Souris
Développement d’une technique innovante et mini-invasive d’injection de thérapie génique dans l’oreille interne par bioimpression assistée par laser
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Opérées de l'oreille interne à l'âge de deux semaines, 70 souris reçoivent une thérapie génique déposée au laser sur la fenêtre ronde, puis passent quatre mesures d'audition sous anesthésie étalées sur huit semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées après la dernière mesure, pour prélèvement des tissus de l'oreille interne. Une partie des animaux appartient à une lignée sourde par mutation, ce qui doit permettre de vérifier que la thérapie restaure l'audition avant un passage chez l'être humain. Le porteur affirme que le dépôt au laser et les mesures d'audition n'engendrent aucune douleur, et annonce des points limites définis sans dire lesquels.
Objectifs
L’oreille interne, où se situe la cochlée, l’organe permettant d’entendre, est difficile d’accès pour l'administration de médicaments. En effet, la cochlée est un organe de quelques millimètres situé derrière le tympan. La présence d’une barrière physiologique entre la circulation sanguine et les liquides de l’oreille interne limite l’accès par les voies conventionnelles telles que la voie orale ou intraveineuse. Une des extrémités de la cochlée, la membrane de la fenêtre ronde, fine et perméable, est une voie d’accès à la cochlée. En effet, il est possible de venir déposer le médicament sur la membrane de la fenêtre ronde, cette approche étant considérée conservative et peu invasive. La bioimpression assistée par laser permet le dépôt contrôlé et très précis de bioencre contenant des cellules. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de médicaments assistée par laser. Cette méthode a déjà été utilisée pour l’administration d’anti-inflammatoires sur la membrane de la fenêtre ronde chez la souris. Les résultats montrent que le médicament diffuse jusqu’aux cellules au sein de la cochlée sans effet délétère. Dans la continuité de ce projet, l’objectif est d’améliorer le procédé de dépôt ciblé pour l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur la fenêtre ronde humaine. Des méthodes pour augmenter la diffusion à travers la membrane doivent également être validées pour améliorer le transfert de la thérapie génique. Finalement, la correction du défaut génétique et la récupération de l'audition seront validées chez un modèle animal présentant une modification génétique similaire à l'homme, touchant la production d'une protéine indispensable pour entendre.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’injection et de diffusion de médicaments, et plus particulièrement de thérapie génique, dans la cochlée, avec une grande précision et sans risque de lésions, contrairement aux injections invasives développées à ce jour. L’utilisation d’une fibre et de médicaments plus volumineux nécessite une nouvelle validation du procédé de dépôt ciblé assisté par laser sur la fenêtre ronde et une diffusion dans l’oreille interne. De plus, cette étude pré-clinique est nécessaire pour ensuite passer aux essais cliniques chez l’homme. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de dépôt ciblé de médicaments assisté par laser conduit par fibre. Plus largement, ce projet permettra de valider l’utilisation du laser pour l'administration de médicaments.
Procédures
Les animaux seront soumis à des mesures pré-opératoires et post-opératoires de l’audition, n’excèdant pas 10 minutes. Les mesures post-opératoires seront effectuées 48h, une semaine, deux semaines et huit semaines après l’opération. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments dans l’oreille (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). Un anti-douleur est également administré en pré-opératoire, et 24h après la chirurgie, pour limiter la douleur occasionnée par la chirurgie. L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et sont réalisés sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédure pré-opératoire et opératoire n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt ciblé et de mesure de l’audition n'engendreront aucune douleur. Chez les souris avec surdité d'origine génétique, la thérapie génique doit entraîner la récupération de l'audition dans les semaines suivant le traitement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue à la fin de la dernière mesure de l'audition (huit semaines post-opératoire). Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse quantitative et qualitative (histologie, fluorescence).
Remplacement
L’application de thérapie génique sur la membrane de la fenêtre ronde assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.
Réduction
Des tests préliminaires seront effectués sur des lames receveuses et du matériel inerte afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) avant de procéder aux expérimentations animales. La méthode de perméabilisation sera décrite précisément et validée in vitro et ex vivo, avant de procéder aux études in vivo. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure : mesure pré-opératoire de l’audition, chirurgie, perméabilisation et dépôt ciblé assistés par laser, et les quatre mesures post-opératoires de l’audition, afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions (contrôles, validation du dépôt ciblé, délivrance de médicaments actifs). Le nombre total de 70 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage en groupe (5 par cage) à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dans la semaine précédant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante, uniquement avec la mère puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe per-opératoire. La douleur engendrée par la chirurgie sera réduite au maximum par utilisation d’analgésique et anesthésique local. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites sont définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Tous les expérimentateurs satisferont les obligations de formation en chirurgie sur rongeurs et en expérimentation animale.
Choix des espèces
L’évaluation de l’impact de la procédure sur la fonction auditive et de la diffusion et du transfert de thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. Les mesures de l'audition ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Par ailleurs, une lignée de souris présentant un défaut auditif génétique similaire à l’homme existe au sein de l’animalerie et nous permettrait de valider la diffusion, le transfert génique et la récupération de l’audition. Les souris utilisées auront deux semaines lors de la procédure opératoire, car les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde.
Rôle des molécules S100 dans la pathogenèse du diabète de type 2 EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées puis nécropsiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent jusqu'à quinze gavages un jour sur deux, seize prélèvements sanguins à la queue, une chirurgie de pose de pompe osmotique sous anesthésie, un régime enrichi en lipides pendant douze semaines au plus, des séances de tapis roulant cinq fois trente minutes par semaine sur six semaines, et pour certaines un isolement de quarante-huit heures en cage de calorimétrie. Le porteur décrit des blessures œsophagiennes possibles après les gavages répétés, des crampes abdominales après l'injection de molécules toxiques pour les cellules du pancréas, et des blessures légères aux pattes à la course. L'objet est de mesurer le rôle d'une protéine dans l'insulino-résistance et la fonte musculaire, et le porteur écrit que le recours à la souris est "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant ces interactions.
Objectifs
L'obésité est un facteur de risque majeur de diabète de type 2 (DT2) qui représente un fardeau de santé publique et diminue l’espérance de vie en bonne santé. Ces deux pathologies sont également associées à une insulino-résistance et une sarcopénie, i.e. perte progressive de masse et de force musculaire. Nous avons mis en évidence une surexpression marquée d’une protéine d’intérêt. Cette protéine peut s’hétérodimériser avec une autre protéine de la même famille pour former un complexe multi-protéique. Ces protéines jouent un rôle clé dans l’inflammation et l’immunité. Cependant leur rôle dans la pathogenèse du DT2 reste incertain. Nous émettons l’hypothèse que cette protéine pourrait jouer un rôle causal dans les altérations métaboliques et fonctionnelles du muscle squelettique dans un contexte d’obésité et de vieillissement. L’objectif de ce projet est de : 1) démontrer un rôle causal de notre protéine d’intérêt dans le développement de l’insulino-résistance et de la sarcopénie ; 2) évaluer si l’inhibition de l’action de cette protéine prévient au moins en partie du développement de l’insulino-résistance et/ou de la sarcopénie associée à l’obésité et à l’âge. Ces questions exigent le recours au modèle animal pour se placer dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet visant à étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie promet de générer des bénéfices substantiels tant au niveau scientifique que clinique. En premier lieu, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ces pathologies métaboliques et musculaires, en étudiant spécifiquement le rôle de notre protéine d’intérêt. Une connaissance plus détaillée de l'implication de cette protéine pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, offrant ainsi des perspectives innovantes pour le développement de traitements spécifiques et efficaces. Sur le plan clinique, l'identification de la protéine comme un biomarqueur clé dans l'inflammation chronique associée à l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie pourrait améliorer le diagnostic précoce et la stratification des patients. Les praticiens pourraient ainsi mieux évaluer le risque de complications métaboliques et musculaires chez les patients obèses et ceux présentant une résistance à l'insuline, permettant une intervention préventive plus rapide et personnalisée. De plus, cibler cette protéine dans des approches thérapeutiques pourrait offrir une nouvelle avenue pour réduire l'inflammation et améliorer la sensibilité à l'insuline, atténuant ainsi les effets délétères de ces conditions sur la santé des patients. L'impact potentiel sur la gestion de la sarcopénie est également significatif. En étudiant les mécanismes par lesquels notre protéine d’intérêt contribue à la perte de masse musculaire et à la dysfonction métabolique, ce projet pourrait mener à des stratégies visant à préserver la masse et la fonction musculaire chez les personnes âgées et les patients atteints de maladies chroniques. Cela pourrait améliorer considérablement la qualité de vie et l'autonomie des individus affectés, tout en réduisant les coûts de santé associés aux complications liées à la sarcopénie. En somme, ce projet offre une opportunité de faire progresser notre compréhension des maladies chroniques liées à l'obésité et au vieillissement, tout en ouvrant la voie à des interventions thérapeutiques novatrices et personnalisées pour améliorer la santé et le bien-être des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 15 gavages (1 jour sur 2) et/ou à 7 injections sur 5 jours consécutifs seulement ainsi que 16 prélèvements sanguins à la queue (4 séquences de 7 prélèvements consécutifs). Tous les actes précédemment cités ne durent qu’au maximum 30 secondes chacun. Certains animaux auront une injection unique sous anesthésie générale. D’autres animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale une fois au cours de leur vie pour la pose de mini-pompe osmotique. Certains animaux auront une alimentation enrichie en lipides pendant un maximum de 12 semaines ou encore deux tests d’effort et de préhension au maximum. Un nombre limité d’animaux sera entrainé sur tapis roulant 5 fois 30 minutes maximum par semaine pendant 6 semaines consécutives. Certains animaux subiront au maximum deux isolements de 3 minutes pour mesures de composition corporelle et d’autres subiront un isolement pour mesure de dépense énergétique pendant un maximum de 48h. Dans le second établissement utilisateur, un nombre restreint d’animaux subira une injection de traceur radioactif pendant 15 minutes avant mise à mort et l’ensemble des animaux seront mis à mort et nécropsiés.
