Souris

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de toxines bactériennes provoque une chute de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec troubles de la conscience allant jusqu'au coma, suivie d'une IRM de trente minutes sous anesthésie. Le porteur présente ce coma comme limitant l'inconfort, tout en indiquant que les doses employées ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant son installation. Les essais préliminaires sur cellules sont écartés, le porteur concluant à la "nécessité" d'un modèle animal pour intégrer les voies physiologiques du choc septique.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.

Opérées d'une splénectomie partielle sous anesthésie générale pour recevoir une injection de cellules tumorales, les souris de ce projet développent des métastases hépatiques. 787 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour analyse des cellules du foie. Certaines subissent en plus trois injections d'un inducteur sous anesthésie locale, deux gavages par sonde œsophagienne et un prélèvement de sang, le porteur reconnaissant que les métastases peuvent provoquer douleurs et perte de poids modérées. Le bénéfice annoncé reste une meilleure compréhension de la biologie des macrophages et l'espoir d'identifier des cibles thérapeutiques, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates et certaines.

Objectifs

Chaque année 1,4 million de nouveaux cas de cancer colorectal sont diagnostiqués dans le monde et 700 000 en meurs chaque année faisant de celui-ci la 2e cause de mort cancer. Environ 25% des patients présentent des métastases hépatiques, la résection des tumeurs est la meilleure option pour traiter ses métastases cependant seul 10 à 20% des patients y sont éligibles. Pour les patients atteints de métastases non-résécables, la survie ne dépasse pas les 2% à 5 ans. Par conséquent, il existe un besoin urgent pour de meilleures options thérapeutiques pour ces patients. Les tumeurs sont formées d’un ensemble de cellules cancéreuses et non-cancéreuses composant le microenvironnement tumoral (TME) telles que des cellules immunitaires. Parmi celles-ci, les macrophages associés aux tumeurs sont présents en abondance et sont associés à un mauvais pronostic. Notre laboratoire a démontré que les macrophages émergent lors de plusieurs vagues consécutives au cours du développement. En plus de ses particularités, l’effet du temps passé dans le tissu contribue à l’acquisition d’une signature unique. A Dans ce projet, nous avons pour objectif d’étudier avec précision les interactions locales et les fonctions de ce mélange hétérogène de macrophages d’ontogénie différentes dans le microenvironnement métastatique afin d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a le potentiel d'améliorer de manière significative notre compréhension de la biologie des macrophages dans le contexte des métastases hépatiques. Nous espérons que ce projet offre de nouvelles perspectives et stratégies concernant l'exploitation des macrophages à des fins thérapeutiques dans le cancer. Les découvertes liées à ce projet pourraient également avoir des portées plus larges applicables à d'autres maladies. Ce projet pourra apporter alors des avances majeures en termes de recherche fondamentale et translationnelle.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales après splénectomie partielle chirurgicale (n=1, durée 15 minutes sous analgésie et anesthésie générale). Certains animaux subiront également un prélèvement de sang (n=1, anesthésie locale, durée 1 minute maximum). Certains animaux auront 3 injections d'un inducteur (durée 15 secondes, anesthésie locale). Des animaux auront deux gavages (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L'opération chirurgicale permettant l'injection de cellules cancéreuses dans la rate sous anesthésie et analgésie occasiionnera en elle-même une contrainte légère et temporaire. Le développement des métastases hépatiques représente une nuisance pour l'animal qui peut se manifester par des douleurs ou une perte de poids modérés. Les injections sous anesthésie locale représentent des contraintes légères liée à la contention. Le gavage représente une contrainte moyenne de courte durée liée à la contention et à l'introduction de la sonde dans l'œsophage: risque de douleur locale légère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'étude pour analyses sur les cellules hépatiques.

Remplacement

Ce projet nécessite l'établissement des métastases dans des conditions réelles pour pouvoir étudier l'hétérogénéité des macrophages au cours du temps et en fonction de leur origine. Nous développons en parallèle des modèles types organoïdes pour récréer les tumeurs in vitro cependant cette approche ne permet pas actuellement de récapituler la complexité du microenvironnement tumoral qui est un paramètre fondamental de notre étude. De plus, notre stratégie est entre autres basée sur le suivi temporel de la différentiation des macrophages ayant colonisé le tissu métastatique à différents moments avant et durant le developpement de métastases. Si les organoïdes nous permettent d'étudier l'évolution tumorale sur quelques semaines, ils ne nous offrent pas la possibilité de l'étudier sur un lapse de temps comparable à nos modèles murins. Ainsi, l'utilisation de modèles animaux est indispensable à notre étude.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit a son minimum en suivant la littérature ou en utilisant des outils statistiques pour le calcul des effectifs. De nombreuses cellules dont certaines rares seront collectées après mise à mort pour pouvoir étudier l'implication de nos cellules d'interêt dans les métastases hépatiques au niveau cellulaire, moléculaire et transcriptomique. Chaque individu permettra de générer de très nombreuses informations.

