteurs de risque pour la santé dans les sociétés modernes. Les possibilités de traitement sont malheureusement très limitées, la chirurgie bariatrique (bypass gastrique) représentant jusqu'à présent pour de nombreux patients quasiment la seule possibilité de perte de poids durable et d'amélioration du métabolisme glucidique, mais elle est non réversible, liée à de nombreuses complications post-opératoires et n’est envisageable que pour un très petit nombre de personnes extrêmement obèses. En-dehors des caractères génétiques, l'hérédité dite épigénétique des caractères acquis, contribue probablement de manière décisive à la pandémie d'obésité et de diabète observée dans le monde entier. L'épigénétique s'intéresse aux mécanismes et modifications chromosomiques héréditaires qui ne sont pas dues à des changements de la séquence d'ADN, mais des modifications chimiques ultérieures de l'ADN. Dans une étude précédente, nos collaborateurs ont pu montrer que la transmission épigénétique via les cellules reproductrices (spermatozoide, ovocyte) augmente la prédisposition à l'obésité et au diabète de type 2, l'information transmise à la descendance étant déjà ancrée dans les cellules reproductrices. Ces observations peuvent être mises en relation directe avec les études épidémiologiques menées chez l'homme, qui montrent que l'indice de massse corporelle de la descendance est significativement corrélé avec le degré d'obésité parentale, tant paternelle que maternelle. Dans ce projet, nous souhaitons étudier dans quelle mesure il est possible d'influencer l'obésité transmise par voie épigénétique en intervenant sur les parents par traitement pharmacologique ou en adaptant leur régime alimentaire et de déterminer si et dans quelles conditions l'hérédité épigénétique est réversible. Il s’agit ainsi de voir si la génération suivante peut être saine, lorsque les parents obèses sont traités de manière appropriée par voie pharmacologique ou par adaptation du régime alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'appréhender les mécanismes liés à la transmission épigénétique de l'obésité et du diabète d'une génération à l'autre, d'évaluer une nouvelle approche thérapeutique en traitant les parents pour protéger la génération suivante de ces pathologies, et ainsi par le gain de ces connaissances proposer une solution pour influencer durablement la santé des générations futures.
Procédures
Alimentation avec une diète enrichie en graisses et en sucres (durée 14 semaines pour les parents (fondateurs) ou 9 semaines pour la descendance). Injections (1x/jour, sur une durée de 2 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (4-6 prélèvements; durée 1-3 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (2 fois; durée 3 min). Mesure de la dépense énergétique dans des cages d'hébergement individuelles (durée 48h)
Impact sur les animaux
Lors de la réalisation de ces protocoles, le régime enrichi en graisses peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hypertoilettage (nuisance légère). Les prélèvements sanguins à la queue, après une mise à jeun de 4h, peuvent induire un stress et une douleur légère (pendant 1-3min). Les animaux seront isolés pour une période de 48h dans des cages spécifiques pouvant engendrant un stress modéré. L’évaluation de la composition corporelle sera faite par une méthode non invasive (qNMR), et les pesées hebdomadaires ne vont pas induire de nuisances ou stress particulier.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédures pour prélever des organes en vue d'analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre l'impact des modifications épigénétiques de l'ADN sur le développement de l'obésité et du diabète, et plus particulièrement la transmission de cette information d'une génération à l'autre, en traitant les parents, puis en analysant le métabolisme de la descendance. Cette analyse ne peut être proposée que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, des glucides, de la balance energétique..), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle pour proposer une approche thérapeutique pour la population humaine.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné sur la base de nos expériences dans le domaine métabolique. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que qu'un effectif de 8 souris par sexe et par condition constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, composition corporelle) qui seront analysées à l'aide d'analyses statistiques appropriées. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique et permettre d’observer un effet du traitement.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Durant la période d'alimentation avec la nourriture enrichie en graisses et un sucres, de la nourriture sera mise à disposition sous forme de pâte dans des coupelles au fond des cages. Si la litière est souillée rapidement, le change sera fait deux fois par semaine. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..).
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère qui permet une première approche informative concernant les mécanismes épigénétiques, et en cas de traitement des parents, l'évaluation de la protection attendue sur la génération suivante. Ces données pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de proposer une approche thérapeutique à long terme pour traiter l'obésité et le diabète en clinique humaine. Les animaux démarreront le protocole après le sevrage, à partir de 4 semaines où la régulation métabolique est déjà mise en place, et jusqu'à 18 semaines d'age.
Remodelage du système de Purkinje dans les arythmies ventriculaires chez la souris (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des femelles gestantes reçoivent par voie orale une molécule qui déclenche une cardiomyopathie chez leur descendance, au risque de provoquer la mise bas ou une fausse route. 654 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont injectés au deuxième jour, tatoués à dix jours, biopsiés de la queue pour génotypage, puis anesthésiés pour un électrocardiogramme, une stimulation cardiaque et une IRM, l'induction d'arythmies pouvant provoquer une fibrillation ventriculaire et la mort de certains animaux. Sur la réduction, le porteur écrit que les animaux subiront "le maximum de procédures possibles" afin d'obtenir le maximum de données sur un minimum d'individus.
Objectifs
Ce projet se déroule sur 2 établissements EU1 et EU2. La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.
Bénéfices attendus
La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.
Procédures
La première intervention consiste au traitement des souris gestantes, juste avant la naissance et par voie orale avec une molécule qui induit les cardiomyopathies chez la descendance (durée : moins d’une minute). La descendance issue de ces mères gestantes recevra une injection du même traitement au 2ème jour après la naissance (durée : moins d’une minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée : moins d’une minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (durée : moins d’une minute). Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU1/2 Ces animaux seront sous anesthésie générale, et leur activité électrique sera analysée au niveau du cœur entier par électrocardiogramme (ECG), au niveau tissulaire par stimulation cardiaque, et au niveau structurel par IRM. Ces interventions auront lieu dans l’établissement EU2/2.
Impact sur les animaux
Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.
Remplacement
Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.
Réduction
Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.
Raffinement
Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.