Impact sur les animaux
Le régime hyperlipidique induit une obésité chez les animaux pouvant créer un inconfort. Le gavage répété peut causer du stress et des blessures oesophagiennes (entrainant une diminution de la prise alimentaire) abolis après arrêt des gavages. La pose d’une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie gazeuse peut provoquer des douleurs quelques jours après l’opération. La surexpression de notre protéine peut entraîner une inflammation associée à l’obésité et engendrer l'aggravation de l'insulino-résistance ainsi qu’une diminution des fonctions musculaires. Les prélèvements répétés de sang lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer du stress et des douleurs légères pendant 120 minutes au maximum. Les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant 2 à 3 minutes seulement. Les tests de force provoquent un stress pendant 120 minutes au maximum. La course provoque un stress pendant 120 minutes au maximum et peut provoquer des blessures légères aux pattes. La mesure de calorimétrie provoque un stress dû à l’isolement visuel et olfactif pendant 48h au maximum. Le transfert adoptif de cellules immunitaires peut provoquer une inflammation de bas grade. L’injection de certaines molécules est cytotoxique pour les cellules pancréatiques et peut engendrer des crampes abdominales.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort de manière réglementaire en fin de procédure et sont nécropsiés pour récolte d’organes et analyses ex vivo. Aucun animal de ce projet ne sera ré-utilisé.
Remplacement
Nous avons effectué des travaux préliminaires sur des modèles in vitro de myotubes humains montrant des effets de notre protéine d’intérêt sur la sensibilité à l’insuline et l’atrophie des myotubes. Le recours au modèle animal est indispensable pour évaluer les effets de cette protéine dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des études in vitro sont réalisées en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur les animaux. Des études pilotes permettront d'ajuster le protocole expérimental pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans les études principales ; ces études pilotes permettront aussi de s’assurer de la fiabilité du modèle. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats significatifs sont effectués.
Raffinement
Les animaux auront une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le responsable de la mise en oeuvre sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Lors des actes chirurgicaux ou injections douloureuses des anesthésies gazeuses sont prévues avec utilisation d’antalgiques en périopératoire. Lors des injections de produits provoquant des douleurs nous administrerons des antalgiques en amont. Pour les tests d’exercices physiques les animaux seront préalablement acclimatés et surveillés afin de détecter d’éventuelles blessures aux pattes. Pour les manipulations nécessitant l’isolement des animaux pendant 48 heures maximum, une surveillance accrue sera appliquée lors de leur retour en groupe afin de détecter des comportements agressifs. Nous pourrons alors ajouter des enrichissements dans les cages voire séparer les individus trop agressifs. Pour les animaux spontanément diabétiques nous réaliserons un change de litière plus fréquent et des contrôles de la glycémie. Pour l’expérimentation terminale dans l’établissement n°2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles de souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies métaboliques. Le modèle de souris choisi se prête bien aux phénotypage métabolique en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes moléculaires des maladies et de sa bonne susceptibilité aux régimes obésogènes. De plus, l’utilisation de souris spontanément obèses et diabétiques et leurs contrôles non-diabétique permettent une étude plus fine des mécanismes moléculaires. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 8 semaines. L’intérêt est ici d’étudier l’obésité, son développement et ses complications chez l’individu adulte.
Système nerveux central – modèle chronique de depression chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1000
Rendre des rongeurs dépressifs pour y faire passer une quinzaine de molécules : 2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des situations stressantes de quinze minutes à quatre heures par jour pendant une à huit semaines, sont privés de nourriture ou d'eau jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée une fois par semaine, et reçoivent des substances jusqu'à deux fois par jour. L'état obtenu est mesuré par des tests comportementaux que le porteur ne nomme pas, et la mise à mort de tous les animaux est justifiée par les effets méconnus des substances testées. Quinze molécules par modèle et par espèce doivent passer par ce criblage sur la durée du projet.
Objectifs
La dépression est une maladie psychiatrique complexe qui est actuellement reconnue comme l’une des principales causes d’invalidité et de souffrance dans le monde. Le National Institute of Mental Health (NIMH) rapporte qu’environ 12 % des Américains souffrent de dépression clinique, avec deux fois plus de femmes touchées que d’hommes. La dépression représente des milliards de dollars de coûts directs de santé et aussi indirects (baisse des revenus et perte de productivité). Les symptômes de la dépression comprennent l’anhédonie (absence de prise de plaisir), les changements de poids et des cycles de sommeil, la diminution de l’activité physique et de l’hygiène personnelle, des sentiments de désespoir ou de culpabilité et/ou des pensées récurrentes de mort ou de suicide. Des études épidémiologiques et cliniques ont indiqué que la dépression est prédictive d’un pronostic plus sévère de pathologies cardiovasculaires. L’étiologie et la physiopathologie associée de cette maladie sont mal comprises et l’hétérogénéité de la maladie due à divers facteurs (par exemple, des composants génétiques, biologiques et environnementaux, particulièrement l’exposition chronique au stress est un facteur de risque majeur) rend le diagnostic clinique difficile à définir. La dépression est principalement traitée avec des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine. Cependant, après une période de 2 à 3 mois de traitement, les taux de rémission sont faibles et certains patients ne présentent pas de rémission après des traitements avec plusieurs antidépresseurs : la résistance à la pharmacothérapie est conventionnellement appelée dépression résistante au traitement. Les modèles animaux des troubles psychiatriques demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie de ces maladies, l’identification des nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicamenteux ainsi que la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Ce projet vise à mettre en place des modèles de stress chronique induisant des comportements anxio-dépressifs chez le rongeur et permettant d’évaluer de nouveaux traitements. Nous prévoyons évaluer environ 15 molécules différentes de chacun des modèles chez le rat et la souris au cours de la durée du projet
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'améliorer la qualité de vie des patients et de leur entourage. Un traitement plus efficace pourrait réduire plus rapidement et plus durablement les symptômes de la dépression, sa sévérité et le taux de rechute permettant ainsi une meilleure qualité de vie des patients, de maintenir un état de santé stable plus longtemps, de diminuer les taux d'invalidité . Ce projet permettra également d'avoir un impact socio-économique positif en réduisant les coûts de santé (nombre de consultations médicales, d'hospitalisations et de traitements complémentaires nécessaires).
Procédures
Les animaux sont exposés à des situations inconfortables et stressantes de 15 min à 4 heures par jour pendant 1 à 8 semaines selon les procédures de façon à induire un état depressif. Cet état est évaluer en 2 ou 3 occasions à partir de tests comportementaux dont la durée varie de 5 à 40 minutes environ. Pour certaines procédures les animaux sont privés de nourriture ou d'eau pour une période maximale de 24 heures pouvant être répétés (1 fois par semaine, maximum 8 semaines). Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration). La durée du traitement peut aller jusqu’à 8 semaines. Les autres interventions subies par les animaux sont la préhension (maximum 1 minute) pour le placement et le retrait dans les différents dispositifs de mesures comportementales et l’administration du traitement.
Impact sur les animaux
La répétition des situations inconfortables et stressantes vont engendrer un état de stress chronique et une modification de comportement pendant plusieurs semaines (maximum 8 semaines). Les manipulations/contentions des animaux réalisées au cours des procédures d’administrations peuvent également engendrer un stress de courte durée. L'injection des différents traitements pourra entraîner une douleur légère de courte durée.
Devenir
Compte tenu de l'induction de stress chronique, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. De plus, les substances d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus pourrait induire un effet délétère sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation chez l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc le nombre d’animaux. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux états d'anxiété/dépression ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 12 - 18 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests statistiques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, tunnels, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.
Choix des espèces
Un certain nombre de symptômes des troubles anxieux et dépressifs comprenant l’anhédonie, apathie, troubles du sommeil, changements de poids/d'appétit, alltération psychomotrice, retrait social peuvent être facilement évaluées chez les animaux, en particulier chez le rongeur. Ainsi, divers tests ont été conçus pour mesurer ces différents aspects. L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature. Les symptômes d'anxiété et dépression se retrouvent plutôt chez des sujets adolescents ou adultes, aussi les traitements qui seront appliqués dans ce projet seront appliqués sur des rongeurs dont le SNC a atteint ce niveau de maturité.
Prélèvement de tissu pour le génotypage de 2 lignées de souris transgéniques pour le récepteur du peptide vasocatif urotensine
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées lorsque leur profil génétique ne sert plus à la reproduction, versées à d'autres projets autorisés dans le cas contraire, 3 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Au sevrage, entre trois et cinq semaines, chacune se fait découper un bout d'oreille sous anesthésie brève et implanter une puce électronique sous la peau, et jusqu'à 5 % d'entre elles repassent une seconde fois par ce prélèvement. Le projet ne sert qu'à entretenir deux lignées transgéniques liées au récepteur de l'urotensine II, élevées depuis cinq ans dans l'établissement pour alimenter des travaux sur les hémorragies cérébrales. Le porteur qualifie ces lignées d'"indispensables" à ces travaux et conclut que "l'animal entier est donc nécessaire", les cerveaux devant être étudiés en entier.
