Souris

Toute souris qui perd plus de quinze pour cent de son poids, ou qui cumule trois signes cliniques, est mise à mort. 4 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des régimes déficients en tryptophane, trois injections déclenchant des crises de migraine, l'implantation d'électrodes crâniennes ou d'une caméra endoscopique fixée sur le crâne, et des enregistrements de quarante minutes de la rétine et du cortex visuel, répétés trois fois. Le porteur reconnaît que l'exposition à la lumière bleue est aversive et que l'endoscope pèse sur la tête de l'animal, et présente 4 320 comme un maximum susceptible d'être revu à la baisse, sans détailler la répartition par groupe.

Objectifs

La migraine, 6ème cause de handicap dans le monde, est associée à une allodynie cutanée et une photophobie qui rendent difficile le traitement. Elle est influencée par les aliments. Dans ce contexte nous nous intéressons plus particulièrement au tryptophane, un acide aminé essentiel dont la réduction de son ingestion augmente l’intensité des nausées, de la douleur et de la photophobie pendant la crise migraineuse. Les dérivés du tryptophane agissent sur un récepteur qui participe au contrôle de la neuroinflammation et la neurotoxicité. L'activation de ce récepteur a des effets protecteurs et antiinflammatoires. Au laboratoire nous avons mis en évidence chez la souris qu’une déficience en tryptophane conduit à des altérations au niveau cérébrale associées à une persistance de la diminution du seuil de sensibilité à la douleur et de la photophobie. Le 1er objectif est d’étudier le rôle du tryptophane dans le déclenchement et/ou la chronicisation de la migraine et les troubles sensoriels/affectifs associés. De plus, durant la crise migraineuse le message nociceptif (signal de douleur) issu des méninges et le message lumineux issu de la rétine convergent au niveau du thalamus (structure centrale du cerveau) avant d’être transmis vers les régions corticales suggérant un rôle de la rétine et du thalamus dans le mécanisme de photophobie. Le deuxième objectif de notre projet est donc d’étudier comment le message nociceptif/lumineux est traité au niveau thalamique et cortical durant et entre les crises de migraine. Enfin, récemment, il a été montré que la lumière peut avoir des effets bénéfiques sur la sensibilité à la douleur, en fonction de sa couleur avec des effets antinociceptifs de la lumière verte et pronociceptif de la lumière bleue dans des modèles animaux de nociception et de douleurs neuropathiques. Notre troisième objectif est donc d’étudier l’impact de la lumière en fonction de sa couleur sur la sensibilité à la douleur dans un contexte de migraine.

Bénéfices attendus

Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Une déficience en tryptophane favoriserait ces dysfonctionnements via la modulation d'un récepteur. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence le rôle du tryptophane dans l’initiation et la chronicisation de la migraine ainsi que la vulnérabilité du circuit thalamo-corticale à la neuroinflammation, permettant de trouver des nouvelles cibles thérapeutiques adaptés au patient et centrées sur une approche alimentaire et probiotique et/ou photothérapeutique.

Procédures

injections intrapéritonéales - 3 injections par animal espacées de minimum 9h- quelques secondes par injection injection anesthésique - quelques secondes par injection procédures chirurgicales (implantation électrodes craniennes)- entre 20 et 30 minutes enregistrements électrorétinographiques, 40 minutes maximum, 3 enregistrements par souris à 10 min, 24h et 7 jours enregistrements potentiels évoqués visuel, 40 minutes maximum, 3 enregistrements par souris à 10 min, 24h et 7 jours procédures chirurgicales (microendoscopie)- entre 20 et 30 minutes

Impact sur les animaux

hypersensibilité sensorielle hypersensbilité à la douleur la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement) inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids inconfort lors de l'exposiiton à la luière bleue qui est plutôt aversive Normalement l'ISDN n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaine souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité. Douleur légère (piqûre) lors des injections Léger inconfort lié à la présence de la caméra endoscopique sur la tête de l’animal

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car ayant reçu des régimes particuliers et/ou des traiements ou des chirurrgies, ils ne pourront pas etre réutilisé sans prendre le risque de compromettre les autres expérimentations. De plus certains animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (procédure 3)

Remplacement

Aucune méthode alternative actuelle ne permet de remplacer l’expérimentation sur animal dans le cadre de ce projet qui prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière), le cerveau et le microbiote (alimentation) impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.

Réduction

Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe. Quelle que soit la procédure à réaliser, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin de tirer des conclusions statistiquement fiables et pertinentes.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération de la chirurgie, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier) avec accès libre à la nourriture et l’eau. Leur état physique et comportement seront évalués régulièrement de la réception à la mise à mort. Dans le cas où l’animal montre au moins un des signes cliniques (tels que manque de toilettage, piloérection, déplacement anormal, posture anormale, mutilation, hypoactivité, agressivité, vocalisation spontanée, lésions, perte de poids, fuite anormale) soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contre la douleur, désinfection des blessures, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à sa mise à mort. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques ou s’il perd plus de 15% de son poids initial, nous procèderons à sa mise à mort.

