Souris

Des souris saines sont irradiées pendant dix minutes, sans anesthésie, pour détruire leurs propres cellules souches du sang avant de recevoir celles de souris porteuses de mutations de l'anémie de Fanconi. 540 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent ensuite jusqu'à cinq prises de sang dans la veine de la joue, également sans anesthésie, et le porteur signale perte de poids, diarrhée, mobilité réduite, toilettage négligé et sensibilité aux infections, en particulier si une leucémie se déclare. Toutes sont tuées au plus tard vingt semaines après la greffe pour prélever rate et moelle osseuse, sans que le RNT indique la dose d'irradiation reçue ni la part des animaux qui développeront la leucémie recherchée.

Objectifs

L’anémie de Fanconi est une maladie héréditaire rare, caractérisée par des malformations dès la naissance, et un défaut de la production de cellules sanguines par la moelle osseuse, menant à une quantité réduite de globules rouges, globules blancs et plaquettes dans le sang. Par ailleurs tous les patients ont une tendance très importante à développer des cancers du sang (leucémie) et des cancers solides tels que ceux de la tête et du cou. Cette maladie est causée notamment par des mutations des gènes FANC, qui participent à la réparation de l’ADN. A ce jour, les mécanismes d’évolution de la maladie jusqu’à la leucémie chez les patients atteints d’anémie de Fanconi sont encore incomplètement compris. Nous disposons de plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées présentant des mutations des gènes FANC ainsi que d’autres gènes associés à la maladie de Fanconi. L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux modèles d’étude et ainsi démontrer que l’association de plusieurs anomalies génétiques liées à la maladie de Fanconi favoriserait une évolution en leucémie en donnant aux cellules Fanconi un risque accru à devenir des cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’améliorer les modèles d’étude de la maladie de Fanconi chez la souris, les rendant encore plus proche de ce qui est observé chez l’Homme. Ces nouveaux modèles serviront à mieux comprendre les évènements responsables de l’apparition de cancer du sang chez les patients atteints de la maladie de Fanconi. A plus long terme, ils pourront également être utilisés pour tester des modalités de traitement à la fois de la maladie de Fanconi et de la leucémie qui apparaît chez les patients au cours de leur vie.

Procédures

La mise en place de nos nouveaux modèles d’étude consiste à réaliser des greffes de cellules souches hématopoïétiques (cellules qui lorsqu’elles se développent dans un organisme permettent de produire toutes les cellules sanguines) dans des souris saines. Pour cela, les souris saines seront irradiées (durée 10 min, sans anesthésie) afin d’éliminer toutes leurs cellules souches hématopoïétiques qui seront remplacées par celles issues de souris génétiquement modifiées (ayant des modifications au niveau de gènes impliqués dans l’anémie de Fanconi). Ces cellules souches hématopoïétiques de souris transgéniques seront injectées, quelques heures après l’irradiation, dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l’injection : 30 s). Afin de suivre leur expansion et leur différenciation (production de toutes les cellules du sang à partir des cellules souches hématopoïétiques), nous réaliserons des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue une fois par mois (durée : 30s ; sans anesthésie). Sur la durée de l’expérience, chaque souris sera soumise à 5 prélèvements de sang au maximum.

Impact sur les animaux

L’irradiation des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Une perte de poids ainsi qu’une diarrhée au cours des 2 premières semaines peuvent être observées. Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage peuvent être observés chez les animaux suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques issues de souris transgéniques Fanconi, en particulier si une leucémie se développe. Une douleur brève liée au prélèvement de sang réalisé au niveau de la veine de la joue peut être constatée lors des prélèvements mensuels, ainsi qu’un stress lié à la contention de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au plus tard 20 semaines après la greffe. Les différents organes (rate, moelle osseuse notamment) seront prélevés afin de réaliser une analyse précise des cellules qui y sont présents.