Objectifs
Ce projet vise à identifier et à réaliser des prélèvements de tissus (petit bout d'oreille) permettant de réaliser la caractérisation génétique de souriceaux issus de la reproduction de souris de 2 lignées transgéniques, des souris n'exprimant pas le récepteur d'un peptide vasoactif (urotensine II) et des souris exprimant le gène du récepteur de l'urotensine humain. Les biopsies permettront de maintenir l’élevage de ces 2 lignées de souris, en cours dans l'établissement depuis 5 ans, et permettra de fournir les animaux nécessaires aux projets scientifiques autorisés. Ces souris sont actuellement utilisées dans différents projets scientifiques du laboratoire cherchant à caractériser le rôle de l'urotensine dans divers processus pathologiques, notamment les hémorragies cérébrales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la caractérisation génétique et l'identification des souris issues des reproductions nécessaires aux élevages et utilisées pour les différents projets scientifiques de l'équipe. Ce projet permettra de produire et d'entretenir des lignées de souris transgéniques qui sont indispensables aux projets scientifiques actuellement en cours (projets autorisés) visant à élucider les mécanismes impliquant le système urotensinergique et à rechercher des thérapies potentielles dans le cadre de modèles d'hémorragies cérébrales.
Procédures
Les souriceaux issus de la reproduction au sein de chacune des 2 lignées de souris transgéniques feront l'objet d'une biopsie au moment du sevrage (entre 3 et 5 semaines post-natal) afin de permettre leur caractérisation génétique. Pour cela un petit bout d’oreille sera prélevé grâce à des micro-ciseaux chirurgicaux, désinfectés avant chaque utilisation. Les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) afin de limiter le stress éventuel lié à leur manipulation nécessaire pour le prélèvement de tissu et pour l'injection sous-cutanée d'une puce électronique permettant leur identification à long-terme. En cas de problème techniques rencontrés parfois au moment des expériences de caractérisation génétique, il pourrait être nécessaire de réaliser à nouveau, quelques jours après le sevrage, un prélèvement de tissu à l'oreille sur les animaux anesthésiés brièvement, et ceci pour moins de 5 % des souris.
Impact sur les animaux
Une possible douleur au niveau de la zone de la biopsie et un stress de courte durée pourraient apparaitre.
Devenir
Les animaux anciens reproducteurs ou dont le profil génétique n'est pas utile pour la reproduction, et qui ne seront pas utilisables pour d’autres projets ayant reçu une autorisation du ministère, seront mis à mort. Les autres animaux seront utilisés pour des projets scientifiques spécifiques (ayant fait l'objet d'autres demandes d'autorisation de projet).
Remplacement
Des souris sont nécessaires pour assurer la reproduction des animaux des 2 lignées transgéniques et ainsi fournir les souris utilisées dans les projets de recherche faisant l’objet ou ayant fait l’objet d’autres demandes d’autorisation au Ministère et portant notamment sur des modèles murins d'hémorragie cérébrale qui sont évalués dans des tests comportementaux et dont le cerveau entier est indispensable pour des études neurobiologiques. L'animal entier est donc nécessaire.
Réduction
Les prélèvements nécessaires à la caractérisation génétique des animaux ne concerneront que les souris servant au maintien de l'élevage. Le nombre d'animaux de ce projet est un nombre maximal car il ne tient pas compte de la variabilité de l'effectif de nouveau-nés d'une portée à l'autre (variant de 0 à 15). Afin de réduire le nombre d'animaux qui feront l'objet de prélèvements pour le génotypage, des schémas de reproduction pourraient être mis en place (entre homozygotes) pour obtenir des souris en plus grand nombre en cas de besoin dans des procédures décrites dans d'autres projets autorisés.
Raffinement
Les prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté. Afin de réduire le stress des animaux soumis à une contention pour le prélèvement de tissus au moment de leur identification, les souris seront anesthésiées brièvement. Le tissu prélevé sera le plus petit possible. Les outils nécessaires à la biopsie seront désinfectés avant chaque utilisation. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur au minimum. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement et permet de déceler un éventuel signe de souffrance. Un suivi particulier sera fait au niveau des zones de la biopsie au cours de la semaine qui suit les gestes. Parmi ces signes, des plaies, des vocalisations anormales, une agressivité anormale, une posture « dos voûté », une lenteur des mouvements, une prostration indiquent une souffrance de l’animal. Si l’un de ces signes ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé dans les heures qui suivent son apparition, des soins seront apportés, par exemple désinfection des plaies. Et si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 48h, il sera considéré que le niveau de souffrance atteint nécessite une mise à mort anticipée.
Choix des espèces
La souris est très couramment utilisée comme modèle transgénique et c’est une espèce classiquement utilisée le cas des études sur l'hémorragie cérébrale car leur anatomie et physiologie sont bien connues. Ce projet utilise des souris n’exprimant pas le gène du récepteur de l'urotensine ou exprimant le gène codant le récepteur humain. Ces 2 lignées de souris sont déjà utilisées dans notre établissement et permettront de poursuivre les projets scientifiques en cours ou prochainement mis en place. Le prélèvement de tissu pour permettre la caractérisation génétique des individus sera fait sur des souris âgées de 3 à 5 semaines.
Acquisition d’une maitrise des gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 690
Cochons d'Inde : 817
Lapins : 647
Pour que le personnel d'animalerie acquière et maintienne la maîtrise de gestes techniques exigée par l'arrêté du 1er février 2013, 2 772 animaux non-humains vont être utilisés et tous tués. Ce sont 817 cobayes, 690 rats, 647 lapins et 618 souris, chacun soumis vigile et sous contention à quatre gestes différents au maximum, de trente secondes à deux minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les mannequins et les simulateurs d'injection servent en amont mais ne suffisent pas à réussir le geste sur un animal vigile. Il précise que ces animaux sont des animaux de réforme "déjà destinés à l'euthanasie" ou repris d'autres protocoles, et qu'ils ne sont pas gardés en vie afin de pouvoir vérifier la qualité du geste.
Objectifs
Ce projet est dédié à l’acquisition d’une parfaite maîtrise de gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales par les personnels d’animalerie. Il répond aux exigences réglementaires de l'arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation de compétences du personnel des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux à des fins scientifiques. Maîtriser les gestes techniques est fondamental pour le bien-être animal (réduction au maximum du stress et de la douleur associé à ces gestes) et la reproductibilité des résultats scientifiques (exécution correcte du geste et fiabilité du résultat scientifique en découlant) lors des prochaines procédures de l’établissement. L’objectif de ce projet est d’assurer, après une première acquisition théoriques et sur modèles inertes, des compétences relatives aux gestes techniques, leur qualification et leur maintien dans le temps tout en garantissant le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la maitrise pour nos personnels travaillant avec les animaux des gestes techniques de routine dans nos activités, en respectant les bonnes pratiques actuelles et en minimisant les contraintes sur les animaux. En s’assurant que nos personnels sont à jour dans les connaissances pratiques et théoriques des gestes techniques, nous nous assurons que les procédures sont réalisées dans les meilleures conditions possibles et dans le respect du bien-être de l’animal.
Procédures
Chaque animal sera soumis au maximum à 4 gestes techniques différents, vigile et sous contention, d’une durée oscillant entre 30 secondes et 2 minutes.
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention et douleur associée aux gestes techniques (introduction d’une aiguille).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Les animaux utilisés sont des animaux de réformes déjà destinés à l’euthanasie, il a donc été décidé de ne pas les garder en vie après les procédures pour éviter tout stress supplémentaire et pouvoir, le cas échéant, vérifier la qualité du geste technique.
Remplacement
Des méthodes alternatives comme des vidéos explicatives ou encore le recours à des mannequins ou autre support inerte (ex : simulateur d’injection intra veineuse) serviront de supports préalables lors des volets théoriques et pratiques des différents gestes techniques. Cependant, ces méthodes alternatives ne suffisent pas pour que le personnel réussisse à réaliser les gestes en conditions réelles, sur animal vigile tout en minimisant les nuisances sur cet animal lors de la réalisation du geste : cette partie ne peut être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour les procédures est composé d’un minimum et d’un maximum, afin de pouvoir vérifier que le personnel maitrise la technique. Dès lors que le nombre minimum d’animaux est atteint et que le geste est maîtrisé, la procédure s’arrête. Si le nombre maximum est atteint et que le personnel ne maîtrise toujours pas le geste, il repasse sur modèle inerte. Les animaux utilisés seront uniquement des animaux de réforme de l’animalerie de l’établissement où se déroule le projet ou des animaux réutilisés de protocoles expérimentaux (après validation vétérinaire et selon les recommandations éthiques). Lors de ces procédures et sur les conseil du vétérinaire et/ou la SBEA, il est possible d’utiliser un même animal pour plusieurs gestes techniques (selon leur caractère invasif) afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour atteindre les objectifs du projet.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge. Des points limites en fonction des spécificités des gestes seront appliqués. Une observation de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (soins locaux, ajout d’enrichissement, ajout d’aliment, ...). ...). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. La manipulation et la contention des animaux se fera par le biais de méthodes les moins stressantes possibles (creux de la main, tunnels, habituation …). Les techniciens s’entraineront d’abord à la contention avant d’effectuer le geste, pour que le geste soit réalisé de manière sécurisée et non stressante pour l’animal et la personne. Les volumes prélevés ou injectés seront basés sur les doses minimales, et avec des produits neutres comme du sérum physiologique, ceci dans le respect des volumes d’administration et de prélèvements propres à chaque espèce.
Choix des espèces
Mâles ou femelles peuvent être utilisés. Dans la mesure du possible, les surplus de stock comme les mâles chez l’espèce souris et lapins et les femelles chez l’espèce rat et cobayes seront choisis. Ces espèces ont été choisies car ce sont les espèces élevées et utilisées dans notre établissement, il est donc nécessaire que le personnel maitrise les gestes techniques sur ces différentes espèces qui ont chacune leurs particularités. Pour pouvoir être cohérent avec les conditions réelles dans laquelle ces gestes techniques vont être réalisés et minimiser ainsi l’impact sur le bien-être animal, la qualification et la requalification des gestes techniques est effectuée sur des animaux vivants dont l’espèce correspond à celle sur laquelle les gestes seront réalisés. Les mâles ou femelles peuvent être utilisés. Dans la mesure du possible, les surplus de stock comme les mâles chez l’espèce souris et lapins et les femelles chez l’espèce rat et cobayes seront choisis.