Choix des espèces

Ce projet est la suite d'une étude précédente. Nous continuons donc à utiliser le même modèle animal. Nous avons pu mettre en évidence une similarité des symptômes migraineux chez la souris et l’homme dont allodynie faciale et photophobie. De plus nous envisageons par la suite de travailler sur des souris génétiquement modifiés, knockouts pour des gènes spécifiques afin d’affiner notre étude sur les mécanismes impliqués dans la migraine. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (6 -12 semaines d’âge)

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection par jour pendant quatre semaines sur animal vigile, avec un risque de péritonite et d'infection aux points de piqûre que le porteur reconnaît, puis passent deux tests d'agrippement forcé et deux prélèvements sanguins sous anesthésie. La dernière étape est une chirurgie de mesure de la force musculaire, sous anesthésie profonde, immédiatement suivie de la mise à mort. Deux composés ont déjà montré leur effet sur des cellules de patients, le porteur affirmant que le passage in vivo reste une étape "indispensable" avant tout essai chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif global du projet est d'évaluer l'efficacité de molécules pharmacologiques pour la ré-expression de protéines, dans des modèles murins bien caractérisés de maladies neuromusculaires rares. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, de traitement pour ces maladies. Des études sont en cours afin de moduler les déficits secondaires liés aux mutations mais il est pertinent de développer une approche permettant de cibler le défaut primaire (l’absence de protéine en raison de la mutation génétique) en permettant la ré-expression de la protéine déficitaire. Les molécules dont nous voulons évaluer l'efficacité in vivo ont déjà démontré, in vitro dans des systèmes rapporteurs et des lignées cellulaires issues de patients, leur efficacité. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet.

Bénéfices attendus

Les maladies neuromusculaires sont des maladies héréditaires rares, cliniquement et génétiquement hétérogènes. La dystrophie musculaire de Duchenne est la maladie musculaire la plus commune chez l’enfant (prévalence estimée à 1-9 / 100 000) et les dystrophies liées au déficit en collagène VI sont la seconde forme de dystrophies musculaires congénitales en Europe dont la prévalence exacte est inconnue. Environ 10 pourcent des patients portent des mutations non-sens entraînant entraînant des codons de terminaison de la traduction prématurés (PTC pour premature termination codon), et une absence de synthèse protéique. A ce jour il n’existe aucun traitement curatif pour ces maladies très invalidantes. Le besoin de développer des stratégies ciblées est donc très fort. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer le bénéfice thérapeutique de nouvelles molécules contrecarrant spécifiquement les mutations non-sens, en forçant la synthèse protéique. A long terme, ces molécules pourraient bénéficier à des patients atteints d’autres maladies génétiques causées par des mutations non-sens. Des modèles murins portant des mutations non-sens dans les gènes impliqués dans ces maladies reproduisent de nombreux défauts moléculaires et fonctionnels, et sont donc des modèles parfaitement adaptés pour l’évaluation de cette approche thérapeutique. Le bénéfice attendu est la ré-expression de la protéine ciblée qui sera détectée sur tissus prélevés en post-mortem, et qui devrait améliorer la fonction musculaire.

Procédures

Les animaux feront l'objet d'injections quotidienne (sur animal vigil car procédure très rapide), sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Deux prélèvements sanguins sont prévus, un en tout début de procédure effectué sous anesthésie (durée de l'acte moins de 5min), un autre juste avant l'euthanasie, sous anesthésie (durée de l'acte moins de 5min). Des mesures de la force musculaire seront réalisées la 1ère semaine du traitement et lors de la 3ème semaine, grâce à un test d'agrippement qui consiste simplement à faire agripper une grille par la souris au niveau de ses membres antérieurs ou postérieurs (ou les deux) en appliquant une légère traction pour mesurer la force d’agrippement. Ce test comporte 3 mesures avec une minute de repos (soit une durée de 3-4 minutes environ). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force de muscles spécifiques des membres postérieurs, nécessitant une intervention chirurgicale sous analgésique et anesthésie profonde et qui sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil. La durée de l'acte chirurgical est d'environ 30min par animal.

Impact sur les animaux

Certains animaux de cette étude présentent un phénotype dommageable, qui se traduit par une atteinte musculaire lorsqu'elles sont âgées qui n’altère cependant pas la survie des animaux, ni leur mobilité ou fertilité. Elles sont viables, fertiles, et possèdent une longévité normale. Les souris feront l’objet de procédures consistant essentiellement en des étapes d’injections, puis d’un protocole d’évaluation non invasive de la force musculaire (grip strength), et enfin d’un protocole d’évaluation de la fonction musculaire. Les souris pourraient donc ressentir une légère douleur de courte durée au point d’injection/prélèvement et un stress léger lors des manipulations quotidiennes, la pesée hebdomadaire ou les périodes d’adaptation aux différentes techniques. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite et les sites d’injections peuvent s’infecter. Les tests de force musculaire peuvent générer un stress et une fatigue transitoire. Des prélèvements sanguins sont aussi prévus (en vigile ou sous anesthésie) et peuvent induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Par ailleurs, les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les animaux qui entreront dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des tissus cibles. Dans le cas des modèles que nous allons utiliser, nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles squelettiques, à la fois d’un point de vue de la force musculaire mais aussi grâce à des marqueurs moléculaires et à la réexpression de la protéine d’intérêt. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyse d’un marqueur sanguin couramment utilisé pour vérifier l’état des cellules musculaires.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie est effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Les molécules dont nous voulons évaluer l'efficacité in vivo ont déjà démontré leur potentiel dans des conditions in vitro. Cependant les modèles in vitro restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas la complexité tissulaire contenant plusieurs types cellulaires qui communiquent entre eux et avec leur microenvironnement. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutiques nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation d’intérêt et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. Ainsi, sur la base des tests in vitro nous avons sélectionné 2 composés montrant une efficacité sans cytotoxicité.