Remplacement

Notre projet a pour but de développer un modèle murin de maladie de Fanconi, qui vienne reproduire les anomalies du sang (baisse de production, développement de leucémie) observé chez les patients de façon spontanée. D’une part, il n’existe pas aujourd’hui de modèle animal Fanconi reproduisant ces anomalies de façon spontanée. D’autre part, les études in vitro ne permettent pas de reproduire parfaitement les anomalies observées chez les patients. Les capacités très particulières des cellules souches produisant les cellules du sang, notamment leur capacité de divisions vers des cellules spécifiques de lignées (globules rouges, globules blancs ou plaquettes) ou à évoluer vers des cellules cancéreuses, dépendent notamment de leur interaction avec l’environnement où elles se développent. Il est donc indispensable d’utiliser un modèle animal vivant afin de reproduire ces conditions.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour documenter les variations des paramètres sanguins étudiés. Ce nombre a été déterminé grâce à des analyses statistiques afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements avec papier kraft, tunnel, buchette de bois). De plus, un suivi clinique des souris sera également réalisé une fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) et de l’apparence (poids, pelage, présence de masse tumorale) et éviter les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de signes de douleur avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, il existe des souris génétiquement modifiées présentant les modifications au niveau de gènes connus pour être altérés chez les patients atteints de la maladie de Fanconi ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.

Abrasion de la cornée, instillation d'endotoxines, ablation des glandes lacrymales et instillations d'un conservateur de collyre deux fois par jour pendant une semaine : 168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend les mêmes symptômes que chez les patients humains, picotements, brûlures, larmoiements, sensation de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière. L'analgésie s'arrête vingt-quatre heures après la chirurgie, parce qu'au-delà, écrit-il, elle "inhiberait l'évolution du modèle expérimental". La douleur oculaire que le projet veut comprendre est donc aussi celle qu'il faut laisser s'installer chez les souris pour que l'expérience fonctionne.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pourcents des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous- jacents. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est un des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et de thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

L’objectif est de définir, le rôle fonctionnel de ces chimiokines dans les interactions entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels et leurs implications spécifiques dans les mécanismes d'initiation et de maintien des syndromes douloureux au cours de la douleur oculaire. Globalement, ce projet apportera le rationnel pour l'utilisation des antagonistes des récepteurs de chimiokines comme traitement contre la douleur oculaire chronique. Ainsi, nous faisons l'hypothèse que ces chimiokines après une atteinte cornéenne pourraient induire, le recrutement et l'activation de cellules immunitaires localement au niveau de la lésion cornéenne et dans le système trigéminal, et ainsi participer aux mécanismes conduisant à la centralisation et à la chronicité de la douleur oculaire.

Procédures

Trois modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle douleur inflammatoire est obtenu par des instillations 2 fois par jour pendant 7 jours d’un conservateur de collyre ; il nécessite la contention pendant quelques secondes de l’animal. Le modèle de douleur lié à une infection est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes) associé à l’instillation d’endotoxines le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur

Impact sur les animaux

Modèles : les nuisances attendues dans les 3 modèles sont celles observées chez l’Homme à savoir, des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, des larmoiements, la sensation de corps étranger dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. Le modèle d’instillation répétée d'un conservateur correspond classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritation ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. Dans le second modèle, l’abrasion de la cornée entrainera une douleur post-opératoire. L’instillation de toxine entrainera une inflammation de la cornée et une rougeur de la conjonctive. Chirurgie : la chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post opératoire. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire en clinique à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure car les prélèvements d'organes pour analyse post mortem par imagerie sont nécessaires.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro permet : 1) mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui sont liées. 2) la complexité et l’interaction des circuits neuronaux mis en jeu (connectant la cornée, ganglions trigéminés et cerveau) ainsi que l’interaction avec l’activité du système immunitaire inné, ne peuvent également être étudier et remplacer par un modèle d’étude vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 168 souris dans ce projet d’une durée de 5 ans. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Le choix de faire 4 animaux par groupe, repose essentiellement sur un choix volontaire de « réduction » tout en satisfaisant le critère de reproductibilité. Cette étude présente en grande partie un aspect descriptif de la distribution et de la forme des cellules n'impliquant pas necessairement de test statistique. Dans cette approche nous considérons chaque animal de manière pairée avec son control, mais aussi au sein même d’un animal (œil control vs œil lésé). Néanmoins des tests statisitiques pourront être réalisés sur certaines quantifications à l’échelle de la cellule unique. Le nombre d’image peut être plus ou moins augmenté par animal, ainsi le nombre de point comparés étant très grand nous atteignons largement les effectifs minimaux requis par les tests de calcul de puissance. Cependant nous satisfaisons aux critères de reproductibilité de la manip en faisant 4 fois cette quantification (2 males et 2 femelles traités vs 4 contrôles). D’expérience si aucune différence n’est observée sur ce nombre d’animaux il ne sert à rien d’accumuler des tests. Cette étude par microscopie et cette approche statistique nous permet donc de travailler avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