Évaluation de différentes approches thérapeutiques dans 2 modèles de diabète chez le rongeur (rat ou souris)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 755
Pour tester des implants abdominaux contre le diabète, 755 souris et 755 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue. 1 260 d'entre eux relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 210 d'un niveau modéré, 40 étant opérés sans réveil. Ils subissent une à deux chirurgies sous anesthésie gazeuse d'environ trente minutes, des soins post-opératoires de 48 à 72 heures, jusqu'à cinq prélèvements sanguins par 24 heures et des contentions répétées, avec le risque d'hypoglycémies et d'hyperglycémies provoquées. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'effet d'une molécule sur le diabète et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'être humain.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique qui se caractérise par un excès de sucre dans le sang ou hyperglycémie. Il existe 2 principaux types de diabète, dus à des dysfonctionnements différents : le diabète de type 1 (Pas de production d’insuline par le pancréas) et le diabète de type 2 (Résistance à l'insuline). En France en 2015, plus de 3,5 millions de personnes étaient traitées pour un diabète. Ce chiffre est en constante augmentation. En 2022, le nombre de patients est passé à plus de 4,3 millions, soit 6,3 % de la population, 44,8 % de femmes et 55,2 % d’hommes. Au niveau mondial, le diabète de type 2, le plus fréquent (plus de 90 %), est en forte progression : 108 millions en 1980, 422 millions en 2014 et 537 millions en 2021. Ce projet consiste à évaluer de nouvelles thérapies sur un modèle de rongeur diabétique (rat et souris). Ces nouvelles thérapies consistent en des implants placés dans l'abdomen en comparaison avec une technique de référence.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments ou dispostifs pour traiter le diabète, une pathologie humaine touchant plus de 5 millions de personnes en France et plus de 600 millions dans le monde. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rongeurs) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
Les souris de ce projet pourront subir une anesthésie gazeuse (1 à 2 fois, environ 30 min/chirurgie), des soins post-opératoire pendant 48 à 72h, des administrations de produits d’analgésie (1 ou 2 avant la chirurgie puis 3 ou 5 sur les 48 à 72h de soins post opératoires, environ 1 min par administration) ou des prélèvements sanguins [(maximum 5 prélèvements /24h, durée: moins de 30 sec/prélèvement)], une contention lors de suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lié à la chirurgie et aux soins post-opératoires, un stress lié aux administrations des produits d’analgésie et/ou aux prélèvements sanguins, un stress lié à la contention lors de suivis cliniques et un stress lié aux effets d'une potentielle hypo- ou hyperglycémie.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s) ou le modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments ou dispositifs, ce projet est réalisé chez la souris ou le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le diabète. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament ou dispositif. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées au modèle. Pour obtenir un nombre suffisant de données scientifiques, le nombre d’utilisation d’animaux est notifié dans le paragraphe portant sur le nombre estimé d'animaux utilisés. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : •La mise au point de procédures rigoureuses, •La formation du personnel, •Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, •Le recours à des procédures les moins invasives possibles, •Le suivi d’éventuel signes cliniques, •La détermination des points limites, •Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire •Un protocole anesthésique adapté pour la chirurgie, •Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, •La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, •La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces animales pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-diabétiques, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. Les produits testés n'ont pas de visée pédiatrique.
Etude des effets des ultrasons sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une session d'ultrasons de trente secondes à une minute, précédée d'une injection de microbulles de gaz par un cathéter, puis trente minutes d'imagerie sous anesthésie, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet existe parce qu'une étude précédente de la même équipe a laissé la moitié des animaux léthargiques après la séance d'ultrasons, des hémorragies cérébrales étant retrouvées chez 80 % de ceux qui ont ensuite été tués et examinés. Le porteur maintient que la technique est "prometteuse" et déjà en voie d'utilisation chez l'être humain, tout en cherchant à caractériser la neuroinflammation qu'elle provoque. Toutes les souris sont tuées pour des analyses complétant l'imagerie.
Objectifs
Le traitement des pathologies neurologiques, en particulier des maladies neurodégénératives, est limité par la présence de la barrière cérébrale qui complique le passage de molécules thérapeutiques au niveau du cerveau. Pour pallier cela, l’utilisation de la technique des ultrasons thérapeutiques semble une approche prometteuse. Cependant, lors d’une de nos précédentes études combinant l’utilisation des ultrasons, des microbulles et d’un composé thérapeutique, nous avons constaté un état léthargique chez environ 50% des animaux dans les heures suivant la session d’ultrasons. Après euthanasie de ces animaux, nous avons constaté, chez 80% des animaux, l’apparition d’hémorrhagie cérébrale. L’objectif de cette étude est donc de s’intéresser aux effets de ce schéma thérapeutique sur le cerveau et notamment sur l’inflammation. En effet, une augmentation locale de l’inflammation cérébrale suite à l’application des ultrasons associés aux microbulles est reportée dans la littérature. Nous souhaitons donc expliquer les effets des US après une ou deux sessions d’ultrasons grâce à l’imagerie basée sur la radioactivité et à l’analyse des molécules impliquées dans l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet va apporter des informations sur les effets des ultrasons cérébraux aigus et subaigus, notamment sur la neuroinflammation. En effet, l’utilisation des ultrasons pour perméabiliser la protection cérébrale est en voie d’utilisation chez l’homme et nous souhaitons caractériser la neuroinflammation induite. Cette étude vise à développer des nouveaux traitements dans les maladies neurologiques chez l'Homme
Procédures
Les animaux auront une session d’ultrasons d’une durée de trois minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection de microbulles de gaz (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ce groupe aura également une session d’imagerie TEP d’une durée de 30 minutes : pose de cathéter (1 minute) puis injection du radiotraceur (1 minute) et une séquence d’ultrasons (30 secondes à 1 minute, le tout sous anesthésie gazeuse. Ces animaux seront maintenus en contention lors du prélèvement sanguin en sous-mandibulaire (1 minute).
Impact sur les animaux
Injection des différentes molécules : un hématome au niveau de la queue à la pose ou au retrait de l’aiguille peut être ressenti. Session d’ultrasons : les souris ayant reçu les ultrasons peuvent présenter des difficultés à récupérer dans les heures suivant la session d’ultrasons. L’apparition d’hémorragies cérébrales est également possible du fait de la ou des sessions d’US.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études ex vivo complémentaires aux études d’imagerie.
Remplacement
Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie utilisée basée sur la radioactivité est intégralement transférable à la clinique. A l’heure actuelle il n’existe de méthode alternative permettant d’étudiant les conséquences de l’ouverture de la barrière de protection sur le tissu cérébral.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 20 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter par sexe, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Des analyses statistiques seront réalisées dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés quotidiennement. En cas de blessures, la plaie sera nettoyée et désinfectée jusqu’à la cicatrisation complète. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement. Le protocole expérimental sera mené avec une attention particulière portée au bien-être animal, notamment grâce à l'application de points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en condition normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra utilisée en imagerie reposant sur la radioactivité. Adulte (6 mois) car les traitements US en clinique, notamment pour les maladies neurologiques, ne concernent que des sujets adultes. Les groupes d’animaux seront composés à 50% de mâles et 50% de femelles afin d’éviter les biais dus au sexe.