Raffinement

Les souris sont sous surveillance clinique quotidienne pour une évaluation précise et stricte de leur état de santé. Des points limites précoces adaptés ont été définis et seront strictement appliqués. Nous avons adapté nos procédures pour limiter les nuisances et effets indésirables. Pour la chirurgie, les souris reçoivent une analgésie et sont sous anesthésie générale. Pour les injections, les souris recoivent une anesthésie locale ou générale en fonction du site d'injection et nous utilisons des aiguilles très fines . Pour les gavages nous utiliserons des sondes souples.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en terme de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans la tumorogénèse dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle entre 8 et 12 semaines, âge minimum de la maladie chez les patients.

972 souris vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à trois séjours de 96 heures isolée en cage métabolique sur trois mois, à jeun seize heures avant chaque expérimentation. Elles reçoivent quinze administrations par voie orale en un mois, jusqu'à six anesthésies et jusqu'à trois prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les animaux homozygotes développent l'hypercalcémie recherchée, et le porteur affirme sur la base d'expériences antérieures qu'aucune nuisance n'est attendue, ne retenant comme stress que l'isolement en cage métabolique. Les points limites prévus décrivent pourtant une absence de gain de poids à la puberté, une incapacité à s'alimenter, un poids inférieur de plus de 15 % et des poils hérissés, autant de signes qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.

Procédures

isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois), mise à jeun 16H avant l’expérimentation, administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise). Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule. Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Devenir

Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient etre administres selon les recommendations veterinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques avec mise à jeun, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée. Le jeûne (mise à jeun) avant la récolte d'urine et de sang est nécessaire pour garantir des résultats précis. Il permet d'éviter les fluctuations biochimiques sanguins tel que glycémie, des lipides et des hormones causées par l'alimentation, qui pourraient fausser les analyses. Cela assure une meilleure interprétation des résultats et une reproductibilité.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.

Former le personnel aux gestes techniques d'une activité de recherche et développement, sur des animaux vivants, constitue l'objet de ce projet. 1 340 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 souris, 80 lapins, 80 rats, 80 cochons d'Inde, 70 hamsters dorés, 10 hamsters de Chine et 20 cochons. Chaque séance comporte une à trois interventions par animal sur trente minutes, injections, prises de sang, anesthésies parfois répétées, lavages broncho-alvéolaires avec chute de la saturation en oxygène, le porteur reconnaissant que les personnes à former ne maîtrisent pas les gestes et peuvent provoquer saignements et douleurs par erreur technique. Quarante animaux seront réutilisés et vingt lapins ou cochons placés en adoption quand les conditions le permettent, les 1 280 autres étant tués, et le porteur justifie l'ensemble par une obligation réglementaire de formation qu'il qualifie d'"indispensable".

Objectifs

- Educatif : La formation sur animaux est indispensable pour la qualification du personnel et la maitrise des gestes techniques et ainsi pouvoir observer que ceux-ci correspondent bien aux règles de l’art et qu’aucun impact clinique n’est constaté suite à la réalisation des gestes techniques. - Réglementaire : La formation du personnel avec démonstration de la compétence est une obligation réglementaire (décret 2013-118, section 6, sous-section 4, paragraphe 2).

Bénéfices attendus

La formation du personnel aux gestes techniques permet d’avoir des personnes parfaitement formées et compétentes, et travaillant de façon harmonisée avec du matériel optimisé. Les bénéfices sont principalement éthiques : pour le bien-être de l’animal manipulé (raffinement), ainsi que pour consolider la reproductibilité du geste et donc éviter d’avoir à refaire l’étude (réduction). Des gestes maitrisés permettent également de limiter le risque de blessure pour l’opérateur

Procédures

Les animaux sont soumis à des sessions de formation à l’administration de produits non irritants et/ou de prélèvements de sang. Par séance de formation, ils vivront entre 1 et 3 interventions ; pour une durée totale de 30 minutes

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : - la sensation de piqûre de l’aiguille pour les injections et prélèvements. - l’anesthésie potentiellement répétée notamment pour certains types de prélèvements sanguins - la chute de la saturation en oxygène du sang pendant quelques minutes dans le cas des lavages broncho-alvéolaires. Par définition, les personnes à former ne maitrisent pas complètement les gestes techniques. Bien qu’une formation théorique préalable et un accompagnement par une personne compétente soit assurés, il est possible que des erreurs techniques surviennent induisant des effets indésirables comme des saignements de faible intensité et de courte durée lors des prélèvements sanguins, ou de légères douleurs induites par une injection dans un compartiment non adéquate (péri-veineux ou intra-intestinal par exemple).