Développement et utilisation d’une nouvelle technique double d’activation neuronale et d’imagerie simultanée : la sonogénétique
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Rats : 480
344 souris et 480 rats vont être utilisés, chacun pouvant subir jusqu'à trois opérations du cerveau de trente minutes à quatre heures, et jusqu'à 28 tests de sensibilité de la patte. 320 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère, une partie des animaux recevant une lésion du nerf sciatique qui installe une douleur persistante, tandis que les séances sur le sommeil et la récompense durent de trente minutes à deux heures, deux fois par semaine. Le porteur décrit cette douleur tantôt comme de "faible intensité", tantôt comme d'"intensité moyenne", et annonce qu'elle n'occasionnera "qu'une gêne ou une douleur légère". Tous sont tués à la fin du protocole, leur cerveau étant collecté pour l'étude histochimique.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer une nouvelle technique d’étude des circuits cérébraux, par stimulation ultrasonore. Nous souhaitons stimuler les neurones et enregistrer en même temps les conséquences de cette stimulation sur les réseaux cérébraux, ainsi que le comportement animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront le développement d’une nouvelle technique d’étude du cerveau chez le petit rongeur (principales espèces modèles en neuroscience) permettant à la fois de stimuler et d’imager des zones cérébrales et des réseaux avec une grande précision spatiale et temporelle. De plus cette nouvelle modalité d’étude est non invasive chez la souris ce qui en fait une méthode de stimulation cérébrale unique. Par ailleurs, en plus de cet apport technologique, nos travaux visent à définir le réseau de structures cérébrales activées et désactivées au cours d’une tâche de récompense et au cours du sommeil.
Procédures
Au cours des phases du projet, les animaux seront amenés à subir : - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 minutes et 4 heures. Certains animaux subiront plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. Ces chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale. Ils subiront également 4 semaines après la chirurgie, un test pour évaluer le seuil de douleur. - Des tests comportementaux pour étudier leur sommeil ou leur comportement de récompense. Ces tests dureront entre 30 minutes et 2 heures, deux fois par semaine maximum. - Certains animaux seront soumis à une douleur persistante de faible intensité car ils subiront une chirurgie de lésion du nerf sciatique au niveau de leur patte droite et une chirurgie au niveau de leur cerveau. Ces animaux subiront à des tests de leur seuil de sensibilité de la patte : avant cette chirurgie de lésion du nerf sciatique, puis deux fois par semaine (délai de 4 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental (soit un total de 28 tests maximum). Il n'occasionnera qu’une gêne ou une douleur légère.
Impact sur les animaux
Suite aux chirurgies (présentes dans toutes les procédures du projet), une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue, mais celle-ci disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les animaux ayant reçu une lésion d'un nerf de la patte postérieure vont développer une douleur persistante d'intensité moyenne. Dans les différentes parties de notre étude, la technologie utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera environ une heure. Au cours des expériences sur le sommeil, il se pourrait que le repos et le rythme de vie des animaux soit impacté négativement. Nous espacerons donc les sessions d’expérimentation pour chaque animal afin que les effets potentiellement négatifs ne s’accumulent pas. Au cours des séances d’imagerie chez les animaux anesthésiés, l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables, notamment sur les constantes vitales de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole. La collecte de leur cerveau est nécessaire à notre étude histochimique.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse anatomo-fonctionnelle des réseaux cérébraux impliqués dans la sensibilité, l'action motrice ou le sommeil nécessitent une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives. Ce nombre a été calculé grâce à un calcul de puissance statistique sur la base d'expériences antérieures de notre laboratoire, des articles publiés et le taux de succès attendu de certaines procédures. Autant que possible, nous allons recueillir le maximum de données scientifiques des animaux utilisés afin d' utiliser le plus petit nombre possible. Nous utilisons également leurs tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.
Raffinement
Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures ont été mises en place : - Les animaux sont manipulés à l’aide de la technique du tunnel pour limiter les interactions négatives avec les experimentateurs. - Chez le rat, une interaction par ‘tickling’ (chatouillis mimant les interactions de jeux entre congénères) sera mise en place pour améliorer leur bien-être quotidien. - Des protections de fenêtre chronique ont été développées afin de permettre de garder les animaux implantés chroniquement en petite colonie. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques, analgésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs.
Choix des espèces
Il est important que cette nouvelle technologie soit développée et validée chez le rat et la souris. Les deux espèces sont largement utilisés en Neurosciences pour des raisons différentes : - Le rat a un comportement très riche. Plus calme, il peut porter des charges plus importantes sur sa tête (comme le porte sonde et la sonde échographique) et est, de ce fait, l' espèce de référence pour faire des études chez l'animal vigile. Son cerveau est aussi plus gros, ce qui rend la quantification de l' imagerie plus robuste. - La souris est un choix évident pour comparer l'efficacité de notre technique avec une prédente approche qui activait les neurones avec de la lumière. De plus, le modèle de douleur utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé chez la souris et non dans une autre espèce. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifiques posées.
Thérapie Génique par surexpression de la phosphodiestérase de type 3 chez la souris pour traiter l’insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une minipompe implantée sous la peau du dos pour faire monter la pression artérielle, ou une aorte resserrée chirurgicalement pour provoquer une insuffisance cardiaque, puis une injection de virus derrière l'œil et une échocardiographie sous anesthésie tous les sept jours pendant six semaines. 404 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dont 244 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'hypertrophie du cœur qui évolue vers l'insuffisance cardiaque, l'œdème pulmonaire, la fatigue, la difficulté respiratoire et la prostration, et reconnaît des douleurs importantes pour la constriction de l'aorte. Il écrit aussi que l'injection derrière l'œil "ne provoque aucune nuisance notable" et que l'entretien des animaux est conduit de façon à "s'assurer qu'ils ne subissent aucun stress".
Objectifs
L’objectif du projet est de 1: Démontrer in vivo par l'utilisation de modèles d'hypertension provoquée chez la souris, qu’une thérapie génique réalisée par injection intraveineuse de virus qui cible le coeur et permettent l'augmentation de l'expression d'une enzyme dans le coeur, améliorerait l'activité cardiaque des patients atteints d’hypertension artérielle et éviterait que leur pathologie amène à l’insuffisance cardiaque. Des mesures de la fonction cardiaque par échocardiographie, de la mesure de pression artérielle et des analyses biochimiques réalisées ex vivo fourniront des éléments de réponse à ce sujet. 2: Ce projet permettra de caractériser également les effets protecteurs de notre traitement ex vivo à l'échelle cellulaire et moléculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter des connaissances essentielles pour la compréhension des mécanismes sous-jacents aux effets cardioprotecteurs d'une thérapie génique de l'insuffisance cardiaque ; ii/ A court terme ce projet nous permettra de valider notre concept thérapeutique innovant ouvrant la voie à une éventuelle thérapie génique de l'insuffisance cardiaque par une enzyme. A plus long terme il permettra de développer une alternative prometteuse ou un complément aux traitements actuels de l'insuffisance cardiaque induite par l’hypertension artérielle qui pour l'instant reste inefficace pour de nombreux patients.
Procédures
Un groupe d'animaux sera traité pharmacologiquement pour induire une hypertension. Pour cela, une minipompe délivrant des produits induisant une hypertension est placée sous la peau du dos de l'animal anesthésié et analgésié. Une deuxième groupe est soumis à une contriction de l'aorte pour induire une insuffisance cardiaque. Ces procédures chirurgicales réalisées sous anesthésie générale durent 10 minutes environ. Les animaux sont ensuite soumis à une seule injection rétro-orbitale des virus qui est réalisée en 1 minute sous anesthésie générale et qui ne provoque aucune nuisance notable. L'activité cardiaque et la pression artérielle des animaux est suivie régulièrement par échocardiographie tout les 7 jours sous anesthésie générale pendant 6 semaines. Ces mesures sont réalisées en 10 minutes.
Impact sur les animaux
L’hypertension et l’éventuelle insuffisance cardiaque qui vont ensuite s’installer dans le groupe soumis au traitement pharmacologique pour élever la pression artérielle ou l'autre, subissant la constriction de l’aorte, vont s’accompagner des signes cliniques de ces pathologies. L’apparition d’un œdème pulmonaire, qui provoquent fatigue, difficulté respiratoire, perte de poids et une prostration sera surveillée. Les chirurgies réalisées entraineront des douleurs peu importantes (pour le modèle induit pharmacologiquement) ou importantes (pour le modèle de constriction de l'aorte) qui seront prises en charge par un traitement analgésique approprié. Les modèles provoquent dans les 14 jours après traitement pharmacologique ou 2 jours après constriction de l’aorte, une hypertrophie du coeur qui évolue vers l'insuffisance cardiaque caractérisée par une diminution de sa capacité à pomper le sang et l’apparition d’un œdème pulmonaire caractéristique de la maladie.
Devenir
L’insuffisance cardiaque est une pathologie irréversible, les animaux sont donc euthanasiés en fin de procédure. L’ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvements d’organes, ce qui est nécessaire pour permettre l’évaluation du potentiel thérapeutique de la thérapie génique que nous testons.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant de récapituler le phénotype d’une cellule cardiaque adulte. Les tests cellulaires ne peuvent donc être réalisés que sur des cellules fraichement isolées de cœurs. De plus, dans l’hypertension artérielle et l’insuffisance cardiaque, le corps met en place des régulations physiologiques impliquant le système neuro-hormonal. Ces régulations neuro-hormonales ne peuvent pas être reproduites in vitro ce qui rend indispensable l’expérimentation dans un modèle préclinique intégré.