Rôle des protéines de liaison à l’ARN dans le développement de tumeurs chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un écoulement de sang ou un ulcère sur la tumeur déclenche la mise à mort de l'animal. 2 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Prélevées à la queue à six jours pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes cinq jours d'injections ou de gavage, une irradiation de dix minutes, un transfert de cellules par une veine derrière l'œil, une greffe de cellules tumorales, puis un suivi de la tumeur pendant deux à huit semaines. Le porteur indique que la suppression des protéines étudiées dans les lymphocytes T peut déclencher une auto-immunité avec amaigrissement, inflammation de la peau, prostration et perte d'activité sévère, auquel cas les souris sont tuées et le traitement raccourci à cinq doses.
Objectifs
La modulation des réponses immunitaires par les lymphocytes T grâce aux immunothérapies est à présent mise en place comme un traitement standard contre divers cancers. Dans ce contexte, l'activation des lymphocytes T dépend d’une régulation hautement dynamique des programmes génétiques pour la production de molécules effectrices qui éliminera les cellules tumorales. Nos données préliminaires montrent que les fonctions effectrices et régulatrices des lymphocytes T sont modulées par les protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous émettons l'hypothèse que les RBPs sont essentielles pour le développement de la réponse antitumoraux par les lymphocytes T. Avec l'utilisation de modèles de souris transgéniques, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l'amplitude et l’étendue des réponses immunitaires contre les tumeurs. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 - Comprendre la fonction des RBPs pour la maintenance de populations de lymphocytes T saines. 2 - Étudier l’importance de ces protéines pour l’activation des lymphocytes T effectrices et régulatrices dans la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous avons sélectionné les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 comme modèles pour évaluer l'importance des mécanismes post-transcriptionnels clés des ARNm jusqu'à la synthèse des protéines. Pour certains cancers, l’expression de TIA1 et TIAL1 dans les lymphocytes T a été utilisé comme un marqueur pronostique, mais sa fonction moléculaire reste inconnue. G3BP1 et G3BP2 sont des protéine impliques dans l’apparition de cancer. Donc, nos études apporteront d'importantes connaissances sur la biologie de ces protéines et sur le fonctionnement des lymphocytes T qui permettra de mieux optimiser les stratégies pour la détection ou traitement de cancers.
Procédures
Les animaux sont soumis à une contention de 3-5 minutes pour un prélèvement de tissu (queue) lorsqu’elles ont 6 jours pour le génotypage (détermination des modifications génétiques) et, dans certains cas, un prélèvement du sang. Les animaux transgéniques n’expriment pas les protéines TIA1, TIAL1, G3BP1 et G3BP2 dans les lymphocytes T après un traitement spécifique par injection intra-péritonéale ou gavage oral (chaque intervention dure 2 minutes) pendant 5 jours, ou par régime alimentaire (sans manipulation). Ils serviront comme modèles tumoraux ou de donneurs de cellules T pour nos expériences de transfert cellulaire. Le transfert de cellules se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par une injection de 100-200μL en voie intraveineuse, par injection rétro-orbitale. Certains animaux seront irradiés, une fois pendant maximum 10 minutes, avant la reconstitution du système immunitaire avec le transfert de cellules souches par injection intraveineuse de 100-200μL dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes. Dans les modèles de cancers murins, l'implantation des cellules tumorales se fait dans la souris anesthésiée pendant 5 minutes par injection sous-cutanée (sc) au niveau du flanc. Les animaux sont soumis à une contention de 2-3 minutes pour mesurer la tumeur tous les 2-3 jours (pendant 2-8 semaines selon les expériences) jusqu’au point d’analyse. Toutes les souris seront euthanasiées avant le prélèvement des organes le jour du point d’analyse.
Impact sur les animaux
Pour minimiser les effets indésirables, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales, puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de une taille tumorale maximale. Parfois, des nécroses peuvent apparaître au centre de certaines tumeurs et commencer à s’ulcérer ou à saigner. Si se le cas, les souris seront suivies par le/la vétérinaire. L’apparatition d’écoulement de sang ou d’ulcère avec un écoulement de liquide est un point limite, et le souris seront euthanasiées. Pour les animaux transgéniques qui n’expriment pas nos protéines d'intérêt dans les lymphocytes T, il y a la possibilité de développer un épisode d'auto-immunité associé à une perte de lymphocytes T régulateurs. L’auto-immunité peut être caractérisée par un amaigrissement, une inflammation cutanée, une peau rugueuse et/ou squameuse, une déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés, une absence de toilettage, ou une absence d’activité sévère. Si les animaux présentent un des phénotypes cités en amont, ils seront euthanasiés et nous remplacerons le traitement continu par un traitement limité à cinq doses de médicament (1 par jour durant 5 jours) où la perte de poids sera inférieure à 5 %, sans aucune inflammation cutanée et une activité physique normale. Nous n’avons observé aucun autre phénotype dommageable lié aux croisements de lignées génétiquement modifiées. Dans tous les cas, la santé de l’ensemble de nos souris sera surveillée au minimum 3 fois par semaine et les souris seront euthanasiées si elles perdent plus de 20% de leur poids initial ou présentent une posture voutée ou prostrée, des poils hérissés, des salissures ou écoulements ou une absence de toilettage. La souffrance, la douleur et le stress associés à la manipulation d'animaux, l’injection de substances et cellules (nuisances légères), l'irradiation de souris (nuisance modérée), et de prélèvement de sang et/ou d’une biopsie pour le génotypage (nuisances légères) sont limités en raison de la formation constante de notre personnel.
Devenir
Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés à la fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Les réponses immunitaires contre le cancer sont des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains et permettent l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures se limiteront à la description des interactions moléculaires entre nos RBPs et l’ARN.