Réduction

Afin de réduire et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés tout en tenant compte des connaissances sur les lignées utilisées pour optimiser nos chances de détecter un bénéfice thérapeutique. Des résultats préliminaires de pharmacocinétique ont aussi été obtenus dans des souris contrôles permettant d’affiner le déroulement de ce projet, et de choisir 3 doses pertinentes. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus. Nos études précédentes ainsi que la veille scientifique réalisées sur la littérature scientifique rapportant des études similaires nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des analyses statistiques seront réalisées pour une interprétation fiable des résultats. Au maximum 124 animaux seront utilisés pour ce projet.

Raffinement

Dans le but de raffiner le protocole, toutes les précautions seront prises afin de réduire au mieux le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Pour la lignée avec phénotype dommageable, des croquettes de nourriture seront laissées sur la litière. Pour les animaux très jeunes, de la nourriture hydratée sera laissée sur la litière des cages. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Des mesures de raffinement adaptées aux différentes procédures et corrélées avec les nuisances ou effets indésirables attendus seront mises en place afin de limiter la douleur et le stress : Lors de l’anesthésie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter une chute de la température corporelle. Les sites d’injection seront examinés chaque jour afin de détecter tout signe d’inflammation ou d’infection, ce qui serait alors discuté avec la cellule du bien-être animal et le vétérinaire. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis.

Choix des espèces

Des modèles murins, drosophile et/ou poisson-zèbres ont été décrits pour la dystrophie musculaire de Duchenne et d'autres myopathies. L’approche thérapeutique testée cible un type particulier de mutation qui ne sont reproduites que dans des modèles murins. Le premier modèle utilisé présente un phénotype musculaire adapté pour l’évaluation d’approches thérapeutiques car permettant une meilleure évaluation des bénéfices fonctionnels. Ce modèle présente un phénotype dommageable. Le second modèle est le seul modèle disponible présentant une mutation essentielle pour le projet. Ce second modèle ne présente pas de phénotype dommageable. L’utilisation de ces modèles permettra de valider l’approche thérapeutique dans les tissus affectés. Les animaux sont utilisés à 4-6 semaines, stade auquel la croissance musculaire est bien avancée et afin de réaliser sans problème les injections.

1 000 souris vont être utilisées et tuées pour mettre au point une injection censée remplacer la castration chirurgicale, chacune ne subissant qu'une seule injection, un micro-tatouage et au plus deux prélèvements de sang. Les procédures sont classées en gravité modérée, le porteur mentionnant des prélèvements derrière l'œil, une possible inflammation locale après injection intramusculaire et des réactions d'hypersensibilité par voie intraveineuse. Le bénéfice avancé tient à l'évitement d'une chirurgie qualifiée de traumatisante pour les chiens, chats et cochons, et au contrôle des populations d'animaux errants. Épargner ces opérations passe donc par la mise à mort de mille souris, étape que le porteur présente comme obligatoire pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif du projet vise à développer une solution alternative à la castration chirurgicale des mammifères. Il vise à remplacer une chirurgie douloureuse, stressante, source d’angoisse et génératrice d’effets secondaires graves par un médicament injectable, biologique et indolore. Le concept a été validé avec des experts scientifiques et vétérinaires. Après des optimisations et des évaluations réalisées in vitro, la procédure de ce projet sera réalisée chez la souris. Les études réalisées chez la souris serviront à définir la dose efficace et sécurisée qui sera utilisée chez d’autres mammifères au cours des essais cliniques qui seront ensuite conduits. L’ensemble de ces expériences sont nécessaires pour obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un futur médicament.

Bénéfices attendus

- Le bénéfice attendu est de trouver une alternative à la castration chirurgicale qui est traumatisante pour les animaux et engendre de plus des maladies chroniques chez les animaux de compagnie (cancer par exemple). - Créer un outil de contrôle plus simple des populations d'animaux errants.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins sous anesthésie d'un nombre maximum de 2 de leur vivant pour une durée n'excédant pas 1 minute. Chaque animal sera soumis à un micro-tatouage pendant une 20aine de secondes. Chaque animal sera soumis sous anesthésie à une unique injection, soit sous cutanée, soit intra-musculaire, soit intra-veineuse. Quelle que soit la procédure choisie, le temps n'excèdera pas les 30 secondes.

Impact sur les animaux

L'injection sous-cutanée et les prélèvements sanguins rétro-orbitaires peuvent générer de l'inconfort au réveil de l'animal. L'injection intra-musculaire peut provoquer une inflammation locale. L’injection intra-veineuse peut provoquer des réactions d’hypersensibilités dite « d’infusion », bénignes et transitoires. Il y a une possibilité d'effet indésirable éventuel des médicaments.