Dans le cadre d’une démarche de raffinement nous devons chercher à préserver l’animal de la douleur. Pour cela, les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire sur 24h. Au delà de 24h cela inhiberait l’évolution du modèle expérimental et interférerait avec les résultats attendus pour ce projet. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ses différentes constantes. Si un animal anesthésié lors de l'induction du modèle présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours. Au delà des 24h post-op, le bien être animal sera évalué à l’aide de points limites établis. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie afin de limiter au maximum la souffrance prolongée. Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Chaque cage contient au moins un élément d'enrichissement, bâton à ronger ou tunnel en carton. Les enrichissements de nidification (craft, ouate) sont exclus pour réduire les risque de poussière dans les yeux, la litière utilisée a été validée par la structure pour son faible taux de poussière. Les animaux sont hébergés dans les conditions de notre établissement avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies à volonté.

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, et que nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7-8 semaines et entreront en procédure entre 10 et 12 semaines. Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 4 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 23 semaines en sortie de procédure.

L'occlusion d'une artère cérébrale provoque chez chaque souris un infarctus dont elle ne se remettra pas. 696 souris vont être utilisées sur ce site dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des injections en bolus ou en perfusion de trente minutes, une chirurgie pouvant atteindre deux heures et une perfusion intracardiaque finale. Toutes sont mises à mort et leurs tissus prélevés, le porteur indiquant que l'AVC exclut de les garder en vie. Il énumère par ailleurs saignements, œdème cérébral, prostration, paupières closes et troubles de la motricité, puis conclut que les premiers essais "semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés".

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. L’ajout de 2 nouvelles lignées de souris, modifiant ainsi le nombre d’animaux, nécessite une modification du projet initial. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux au moins 7 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

Jusqu'à trente jours de séances quotidiennes la tête fixée, sous une restriction alimentaire qui leur fait perdre 10 à 15 % de leur poids : 764 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent d'abord une chirurgie de trente minutes pour la pose d'un dispositif de maintien de la tête, ou d'une heure et demie pour l'injection d'un vecteur viral et l'implantation d'une fibre ou d'une lentille optique dans le cerveau. Le RNT annonce cette seconde chirurgie "sans effets adverses" tout en décrivant plus loin une douleur post-opératoire modérée et une possible perte de poids. Tout cela vise à comprendre comment une action réfléchie devient une habitude, le porteur affirmant qu'un modèle mammifère s'impose faute de structures équivalentes chez les autres vertébrés.

Objectifs

Le projet vise à comprendre en profondeur le processus d'apprentissage procédural, qui repose sur l'automatisation et l'exécution de séquences cognitivo-motrices complexes, telles que la conduite automobile ou la réalisation de gestes comme attacher ses lacets. Ce processus d'apprentissage se développe à travers de multiples répétitions réussies, progressant ainsi des comportements dirigés vers un but vers l'établissement d'habitudes. Le striatum, une région du cerveau, joue un rôle clé dans cet apprentissage, avec la région dorsomédiane (DMS) associée à l'acquisition des actions orientées vers un but, et la région dorsolatérale (DLS) impliquée dans l'acquisition des habitudes. Les recherches précédentes ont montré que différentes parties du striatum sont impliquées à différentes étapes de l'apprentissage, mais il reste à comprendre comment la mémoire procédurale est transférée entre ces régions lorsque les comportements évoluent vers des habitudes. Pour cela, une exploration longitudinale de la plasticité du réseau striatal est nécessaire, en suivant l'activité électrophysiologique ou en imagerie in vivo des différentes composantes du réseau dans le DMS et le DLS pendant tout le processus d'apprentissage procédural.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à découvrir comment nous apprenons des actions de manière automatique. En utilisant des techniques d'imagerie et d'électrophysiologie, nous allons suivre comment la plasticité synaptique change pendant que nous apprenons. Cela nous aidera à comprendre comment des actions initialement réfléchies et flexibles deviennent des habitudes automatiques, inconscientes. Le projet contribuera à la compréhension de la formation de la mémoire implicite lors d’un apprentissage procédural, ce qui aidera à éclaircir les mécanismes impliqués dans l'automatisation et l'exécution de séquences cognitivo-motrices complexes.