Réduction
Nous suivons les directives ARRIVE afin de garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d'animaux. La stratégie d'élevage produit le même nombre des souris tests et contrôles. Les souris sont classées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d'animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. Sur la base de nos données préliminaires, pour avoir la plus grande puissance statistique, nous aurons besoin de 7 souris par groupe. Pour la reproductibilité de résultats concluants, nous répéterons chaque expérience 3 fois pour permettre un test statistique et une bonne reproductibilité. Finalement, dans certains cas, le transfert des lymphocytes T matures ou la reconstitution du système immunitaire avec des cellules souches permettra la reconstitution des lymphocytes T chez plusieurs souris réceptrices non-transgéniques, réduisant ainsi l'élevage des animaux transgéniques.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 maximum dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. Les souris ne seront jamais laissées seules dans leur cage. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. De l’essuie-tout, des copeaux et du rouleau en carton et une maison en plastique rouge sont rajoutés en tant qu’enrichissements pour permettre aux souris de se détendre. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens dès leur naissance. Les animaux disposent d'une semaine d'acclimatation avant le début du protocole. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Dans chaque procédure, nous avons mis en place des points limites (activité, posture, aspect et/ou respiration anormale, amaigrissement, inflammation cutanée, présence d'une anomalie ou avec une tumeur de taille anormale [ayant atteint 1500mm3], ulcère ou sanglante). Si l’un de ces critères est atteint, les souris seront euthanasiées. Les utilisateurs ont reçu des formations spécialisées et officielles qui leur permettent l’évaluation des souris et le raffinement des procédures. Les zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que les grimaces, l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage. L’anesthésie gazeuse (2% isoflurane + mélange air/oxygène, débit : 2 L/min pour la boîte et 0.2 L/min pour le masque) sera utilisée pendant le prélèvement du sang ou l’injection des cellules pour réduire le stress.
Choix des espèces
Les mécanismes moléculaires régulés par les protéines de liaison à l'ARN étudiées dans ce projet, ainsi que la dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris sont similaires à celle observées chez l'homme. Donc, nos modèles de souris nous permettent d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Tout particulièrement, nous pouvons évaluer le maintien et le fonctionnement des cellules lymphoïdes dans un environnement tumoral complexe et difficile à modéliser in vitro, et ainsi analyser l'impact des réponses immunitaires systémiques en dehors du site tumoral. Toutes les procédures seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Impact des macrophages sur la matrice extracellulaire tumorale et la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une tumeur greffée sous la peau du flanc, puis mesurée tous les deux jours pendant treize jours, 1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyses post-mortem, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 188 un niveau modéré. Selon les groupes, elles reçoivent jusqu'à trois injections d'un agent qui détruit leurs macrophages, ou cinq injections d'immunothérapie, et le porteur signale diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans un des modèles, ainsi qu'une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience. Le projet cherche à comprendre comment les macrophages modifient la matrice qui entoure la tumeur et gêne l'entrée des cellules immunitaires. Les souris employées sont génétiquement modifiées et les tumeurs greffées choisies pour leur résistance variable aux immunothérapies, le porteur jugeant la similitude des systèmes immunitaires humain et murin suffisante pour parler de modèle "idéal".
Objectifs
Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.
Procédures
1-Greffe de cellules tumorales: 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis suivi de la croissance tumorale pendant 13 jours maximum (J3-5-7-9-11-13), sur maximum 1108 animaux 2- Injections d’un agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, 3 injections à J3-5-7 ou 9-11-13, sur maximum 458 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 3- Traitement par un autre agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, une injection à J3 ou à J9, sur maximum 96 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 4-Traitement d’immunothérapie (ou contrôle), non douloureux : une injection à J10-13-16-19-22 sur 160 animaux. 5-Traitement (ou contrôle), non douloureux, sous anesthésie générale : une injection à J10-11-12-13 sur 192 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes).
Impact sur les animaux
Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.
Réduction
Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.
Evaluation de la tolérance induite par des antigènes en vue de l’identification de nouveaux candidats vaccins pour la prévention des troubles allergiques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Sensibilisées à un allergène par doses répétées puis soumises à une épreuve allergique par voie orale, respiratoire ou cutanée, 5 000 souris vont être utilisées et toutes tuées après l'épreuve. 2 000 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 2 000 d'un niveau modéré, 1 000 d'un niveau léger. Le porteur décrit les effets attendus de l'induction de l'allergie, poils hérissés, baisse d'activité, hyperthermie ou hypothermie, signes neurologiques, troubles respiratoires et perte de poids. Il attend de ces candidats vaccins qu'ils permettent de "sauver des vies humaines dans le monde", et affirme que la tolérance induite ne s'évalue que sur un "organisme entier".
Objectifs
Les allergies sont des réactions d’hypersensibilité à des substances, appelées allergènes, présentes dans l’environnement et qui sont normalement inoffensives car tolérés par le système immunitaire. Les réactions peuvent être diverses, des plus bénignes aux plus sévères. Les allergies correspondent à une perte de tolérance envers ces substances. La tolérance immunitaire se définit par la capacité du système immunitaire à ne pas manifester de réaction agressive vis-à-vis de certains antigènes avec lesquels il a été au préalable en contact. Le projet s’organise en 2 étapes, le développement des modèles d’allergie et l’évaluation, sur l’animal, de l’efficacité d’un candidat vaccin contre les troubles allergiques alimentaires connues chez l’homme. 1/Mise en place des modèles d’allergie alimentaire dit de sensibilisation à l’allergènes : dans un premier temps des études seront réalisées pour établir les modèles animaux afin de représenter la maladie d’intérêt dite « allergique » par exemple l’allergie aux arachides. Ces études permettront de définir entre autres les doses d’allergène générant d’une part la sensibilisation à l’allergène et d’autre part la réaction d’hypersensibilité qui seront inoculées chez l’animal ou encore la voie d’administration. 2/ étude d’évaluation des vaccins anti-allergies Une fois ces modèles d’allergies établies, des études d’évaluation de la capacité d’un vaccin à restaurer la tolérance contre ces allergènes alimentaires seront effectuées. Pour cela, les animaux recevront le candidat vaccin dont l’efficacité sera mesurée par le degré d’efficacité induit contre l’inoculation de l’allergène.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont l’utilisation en essai clinique, et éventuellement la mise sur le marché, de différentes préparations vaccinales permettant de protéger efficacement les patients contre les troubles allergiques alimentaires et répondre aux besoins cliniques des patients. Ce projet permettra également, d’évaluer les nouvelles voies d’administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin anti allergiques. Enfin, ce projet permet de comprendre les mécanismes d’action, la caractérisation de la réponse immunitaire dans le cadre d’hypersensibilité. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre les phénomènes croissants d’allergie alimentaire et de sauver des vies humaines dans le monde.