Devenir

L'ensemble des animaux concernés par cette demande de projet sont impliqués dans une unique procédure, ils seront tous mis à mort au terme de celle-ci.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytiques et/ou moléculaires de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments biologiques mis en œuvre.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum nécessaire par lot a été déterminé par une analyse statistique préalable. Les molécules candidates sont soigneusement sélectionnées par des tests In-Vitro au préalable de manière à ne pas générer de cohortes d'animaux superflues.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en conditions stériles et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en fratries. Les conditions d’hébergements sont adaptées à ces animaux (maintien du statut sanitaire) : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de laine végétale. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont référencés et régulièrement ré-évalués par la Structure de Bien-Etre Animal. Les procédures prévue dans ce projets seront réalisées sous anesthésie et tout sera mis en place pour éviter la douleur des animaux sans provoquer d'interaction les traitements testés. Les mesures concervatoires et points limites adaptés et spécifiques au projets sont défini pour limiter au maximum toute souffrance animale. Les procédures prévue dans ce projets seront réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytiques et/ou moléculaires de notre objet d'étude. Après des optimisations et des évaluations réalisées in vitro, la procédure de ce projet sera réalisée chez la souris. Les études réalisées chez la souris serviront à définir la dose efficace et sécurisée qui sera utilisée chez d’autres mammifères au cours des essais cliniques qui seront ensuite conduits. L’évaluation des biothérapies exprimant nos anticorps chez la souris, espèces représentatives des espèces cibles, est une étape préliminaire pour définir la dose efficace (dose stérilisante) et tolérée des animaux de plus grande taille (porc, chien et chat). Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines , âge pour lequel elles sont reconnues comme pubères et fertiles et dont on pourra confirmer l’induction d’une stérilisation biologique et après 2 semaines d’acclimatation.

Une phalange est coupée sur chaque souriceau entre son septième et son dixième jour de vie, pour l'identifier. Les mêmes souris développent à partir de quatre mois un cancer de la glande surrénale avec métastases pulmonaires, et reçoivent alors deux à trois injections par semaine pendant deux mois, seules ou combinées à une chimiothérapie. 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à six mois, au stade où la dissémination métastatique est jugée évidente. Le porteur ne mentionne comme nuisances que le stress de la contention et une douleur de faible intensité liée aux piqûres, sans un mot sur ce que représente pour l'animal un cancer métastatique laissé évoluer deux mois.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif avec un pronostic très défavorable, en grande partie à cause de l’absence de thérapies efficaces pour les patients atteints de carcinome cortico-surrénalien métastatique ou récurrent. En effet, le traitement standard actuel pour ces patients – la combinaison du mitotane avec la tri-chimiothérapie EDP (Etoposide, Doxorubicine et Platine) ne donne qu’une survie globale de 15 mois, soulignant la nécessité de développer de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de l’élimination des cellules sénescentes avec des sénolytiques seuls ou en co-thérapie avec l’étoposide dans un modèle métastatique de carcinome cortico-surrénalien cliniquement pertinent. Ceci devrait permettre d’améliorer le pronostic du corticosurrénalome, qui reste aujourd’hui défavorable.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Identification par phalangectomie : une phalange distale des souris nouveaux-nées sera coupée entre les premiers 7 et 10 jours de vie afin de permettre l’identification et le génotypage des individus. Le geste sera realisé une seule fois au cours de la vie de l’animal et ne durera que quelques secondes. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 128 souris (mâles et femelles confondus, âgées de 4 mois), seront injectées deux ou trois jours par semaine pendant 2 mois avec des sénolytiques seuls on en combinaison avec la chimiothérapie étoposide. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Échographie : realisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 128 souris de 4 mois d’âge, mâles et femelles confondus, seront rasées sur les flancs et la taille de la tumeur sera mesurée à l’aide d’un échographe. Ce geste sera réalisé 3 fois par souris : une fois au début du traitement, une fois après un mois de traitement, et puis entre 72 et 48h avant la mise à mort de la souris, et ne durera que 30 minutes à chaque fois.

Impact sur les animaux

Bien que de courte durée (quelques secondes), la contention et les injections intrapéritoneales peuvent induire un stress et une douleur de faible intensité.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses ciblant le rôle des sénolytiques comme nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour faire des analyses moléculaires et l’autre pour des analyses histologiques.. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux injectés avec le sénolytique seul ou en combinaison avec l’étoposide seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, jusqu’à leur euthanasie. Les points limites de nos expériences sont déterminés en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Ainsi, les expériences seront arrêtées suite à la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Pour tous les signes indicateurs de douleurs (activité réduite, perte de poids, automutilation…) nous suivrons une échelle de points limites stricte et des analgésiques seront administrés si besoin.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée utilisée permet l’inactivation de ces deux gènes dans le cortex de la glande surrénale. À partir de 4 mois, ces souris développent des corticosurrénalomes agressifs qui se manifestent par l’apparition de métastases pulmonaires. Afin d’évaluer le rôle antitumoral des sénolytiques sur des corticosurrénalomes à des stades avancés associés à une dissémination métastatique, les souris seront traitées avec le sénolytique seul ou en combinaison avec l’étoposide au moment où les premiers signes de malignité ont été détectés (4 mois) et jusqu’au moment où la dissémination métastatique est évidente (6 mois).