Réduction
(i) une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu sur la diminution de la fonction cardiaque (ii) les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux, (iii) afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les souris sont mises en cage et observées tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’hypertension artérielle sera induite en respectant au maximum les procédures de bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Un suivi rigoureux des animaux engagés dans les procédures est mis en place. Des points limites ont été scrupuleusement déterminés et sont soigneusement évalués quotidiennement. Si ces points limites sont atteints, les animaux sont euthanasiés pour limiter leur souffrance et leurs organes sont prélevés.
Choix des espèces
La souris est choisie car c’est un mammifère qui constitue un modèle courant et classique pour l'étude de la fonction cardiovasculaire y compris dans un contexte pathologique. Il est un modèle de choix car il offre la possibilité d’induire l’insuffisance cardiaque par des procédures chirurgicales. Des souris mâles et femelles de 6 semaines (30g ) jeunes adultes sont utilisées car les maladies cardiovasculaires se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Comparaison de la régulation de l’expression de deux transgènes efficaces en thérapie génique in vivo chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris qui font plusieurs hypoglycémies avant de recevoir la thérapie génique sont mises à mort. 58 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour prélever leur foie. La maladie leur est induite par cinq injections quotidiennes, puis viennent l'injection du vecteur viral dans la circulation, deux semaines de régime riche en sucres et en graisses pour une partie d'entre elles, une incision du bout de la queue et six prélèvements de sang par test de glycémie. Le porteur cherche lequel de deux vecteurs dérègle le moins la glycémie, et espère en tirer des recommandations alimentaires pour des patients dont la maladie touche environ 150 personnes en France.
Objectifs
La glycogénose de type I est une maladie génétique rare causée par un défaut dans un gène qui joue un rôle clé dans la production de sucre (glucose) par le foie. Lorsqu'il ne fonctionne pas correctement, le corps ne peut pas produire de glucose en interne, ce qui entraîne de graves baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies). De plus, des accumulations de glycogène (polymère de glucose) et de graisses se forment dans le foie, ce qui peut provoquer des problèmes hépatiques à long terme, allant jusqu’au développement de tumeurs pouvant nécessiter une greffe du foie. Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour cette maladie. Les patients doivent suivre un régime alimentaire très strict pour éviter les hypoglycémies, en mangeant régulièrement des sucres lents (Maïzena crue). La thérapie génique est une piste prometteuse ; elle consiste à introduire un gène fonctionnel dans le foie à l’aide de virus modifiés qui servent de « transporteurs » du gène médicament. Une étude sur un modèle viable de souris atteintes de glycogénose de type I a montré que l’injection unique de ce traitement permettait de restaurer la production de glucose par le foie et d’éviter l’apparition de tumeurs. Deux types de vecteurs ont été testés. Le premier est plus efficace et nécessite l’injection d’une dose plus faible, mais l’expression du gène médicament n’est pas régulée par l’insuline. Le deuxième, bien que moins efficace, est sensible aux régulations hormonales. Ces régulations sont importantes car l’insuline est une hormone qui contrôle le taux de sucre dans le sang. Elle est produite par le pancréas après un repas pour éviter que les taux de glucose dans le sang soient trop élevés. L’absence de régulation hormonale de l’expression du gène médicament pourrait dérégler l’équilibre de glucose dans le corps, et potentiellement favoriser une résistance à l’insuline, surtout en cas d'alimentation déséquilibrée, voire une hyperglycémie, qui sont les caractéristiques du diabète. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la thérapie génique sur l’équilibre du glucose et la réponse à l’insuline chez des souris atteintes de glycogénose. Ces souris suivront deux types d’alimentation : • Un régime normal • Un régime riche en sucre et en graisses (favorisant le diabète) Cela permettra de s’assurer que le traitement ne provoque pas de complications métaboliques, quelles que soient les habitudes alimentaires du patient.
Bénéfices attendus
Le taux de sucre dans le sang (glycémie) doit être très bien régulé. Si le foie produit trop de glucose, cela peut entraîner un risque de diabète, surtout chez les personnes ayant une alimentation déséquilibrée et un excès de poids. Les patients atteints de glycogénose de type I ne produisent pas de glucose eux-mêmes, donc ils doivent manger régulièrement des sucres lents tout au long de la journée et même la nuit. Ce régime constant peut les rendre moins sensibles à l'insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. La thérapie génique pourrait leur permettre de produire du glucose, mais selon la méthode utilisée, elle pourrait aussi modifier l’équilibre glycémique et, à long terme, augmenter le risque de diabète, surtout si leur alimentation n’est pas adaptée. Ce projet vise à mieux comprendre comment la thérapie génique influence la régulation du glucose chez des souris atteintes de glycogénose, en particulier après les repas. L’objectif est de trouver la meilleure approche pour optimiser ce traitement et, si nécessaire, donner des recommandations alimentaires aux patients pour éviter d’éventuels effets secondaires.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Toutes les souris transgéniques seront traitées par thérapie génique par une injection unique du vecteur dans la circulation sanguine. Pour cela, les souris seront immobilisées dans un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (durée d’environ 1 minute). Une partie des souris seront nourries en régime riche en sucres et en graisse pendant 2 semaines après la thérapie génique. Ce régime pourrait favoriser le développement d’un état prédiabétique chez certains lots de souris, sans conséquence sur le bien-être animal (asymptomatique). Pour analyser la régulation de leur glycémie, les souris recevront une injection de glucose ou d’insuline et leur glycémie sera mesurée régulièrement. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 6 fois au cours de chaque test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Au total, 3 prises de sang seront aussi réalisées avant et après l’injection du glucose pour suivre la sécrétion d’insuline. En fin de procédure, une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : -l’induction de la glycogénose de type I qui est une maladie entrainant des hypoglycémies sévères quand les animaux ne mangent pas (entre les repas). Le développement des hypoglycémies entraine un mal-être qui peut être important, voire le décès de l’animal s’il n’est pas pris en charge. -la biopsie de tissu et les injections peuvent entrainer une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour réaliser ces gestes induit un léger stress. -la prise de sang peut entrainer une légère douleur.
Devenir
Afin de caractériser l’effet des traitements, en particulier le pourcentage de cellules du foie guéries et le nombre de particules virales, le foie sera prélevé en fin d’expérience. Pour cela, tous les animaux devront être mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Aujourd’hui, on sait fabriquer en laboratoire de mini-foies appelés organoïdes, qui contiennent différents types de cellules du foie (comme les hépatocytes, les cellules biliaires ou encore les cellules immunitaires). Cependant, la thérapie génique ne peut pas être testée uniquement sur ces mini-foies, car elle repose sur l’injection de virus modifiés dans le sang pour transporter le gène médicament. Pour fonctionner, ces vecteurs doivent atteindre les cellules du foie (hépatocytes) en traversant les petits vaisseaux sanguins. Or, toutes les cellules du foie ne seront pas forcément corrigées. L’efficacité du traitement dépend donc de la quantité de cellules qui reçoivent le gène. C'est pourquoi il est essentiel de tester cette thérapie dans un organisme entier, où la circulation sanguine et le fonctionnement du foie sont aussi proches que possible de la réalité.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour cette étude a été calculé avec précision, en tenant compte des connaissances actuelles sur la maladie, du modèle animal choisi, du fonctionnement du métabolisme du sucre et de l’énergie, des résultats d’expériences précédentes et d’une approche statistique. Au total, ce projet réalisé sur 2 ans nécessitera 58 souris mâles, dont 50 souris atteintes de la maladie et traitées par thérapie génique et 8 souris saines servant de groupe témoin.
Raffinement
-Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, l’induction de la maladie sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. -La maladie étudiée ne se développe que dans le foie des souris adultes, ce qui évite des complications comme des hypoglycémies graves et protège les souris pendant leur développement. - Avant que la maladie n’apparaisse, les souris seront habituées à boire du glucose à la pipette. Ainsi, si leur taux de sucre baisse légèrement, elles accepteront plus facilement cette solution. - Pour éviter les hypoglycémies, les souris auront un accès facile à la nourriture (croquettes dans la cage, biberons adaptés). En cas d’hypoglycémie sévère, une injection de glucose sera réalisée, et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir leur température. Une grille d’évaluation permettra de surveiller les signes d’hypoglycémie. L’apparition de plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique constitue un point limite nécessitant l’euthanasie de la souris pour raison éthique. -Les souris seront manipulées avec un tunnel pour limiter leur stress. -Pour réduire la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones de ponction du sang et d’incision. -Une grille de score aidera à prendre des décisions en cas d’observation d’un mal-être et décrit les points limites au-delà desquels les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. La maladie sera induite à l’âge de à 5 semaines. Une période de 5 semaines suivant ces injections permet la disparition des effets potentiels sur le métabolisme du produit injecté lors de l’induction de la maladie. Les souris seront traitées par thérapie génique à l’âge de 10 semaines. Les souris saines témoins seront commandées dès l’âge de 4 semaines.
Génotypage invasif et gestion de la production de souris génétiquement modifiées atteintes de glycogénose de type 1a qui développent une maladie chronique rénale.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées au sevrage pour les femelles et les génotypes jugés non pertinents, à sept mois pour les mâles malades, la moitié des géniteurs pouvant retourner à l'élevage, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes les souris de chaque portée subissent à sept ou dix jours le prélèvement d'un morceau de tissu destiné à lire leur génotype, y compris celles dont le génotype ne servira à rien. Les souris porteuses de la modification développent une maladie rénale chronique que le porteur décrit comme silencieuse jusqu'à la mise à mort, une perte de poids supérieure à 15 % déclenchant celle-ci plus tôt. Il indique que des mini-organes cultivés en laboratoire existent désormais, tout en concluant que l'étude du rein "nécessite" des animaux parce que la fonction rénale suppose un organe entier.