Procédures

Les souris, selon les groupes expérimentaux, subiront ou une chirurgie de courte durée (environ 30 minutes) sous-anesthésie générale pour la pose du dispositif de maintien de la tête, ou une chirurgie d’environ une heure et demi sous anesthésie générale, prévoyant l’injection du vecteur et l’implant de fibre ou lentille optique, sans effets adverses. Toutes les souris vont réaliser une tache comportementale, envisageant un apprentissage procédural (une session par jour pendant 3, 8, 21 ou 30 jours selon les besoins expérimentaux).

Impact sur les animaux

Après intervention chirurgicale, les animaux peuvent éprouver une douleur post-opératoire modérée, pouvant conduire à une éventuelle perte de poids. De plus, la restriction alimentaire entraînant une diminution de poids (entre 10 et 15%), la configuration tête-fixée, les manipulations liées aux enregistrements électrophysiologiques, comme le branchement et le débranchement des équipements, peuvent engendrer un stress chez l’animal.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées

Remplacement

Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire les dynamiques des réseaux de neurones impliqués dans l’apprentissage procédural. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre les mécanismes par lesquels le cerveau sélectionne une stratégie motrice ainsi que pour étudier les plasticités mise en place, au fur et à mesure de l’apprentissage. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain.

Réduction

En suivant la même souris à travers plusieurs sessions comportementales, nous parvenons à réduire le nombre d'animaux requis pour obtenir des résultats fiables, tout en atténuant la variabilité inter-individuelle. La méthode d'imagerie 2-photons employée offre la possibilité d'observer simultanément de multiples neurones.

Raffinement

Des éléments d'enrichissement supplémentaires, tels que la présence de sizzled pad et des petites bûches en bois, sont introduits dans la cage d’hébergement des souris. Les conditions chirurgicales (anesthésie, analgésie, asepsie) et les soins post-opératoires appliqués garantissent une prise en charge appropriée pour diminuer toute souffrance de l’animal après chirurgie. La restriction alimentaire est légère, et nous avons élaboré un protocole qui ne requiert pas l'isolement des animaux en restriction, favorisant ainsi leur bien-être social. Pour réduire le stress des animaux lié au dispositif expérimental, nous avons mis en place un protocole d'habituation progressive. De plus, afin d'associer positivement les souris au dispositif expérimental, elles reçoivent des récompenses pendant la phase d'habituation (et également pendant le protocole). L'appareil expérimental employé permet aux souris de se déplacer et de réaliser des tâches de manière active, même lorsqu'elles sont maintenues par la tête, réduisant ainsi le stress lié à cette contrainte. Les lignées transgéniques utilisées présentent un phénotype non-dommageable. Les vecteurs viraux et les protéines exprimées sont utilisés à des fins techniques uniquement (telles que l'imagerie et l'optogénétique) et ne semblent pas avoir d'effets néfastes sur les souris. Par ailleurs, les implants utilisés sont miniaturisés et légers (< 2g avec ciment inclus), et n'interfèrent donc pas avec le comportement normal des animaux. Enfin, une évaluation rigoureuse de l’état de santé et du bien-être des animaux est assurée pendant la durée du protocole experimental, grâce à des points limites pré-établis, qui permettent de définir des actions à prendre, qu’il s’agisse de soins de soutien, du retrait de l’animal du protocole expérimental ou, en cas de souffrance importante non réversible, d'une euthanasie éthique. Les critères d’arrêt associés à ces points limites garantissent une prise en charge rapide et adaptée, dans le respect de la réglementation et des principes de bien-être animal.

Choix des espèces

Il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures des ganglions de la base ne sont pas présentes, ou sont organisées différemment chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, l'utilisation du modèle souris permet l'accès aux nombreuses lignées transgéniques indispensables pour notre projet. Les animaux en comportement seront utilisés au premier stade adulte (à partir de 50 jours), ce qui permet d'avoir des taux d'apprentissage élevés, tout en étudiant l'activité des réseaux neuronaux dont le développement post-natal est fini.