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, six jours sur sept, elles reçoivent un composé par la bouche, à la pipette ou par sonde de gavage enfoncée jusqu'à l'estomac quand elles se montrent réfractaires. Trois batteries de tests mesurent leur motricité et leur sensibilité : cinq minutes forcées à marcher sur une roue tournante, analyse de la démarche, et pressions croissantes d'un filament sur la paume de la patte. Le porteur estime l'ensemble des nuisances "à caractère léger", le seul gavage relevant selon lui du modéré, alors que les 240 souris sont déclarées en gravité modérée.

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique. Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est dûe à des mutations dans le gène MFN2 . Au niveau cellulaire, ce gène muté entraine des défauts dans les interactions entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que dans la dynamique et le transport des mitochondries, dans les neurones moteurs des souris CMT2A. Nos travaux précédents ont montré qu’un des mécanismes sous-jacents à la pathologie était l’activation d’un stress cellulaire appelé stress du réticulum endoplasmique. Le composé pharmacologique utilisé au cours de ce projet est un inhibiteur de cette voie de stress. Il a déjà démontré des effets protecteurs dans d’autres formes de CMT ainsi que dans la maladie de Charcot chez des modèles souris et est en cours d’essai clinique pour cette dernière chez l’homme. Ce projet a pour but de tester une approche thérapeutique basée sur l'administration de ce composé pharmacologique dans un modèle murin modélisant de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ce traitement pharmacologique représente une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. Si un effet bénéfique est obtenu, cela pourrait dans le futur conduire à un essai clinique chez l’homme. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à des défauts de stress du réticulum endoplasmique.

Procédures

Les animaux seront soumis à : une administration de traitement par voie orale en prise spontanée ou par gavage 6j/7 pendant 8 semaines (léger; quelques minutes); des tests de comportement permettant la masure de la locmotion et de la sensibilité des pattes . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, une chirurgie sans réveil sera réalisée.

Impact sur les animaux

Dans le cas de l’administration guidée par micropipette, les animaux subiront à l’âge adulte un traitement par voie orale de 6 jours par semaine pendant deux mois. Cela impliquera une légère contention de l'animal deux fois par jour au moyen d'une légère pression exercée par la paume de la main de l'expérimentateur. L'administration par micropipette ne créera pas d'inconfort, et le composé a déjà été testé et est bien toléré. Si les animaux deviennent réfractaires à la fin du traitement à l’administration par micropipette, le composé sera alors administré par gavage à l’aide d’une sonde droite de 26G. Dans ce cas les animaux subiront une contention afin d'immobiliser l'animal et l’incorporation d’une canule à bout rond pour délivrer directement dans l’estomac. Ces gavages répétés peuvent induire des irritations au niveau de l’œsophage et représentent ainsi une nuisance modérée. Le phénotype dommageable de ces souris est léger et n'entrainent pas d'inconfort dans leur vie quotidienne. Néanmoins, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement). Au cours du test rotarod, les souris seront forcées à marcher sur une roue qui tourne pendant 5 min. Pour les souris transgéniques qui présentent des défauts locomoteurs sur ce test, cela pourra conduire à une fatigue musculaire légère. Nous n'anticipons pas de nuisance liée au test du gait. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne par contre un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Les souris ressentiront ainsi une légère piqûre au niveau de leur paume qui entraine un léger inconfort. Nous estimons qu'au cours du projet l'ensemble des nuisances à caractère léger. Seul la mise en place du gavage entrainera une nuisance modérée.

Devenir

mise à mort et récupération des tissus

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique de ce composé sur un modèle in vitro de la maladie. Néanmoins le passage in vivo est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux, détaillé au point 3.4.10, a été limité au minimum nécessaire (= 16 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et au moyen de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous privilégions une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies. Au total nous utiliserons 192 animaux répartis de la manière suivante: - Deux groupes d’âge : début du traitement (avant le début des symptomes ) et début du traitement (après le début des symptomes) – Deux groupes d'animaux : contrôles et modèles de la pathologie - Trois groupes thérapeutiques : non traités, traités avec une solution saline et lait, traités avec le composé pharmacologique. Il y aura donc au total 192 animaux dans l'étude.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe). Les souris seront stabulées par petits groupes dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de maisonnettes en carton. Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Le maintien de lignée est réalisé dans un établissement utilisateur agrée et les souris seront manipulées et suivies par du personnel compétent. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont controlés. Nous avons également choisi de privilégié un mode d’administration de notre composé pharmacologique via la méthodede prise spontanée par pipette plutôt que par gavage afin de réduire considérablement le stress des animaux et d’éventuels risques de blessures lors de l’injection. Des points limites ont été établis (voir fiche de score) pour prendre en charge au plus vite les atteintes au bien être de l’animal et l’arrêt des souffrances.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire, et des défauts locomoteurs tardifs. Pour les deux approches, les traitements seront réalisés à deux âges : avant (3 mois) et après le déclenchement de la maladie (5 mois) afin de déterminer si l'effet du traitement permettra d'empêcher le développement de la maladie et/ou de la ralentir une fois celle-ci déclarée. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement.