Objectifs
Ce projet porte sur la gestion de souris génétiquement modifiées pour étudier la maladie rénale qui se développent chez les patients atteints de glycogénose de type 1. L’absence de cette enzyme provoque de fortes baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies) et des problèmes au foie et aux reins. La glycogénose est une maladie génétique rare qui touche environ 150 personnes en France. Jusqu’à ce jour, il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la maladie rénale de la glycogénose. En effet, son développement implique différents types cellulaires constituant le néphron et les tubules rénaux, ainsi que des cellules immunitaires recrutées de la circulation sanguine. Le modèle de souris utilisé dans ce projet reproduit toute la maladie rénale de la glycogénose et est viable car la transgenèse est ciblée dans les reins. L’obtention de ces souris transgéniques nécessitent la réalisation d’un prélèvement de tissu (biopsie) pour caractériser leur gène et sélectionner uniquement les souris d’intérêt. Contrairement aux souris totalement dépourvues de l’enzyme clé de la production de sucre et qui meurent très tôt d’hypoglycémie (chute des taux de sucre dans le sang), ces souris particulières restent en vie car leur foie peut encore produire du glucose. Elles développent cependant progressivement une maladie des reins, avec apparition de kystes et perte de la fonction rénale, ce qui en fait un bon modèle pour étudier cette complication. Ces souris sont donc un outil unique pour comprendre les mécanismes de la maladie rénale dans la GSD1a et pour tester de nouveaux traitements. Le projet a pour but de conserver de jeunes mâles capables de se reproduire pour produire rapidement un nombre suffisant de souris destinées à ces recherches.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus seront l’identification génétique de la lignée à partir d’une biopsie de tissu pour optimiser la gestion de l’élevage. Ce projet permet aussi d’organiser au mieux la production de cohortes d’animaux pour nos projets scientifiques (utilisation continue vers des projets liés à l’étude de la maladie rénale ou le test d’efficacité d’approches thérapeutique), en conservant un nombre de souris d’intérêt jeunes reproducteurs sans atteindre le développement le développement d’un mal -être lié à l’apparition d’une insuffisance rénale.
Procédures
Pour sélectionner les souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un morceau de tissu sera prélevé à l’âge de 7-10j sur toutes les souris de la portée (souris d’intérêt pour ce projet, mais aussi les souris de génotype non pertinent ou ne présentant pas phénotype dommageable) pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Les souris atteintes de glycogénose peuvent développer une maladie chronique rénale, mais qui restera silencieuse puisqu’aucun signe de mal-être liée à une insuffisance rénale ne devrait apparaitre avant la mise à mort à l’âge de 7 mois des animaux.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, on prélève un morceau de tissu pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci peut entrainer une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Le risque de saignement est très faible. La nuisance liée au phénotype dommageable est principalement induite par la perte de la fonction rénale à long terme. Cette maladie silencieuse peut se révéler par une perte de poids importantes et des signes communs de mal-être (prostration de l’animal, absence de toilettage, yeux fermés, respiration accélérée).
Devenir
Toutes les souris génétiquement modifiées qui présentent les caractéristiques de la glycogénose seront mis à mort à l’âge de 7 mois afin d’éviter d’atteindre les stades avancés de la maladie rénale. Les animaux de génotype non pertinent ou femelles non utilisées seront mis à mort au sevrage ; cependant une partie des animaux géniteurs (50%) pourra être replacée, si besoin, dans le système d’élevage en vue du maintien de lignées.
Remplacement
Même s’il est maintenant possible de bio-construire des mini-organes à partir de cellules en laboratoire, l’étude de la maladie rénale nécessite l’utilisation d’animaux ; en effet, le rein est un organe complexe dont l’organisation en néphrons est requise pour assurer la fonction rénale. Ainsi, conserver la physiologie de l’organisme est nécessaire pour comprendre les mécanismes impliqués dans cette maladie et tester l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en connaissant le schéma d’accouplement et le nombre de lots de souris nécessaires pour chaque projet d’expérimentation. Les lignées transgéniques nécessaires à la création de ce modèle animal sont cryoconservées, ce qui permettra d’arrêter la production des animaux dès la fin des projets nécessitant ces animaux
Raffinement
L’obtention d’un modèle de la glycogénose ne touchant que les reins permet d’éviter le développement d’hypoglycémies sévères caractéristiques de la glycogénose et qui sont fatales chez les souris génétiquement modifiées dans tous les tissus. Ce raffinement a permis d’obtenir un modèle unique reproduisant la maladie rénale chronique qui apparait chez les patients atteints de glycogénose plutôt âgés. Pour vérifier la modification génique, la biopsie sera réalisée sur une zone peu innervée à l’âge de 7-10 jours pour limiter la douleur liée à la petite incision. Lors de la contention des nouveau-nés, le zootechnicien se frottera les mains dans la litière pour limiter le stress des animaux. La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. L’âge de la mise à mort des animaux a été fixé à 7 mois pour les mâles afin de s’affranchir du développement du phénotype dommageable. Les femelles seront mises à mort au sevrage car elles ne peuvent pas être utilisées pour la reproduction. Une perte de poids au-delà des 15%, ainsi que l’observation d’une souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels les souris seront mises à morts.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Seule une biopsie de tissu sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Les animaux d’intérêt seront ensuite utilisés à l’âge de la maturité sexuelle (6-8 semaines) pour être mis en reproduction.
Etude comportementale de souris mutantes, modèles d’une maladie maladie génétique rare caractérisée par une déficience intellectuelle MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Placées dans des dispositifs qui mesurent leur activité, leur motricité, leur anxiété, leur sociabilité et leur mémoire, 360 souris porteuses de mutations liées au syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Cette version du projet ajoute un test de rotarod, où l'animal court sur un cylindre tournant jusqu'à trois cents secondes, sans augmenter l'effectif. Le porteur écrit pourtant que le seul effet indésirable potentiel sera le stress lié à la nouveauté de l'environnement, et qualifie le phénotype de non dommageable. L'encéphale de chaque souris est prélevé après la mise à mort, au cas où des modifications anatomiques échapperaient à l'observation du comportement.
Objectifs
L’ajout d’un nouveau test comportemental (rotarod) sans ajout d’animaux nécessite une modification du projet initial. Le syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf est une maladie génétique humaine identifiée à ce jour sur une centaine de personnes à travers le monde, souvent chez de jeunes enfants. Ces malades souffrent généralement d'une déficience intellectuelle, d'un retard développemental, de syndromes autistiques ainsi que de modifications comportementales plus ou moins sévères. De plus,cette pathologie est souvent associée à des troubles de la vision. Chez la souris, trois lignées mutantes ont été générées afin d'être au plus près des mutations rencontrées chez l'Homme. L'objectif principale est d'étudier le comportement (activité générale,motricité, apprentissage, mémoire, anxiété, sociabilité) de ces animaux afin de déterminer quel est le modèle (la mutation) le plus proche de l'Homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont importants car cela permettra de valider le modèle animal et de choisir la mutation génétique la plus proche de l'Homme afin de mieux étudier ensuite le neurodéveloppement dans ce modèle et éventuellement de proposer des thérapies comportementales afin de permettre une évolution favorable de ce syndrôme.
Procédures
Les animaux seront soumis à differents tests comportementaux pour étudier leur activité générale; leur motricité, le niveau d'anxiété, le niveau de sociabilité ainsiq ue leur capacité d'apprentissage et de mémorisation
Impact sur les animaux
Le seul effet indésirable potentiel sera le stress que peuvent engendrer certains tests, les animaux étant mis dans un environnement nouveau.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et l'encéphale sera prélevé pour d'éventuelles études in vitro à postériori. En effet, si des modifications comportementales sont enregistrées, il sera peut-être nécessaire d'étudier anatomiquement la structure de l'encéphale. Ce n'est pas parce que le phénotype est non dommageable et que le comportement semble normal qu'il n'y a pas des modifications au niveau anatomique ou cellulaire possibles
Remplacement
Les conséquences de certaines mutations sur le comportement ne peuvent pas être testées in vitro. Les interactions sociales, motivationnelles, les capacités motrices et mnésiques ne peuvent être étudiées que sur l'animal vigile. Afin de s'assurer que les résultats soient transférables à l'humain, les expériences seront menées sur la souris qui est un excellent modèle génétique.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé selon un testde puissance (80%) et d'après notre propre expérience afin d'obtenir des résultats robustes. Cela nous permet d'utiliser le strict minimun d'animaux, cad 20 animaux par groupe. Nous utiliserons les mâles et les femelles car il n'a pas été rapporté de différences comportementales entre sexe dans de précédentes études de ce gène.
Raffinement
L'hébergement sera effectué dans l'animalerie où les conditions d'élévage sont parfaitement définies pour un bienêtre animal. Les tests comportementaux seront effectués entre 9:00 et 17:00, avec un seul test par jour pour limiter le stress. Un suivi quotidien des animaux ( week-end et jours fériés inclus) est effectué soit par les animaliers, soit par l'expérimentateur. Les animaux seront amenés en salle d'expérimentation 30 minutes minimum avant le début du test pour s'habituer à la pièce et diminuer le stress. Les expérimenteurs pourront venir éventuellement le weekend afin de travailler dans des conditions optimales. Les animaux ne seront pas soumis à plus de 3 tests par semaines. Si besoin, suite à une évolution du score de la grille d'évaluation, et en accord avec le vétérinaire de l'institut, des mesures seront prises pour traiter l'animal. L'analyse comportementale sera faite par un système d'analyse vidéo automatique afin d'avoir un bon niveau de raffinement des résultats et de permettre d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Une application stricte des points limites durant toute la vie de l'animal sera mise en place pour ce projet. Dans le test de rotarod, lors d'une session, si l'animal arrive à 300s lors d'un essai, il ne fera pas les essais suivants dans la mesure où il aura atteint la réponse maximale.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. La souris est un excellent modèle génétique afin d'étudier le comportement suite à la mutation des gènes connus chez l'Homme comme impliqués dans notre syndrome. Ces mutations sont maintenant bien identifiées et les animaux sont en élévage chez les prestataires d'élévage. Les tests comportementaux seront effectués sur des animaux adultes permettant ainsi d'avoir une maturité corticale suffisante.