Procédures
Les études de tolérance consistent à administrer des vaccins dont la dose peut être unique ou multiple (un à six fois) sous différentes voies d’immunisation en vue de protéger contre une épreuve d’hypersensiblité par un allergène. La sensibilisation à l’allergène se fait par des doses répétées (deux à quatre fois). L'épreuve allergique est unique, plus rarement répétée. Plusieurs voies d'épreuve allergique en fonction du type d’allergie (orale, topique, respiratoire) peuvent être utilisées. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’administration des candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques génère des signes cliniques légers (réactogénicité locale avec principalement de l’érythème voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%). Dans le cas de l’induction de l’allergie, en fonction du protocole appliqué, les effets indésirables sont légers à sévères (poils hérissés, baisse d’activité, hyper/hypothermie, signes neurologiques et troubles respiratoires et une perte de poids transitoire de moins de 15%). Les nuisances associées aux prélèvements sont un inconfort local, il peut y avoir un petit hématome (prélèvement sanguin) en conséquence la contrainte représentée par les prélèvements est évaluée en degré léger.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés après épreuve allergique afin d’évaluer la réponse immune. Les volumes sanguins prélevés nécessaires ou le prélèvement d’organes ne permettant pas le maintien en survie des animaux. L’euthanasie pourra être pratiquée plus précocement en fonction du type de test, de l’évolution des signes cliniques et de l’expérience du technicien animalier ou de recherche pour abréger la souffrance.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins ou de traitements anti-allergiques la réponse immunitaire ainsi que l'effet tolérogène doivent être évalués sur un organisme entier. Ainsi à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour évaluer les capacités d’un vaccin ou d’un traitement anti-allergique à induire une tolérance contre un allergène, et reproduire la complexité des réponses cellulaires et humorales impliquées dans la mise en place d’une immunité contre un allergène. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc nécessaire.
Réduction
Chaque étude est évaluée au plus juste et est revue par les biostatisticiens afin de définir le nombre minimum et suffisant d'animaux requis permettant une analyse statistique des résultats. Quelques soient les espèces, les scientifiques après revue bibliographique sur la maladie d’intérêt et en fonction du nombre de lots à tester élaborent le plan de l’étude. Afin de réduire le nombre de lots, ceux-ci sont d’abord présélectionnés en amont sur des modèles vitro existants. Le plan d’étude est revu par l’équipe de recherche qui comprend d’autres scientifiques ainsi que des biostatisticiens afin de revoir les groupes et le nombre d’animaux afin de le réduire à un nombre suffisant pour que l’étude soit robuste
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les épreuves. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. En fonction de l’allergène, une grille d'évaluation des signes cliniques post-induction sera mise en place entre le responsable d'étude, les biostatisticiens et les vétérinaires cliniciens. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques de l’allergène, par un personnel spécifiquement formé. Dès que le score atteint un seuil jugé critique, les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'étude pour abréger leur souffrance. Les autres options de traitement des points limites sont malheureusement exclues car les analgésiques modifient la réponse immune étudiée Des points limites sont mis en place et seront appliqués. Ainsi, un suivi clinique quotidien 7/7 jours est réalisé tout au long de l’étude, avec surveillance du poids. La voie, la fréquence et le volume des prélèvements sont conformes aux pratiques en vigueur décrites dans le module interne de formation aux manipulations. En fonction des voies, des anesthésiques sont utilisés.
Choix des espèces
La souris est sélectionnée du fait des modèles d’allergie décrits dans la littérature et des connaissances scientifiques. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux, disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…).
Tests de molécules sur un modèle souris du syndrome d’Ondine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Les souris utilisées portent une modification génétique qui reproduit le syndrome d'Ondine et les empêche de respirer normalement, ce qui les expose à des épisodes d'hypoxie dès les premiers jours de vie. 2 028 souris vont être utilisées, 1 008 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 020 un niveau léger. Les nouveau-nés sont anesthésiés sur de la glace, séparés de leur mère, injectés, puis placés deux fois par semaine trente minutes dans une enceinte où l'air est enrichi en dioxyde de carbone, et les femelles gestantes reçoivent une injection. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme de tests portant sur cinq molécules mises au point par une société privée.
Objectifs
Dans le syndrome d’Ondine (encore appelé syndrome d’hypoventilation centrale congénitale), les patients présentent un dysfonctionnement central du contrôle nerveux responsable de la respiration automatique. Cela se traduit notamment par leur incapacité à respirer de façon autonome notamment durant les périodes de sommeil, nécessitant une assistance ventilatoire qui leur est vitale. Nommée en référence à la nymphe d’Ondine de la mythologie grecque, le syndrome d’Ondine est une maladie génétique rare dont l’incidence est de 1 pour 200 000 naissances vivantes en France et la prévalence estimée à 1/550 000. La caractérisation d'un nouveau modèle murin du syndrome d'Ondine a été réalisée sous une précédente autorisation de projet. Sa proximité physiopathologique avec l’Homme nous permet maintenant de l'utiliser comme un modèle préclinique en collaboration avec une société qui développe des traitements novateurs pour des patients souffrant de maladies neurologiques sévères. Notre expérimentation consistera à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules candidates mises au point en s’appuyant sur l'analyse de la survie et la comparaison de paramètres respiratoires entre deux lots d'animaux : animaux modèles du syndrome d'Ondine traités ou non
Bénéfices attendus
Les souris modèles du syndrome d’Ondine récaptitulent le phénotype des patients. La stimulation pharmacologique, via les molécules candidates, pourrait potentiellement améliorer la respiration de ces souris nouveau-nés, juvéniles ou adultes en restaurant une réponse à l’hypercapnie. Si une molécule candidate est efficace, nous souhaitons décrypter son mécanisme d’action au niveau de la commande centrale respiratoire. Nous souhaitons également investiguer ce mécanisme selon l’âge car certaines souris modèles du syndrome d’Ondine survivent et récupèrent naturellement une faible réponse à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre la pathologie et son mode d’action. Les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient constituer un socle de connaissances pour aider à la prise en charge de patients atteints du syndrome d’Ondine.