Cinquante molécules par an, deux cent cinquante sur la durée du projet, envoyées par des clients : 4 000 rongeurs, 2 500 souris et 1 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse, subissent des prélèvements sanguins à la queue ou en submandibulaire, et une ponction de liquide céphalorachidien. Tous sont tués pour découper leur cerveau en tranches et y enregistrer l'activité électrique. Le porteur qualifie ce travail de projet scientifique mené sur sa plateforme, alors que les composés, leur toxicité évaluée en amont et le calendrier des tests relèvent de ses clients.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives liées au vieillissement ou à des troubles spécifiques, constituent un enjeu majeur de santé publique. Ce projet scientifique, réalisé sur notre plateforme d'électrophysiologie, vise à étudier l'efficacité de composés en développement sur l'activité neuronale, grâce à la technique d'électrophysiologie ex vivo sur coupes cérébrales de rongeurs sains. Ce projet servira de base pour le développement futur de stratégies thérapeutiques, dans les modèles pathologiques spécifiques associés et qui seront décrits dans un autre projet. Pour cela, nous analysons les effets de ces composés sur les mécanismes neuronaux fondamentaux à travers des expériences réalisées sur des rongeurs sauvages. Nos études seront réalisées soit sur la souris soit le rat selon la pathologie étudiée et la disponibilité des modèles animaux de la pathologie. Ces modèles offrent une base physiologique robuste, essentielle pour comprendre les processus fondamentaux dans un système neuronal non altéré. Les différentes structures cérébrales seront étudiées pour étudier la mémoire, la régulation émotionnelle, les circuits de récompense, pour analyser la coordination motrice et les interactions sensorimotrices, pour évaluer les fonctions motrices et certaines dimensions cognitives. Les composés sont administrés par voie orale ou parentérale selon des protocoles adaptés, avec des effets mesurés après des périodes d’exposition définies. Ce projet a pour but de fournir des données fondamentales pour orienter le développement de thérapies innovantes. On estime à 50 le nombre de molécules testées par an soit 250 pour la durée du projet.

Bénéfices attendus

En complément des recherches menées par nos clients, cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces composés et de contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies neurodégénératives. Les résultats obtenus serviront de base pour la mise en place de stratégies thérapeutiques futures, qui seront approfondies à travers des études spécifiques sur des modèles pathologiques.

Procédures

Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, Sur animaux sous anesthésie et sous antalgie : prélèvements sanguins 5 secondes. prélèvements liquide céphalo rachidien 20 secondes, chirurgie terminale sans réveil 1 minute.

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les procédures uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont par nos clients, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. L’administration par gavage peut entraîner une gêne légère à modérée (gavage chronique), transitoire, due à la contention et à l’introduction de la sonde. Les produits administrés par cette voie peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire. L’injection sous-cutanée entraîne une douleur légère et brève, due à la piqûre et au produit injecté. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré. L’injection intrapéritonéale provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. L’injection dans la veine caudale induit une douleur légère au moment de la piqûre et un stress bref lié à l’immobilisation. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin à la veine caudale entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Le prélèvement submandibulaire provoque une douleur légère à modérée de courte durée en raison de la ponction. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire ainsi que celui du liquide céphalorachidien sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée sur des coupes cérébrales de rongeurs à l’aide de techniques d’électrophysiologie. Ces préparations ex vivo conservent certaines propriétés fonctionnelles des circuits neuronaux, permettant d’étudier l’activité synaptique et la dynamique des réseaux à une échelle locale. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, permettant d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’étudier les interactions au sein d’un réseau neuronal fonctionnel, ce qui justifie le recours aux coupes cérébrales ex vivo pour approfondir ces analyses dans un cadre plus proche de la physiologie neuronale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies d’éléments tels que des bûchettes de bois à grignoter, de la frisure papier, et des carrés de coton. Des tunnels en carton seront fournis pour les rats, tandis que des dômes transparents rouges seront utilisés pour les souris afin de faciliter les transferts entre cages tout en réduisant le stress. Des interactions quotidiennes avec les humains, combinées à une transition progressive de la lumière, amélioreront encore leurs conditions d’hébergement. Après chaque intervention technique, les réactions seront étroitement surveillées afin de minimiser toute souffrance animale. En cas de détérioration de leur état général, une surveillance renforcée sera mise en place, avec des soins appropriés prodigués en concertation avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les points limites établis pour le projet seront scrupuleusement respectés pour détecter et traiter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Les animaux seront pesés au moins une fois par semaine après l’acclimatation et avant le début des traitements. En cas de traitements répétés et consécutifs, des pesées 2 fois par semaine permettront d’ajuster précisément les volumes administrés. Les animaux seront toujours sous anesthésie générale / analgésie pour les procédures le nécessitant.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, deux modèles largement utilisés en neurosciences pour l’étude des mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain. Ces similitudes en font des modèles de choix pour étudier les bases du fonctionnement normal du cerveau et les processus qui peuvent être perturbés dans les maladies neurodégénératives. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 4 semaines, (groupe de référence) correspondant au stade adolescent chez l'humain, jusqu'à 95 semaines, afin de couvrir toute la gamme des âges, du stade jeune (adolescent) à l'adulte âgé.

Deux trous sont percés dans le crâne de chaque souris, de part et d'autre de la suture, puis comblés par impression laser de cellules et de matériaux directement sur la plaie. 130 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après l'opération pour mesurer la repousse osseuse. Sept séances d'IRM de trente minutes sous anesthésie s'échelonnent du premier au trente-cinquième jour, cadence que le porteur classe comme non douloureuse. Parmi les bénéfices annoncés figure le dépôt de brevets sur les nouvelles formulations de bioencre, à côté de l'optimisation de la station de bioimpression du laboratoire.