Devenir

Lorsque cela est possible (pas de formation au prélèvement terminal, pas de procédure invasive, bon état de santé de l’animal, pas d’hébergement dans un milieu bioconfiné, statut sanitaire compatible, structure d’accueil identifiée et disponible), des démarches de réutilisation, de replacement et/ou d’adoption sont enclenchées. Lorsque toutes les conditions ne sont pas réunies, les animaux sont euthanasiés en fin de procédures expérimentales.

Remplacement

Lorsque cela est possible, les gestes sont réalisés sur des matières non vivantes (plastique, textile, tissus morts, ou composition diverse) afin de s’entrainer au geste avant de pratiquer sur animal vivant. Des dispositifs ont déjà été testés, tous n’ont pas été retenus (ex : des animaux en plastique trop rigides pour s’entrainer à de la contention). Une veille scientifique est assurée par notre équipe (vétérinaires, managers, techniciens) via les publications, le réseau, la visite d’un centre de formation aux gestes techniques sans animaux, les formations (ex : ComEd), etc. afin de ne rater aucune opportunité à la formation sans animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est raisonné selon le nombre de personnes à former, l’expérience de ces personnes, le nombre de techniques à apprendre, la difficulté technique, le nombre de techniques réalisables sur un même animal et sur la base des expériences terrain comme étant le minimum pour s’assurer qu’une personne maîtrise un geste technique. Aucune approche statistique n'est envisageable pour ce projet, le nombre d'animaux utilisé étant tributaire du nombre de personnes à former et de leur niveau initial. Dans la mesure du possible, des animaux d’autres procédures pourront être utilisés pour cette formation. Pour qu’ils soient réutilisés, il faut que la procédure précédente soit considérée comme « légère ou modéré» et qu’ils soient en bon état de santé. Aucun animal ayant subi une procédure sévère ou ne présentant pas un bon état général ne pourra être utilisé pour la formation. Enfin, un effort de réduction est appliqué chez les rongeurs par l’utilisation d’un appareil d’imagerie qui permet de visualiser la localisation de l’injection (IC, IP, IM, ICe ou SC) -et donc valider le geste technique sans avoir à euthanasier l’animal - permettant ainsi de réutiliser l’animal par la suite.

Raffinement

Moyens entrepris au niveau du projet ou de la procédure pour réduire le niveau de souffrance : une formation théorique est dispensée à l’arrivée des personnes avec du texte, des supports visuels (photos, vidéos). Avant maitrise des gestes de prélèvements et d’administration (hors IP), les animaux sont anesthésiés.

Choix des espèces

La formation du personnel doit prendre en compte toutes les espèces sur lesquelles il est amené à réaliser des gestes techniques dans le cadre des projets de recherche. Ces espèces sont définies et justifiées dans les protocoles des procédures de R&D. Le programme est développé en lien avec le responsable du suivi des compétences et le manager. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement,…). Ces espèces correspondent aux espèces déclarées et validées dans l’agrément d’établissement utilisateur, ainsi qu’aux espèces déclarées dans les projets de recherche et développement. Ce sont donc les espèces pour lesquelles le personnel doit être formé s’il ne l’est pas déjà Les animaux utilisés sont ceux demandés dans les protocoles d’étude de la R&D. Les souris peuvent être utilisées nouveau-nés dans le cadre de besoin projet (ex : développement de candidat vaccin pour des nouveau-nés). Si des souriceaux âgés entre 24h et

Légèrement immunodéficientes pour tolérer des neurones d'une autre espèce, les souris de ce projet reçoivent des greffes de neurones de cervelet humains, de primates non-humains et de souris. 985 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever leur cerveau. La greffe se fait soit in utero, la mère gestante étant opérée sous anesthésie générale pendant moins de quinze minutes avec injection dans le cerveau des fœtus, soit par injection dans le ventricule cérébral du souriceau nouveau-né. Le porteur revendique une approche qui évite l'expérimentation sur des primates non-humains et sur des humains, et annonce 985 animaux au maximum sans détailler le calcul qui aboutit à ce chiffre.