Procédures
Les nouveaux nés seront soumis à une anesthésie sur glace (1 fois, environ 5 min), des injections (une ou plusieurs fois, à déterminer selon l'effet des molécules), - les enregistrements respiratoire en condition normales ou d'air enrichi en CO2 (30 min, 2 fois par semaine), - Les femelles gestantes recevront une injection intra péritonéale ou sous cutanée (une seule fois, moins d'une minute)
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les P0-P5 sont : -hypoxie du au phenotype dommageable - du stress lié à la séparation de la mère, à l'induction de l'anesthésie, aux injections et aux enregistrements pléthysmographiques - de la douleur légère et ponctuelle liée aux injections Les nuisances pour les adultes sont un stress et une douleur légers et ponctuels liés aux injections.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet consiste en l’étude de traitements pharmacologiques sur une pathologie néonatale qui ne peut être reproduit en culture cellulaire car nous travaillons sur le système respiratoire. L’effet ainsi que la toxicité des molecules a déjà été vérifié au niveau cellulaire et doit maintenant être testé sur un système complexe vivant.
Réduction
Notre projet testera l'efficacité de 5 molécules prometteuses, sélectionnées parmi plusieurs molécules candidates. Nous avons choisi la technique d'analyse de la respiration permettant d’enregistrer les animaux longitudinallement et donc de réduire le nombre d’animaux. Par ailleurs, nous avons utilisé une approche statistique pour définir le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cagescomprenant 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. Après injection, un suivi rigoureux et précis sera réalisé, les nouveau-nés injectés seront mis sur un tapis chauffant et seront séparés le moins de temps possible de leur mère. Les femelles gestantes seront manipulées avec douceur seront prises à l’aide de leur enrichissement et non par prise physique directe. Des points limites précoces avec un arbre décisionnel ont été établis.
Choix des espèces
Les rongeurs sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. Les modèles de souris génétiquement modifiés permettent de modéliser les variants rencontrés chez les patients. Le modèle murin est donc actuellement le modèle le plus adapté à l’étude de cette pathologie. Dans la grande majorité des cas, le syndrome d’Ondine se révèle dès la naissance. Le diagnostic est réalisé chez le nouveau-né, dès ses premiers jours de vie. Nous souhaitons donc utiliser les souris modèles du syndrome d'Ondine dès la naissance. En effet, si une molécule candidate est efficace, notre approche sera transférable à l'homme.
Induction de la production d’anticorps après immunisation chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles immunitaires
2 100 souris vont être utilisées, chacune recevant cinq injections d'un fragment de protéine avec adjuvant puis dix prélèvements de sang sous anesthésie, sous la mâchoire ou derrière l'œil. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer environ 1 millilitre de sang, volume que le porteur juge nécessaire à ses tests. L'adjuvant peut provoquer des abcès au point d'injection, et les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Sur le nombre d'animaux, le porteur écrit seulement que "les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés", sans donner le calcul qui conduit à 2 100.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'identifier des fragments de protéines dont l'expression est impliquée dans des maladies inflammatoires chroniques et/ou la progression de certains cancers. Nous espérons identifier des fragments de protéines induisant la production d'anticorps dans le but, par la suite, de tester leur efficacité dans des modèles animaux de maladies inflammatoires chroniques ou de cancers ce qui entrainerait à terme un élargissement de l'offre thérapeutique pour les patients.
Bénéfices attendus
Élargissement de l'arsenal thérapeutique des patients dans les maladies inflammatoires chroniques et/ou la progression de certains cancers.
Procédures
Tous les animaux subiront 5 injections d'une durée inférieure à 1 minute (contention + piqure), réalisées sur animaux vigiles. Dix prélèvements sanguins (sub-jugulaires et rétro-orbitaires) seront réalisées sous anesthésie générale. L'anesthésie sera de courte durée (anesthésie + prélèvement sanguin, temps inférieur à 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des injections pouvant causer un stress et une douleur légère de courte durée. L’utilisation de l’adjuvant peut entrainer la formation d’abcès au point d’injection. Afin de réaliser les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress et une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer une quantité de sang d'environ 1 mL, volume nécessaire à l'ensemble des tests prévus.
Remplacement
Les fragments de protéines sont sélectionnés en amont par le biais d'outils informatiques adaptés avant toutes expérimentations chez l'animal.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnemen enrichi. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été déterminés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Afin de développer des vaccins thérapeutiques contre les maladies inflammatoires chroniques et/ou la progression du cancer chez l'Homme, les traitements développés doivent préalablement être validés chez l'animal. La souris est un mammifère de choix classiquement utilisé dans la littérature pour les études de production d'anticorps. Il est nécessaire que l'animal soit adulte (âge supérieur à 5 semaines) afin que le système immunitaire soit mature.
Formation réglementaire à la Chirurgie Expérimentale appliquée aux rongeurs
- Formation professionnelle
Tuées par injection létale à la fin du second geste chirurgical, sans avoir été réveillées, 260 souris de réforme vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une biopsie de peau de 4 millimètres avec deux points de suture, se réveille, puis retourne sur la table moins de vingt-quatre heures plus tard pour l'ablation de la rate ou la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire, gestes exécutés par des stagiaires. Le porteur qualifie les effets indésirables attendus de "très limités" et les ramène à l'inconfort d'une plaie de petite taille si les sutures lâchent. La finalité tient à l'obligation réglementaire de former les personnels, formation agréée par le ministère de l'Agriculture dont une partie des exercices se fait sur cuisse de poulet.
Objectifs
La réglementation encadrant l'utilisation des animaux à des fins scientifiques impose la formation de tous les personnels impliqués avec une formation spécifique en chirurgie pour les personnels concevant ou réalisant des procédures chirurgicales. Ce projet répond aux exigences réglementaires de formation des personnels et a reçu un agrément du Ministère de l'Agriculture. Elle vise à initier les personnels aux bases de la chirurgie.
Bénéfices attendus
Etre sensibilisé et initié aux bonnes pratiques chirurgicales est essentiel, et obligatoire d'un point de vue réglementaire, pour concevoir ou mettre en oeuvre des actes de chirurgicaux dans le cadre de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques ou éducatives. Cette initiation passe par une formation réalisée par des experts (vétérinaires et ingénieurs/techniciens compétents) et doit être complétée ensuite par un encadrement adapté pour la mise en oeuvre d'une procédure chirurgicale en particulier dans le cadre d'un projet autorisé. Cette formation n’a pas vocation à transformer les stagiaires en chirurgiens accomplis mais doit leur permettre d'acquérir les notions élémentaires et les gestes de base fondamentaux pour réaliser une procédure chirurgicale et une prise en charge per-opératoire adaptées. Les bénéfices attendus de ce projet sont ceux découlant des objectifs de toute formation en chirurgie : éduquer et former sur les bases fondamentales en chirurgie et sur la prise en charge per-opératoire afin de minimiser les risques de douleur, inconfort ou souffrance des opérés. Cette formation participe à la bien- taitance des animaux utilisés à des fins scientifiques.