Provoquer un accident vasculaire cérébral pour étudier deux récepteurs des plaquettes sanguines mobilise 696 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie pouvant durer deux heures sous anesthésie générale, une IRM de trente minutes à une heure vingt-quatre puis soixante-douze heures après l'AVC, enfin une laparotomie et une perfusion intracardiaque. Le porteur décrit des saignements, un œdème après ouverture du crâne, une activité réduite voire une prostration, des paupières fermées et des mouvements de rotation pendant les trois jours suivant l'opération. Toutes sont mises à mort, le développement d'un AVC n'étant selon lui "pas compatible avec un maintien en vie de la souris".

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. L’ajout de 2 nouvelles lignées de souris, modifiant ainsi le nombre d’animaux, nécessite une modification du projet initial. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux au moins 7 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

51 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules de cancer du foie humain sous la peau, puis porte une tumeur dont le porteur indique qu'elle peut provoquer douleurs, perte de poids, déshydratation et gêne à la marche par encombrement. Leur système immunitaire défaillant les empêche de rejeter les cellules humaines, ce qui garantit la prise tumorale. Le projet doit confirmer chez l'animal ce qui a déjà été observé en culture cellulaire, et le bénéfice thérapeutique reste énoncé au conditionnel, comme une piste vers une nouvelle cible.

Objectifs

Le cancer du foie est la deuxième cause de décès liés au cancer. C’est un cancer particulièrement agressif; son taux de survie à 5 ans est estimé à 13 %. Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) sont à l‘origine de 80 à 90% de tous les cancers primitifs du foie. Son incidence continue à augmenter dépassant 9 000 nouveaux cas par an en France et près d’un million de nouveaux cas par an dans le monde. Bien que les programmes de dépistage permettent de diagnostiquer environ 40 % des CHC à un stade où des traitements curateurs peuvent être proposés, au moins la moitié de patients relèvera d’un traitement systémique à un stade plus avancé de la maladie. À ce stade avancé, le pronostic reste encore défavorable. Le traitement clinique du CHC reste difficile en raison du haut taux de la récidive des patients atteints et de l’aspect asymptomatique des premiers stades de la maladie. Il est donc important de caractériser les anomalies moléculaires responsables de la prolifération anormale des cellules hépatiques cancéreuses et de permettre à terme d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux traitements ou de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette étude cherche à comprendre le rôle de deux protéines dans la croissance du cancer du foie (CHC). Pour cela, nous allons tester la prolifération des cellules cancéreuses humaines dans un modèle animal. Nous injecterons à des souris différents types de cellules : des cellules cancéreuses hépatiques non modifiées ou des cellules cancéreuses hépatiques modifiées au niveau de l’une des protéines. Nous observerons ensuite comment ces cellules se développent pour mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la prolifération tumorale. L'objectif final sera de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour stopper la croissance du cancer du foie et développer des traitements plus efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à confirmer in vivo chez la souris les résultats obtenus in vitro sur cellules en culture concernant l’implication de la kinase IKKepsilon et de sa cible RelA dans le processus de la croissance tumorale. Ce projet pourrait aboutir à l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique et à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques afin de provoquer l’arrêt de prolifération des CHC.

Procédures

Tous les animaux recevront une unique injection sous-cutannée de cellules tumorales sous anesthésie générale. L’anesthésie durera environ 10 minutes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L'implantation de cellules tumorales peut engendrer chez les souris douleurs, faibles pertes de poids, déshydratation. Chez les animaux développant une tumeur, une faible gêne lors de la locomotion est possible en raison de de l'encombrement que la tumeur peut engendrer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou ayant atteint les points limites.

Remplacement

Il est indispensable de développer des modèles expérimentaux in vivo les plus proches possible de la maladie humaine, chose qui n’est pas possible in vitro compte tenu du nombre et de la complexité des systèmes biologiques mis en jeu.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons 51 souris immunodéficientes qui seront réparties en trois groupes de 17 afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours et l'étude sera stoppée à partir de points limites précoces qui prendront en compte la taille de la tumeur et l'état général de la souris. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant le stress.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris jeunes adultes (6-8 semaines) immunodéficientes qui sont dépourvues de réponse immunitaire. Elles seront donc incapables de rejeter les cellules humaines qui seront implantées pour le développement de la tumeur à cause de leur système immunitaire défaillant et par conséquent développeront une tumeur.