Objectifs

Les pertes de susbtance osseuse, d'origine traumatique, tumorale ou dégénérative, constituent actuellement un problème majeur de santé publique. Les solutions thérapeutiques actuelles présentent toutes des limites et des risques (manque de disponibilité, infections, douleurs au niveau du site de prélèvement, rejet immunitaire). C'est dans ce contexte que se sont développées les stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse. De précédentes études ont démontré l'intérêt des technologies de bioimpression pour produire des substituts osseux avec des propriétés optimisées, mimant fidèlement le tissu osseux natif et avec une prévascularisation permettant de limiter le risque de nécrose du greffon. De récents travaux ont pu démontrer la faisabilité d’imprimer des biomatériaux et cellules à l'aide de la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) directement au niveau de défauts osseux crâniens chez la souris, pour favoriser une meilleure vascularisation et régénération osseuse. Malgré des résultats prometteurs, les conditions expérimentales n’ont pas permis une régénération osseuse complète. Par ailleurs, l’un des principaux obstacles rencontrés dans un précédent projet concernait l’imagerie et le suivi en temps réel des motifs imprimés in vivo. L'objectif principal de ce nouveau projet est d'optimiser les précédents résultats obtenus en développant une nouvelle bioencre, basée sur l'utilisation d'hydrogels naturels et synthétiques associés à différentes particules minérales, ainsi que des cellules souches ou dérivés cellulaires, afin d'améliorer la régénération osseuse par Bioimpression Assistée par Laser in vivo. Le second objectif du projet est de développer une nouvelle stratégie d'imagerie par IRM pour suivre l’organisation des motifs cellulaires, la vascularisation et la maturation tissulaire avec une haute résolution. Afin de répondre à ces deux objectifs, le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet de la bioimpression in vivo combinée à de nouvelles formulations de bioencre, impliquant des nouveaux biomatériaux associés à différentes particules minérales et cellules/dérivés cellulaires. Ces résultats nous permettront d'envisager un/des dépôts de brevet dans le cadre de ces nouvelles applications. Ce projet visera également à évaluer, au niveau biologique, si des dérivés cellulaires pourraient remplacer les cellules elles-mêmes au sein d'une bioencre et si leur ajout est pertinent dans le contexte de régénération osseuse (permettant ainsi à terme de s'affranchir de l'utilisation des cellules souches). D'un point de vue technologique, ce projet constitue une étape-clé dans l'optimisation de notre station de bioimpression in situ, par l'intégration en son sein du dispositif anesthésique, les optimisations technologiques du dispositif au service d'une bioimpression plus précise et l'utilisation d'une nouvelle interface plus intuitive. Enfin, ce projet permettra de valider l'utilisation d'une nouvelle stratégie d'imagerie non-invasive haute résolution, basée sur l'IRM, pour assurer le suivi en temps des cellules bioimprimées in vivo.

Procédures

Au sein du premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ) et une procédure de bioimpression in situ (15 secondes pour l'impression en elle-même ; 5 minutes au total en comptant l'installation de la souris et le paramétrage de l'impression), sous anesthésie. Les animaux seront également soumis à l'administration d'un anti-douleur à 3 reprises (par injection intra-péritonéale) à différents temps (durée 30 secondes pour chaque injection) dans le cadre de la procédure analgésique. Au sein du second établissement utilisateur, l'acquisition de chaque séquence IRM sera de 30 minutes, sous anesthésie, et réalisée à 7 reprises (J1, J4, J7, J14, J21, J28, J35).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie (phase d'induction dans la boîte, entre 2 et 5 minutes) avant la chirurgie. Des douleurs pourront être ressenties lors des injections (anti-douleur), ainsi qu'après la chirurgie (procédure de classe modérée), sur les 3 jours post-opératoires. Le protocole de bioimpression et d'imagerie in vivo (IRM) n'engendreront aucune douleur (classe légère).

Devenir

Les animaux seront mis à mort 2 mois après l'intervention chirurgicale, afin de pouvoir évaluer la vascularisation et la régénération osseuse d'un point de vue quantitatif et qualitatif (microCT, histologie).

Remplacement

Ces expérimentations doivent se faire dans un modèle animal, car un environnement multifactoriel ne peut pas être reproduit in vitro. Seules ces conditions in vivo chez l'animal permettent l’étude de processus dynamiques complexes tels que la vascularisation et la cicatrisation osseuse, étroitement liées, dans un milieu proche des conditions physiologiques. Néanmoins, des expérimentations in vitro préalables seront réalisées (actuellement en cours) afin de déterminer les formulations optimales pour chaque biomatériau à évaluer in vivo et ainsi réduire considérablement le nombre de conditions expérimentales et donc d'animaux. Cinq conditions expérimentales in vivo sont ainsi finalement prévues pour chacun des deux biomatériaux (soit 2 x (5 x n=10) = 100 animaux) et 3 conditions expérimentales pour le suivi par IRM (soit 3 x n=10 = 30 animaux).