Procédures
Les ateliers proposés dans cette formation sont l’anesthésie, l’analgésie, l'asepsie, les points de suture et sont mis en application à travers une expérience chirurgicale simple et peu invasive : la réalisation d'une biopsie cutanée de 4 mm2 sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale associée à une analgésie) avec réveil de l'animal. L'intervention chirurgicale dure environ un quart d’heure. La majeure partie du temps de cette procédure est consacrée à la préparation de l'animal (Anesthésie, tonte, désinfection, préparation du chirurgien et du matériel). Dans les 24 heures suivant le réveil, une deuxième chirurgie plus invasive (ablation de la rate ou la pose d'un cathéter à la veine jugulaire qui est une veine superficielle) est réalisée sous anesthésie générale et analgésie appropriée (temps chirurgical estimé à une demi heure ) sans réveil de l'animal qui reçoit une injection létale en fin de chirurgie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension /contention et à l'injection pour l'administration de l'anesthésie .Les effets indésirables attendus sur les animaux sont légers et liés à la biopsie cutanée. Le choix des gestes mis en oeuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) et en minimisant l'impact pour les animaux. C'est pour cela qu'une biopsie cutanée est proposée (degré de contrainte léger attendu, pas d'ouverture de cavité abdominale ou thoracique) avec réveil des animaux puis le lendemain réalisation d'une intervention sans réveil : avec une incision latérale mineure pour l'ablation de la rate ou d'une intervention sans ouverture de cavité anatomique pour la pose de cathéter à la veine jugulaire, avec suivi de l'anesthésie et analgésie adaptée et sans réveil des animaux. Les effets indésirables attendus sont donc très limités et pourraient correspondre à l'inconfort d'une éventuelle plaie cutanée de petite taille (4 mm de diamètre) si les 2 points de sutures réalisés par les stagiaires lachaient dans les 24 heures suivant l'intervention. Le protocole anesthésie pour l'ablation de la rate ou la mise en place du cathéter comporte un antalgique et la dose d'anesthésique est adaptée pour la durée de l'intervention attendue qui dure moins d'une heure.
Devenir
Les interventions réalisées sur les animaux par des personnels en formation ne permet pas de garantir un confort de vie aux animaux. Le choix d’euthanasier les animaux encore anesthésiés à la fin d'un geste opératoire est donc fait pour éviter tout risque d'inconfort post-chirurgical. De plus les animaux utilisés dans cette formation sont des animaux de réforme de l'animalerie, c'est-à-dire ne pouvant pas être utilisés dans un projet ou replacés.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux et une mise en situation des participants sont attendues pour l'agrément des formations à la chirurgie expérimentale. Une partie des travaux pratiques est réalisée sur supports inertes (blanc ou cuisse de poulet) et préalablement aux interventions réalisées sur animaux anesthésiés. Il y a donc un remplacement "partiel" de l'animal avec ces étapes pratiques préalables qui permettent aux stagiaires d'acquérir une certaine assurance et automatisme des gestes avant leur mise en oeuvre sur animaux vivants et anesthésiés, limitant ainsi la contrainte pour l'animal qui serait liée à un geste technique mal exécuté. Cette étape permet à la fois un remplacement, une réduction du nombre total d'animaux utilisés et une réduction des contraintes pour les animaux.
Réduction
L'entrainement aux gestes de suture se fait sur matière inerte afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et pour limiter les contraintes imposées aux animaux pendant la formation. C'est pour cela qu'une intervention mineure est réalisée (punch biopsie cutanée) avec un réveil, suivi d'une intervention plus invasive sur le même animal qui ne sera pas réveillé à la suite de cette deuxième intervention. Ainsi un seul animal par expérimentateur sera utilisé, sachant que ces animaux sont des animaux de réforme de l’animalerie n’ayant subi aucune procédure autre qu'une identification et génotypage. Au total 260 souris seront utilisées.
Raffinement
Comme tous les autres animaux de l’animalerie ils sont suivis quotidiennement pour évaluer leur comportement général. Le choix des gestes mis en œuvre dans cette formation réglementaire a été fait en prenant en compte les attentes réglementaires (mise en situation des stagiaires) tout en minimisant l'impact pour les animaux. Les actes chirurgicaux réalisés sont peu invasifs: une biopsie cutanée associée à deux points de suture et une chirurgie simple d'ablation de la rate avec une incision cutanée de petite taille et sont réalisés sous anesthésie générale et locale en associant un antalgique. Ils sont maintenus sur un tapis chauffant thermostaté pendant toute la durée de l'anesthésie afin de limiter le risque d'hypothermie lié à l'anesthésie. Les animaux sont réveillés uniquement après la biopsie cutanée et sont suivis pendant leur réveil. Ils sont maintenus réveillés moins de 24 heures avant d’être de nouveau anesthésiés pour un deuxième acte chirurgical plus technique (ablation la rate ou mise en place d'un cathéter sur la veine jugulaire qui est superficielle) sans réveil cette fois. La deuxième intervention étant réalisée dans les 24 heures suivant la biopsie cutanée, la durée d'un inconfort potentiel post-opératoire reste limitée en intensite et en durée et les animaux ne sont pas réveillés à l'issue de la deuxième chirurgie. Les chirurgies sont réalisées sur les animaux après un entraînement des stagiaires leur permettant d'acquérir une assurance dans la maitrise de leurs gestes avant de les appliquer sur l'animal anesthésié. Cet apprentissage est encadré par des vétérinaires.
Choix des espèces
La souris représente l'espèce la plus utilisée à des fins scientifiques (68 pour cent des animaux selon les statistiques Ministère de la Recherche en France). La mise en application des gestes basiques de chirurgie sur la souris correspond à la majorité des situations rencontrées par les expérimentateurs qui réaliseront des actes de chirurgie dans leurs projets. Nous utiliserons des souris adultes de 6 à 8 semaines d'âge. Le stade de développement de ces animaux est largement utilisé dans la recherche in vivo et leur taille, à ce stade, est optimale pour la réalisation des gestes chirurgicaux décrits dans les procédures de ce projet.
Étude du rôle du système neurovasculaire méningé sur la clairance cérébrale dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement des tissus, dont 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les lots, elles subissent une chirurgie du cou pour boucher des veines, une ou deux injections dans une zone précise du cerveau, et jusqu'à trois heures d'anesthésie par intervention, avec des risques de lésions de la cornée et de chute de température. Le porteur compte dans cet effectif les souris consacrées à l'entraînement des opérateurs. Il affirme que les organoïdes ne reproduisent ni la régulation du flux veino-lymphatique ni les réponses physiologiques globales, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans l’enveloppe la plus externe du cerveau, appelée dure-mère. Ils sont aujourd’hui considérés comme jouant un rôle important dans certaines maladies neurologiques. Situés en dehors du tissu cérébral, ces vaisseaux suivent le trajet de certains vaisseaux sanguins dans cette enveloppe. Des études ont montré que la circulation sanguine dans le cerveau peut influencer leur bon fonctionnement ainsi que l’élimination des liquides présents autour du cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces vaisseaux lymphatiques et de la circulation sanguine dans l’élimination de certaines substances produites par le cerveau, dont l’accumulation est impliquée dans plusieurs maladies dégénératives. Pour cela, deux approches seront mises en œuvre chez la souris : -Une première approche consistera à modifier l’activité des vaisseaux lymphatiques en injectant une substance dans le liquide entourant le cerveau. -La seconde approche visera à réduire le flux sanguin du cerveau en occluant certains vaisseaux veineux du cou. Ces modèles permettront d’étudier l’élimination des déchets cérébraux en utilisant des traceurs injectés soit dans le liquide qui entoure le cerveau soit directement dans le cerveau. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ce système d’élimination et leur lien possible avec les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Le drainage des fluides cérébraux joue un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en permettant l’élimination de substances qui, si elles s’accumulent, peuvent devenir nocives. Ce processus contribue notamment à limiter l’apparition de certaines maladies liées au vieillissement. Des structures situées autour du cerveau, comme certains vaisseaux sanguins et lymphatiques, participent activement à ce mécanisme de nettoyage. Bien que leur implication ait déjà été mise en évidence, les interactions précises entre ces systèmes restent encore mal comprises. En étudiant plus en détail leur rôle, ce projet vise à mieux comprendre les processus d’élimination cérébrale et à explorer de nouvelles pistes pour améliorer ce mécanisme. À terme, cela pourrait ouvrir la voie à des approches innovantes pour retarder ou limiter le développement de certaines pathologies neurologiques.
Procédures
Un premier lot d’animaux aura une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum) puis recevront ensuite une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau (une fois, 3h d’anesthésie maximum). Un deuxième lot aura une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum). Un troisième lot aura deux injections avec un intervalle de 4 semaines, au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 ou 3 heures d’anesthésie maximum par intervention). Un quatrième lot aura deux injections avec un intervalle de 16 jours au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum, réalisée 2 fois), et dans l’intervalle une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une ou plusieurs interventions chirurgicales au niveau du cou ou du cerveau qui peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires chez les animaux, notamment dans les deux jours suivant l’opération. Des signes comportementaux inhabituels tels que l’agitation, la prostration ou une mobilité réduite peuvent être observés à court terme. Il est également possible d’observer des effets secondaires oculaires : gêne oculaire, lésions de la cornée. Enfin, il existe des risques liés à l’anesthésie générale tels que la baisse de température corporelle, sécheresse oculaire ou rares réactions cardio-respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet. L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire et le drainage des fluides cérébraux, nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques globales à une altération fonctionnelle. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
Pour répondre aux exigences du plan expérimental, un total de 1310 souris sera nécessaire. Ce nombre prend en compte plusieurs facteurs, notamment les différentes procédures à réaliser, les analyses post-mortem, les risques de perte liés aux chirurgies, ainsi que les souris requises pour l'entraînement et la formation des opérateurs afin de garantir des interventions standardisées et maîtrisées. Un calcul de puissance statistique rigoureux a été effectué pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires par groupe, en tenant compte des variations expérimentales attendues et des hypothèses formulées. Ce calcul vise à minimiser autant que possible le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Ainsi a été défini qu’un nombre minimal de 10 à 15 souris par groupe serait nécessaire pour chaque condition ou type d’analyse. Par ailleurs, ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats intermédiaires obtenus au cours de l’étude. Ces analyses intermédiaires permettront d’évaluer la nécessité de poursuivre certains volets expérimentaux ou, au contraire, de réduire le nombre d’animaux requis, en optimisant les procédures en fonction des données déjà collectées. Pour l’analyse des données, nous utiliserons des tests diagnostiques adaptés aux caractéristiques des échantillons et à leur distribution statistique, afin d’assurer une interprétation précise et rigoureuse des résultats. Cette approche garantit une utilisation raisonnée et éthique des modèles animaux tout en maximisant la qualité scientifique des conclusions.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée, en groupe et avec un accès à un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification et bâtonnets de bois à ronger). Les paramètres environnementaux, tels que la lumière, la température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Ils auront un accès permanent à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Ils seront observés quotidiennement et toute anomalie sera consignée et transmise à l’équipe de recherche, au vétérinaire et à la structure chargée du bien-être animal pour la mise en place d’une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous maintiendrons la température des animaux tout au long de leur anesthésie et appliquerons un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Une injection de sérum physiologique sera également réalisée pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Nous assurerons une surveillance renforcée dans la période post-opératoire ou après les prélèvements sanguins afin de nous assurer de la bonne récupération des animaux. En post-opératoire nous utiliserons un cahier opératoire qui sera rempli le jour de l’intervention, consignant les observations per-opératoires et post-opératoires immédiates, ainsi que les suivis à un, deux et huit jours après la chirurgie. Nous utiliserons également une grille de surveillance pour évaluer la douleur et détecter toute atteinte de points limites. Ce suivi permettra de détecter tout signe de stress ou de douleur
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent au nettoyage naturel du cerveau, en éliminant certains composés qui peuvent s’y accumuler. Pour cela, un modèle animal est nécessaire. Des souris seront utilisées, car ce modèle est bien adapté à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral y sont maîtrisées. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures expérimentales seront menées sur des souris adultes âgées de 2 mois à 1 an, une période durant laquelle la croissance de la boîte crânienne est achevée, permettant une précision optimale lors des interventions, et où la taille corporelle favorise de bonnes conditions opératoires. Cet âge garantit également que certaines structures impliquées dans la circulation des fluides cérébraux sont encore pleinement fonctionnelles. Tous les animaux seront identifiés par tatouage (au niveau des phalanges) dès leur arrivée au laboratoire, à un âge minimal de 6 semaines.