Une ou deux chirurgies du crâne sous anesthésie attendent chacune des 483 souris de ce projet, et 125 d'entre elles portent ensuite une prothèse fixée sur la tête. Ces 125 souris vivent seules pendant cinq semaines, ce que le porteur reconnaît comme un stress puisqu'elles ne peuvent pas exprimer leur comportement social. Toutes sont soumises à une tâche de mémoire associative, 45 reçoivent en plus quatorze injections en sept jours, et toutes sont tuées pour prélèvement de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le RNT qualifie cette tâche de "légèrement aversive" sans dire en quoi consiste l'aversion infligée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le stockage de la mémoire à court et à long terme au sein du cerveau des rongeurs. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs, qui ont révélé que certaines propriétés des neurones se modifient suite à une expérience ou une tâche comportementale. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs moléculaires et les processus cellulaires responsables des changements observés. Pour les raisons techniques, le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2

Bénéfices attendus

Notre projet aborde des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de la formation de la mémoire. Grâce à la combinaison d'approches utilisées, le projet permettra : i) une meilleure compréhension du rôle du cerveau dans le stockage de la mémoire, ii) l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l'oubli.

Procédures

Tous animaux subissent à une ou deux intervention(s) chirurgicale(s) (chacun d'une durée < 60 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Certains animaux (125) subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement de ces animaux. 125 animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Ces mêmes animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 15 minutes. Tous les animaux sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementalel se compose de deux séances, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque séance dure 6 à 7 minutes). Certains animaux (45) reçoivent également des injections bi-quotidiennes pendant 7 jours (14 injections en totale). Toutes ces interventions sont réalisées au sein de l' EU1. Certains animaux (150) seront transportés (trajet à pied de 5 minutes) vers une zone annexe de l'EU 2, où ils seront profondément anesthésiés, puis euthanasiés. Leurs tissus seront ensuite utilisés pour des expériences physiologiques aiguës.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces interventions incluent un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Ce projet comprends également un test comportemental légèrement aversif. Ce test comportemental peut être stressant pour les souris. Les injections répétées peuvent également être une source d'inconfort. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 5 semaines. Cela représente un stress, car ils ne peuvent pas exprimer leur comportement social naturel.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'étude des mécanismes sous-jacents à la formation et au stockage de la mémoire dans le cerveau. Il comprend les tests comportementaux. Pour mener à bien cette étude, nous avons besoin d'un modèle qui soit : i) complexe et intact, ii) modifiable génétiquement, iii) doté de la structure cérébrale ciblée, et iv) adapté aux approches comportementales complexes et les tests invasifs.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons estimé le nombre nécessaire pour obtenir une signification statistique en nous basant sur des études antérieures et des recherches bibliographiques. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal d'animaux requis pour atteindre les objectifs de l'étude. Pour ce faire, nous avons prévu une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce des données (c'est-à-dire, analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cette approche nous permettra d'ajuster la taille de l'échantillon en fonction des résultats préliminaires et de détecter rapidement tout problème potentiel avec la procédure, afin de modifier notre approche pour les lots suivants si nécessaire. En ce qui concerne l'approche statistique, nous appliquerons les tests appropriés en fonction des caractéristiques de nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne : Les animaux seront surveillés chaque jour pour assurer leur bien-être général. ii) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse (par exemple : état prostré, pelage non toiletté, griffures, etc.). Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures conservatoires (isolement temporaire, administration de glucose, réchauffement en couveuse, soins des blessures, etc.). Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur décidera de l'euthanasie de l'animal, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des zootechniciens si nécessaire. iv) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. v) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. vi) Intégration des techniques de raffinement : Nous intégrerons régulièrement de nouvelles techniques de raffinement en formant les expérimentateurs et en consultant des ressources éducatives visant à renforcer le respect des principes de raffinement. vii) Conditions d’hébergement : Les animaux seront maintenus dans des cages collectives avec un enrichissement comprenant des tubes en carton et du matériel pour la nidification.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris pour les raisons techniques liées à la réalisation du projet. Actuellement, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés tant au niveau comportemental que moléculaire. Les protocoles comportementaux décrits dans ce projet sont déjà validéspour ce modèle. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser de souris plus âgées en raison de l'effet du vieillissement sur la formation de la mémoire. De plus, les souris de moins de 6 semaines (avec un cerveau en développement) peuvent avoir des mécanismes différents sous-jacents à la formation de la mémoire et sont également sujettes à un oubli plus rapide.