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, deux défauts osseux seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture crânienne. Il y aura 10 animaux par groupes, ce qui est le nombre minimal d'animaux que l'ont peut utiliser pour avoir ensuite des analyses statistiques qui soient pertinentes, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage), dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur environnement possible pendant l'étude (nid de coton, litière en copeaux de peupliers et jouets). Les expérimentateurs sont tous titulaires d'une formation Concepteur ou Applicateur, et satisfont aux obligations de formation continue en expérimentation animale. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Du gel lacrymal sera employé afin de limiter la sécheresse oculaire. Les interventions seront réalisées sous anesthésie. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin, après concertation avec le responsable du suivi du bien-être des animaux et en présence du vétérinaire référent. Les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée inférieure à 24h après l’opération pour préserver les sutures et permettre un meilleur rétablissement, puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe pré-opératoire. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet présentent une immuno-déficience marquée, les rendant compétentes pour l’implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Elles seront hébergées à l’animalerie pour une durée maximale de 4 semaines avant l’opération et 10 semaines après l’opération. Elles seront protégées des pathogènes et des opportunistes car hébergées en portoirs ventilés. Le défaut osseux de taille critique de calvaria chez ces souris est un modèle qui est largement validé dans la littérature scientifique. Il s’agit d’un modèle de choix en ingénierie tissulaire osseuse pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce modèle animal est également le seul ayant une taille adaptée à la procédure de bioimpression assistée par laser in vivo à l'heure actuelle, permettant son insertion dans la station de travail. De plus, le site d’implantation au niveau de la surface du crâne permet d’avoir une surface facilement accessible et relativement plane, permettant la focalisation du laser sur le centre du défaut osseux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 à 12 semaines, donc dans un stade adulte pour éviter des faux résultats liés à la croissance de l’animal.

Toutes tuées à l'issue parce que les atteintes subies interdisent tout placement ou réutilisation, 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par une première chirurgie de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, une partie d'entre elles subissant une seconde intervention, chirurgicale ou pharmacologique, destinée à détruire par degrés leur appareil vestibulaire. Les souris ainsi rendues déséquilibrées suivent ensuite un programme de rééducation calqué sur celui proposé aux patients humains. Le porteur signale que ces souris peuvent aussi devenir sourdes, précise que ce point n'est pas quantifié parce qu'il sort du sujet, et affirme que la neurophysiologie intégrative ne peut être conduite que sur animal vivant et éveillé.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier à l'aide de modèles précliniques fiables et reproductibles, l'intérêt potentiel de la mise en place de protocoles locomoteurs et visuels. Les objectifs spécifiques seront i) de déterminer les fenêtres d'opportunités thérapeutiques en quantifiant l'intérêt d'une prise en charge précoce, ii) de déterminer en fonction de la sévérité des pathologies vestibulaires, les bénéfices thérapeutiques potentiels des différentes approches locomotrices et visuelles. Dans le cas de pathologies touchant l'équilibre, les patients ressentent des déséquilibres et des flous visuels liées à une mauvaise stabilisation du corps et du regard au cours des mouvements. Se mettent alors en place des substitutions sensorielles qui permettent progressivement le rétablissement de l’équilibre grâce aux informations visuelles et proprioceptives. La prise en charge des patients comprend la mise en place d'une rééducation vestibulaire consistant en des séances de sollicitations multi sensorielles, notamment à la marche ou visuelles. Ces protocoles n'ont cependant jamais fait l'objet de validations précliniques, ils sont extrêmement variables et dépendent largement de la pratique des professionels de santé.

Bénéfices attendus

Le projet constitue un projet de recherche fondamental dont les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des capacités plastiques du cerveau dans un contexte de dégradation ou perte totale des infomations sensorielles vestibulaires. En particulier le projet permettra de mieux identifier le potentiel thérapeutique associé à des protocoles de réhabilitations effectués en rééducation vestibulaire. Bien que conduit chez l’animal, les retombées sociétales du projet concernent donc la recherche translationnelle chez l’homme et notamment la question de la réhabilitation de patients souffrants de pertes vestibulaires.

Procédures

Tous les animaux (n=492) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Pour générer les modèles de vertiges, une partie des souris seront soumises à une seconde chirurgie afin de causer des pertes vestibulaires gradées par une approche chirurgicale ou pharmacologique. Ces animaux bénéficieront ensuite d'une réhabilitation comparable aux interventions thérapeutiques mises en place chez l'homme dans le cadre de réhabilitation vestibulaire.

Impact sur les animaux

Des chirurgies et interventions pharmacologiques potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées ; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements analgésiques et antalgiques adaptés sont mis en place. Comme les patients, les souris déficientes vestibulaires peuvent présenter des déficits auditifs associés qui ne sont cependant pas l'objet de l'étude et ne sont donc pas quantifiés.

Devenir

L'ensemble des procédures subies ne permettent pas de placer ni réutiliser les animaux qui doivent donc être euthanasiés (n=492 maximum) en fin de protocole.

Remplacement

L’intégration des signaux sensoriels issus de l’oreille interne, de la proprioception, de la vision, et les signaux moteurs issus de la moelle implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests couvrant la période de réhabilitation. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, il est susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères. Les animaux seront utilisés à l’âge où les réflexes sensorimoteurs étudiés sont matures, soit à partir de 6 semaines et jusqu’à 16 semaines (4 mois) pour les plus âgées.