Objectifs

Le développement des neurones du cervelet des espèces de primates, dont l’espèce humaine, reste largement inexploré, malgré l’implication du cervelet dans des troubles cognitifs (autisme), du langage (dyslexie), et moteurs (ataxies). En particulier, se pose la question de propriétés propres aux neurones humains et de primates comparés aux autres espèces animales, dont la souris. Pour répondre à cette question, des protocoles de différentiation in vitro de cellules souches humaines en neurones du cervelet ont été publiés. Cependant, ces approches ne récapitulent pas le développement et l’anatomie normales du cervelet (mauvaise organisation ou absence de certaines structures anatomiques, croissance des neurones limitée, absence de stimulations sensorielles). C’est pourquoi nous proposons de créer un modèle de greffe de ces neurones humains, primates et de souris dans le cervelet de souris. Cette approche permettra d’étudier les propriétés propres aux neurones de cervelet de ces différentes espèces, sans expérimentation sur des individus humains et primates non-humains. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre de parenté entre espèces. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les propriétés propres aux neurones cérébélleux humains. Le développement de notre modèle de greffe permettra d’étudier in vivo des neurones d'espèces variées dont de primates non-humains et humains dans un contexte pathologique (spectre autistique, ataxie cérébelleuse, dyslexie). Il pourrait ainsi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles. La greffe elle-même pourrait aussi être envisagé comme approche thérapeutique pour les troubles du cervelet humain et des autres espèces de Mammifères.

Procédures

Procédure 1: greffe in utero sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection cérébrale sur foetus (

Impact sur les animaux

La greffe in utero est une technique chirurgicale qui peut entrainer une douleur et un stress modérés pendant l’opération (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et utilisés dans les procédures décrites pour analyses histologiques.

Remplacement

Les modèles in vitro différentiés à partir de cellules souches humaines sont encore trop immatures, manquent certaines structures anatomiques, et de stimulation sensorielle, ce qui ne sera pas le cas in vivo. De plus, notre étude in vivo pourrait permettre d’augmenter nos connaissances pour améliorer les protocoles de différentiation in vitro.

Réduction

Ce projet nécessitera au maximum 985 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. De plus, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans des cages ventilées d'une surface adéquate, dans un environnement enrichi, et changés sous flux d'air. Soins spécifiques apportés à la mère gestante. La greffe in utero est effectuée dans une pièce dédiée, après désinfection de la mère, sous analgésie locale et générale, et anesthésie, en température contrôlée (

Choix des espèces

Notre approche permet d’étudier les propriétés propres aux neurones du cervelet d’espèces de primates non-humains et humains sans avoir recours à l’expérimentation sur des animaux primates. Une option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré telle que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-mammifères est trop divergente comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences et envisager une bonne intégration dans des réseaux différents de ceux des Mammifères. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et au stade postnatals critiques dans le développement des neurones du cervelet de souris et humain.

Cinq injections quotidiennes la première semaine pour déclencher une délétion génique, puis jusqu'à 24 injections sur huit semaines, puis quatre autres sur quatre semaines, toutes sur animal vigile, avec neuf à douze pesées : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les chimiothérapies administrées provoquent la cardiotoxicité et la néphrotoxicité recherchées, avec une perte de poids anticipée et, plus rarement, tachycardie, fibrillation ventriculaire ou insuffisance cardiaque aiguë. Le porteur qualifie cette toxicité aiguë de généralement asymptomatique, et affirme que l'usage d'animaux vivants est "indispensable" parce qu'aucune méthode in vitro ne rend compte de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées pour prélever les organes destinés aux analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.

Objectifs

L'autophagie est un mécanisme naturel essentiel permettant aux cellules de se débarrasser de leurs composants endommagés et de recycler certains éléments pour faire face à différentes situations de stress. Ce processus joue un rôle clé dans le maintien de l’équilibre cellulaire, en adaptant les ressources de la cellule aux besoins environnementaux. Des molécules naturellement produites par l’organisme peuvent moduler ce processus d’autophagie. Certaines d’entre elles sont libérées par différents organes (comme le foie, le cœur, les reins ou les muscles) et circulent dans le sang. En plus de leur rôle dans la gestion des nutriments et de l’énergie, elles peuvent aussi agir sur des récepteurs présents sur les cellules, ce qui peut freiner ou activer l’autophagie. Des études récentes ont montré que bloquer certaines de ces molécules favorise l’activation du processus d’autophagie dans plusieurs organes, notamment le cœur, le foie et les reins. Certains traitements anticancéreux peuvent entraîner des effets secondaires importants, notamment au niveau du cœur et des reins, augmentant ainsi le risque d’insuffisance cardiaque ou rénale chez les patients. Ce projet vise à évaluer si l’activation de l’autophagie, par le blocage de certaines molécules régulatrices, pourrait protéger ces organes et limiter les effets secondaires de certaines chimiothérapies, dans des modèles expérimentaux chez la souris.

Bénéfices attendus

Le cancer demeure aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité. Bien que la chimiothérapie soit une stratégie anticancéreuse incontournable, son efficacité est souvent entravée par ses effets secondaires délétères. En particulier, la cardiotoxicité et la néphrotoxicité associées aux agents chimiothérapeutiques peuvent provoquer une détérioration progressive de la fonction rénale et cardiaque, limitant ainsi les options thérapeutiques disponibles et réduisant l’espérance de vie des patients. Environ 50 pour cent des patients atteints de cancer développent des complications cardiovasculaires liées aux traitements, et la toxicité cardiaque des anthracyclines concerne jusqu’à 26 pour cent des patients recevant des doses élevées. Par ailleurs, la maladie thromboembolique veineuse représente la deuxième cause de mortalité chez les patients cancéreux, soulignant l’ampleur de l’enjeu clinique et de santé publique. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques capables de prévenir ou de limiter ces toxicités sans compromettre l’efficacité des traitements anticancéreux. L’autophagie joue un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie cellulaire, notamment par l’élimination des organites et des protéines endommagés. La modulation de ce processus pourrait non seulement prévenir les dommages tissulaires causés par la chimiothérapie, mais aussi améliorer la tolérance des patients aux traitements anticancéreux. En ciblant les modulateurs de l’autophagie, cette approche innovante pourrait permettre d’activer les mécanismes naturels de protection cellulaire contre les stress chimiques. Les résultats attendus de ce projet pourraient ainsi déboucher sur le développement de nouvelles thérapies adjuvantes, limitant la toxicité des chimiothérapies, tout en préservant leur efficacité anticancéreuse. Cette stratégie pourrait significativement améliorer la qualité de vie et le pronostic vital des patients atteints de cancer. De plus, les bénéfices de cette recherche pourraient s’étendre au traitement d’autres pathologies où l’autophagie joue un rôle central, notamment dans les maladies cardiovasculaires et les maladies dégénératives. En résumé, ce projet ouvre la voie à des innovations thérapeutiques majeures dans le domaine de l’oncologie et pourrait contribuer à réduire de manière significative les risques liés aux traitements actuels, apportant ainsi une avancée précieuse pour la santé publique.

Procédures

La mise en place des modèles murins implique différentes séries d’injections, variables selon les groupes expérimentaux : Certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). D’autres souris ne recevront aucune injection préalable. Enfin, certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Pour la mise en place des traitements, les animaux recevront 4 injections sur 4 semaines et d’autres animaux recevront 24 injections sur 8 semaines puis 4 injections sur 4 semaines en fonction des groupes sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Les animaux seront pesés entre 9- 12 fois en fonction des groupes. Chaque pesée dure également quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de la cardiotoxicité et de la néphrotoxicité par les agents chimiothérapeutiques, effets bien documentés dans la littérature scientifique. Aucun effet indésirable supplémentaire n’est attendu en dehors de ces réactions prévisibles. La toxicité aiguë induite dans ce protocole est généralement asymptomatique, se manifestant parfois par des altérations transitoires de la fonction systolique ou des arythmies cardiaques. Toutefois, une perte de poids corporel est anticipée en raison des effets secondaires des traitements chimiothérapeutiques. Des manifestations symptomatiques graves mais rares peuvent survenir, notamment des épisodes de tachycardie, de fibrillation ventriculaire ou des signes d’insuffisance cardiaque aiguë. Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (i.p.), qui peuvent provoquer un stress lié à la contention ainsi qu'une douleur localisée de courte durée au point d’injection. Enfin, la modulation du flux autophagique par l’administration de traitements pourrait induire des effets métaboliques imprévus. Ces effets incluent potentiellement des modifications du métabolisme énergétique et des altérations physiologiques générales.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques, car cela est nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable dans ce projet, car les modèles cellulaires ou informatiques ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes et des réponses physiologiques impliquées dans la toxicité de certains traitements. Ces effets indésirables résultent de mécanismes multiples qui mobilisent plusieurs systèmes biologiques de manière coordonnée, ce qu’aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser de façon fiable. Avant d’envisager l’expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés sur des cellules en culture afin d’analyser certains mécanismes moléculaires de manière simplifiée. Des approches informatiques ont également été utilisées pour prédire certaines interactions biologiques et effets pharmacologiques. Ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas d’évaluer la toxicité globale ou les effets à long terme sur l’organisme entier. Les modèles murins restent aujourd’hui les plus adaptés pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Ils permettent d’étudier simultanément la transformation des médicaments, les interactions entre organes et les réponses immunitaires et inflammatoires associées. Ils offrent également des outils génétiques permettant d’explorer le rôle de certaines voies biologiques dans les effets secondaires observés. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris, réparties entre les différentes procédures expérimentales. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’une analyse préalable, qui a permis d’estimer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables, tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Afin de réduire encore le nombre d’animaux, les expérimentations seront organisées de manière à mutualiser les groupes témoins chaque fois que cela est possible. Cette approche permettra de limiter la redondance des procédures tout en conservant des comparaisons scientifiquement exploitables. De plus, l’étude pourra être arrêtée dès que les premiers résultats indiqueront que l’objectif scientifique ne pourra pas être atteint, ce qui évitera de mobiliser des animaux inutilement. Chaque animal inclus dans ce projet contribuera à la collecte de plusieurs types de données. À l’issue des procédures, différents organes et tissus seront prélevés pour réaliser plusieurs analyses complémentaires, portant sur les effets immunologiques, les lésions tissulaires ou encore l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans les effets secondaires des traitements. Enfin, il sera nécessaire de réaliser une analyse statistique sur les données recueillies afin de s’assurer que les différences observées entre les groupes sont bien significatives et non dues au hasard. Nous restons attentifs aux évolutions scientifiques permettant de réduire ou de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce type de recherche.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, perte de poids corporel ou des comportements anormaux, ce qui permettra une intervention rapide pour adresser tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, permettant de s’appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les souris offrent également l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés ciblant les protéines d’intérêt, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les lignées sélectionnées sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes spontanés susceptibles de perturber l’interprétation des résultats. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.

Une souris qui atteint le score 3 de la grille d'évaluation, ou le score 2 sans amélioration après 48 heures, est mise à mort. 208 souris Alport, qui développent spontanément une insuffisance rénale chronique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leur sang, de leur urine et de leurs organes. À quatre semaines, elles sont castrées sous anesthésie, puis gavées cinq fois par semaine et implantées deux fois sous la peau de capsules d'estradiol ou de dihydrotestostérone, avec des prises de sang et une mesure de fonction rénale de 45 minutes, capteur fixé sur le dos. Le bénéfice annoncé se limite à une meilleure compréhension du dimorphisme sexuel de la maladie chez ces souris, quand la castration, les gavages répétés et l'injection rétro-orbitaire sont immédiats.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale. Le traitement de l’IRC doit être adapté en fonction du sexe car son incidence et sa gravité sont différents entre les femmes et les hommes. L’objectif du projet est d’étudier l’influence du sexe sur le développement et le traitement de l’IRC. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. Le projet sera mené chez des souris Alport chez qui l’IRC se développe spontanément et rapidement (quelques semaines) en raison d’une mutation homozygote (KO) dans un gène essentiel pour la fonction rénale. Des expériences menées au laboratoire ont montré que chez ces souris, l’IRC était plus fort chez les femelles que chez les mâles au même âge. De plus, seules les femelles étaient sensibles à l’effet protecteur contre l’IRC d’un agent pharmacologique : l’AP#1. Dans le present projet, nous souhaitons tester l’hypothèse de l’implication des hormones sexuelles dans ces dimorphismes sexuels. A cette fin, nous étudierons l’impact de la castration [ovariectomie (OVX) ou orquiectomie (ORX)] et des hormones sexuelles exogènes sur le développement de l’IRC et de son traitement par l’AP#1. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes responsables du dimorphisme sexuel dans l'installation et le traitement de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport.

Procédures

Les souris femelles et males seront soumises à une castration (sous anesthésie gazeuse et analgésie, durée maximale d’environ 10 minutes) à l’âge de 4 semaines, puis traitées à un agent pharmacologique par gavage (5 fois par semaine) combiné ou non à des hormones sexuelle (estradiol ou dihydrotestostérone sous forme de capsules implantés sous la peau 2 fois au cours du protocole). Tous les animaux seront soumis à des prises de sang (sous anesthésie gazeuse) et à une mesures de leur fonction rénale (sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée). Toutes les procédures non terminales et la mise à mort des animaux seront sont réalisées dans l’EU1. Dans le cas où le matériel nécessaire et/ou des salles de sacrifice seraient indisponibles à l’EU1, la mise à mort des animaux sera réalisée à l’EU2.

Impact sur les animaux

- Castration chirurgicale (OVX, ORX) et implantation de capsules en sous-cutanée: ces interventions peuvent provoquer de la douleur (administration d’anti-douleur) et du stress, et des complications sont possibles (saignement, complications au niveau de la cicatrice). Les problèmes de cicatrisation sont des risques faibles- Gavage et collecte d’urine peuvent induire un léger stress - Prise de sang : les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie - Evaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’insuffisance rénale chronique. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, limitant les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre connaissance du modèle utilisé, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 208 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique non paramétrique ou paramétrique (en fonction de la taille des groupes et de leurs distributions). La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autres test statistique.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés (service de zootechnie agréé par le ministère) par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et les points limites seront soit l’atteinte du score 3 sur l’un des critères, soit l’atteinte du score 2 sans amélioration après 48h de surveillance. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport.

Choix des espèces

L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience antérieure, en tenant compte de la variabilité individuelle de la réponse aux différentes conditions expérimentales. Le nombre de souris par groupe (n=12) est calculé pour espérer observer une différence significative (P

Sept séances d'IRM de trente minutes sous anesthésie, du premier au trente-cinquième jour, et deux défauts osseux percés de part et d'autre de la suture crânienne : 130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après l'opération. La chirurgie dure cinq minutes, l'impression de bioencre au laser directement dans le crâne quinze secondes, et trois injections d'antidouleur suivent l'intervention. Le projet vise à améliorer une bioencre pour la régénération osseuse et à valider une station de bioimpression, des dépôts de brevet figurant parmi les bénéfices annoncés. Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet de leur implanter des cellules humaines, et le porteur indique que ce modèle est le seul dont la taille rentre aujourd'hui dans sa station de bioimpression.

Objectifs

Les pertes de susbtance osseuse, d'origine traumatique, tumorale ou dégénérative, constituent actuellement un problème majeur de santé publique. Les solutions thérapeutiques actuelles présentent toutes des limites et des risques (manque de disponibilité, infections, douleurs au niveau du site de prélèvement, rejet immunitaire). C'est dans ce contexte que se sont développées les stratégies d'ingénierie tissulaire osseuse. De précédentes études ont démontré l'intérêt des technologies de bioimpression pour produire des substituts osseux avec des propriétés optimisées, mimant fidèlement le tissu osseux natif et avec une prévascularisation permettant de limiter le risque de nécrose du greffon. De récents travaux ont pu démontrer la faisabilité d’imprimer des biomatériaux et cellules à l'aide de la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) directement au niveau de défauts osseux crâniens chez la souris, pour favoriser une meilleure vascularisation et régénération osseuse. Malgré des résultats prometteurs, les conditions expérimentales n’ont pas permis une régénération osseuse complète. L'objectif principal de ce nouveau projet est d'optimiser les précédents résultats obtenus en développant une nouvelle bioencre, basée sur l'utilisation d'hydrogels naturels et synthétiques associés à différentes particules minérales, ainsi que des cellules souches ou dérivés cellulaires, afin d'améliorer la régénération osseuse par Bioimpression Assistée par Laser in vivo. Le second objectif du projet est de développer une nouvelle stratégie d'imagerie par IRM pour suivre l’organisation des motifs cellulaires, la vascularisation et la maturation tissulaire avec une haute résolution. Afin de répondre à ces deux objectifs, le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet de la bioimpression in vivo combinée à de nouvelles formulations de bioencre, impliquant des nouveaux biomatériaux associés à différentes particules minérales et cellules/dérivés cellulaires. Ces résultats nous permettront d'envisager un/des dépôts de brevet dans le cadre de ces nouvelles applications. Ce projet visera également à évaluer, au niveau biologique, si des dérivés cellulaires pourraient remplacer les cellules elles-mêmes au sein d'une bioencre et si leur ajout est pertinent dans le contexte de régénération osseuse (permettant ainsi à terme de s'affranchir de l'utilisation des cellules souches). D'un point de vue technologique, ce projet constitue une étape-clé dans l'optimisation de notre station de bioimpression in situ, par l'intégration en son sein du dispositif anesthésique, les optimisations technologiques du dispositif au service d'une bioimpression plus précise et l'utilisation d'une nouvelle interface plus intuitive. Enfin, ce projet permettra de valider l'utilisation d'une nouvelle stratégie d'imagerie non-invasive haute résolution, basée sur l'IRM, pour assurer le suivi en temps des cellules bioimprimées in vivo.

Procédures

Au sein du premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ) et une procédure de bioimpression in situ (15 secondes pour l'impression en elle-même ; 5 minutes au total en comptant l'installation de la souris et le paramétrage de l'impression), sous anesthésie. Les animaux seront également soumis à l'administration d'un anti-douleur à 3 reprises (par injection intra-péritonéale) à différents temps (durée 30 secondes pour chaque injection) dans le cadre de la procédure analgésique. Au sein du second établissement utilisateur, l'acquisition de chaque séquence IRM sera de 30 minutes, sous anesthésie, et réalisée à 7 reprises (J1, J4, J7, J14, J21, J28, J35).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie (phase d'induction dans la boîte, entre 2 et 5 minutes) avant la chirurgie. Des douleurs pourront être ressenties lors des injections (anti-douleur), ainsi qu'après la chirurgie (procédure de classe modérée), sur les 3 jours post-opératoires. Le protocole de bioimpression et d'imagerie in vivo (IRM) n'engendreront aucune douleur (classe légère).

Devenir

Les animaux seront mis à mort 2 mois après l'intervention chirurgicale, afin de pouvoir évaluer la vascularisation et la régénération osseuse d'un point de vue quantitatif et qualitatif (microCT, histologie).

Remplacement

Ces expérimentations doivent se faire dans un modèle animal, car un environnement multifactoriel ne peut pas être reproduit in vitro. Seules ces conditions in vivo chez l'animal permettent l’étude de processus dynamiques complexes tels que la vascularisation et la cicatrisation osseuse, étroitement liées, dans un milieu proche des conditions physiologiques. Néanmoins, des expérimentations in vitro préalables seront réalisées (actuellement en cours) afin de déterminer les formulations optimales pour chaque biomatériau à évaluer in vivo et ainsi réduire considérablement le nombre de conditions expérimentales et donc d'animaux. Cinq conditions expérimentales in vivo sont ainsi finalement prévues pour chacun des deux biomatériaux (soit 2 x (5 x n=10) = 100 animaux) et 3 conditions expérimentales pour le suivi par IRM (soit 3 x n=10 = 30 animaux).

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, deux défauts osseux seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture crânienne. Il y aura 10 animaux par groupes, ce qui est le nombre minimal d'animaux que l'ont peut utiliser pour avoir ensuite des analyses statistiques qui soient pertinentes, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe (5 par cage), dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur environnement possible pendant l'étude (nid de coton, litière en copeaux de peupliers et jouets). Les expérimentateurs sont tous titulaires d'une formation Concepteur ou Applicateur, et satisfont aux obligations de formation continue en expérimentation animale. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. Du gel lacrymal sera employé afin de limiter la sécheresse oculaire. Les interventions seront réalisées sous anesthésie. Le réveil s’effectuera sur couverture chauffante. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin, après concertation avec le responsable du suivi du bien-être des animaux et en présence du vétérinaire référent. Les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée inférieure à 24h après l’opération pour préserver les sutures et permettre un meilleur rétablissement, puis regroupées par 5 en respectant la composition du groupe pré-opératoire. L’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur, en même temps que par le personnel de l’animalerie. Cette estimation est ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements. Des points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet présentent une immuno-déficience marquée, les rendant compétentes pour l’implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Elles seront hébergées à l’animalerie pour une durée maximale de 4 semaines avant l’opération et 10 semaines après l’opération. Elles seront protégées des pathogènes et des opportunistes car hébergées en portoirs ventilés. Le défaut osseux de taille critique de calvaria chez ces souris est un modèle qui est largement validé dans la littérature scientifique. Il s’agit d’un modèle de choix en ingénierie tissulaire osseuse pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce modèle animal est également le seul ayant une taille adaptée à la procédure de bioimpression assistée par laser in vivo à l'heure actuelle, permettant son insertion dans la station de travail. De plus, le site d’implantation au niveau de la surface du crâne permet d’avoir une surface facilement accessible et relativement plane, permettant la focalisation du laser sur le centre du défaut osseux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 à 12 semaines, donc dans un stade adulte pour éviter des faux résultats liés à la croissance de l’animal.