Réduction de l’inflammation pour améliorer les réponses vaccinales : une étude préclinique sur un modèle murin de trisomie 21
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Porteuses d'une copie supplémentaire de gènes du chromosome 21, les souris de ce projet naissent avec des réponses immunitaires déséquilibrées, des déficits cognitifs et, dans un cas sur dix, une accumulation de liquide dans le cerveau. 555 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et les autres un niveau léger ou modéré. Chaque souris suivie reçoit un produit par sonde gastrique quinze ou trente jours de suite, deux vaccinations sous anesthésie, neuf prélèvements de sang, puis trois tests de mémoire spatiale, à long terme et épisodique, dont un conditionnement à la peur que le porteur décrit comme une source de stress, d'angoisse et de douleur temporaire. Il annonce 555 souris au total, en indiquant que 150 seulement entrent dans l'expérience et que jusqu'à 540 seront mises au monde pour maintenir la lignée.
Objectifs
Le syndrome de Down (SD) est une anomalie génétique causée par la présence d'un chromosome 21 supplémentaire. Ce chromosome contient des gènes importants pour le système immunitaire, ce qui explique certaines particularités des personnes atteintes par ce syndrome. Par exemple, il influence la réponse du corps aux infections et aux vaccins. Les recherches montrent que chez les personnes atteintes du SD, une partie de leur système immunitaire fonctionne de manière un peu différente pouvant le rendre moins efficace et causer des problèmes de santé supplémentaires, comme des infections ou des maladies inflammatoires. La cause de cette modification du fonctionnement du système immunitaire pourrait participer à l’impact sur le développement intellectuel des personnes atteintes du SD. Nous pensons qu’en corrigeant cette cause il serait possible de non seulement réduire l'inflammation dans le corps, et potentiellement améliorer la réponse des personnes atteintes du SD aux vaccins et voir si cette modulation pourrait améliorer leurs capacités cognitives. L'objectif de notre étude est de tester l'effet d’un traitement sur des souris génétiquement modifiées modèles du syndrome de Down, et ainsi voir s'il peut améliorer leur réponse immunitaire après la vaccination et induire une réduction des déficits cognitifs typiques de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment l'inflammation, les réponses aux vaccins et les déficits cognitifs sont liés à la trisomie 21 (T21), aussi appelée syndrome de Down, en utilisant un modèle de souris spécifiquement conçu pour étudier cette condition. Les connaissances que nous allons acquérir pourraient aider à développer des traitements plus adaptés aux personnes atteintes de T21. Mais ces découvertes pourraient aussi bénéficier à d'autres groupes de personnes qui souffrent de maladies liées à une inflammation chronique, comme celles atteintes de maladies auto-immunes, de diabète, ou même les personnes vieillissantes. De plus, cela pourrait concerner celles qui vivent avec des infections de longue durée, telles que le VIH. Si cette étude donne des résultats positifs, elle pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour améliorer les capacités cognitives des personnes atteintes du syndrome de Down. Elle pourrait également offrir des solutions pour d'autres problèmes de santé qui sont liés à une inflammation du cerveau, comme les maladies neurodégénératives, qui touchent souvent les personnes âgées, telles que Alzheimer. Ainsi, cette recherche a des implications très importantes pour la santé publique. En fonction des résultats obtenus, elle pourrait non seulement aider les personnes atteintes de T21, mais aussi toute une population confrontée à des problèmes de santé similaires liés à l'inflammation et aux troubles cognitifs.
Procédures
Afin d’identifier leur patrimoine génétique tous les jeunes souriceaux vigiles subiront une petite biopsie (durée inférieure à 1 minute, 1 fois). Si un problème technique survenait (rare) un deuxième prélèvement pourrait être réalisé sur ces mêmes animaux adultes vigile (durée inférieure à une minute, une fois). Un sous-groupe de souris recevra un traitement quotidien pendant 15 jours consécutifs, tandis qu’un autre sous-groupe le recevra pendant 30 jours consécutifs. Toutes les souris suivront deux périodes de traitement, espacées de 120 jours, chaque administration durant moins d’une minute. Toutes ces souris recevront une vaccination et une dose de rappel, espacées de 150 jours, sous anesthésie générale (durée inférieure à 5 minutes). Ces souris auront également un suivi longitudinal au niveau sanguin, elles auront au total 9 prélèvements sanguins espacés de 2 semaines minimum, sous anesthésie générale (durée inférieure à 5 minutes). Elles participeront à 3 tests de comportements espacés d’un jour de repos entre chaque test. Le premier test permettra d’évaluer la mémoire spatiale (2 sessions avec 1 session par jour de 8 minutes). Le deuxième permettra d’évaluer la mémoire à long terme (5 sessions avec 1 session par jour de 10 minutes). Et enfin le troisième permettra d’évaluer la mémoire épisodique et l’apprentissage contextuel (2 sessions avec 1 session par jour de 5 minutes). Pour finir une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée afin de collecter le liquide cérébrospinal (durée inférieure à 30 minutes, une fois) suivie de l’euthanasie par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
La biopsie pour identifier le patrimoine génétique des animaux peut causer une douleur passagère et un petit risque de saignement. Les souris utilisées dans cette étude présentent une modification génétique spécifique, qui entraîne des réponses immunitaires déséquilibrées, une hypersensibilité à certains signaux dans le corps, des déficits cognitifs, et dans 10 pourcents des cas, une accumulation de liquide dans le cerveau, appelée hydrocéphalie. Ces souris sont aussi plus petites et plus légères que les autres. Lors de certaines procédures, les animaux peuvent ressentir du stress, notamment lorsqu’ils sont manipulés pour un traitement, des injections ou des tests comportementaux. Le fait de devoir être maintenue immobile peut également être une source de stress pour la souris. Lors de l’administration du traitement, il existe un petit risque que le tube utilisé blesse l’intérieur de la gorge ou de l’estomac, ou que le liquide passe par erreur dans les poumons au lieu de l’estomac. Les tests, comme celui de conditionnement à la peur, peuvent provoquer un stress supplémentaire, ainsi qu'une angoisse et une douleur temporaire. Les souris auront une douleur légère et temporaire au moment des injections ou lors des prélèvements sanguins, avec un risque d’hématome et de saignement. Les injections intramusculaires peuvent également provoquer des douleurs et des hématomes au niveau du muscle. La chirurgie sera associée à un risque de douleur. L'anesthésie générale nécessaire pour la réaliser peut entraîner quelques effets secondaires, comme une légère baisse de la température corporelle, une sécheresse des yeux, et dans de très rares cas, des problèmes respiratoires ou cardiaques. Toutefois, les anesthésies générales pour les prélèvements de sang ou les injections intramusculaires, sont très courtes et présentent donc des risques moins importants.
Devenir
Les souris utilisées pour évaluer le traitement seront euthanasiées afin de prélever puis analyser des tissus d’intérêt dans le but de répondre à notre question scientifique. Toutes les autres souris seront euthanasiées car elles ne pourront pas être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Il n'existe malheureusement pas d'alternative à l'utilisation d'animaux pour ces recherches. Les réponses aux traitements et aux vaccins sont très complexes, et pour obtenir des données précises et fiables, il est indispensable de travailler avec un modèle animal complet. Cela permet d'obtenir des informations pertinentes et compréhensibles sur le fonctionnement réel du corps. Les animaux vivants sont essentiels pour évaluer l'impact des traitements sur le comportement, ce qui est impossible à faire uniquement avec des modèles en laboratoire ou des simulations informatiques. Bien que des études en laboratoire aient montré que le traitement évalué ici pourrait améliorer les réponses immunitaires et réduire l’inflammation du cerveau, ces études ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant. En laboratoire, on analyse souvent des cellules isolées ou des échantillons qui ne peuvent pas simuler les interactions entre les différents systèmes du corps. En plus de cela, même si les recherches en laboratoire montrent des effets à l'échelle cellulaire, elles ne permettent pas de savoir si ces effets auront un réel impact bénéfique dans un organisme vivant. Par exemple, un médicament peut avoir un effet sur des cellules en culture, mais cela ne signifie pas qu'il aura le même effet lorsqu'il est administré à un organisme entier. Enfin, les expériences réalisées sur des animaux vivants fournissent des informations cruciales qui permettent de faire le lien entre les recherches de base et les études sur les humains. C'est cette étape préclinique qui est nécessaire pour savoir si un traitement peut être testé de manière sûre et efficace chez les personnes. En résumé, bien que l'idéal serait d'éviter l'utilisation d'animaux, ces recherches sont actuellement indispensables pour progresser dans le domaine médical.
Réduction
Nous utiliserons un total de 555 souris maximum pour mener à bien ce projet. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire, sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Cette recherche, qui durera plusieurs années, impliquera un total de 150 souris, réparties en cinq groupes de 30 animaux (15 mâles et 15 femelles dans chaque groupe). Ce nombre a été calculé en tenant compte d'études précédentes, pour garantir des résultats fiables et robustes. Les groupes de 30 souris, répartis selon leur sexe et leur génétique, nous permettront d’obtenir des résultats solides, notamment pour les tests de comportement qui peuvent varier en fonction de ces critères. Les tests statistiques appropriés seront utilisés pour valider les données de manière précise. Nous maintiendrons notre élevage de souris génétiquement modifiées pendant toute la durée du projet et ne produirons que le nombre strictement nécessaire d'animaux. Nous prévoyons de produire un maximum de 540 souris, afin de respecter les besoins du projet tout en prenant en compte la production des souris porteuses du patrimoine génétique d’intérêt. Chaque étape de la reproduction et de l’élevage des souris sera minutieusement planifiée pour minimiser le nombre d'animaux utilisés tout en garantissant la qualité et la pertinence des résultats scientifiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à notre équipe, à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire afin d’assurer une prise en charge adaptée pour l’animal. Leur état de santé sera évalué plus spécifiquement par notre équipe chaque semaine ou toutes les deux semaines à l’aide d’un système de notation pour s’assurer qu’elles sont en bonne forme. Des mesures préventives seront mises en place pour réduire tout impact des procédures expérimentales sur les animaux. Cela comprend la formation du personnel, la surveillance constante des animaux, et des méthodes pour les habituer à l’environnement et à la manipulation avant les expériences. Les prélèvements de tissus pour connaître le génotype des souris seront réalisés sur de jeunes animaux, ce qui permet une cicatrisation rapide. Après chaque prélèvement, les animaux seront immédiatement surveillés, puis contrôlés à nouveau 30 minutes après. Nous utiliserons uniquement des mâles génétiquement modifiés comme reproducteurs afin de minimiser réduire au strict minimum le nombre d’animaux impactés par les modifications génétiques et assurer une bonne prise en charge des souriceaux par leur mère. Pour réduire le stress lors de l’administration de médicaments, les souris seront progressivement habituées à être manipulées. Pour les injections intramusculaires et les prélèvements de sang, les souris seront anesthésiées afin de limiter leur stress pendant ces procédures. Lors des tests comportementaux, les souris seront habituées à l’expérimentateur et à la manipulation. Elles seront également transférées dans la salle de test au moins une heure avant le début des expérimentations pour réduire leur anxiété. De plus, entre chaque animal testé, l’équipement sera soigneusement nettoyé pour garantir leur confort. Enfin, pour la chirurgie nécessaire à la collecte de liquide céphalorachidien (LCR), l'animal sera sous anesthésie générale et recevra des analgésiques pour éviter toute douleur. Un tapis chauffant sera utilisé pour prévenir l’hypothermie, et un gel oculaire sera appliqué pour protéger leurs yeux de la sécheresse pendant l’anesthésie. Toutes ces précautions sont prises pour assurer que les souris soient traitées avec respect et que leur bien-être soit pris en compte à chaque étape du projet.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de laboratoire couramment utilisés en raison de leur système immunitaire bien connu et de leur similitude génétique avec l'humain, ce qui permet de mieux comprendre des maladies et des comportements. Elles sont particulièrement adaptées pour étudier des maladies comme le syndrome de Down (SD) et sont cruciales pour mieux comprendre cette pathologie. Le modèle de souris qui a été développé pour imiter certains aspects du SD, est largement utilisé pour la recherche. Ces souris possèdent une copie supplémentaire de certains gènes, similaires à ceux du chromosome 21 humain, ce qui leur permet de développer des caractéristiques proches du SD, comme des troubles immunitaires et des déficits cognitifs. Nous injecterons le traitement à évaluer avant l’âge de 2mois c’est-à-dire juste avant la maturation complète du système nerveux des animaux puis les suivrons jusqu’à l’âge de 8 mois car on considère que le développement cérébral des souris est complet et leur schéma comportemental stable à partir de l’âge de 6 mois. Ce temps d’étude nous permettra de suivre l’évolution des paramètres d’intérêts. Les prélèvements pour identifier le patrimoine génétique des animaux seront réalisés sur de jeunes souris, ce qui permet une cicatrisation rapide.
Validation de biomarqueurs circulants pour l’agressivité et la sensibilité au Folfirinox, dans le cancer du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Opérées en vingt minutes pour recevoir des cellules tumorales dans la rate, puis isolées de leurs congénères, 308 souris subissent ensuite des injections dans l'abdomen cinq fois par semaine pendant trois semaines. Deux cent quarante-six d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, les autres d'un niveau modéré, avec une tumeur du pancréas et des métastases qui provoquent douleur, perte de poids et mobilité réduite. Le porteur affirme que le recours aux animaux est "absolument indispensable" pour valider des biomarqueurs sanguins avant de les chercher dans le plasma de patients, la quantité de plasma humain disponible étant limitée. Toutes sont tuées sous anesthésie après un dernier prélèvement de sang, pour que leurs organes alimentent aussi des projets connexes de l'équipe.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de valider des biomarqueurs sanguins du développement tumoral et de la résistance au traitement dans le contexte du cancer pancréatique.
Bénéfices attendus
Dans l'ensemble, nous exploiterons les résultats obtenus ici pour valider une signature de biomarqueurs afin d’améliorer le diagnostic et la prise en charge des patients atteints de cancers pancréatiques. La validation des ces biomarqueurs permettra la mise en place de validation dans les échantillons sanguins de patients et ensuite la mise en place d’un essai de grande ampleur pour valider la fiabilité des signatures. L’amélioration du diagnostic (éligibilité à la chirurgie et sensibilité au traitement) sont des éléments majeurs permettant d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. La forte augmentation d’incidence des cancers pancréatiques (8.000 cas en 2000 et 16.000 cas en 2021, en France) en fait un réel problème de santé publique.
Procédures
Les animaux seront soumisent à 1 procédure chirurgicale (durée 20 minutes), des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 3 semaines et enfin, un prélèvement de sang sous anesthésie juste avant la mise à mort pour prélèvement des organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont pour les procédures 1 et 3: avant l’acte chirurgical : contention et injections sous-cutanées d’antalgique et d’anesthésique local qui peuvent générer un léger stress ; au cours de l’acte chirurgical : l’anesthésie gazeuse peut engendrer une hypothermie et une détresse respiratoire si elle est mal contrôlée ; en post-chirurgie : des complications post-opératoires (rupture des points de sutures, infection de la plaie) peuvent survenir et engendrer de la douleur qui doit être rapidement prise en charge ; les animaux devront être isolés de leurs congénères ce qui génère un stress. Pour les procédures 1, 2 et 3, les nuisances au cours du développement de la tumeur primaire et des métastases sont les suivantes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, celles-ci sont grâce à notre expertise du modèle rapidement détectées et en fonction du score déterminé, la procédure adaptée sera mise en œuvre.
Devenir
Le sort de tous les animaux sera la mise à mort sous anesthésie pour prélèvement d'organes en vue d'analyses cellulaires, biochimiques et histologiques.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à confirmer la faisabilité de la détection de biomarqueurs vésiculaires sanguins associés à la résécabilité ou à la chimiorésistance avant de pouvoir les valider dans le plasma de patients. La quantité de plasma humain est limitée et les protocoles d’isolation des vésicules extracellulaires et d’identification des biomarqueurs doivent pouvoir être mis au point afin de s’assurer qu’aucun échantillon ne soit perdu. Ce projet fait suite à plusieurs validations in vitro en modèle organoïde de la pertinence de ces biomarqueurs pour stratifier les patients entre les groupes réséqués et non réséqués, et pour identifier les vésicules extracellulaires capables d’induire la chimiorésistance. Ces signatures spécifiques ont été identifiées de telle sorte que, par exemple, une protéine présente dans un groupe ne soit pas du tout identifiée en spectrométrie de masse dans l’autre. Nous disposons donc de signatures spécifiques qui reposent sur la haute sensibilité du spectromètre de masse et sur une quantité importante d’échantillons biologiques différents (n=15 organoïdes).
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires dans chaque procédure pour l’obtention d’un résultat significatif a été défini en utilisant le test statistique d’analyse de la variance suivie de comparaisons multiples; en précisant la diminution attendue de l’incidence/taille des tumeurs et les différences inter-individuelles, estimées sur la base de données bibliographiques et de résultats antérieurs de l’équipe. Par ailleurs, nous prélèverons, par nécropsie, d’autres tissus de chacune de ces souris afin d’alimenter d’autres analyses au laboratoire. Le prélèvement des principaux organes associés aux métastases de l’ADKP (foie, poumon, …), à la régulation du métabolisme, ainsi que de la réponse immunitaire (rate, ganglion lymphatique, moelle osseuse) serviront à des projets connexes de l’équipe afin de mieux comprendre les mécanismes métaboliques de la réponse au traitement, du développement des métastases ainsi que les mécanismes conduisant à l’évasion immunitaire dans l’ADKP, en réponse à un agent chimio-thérapeutique.
Raffinement
Une voire 2 personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront les injections en IP d’antalgiques en pré et post-opératoire, la désinfection de la zone à inciser, l’injection en SC de l’anesthésique local avant l’incision, puis l’implantation des cellules tumorales dans la rate. Ceci afin d’éviter toutes complications post-opératoires et limiter ainsi le nombre d’animaux à opérer. Une surveillance et une manipulation quotidienne des souris avec un phénotype dommageable seront effectuées, des critères objectifs seront quantifiés et un score cumulé sera établi (e.g. Score cumulé 10 apparences et/ou comportements anormaux). Lorsque ce score cumulé est > à 10 pour une souris avec un phénotype dommageable, celle-ci sera rapidement euthanasiée. Un enrichissement matériel (twists, cocon ou nid) de l’environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu’ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris de référence dans le domaine du cancer pancréatique car leurs tumeurs miment fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage.