Souris
Evaluation de l’effet de stratégies thérapeutiques dans des modèles de lésion aigüe et chronique au cours du vieillissement de la sphère orale
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un millimètre carré de gencive retiré sous anesthésie, dix minutes, une seule fois : c'est l'acte central subi par une partie des 1 640 souris utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. D'autres reçoivent une injection quotidienne de molécules pendant sept jours ou l'implantation d'un produit de thérapie cellulaire. Le porteur attend une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids pendant deux à trois jours, et cherche à comprendre pourquoi les tissus de soutien de la dent perdent leur capacité à se régénérer avec l'âge. Il retient la souris parce que la parodontite y évolue comme chez l'humain, et laisse les animaux vieillir jusqu'à dix-huit mois plutôt que de provoquer la maladie par ligature des molaires, procédé qu'il juge plus invasif.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques liées à l’âge sont associées à des perturbations multi-paramétriques entraînant progressivement une architecture tissulaire défectueuse menant à une perte fonctionnelle. Cela conduit à un point critique où le tissu perd sa capacité à se régénérer, qui peut être causée par une perte d’efficacité des cellules conjonctives structurelles appelées MSC. La transplantation de MSC cultivées est une stratégie bien étudiée dans le monde et prometteuse pour le traitement de ces maladies, en raison de leurs diverses capacités. Cependant leur administration dispersée en solution est parfois un échec sur le long terme dans les essais cliniques actuels. Ces éléments soulignent la nécessité i) d’identifier la fenêtre temporelle de thérapie appropriée et ii) de démontrer qu’un environnement 3D permet d’optimiser l’effet de cette thérapie cellulaire. D’autre part, il a été montré que l’administration de certaines molécules pharmacologique après une ablation chirurgicale apportaient un bénéfice sur le potentiel de régénération, montrant ainsi qu’il est possible de redonner du potentiel de régénération chez le mammifère adulte. Un autre objectif de ce projet est donc d’étudier au cours de la vie du mammifère adulte les processus biologiques qui permettent le rétablissement des capacités structuro-fonctionnelle d’un organe après une lésion. Ainsi, nous pensons que le parodonte, ensemble des tissus de soutien des dents, est un bon modèle pour valider nos hypothèses et tester des traitements suite à une lésion aigüe ou chronique chez le rongeur. En effet c’est un organe facile d’accès, multi-tissulaire, qui récapitule la physiopathologie observée chez l’Homme et qui nous permettra d’étudier : 1)le rôle des MSC et de ses partenaires dans la perte des capacités régénératives au cours du vieillissement, qui est permise chez le jeune adulte et altérée chez un sujet âgé ; 2)la cinétique des évènements qui conduisent à l’apparition d’une maladie inflammatoire chronique liée à l’âge, la parodontite ; 3)l’impact et les modalités d’un traitement pharmacologique ou cellulaire efficace dans les deux situations précitées.
Bénéfices attendus
La parodontite est une maladie orale invalidante majeure en impasse thérapeutique, entraînant perte de dents, douleur, altération de la qualité de vie et de l’esthétique, avec une prévalence et un coût de santé publique croissants. La concrétisation de ce projet apportera une meilleure connaissance des processus biologiques conduisant à cette maladie, et identifiera des cibles et une méthodologie permettant de la traiter. D’autre part dans un contexte mondial de population vieillissante, entrainant de plus en plus de perte d’autonomie, tout ce qui pourra être observé et publié dans cette étude contribuera à la compréhension sur le plan général de la perte des capacités régénératives chez le mammifère adulte, ainsi qu’à la physiopathologie des maladies inflammatoires chroniques liée à l’âge.
Procédures
Ablation d’1 mm² de gencive (10min, 1seule fois) sous anesthésie. Injection de molécules pharmacologiques (3min, maximum 1 fois par jour – 7 jours) ou implantation d’un médicament de thérapie innovante sous anesthésie générale (10min, 1 seule fois)
Impact sur les animaux
Diminution de la prise alimentaire pendant 2-3 jours associée à une perte de poids qui est comblée en moins d'une semaine.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanaisés afin d'effectuer les prélèvements d'intérêt et explorer les effets cellulaires et tisssulaires des différents traitements testés, en fonction de l'âge des individus.
Remplacement
L’étude d’une maladie inflammatoire chronique liée à l’âge, ainsi que la perte de capacités régénérative d’un organe sont des processus complexes faisant intervenir des acteurs cellulaires et des signaux moléculaires qui paraissent très difficiles à reproduire dans un modèle ex vivo, d’autant plus lorsque l’âge devient le facteur de risque le plus important à prendre en compte. Cependant, nous travaillons également in vitro sur la composition du produit cellulaire qui sera implanté chez la souris afin de sélectionner les formulations les plus pertinentes pour la phase in vivo. De plus, l’une des stratégies pharmacologiques proposées dans cette étude est issue d’une étude de modélisation in silico qui a permis de déterminer quel type de molécules était le plus relevant pour rendre possible la régénération dans un organe ayant perdu cette capacité.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et une analyse statistique adaptée aux petits échantillons, optimisant ainsi nos protocoles et réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Les travaux antérieurs nous aident à déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour chaque type d’exploration pour garantir la valeur scientifique de l'expérience et éviter qu'elle ne doive être reproduite. De plus, les études in vitro et les modélisations numériques réalisées nous permettent de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires. Lorsque cela est possible (sur les lots contrôle par exemple) nous rendons accessibles les tissus inexploités à la communauté.
Raffinement
Nous avons choisi ici de privilégier une mise en place spontanée de la parodontite en laissant les animaux vieillir afin de se situer au plus proche de la physiopathologie observée chez l’Homme, contrairement à la majorité des études actuellement publiées qui induisent cette pathologie sur des souris jeunes par des actes plus invasifs tels que l’instillation d’une flore bactérienne agressive, ou par ligature des molaires. Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental comprenant l'utilisation de cylindres de carton ou d’igloo, de matériaux de nidifications, afin de réduire le stress potentiel et offrir un abri sécurisé. Un soin particulier est apporté à la préhension des animaux lors du change en utilisant un tunnel. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie, avec une application de gel oculaire. Les animaux sont placés sur une plaque chauffante et surveillés attentivement jusqu'à leur réveil. Le poids est surveillé après chaque chirurgie, jusqu’à reprise du poids initial préopératoire, et consignés dans un cahier de laboratoire. Si la perte de poids atteint 10%, des soins appropriés sont alors prodigués, avec un accès facilité à la nourriture si nécessaire, ou l’apport d’une gelée nutritive en cas de déshydratation. Les personnes effectuant les procédures sont compétentes et formées aux techniques employées.
Choix des espèces
Dans ces deux mammifères, l’Homme et la souris, la maladie parodontale et la perte des capacités régénérative de la gencive au cours du temps sont semblables. Il nous parait donc tout à fait pertinent de décrypter les processus biologiques, rechercher des cibles thérapeutiques, puis déterminer leur efficacité chez l’un avant de les mettre en application chez l’autre. Les animaux utilisés auront de 3 à 18 mois, puisque notre étude s'intéresse au développement d'une pathologie et aux pertes de fonctions associées au vieillissement.
Impact du ciblage des macrophages dans la physiopathologie et le traitement de la Leucémie Aigue Myéloide chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Chaque souris est contenue treize fois, reçoit une injection de cellules leucémiques, subit six prélèvements sanguins, cinq injections dans l'abdomen et dix gavages consécutifs. 1 472 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des molécules censées reprogrammer les macrophages contre la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur décrit des douleurs modérées liées aux prises de sang et aux injections répétées, un inconfort au gavage avec irritation possible de l'œsophage, et une perte de poids après l'injection des cellules cancéreuses. Les calculs qu'il présente portent sur des groupes de huit à dix souris répétés trois fois, sans que le total de 1 472 animaux soit rapporté à ces effectifs.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) touchent environ 3 personnes sur 100 000 chaque année en France. Malgré les traitements comme la chimiothérapie et les greffes de cellules souches, et même si 50 à 80 % des patients entrent en rémission, des cellules cancéreuses restent souvent présentes et peuvent provoquer des rechutes plus tard. Récemment, des chercheurs ont découvert que certains types de cellules immunitaires appelées macrophages jouent un rôle important dans la progression des LAM. Selon l'environnement autour des tumeurs, ces macrophages peuvent être de deux types principaux : 1. Les macrophages M1, qui sont anti-tumorales et combattent les tumeurs. 2. Les macrophages M2, qui sont pro-tumoraux et peuvent aider les tumeurs à se développer. Les macrophages peuvent changer de fonction en réponse à leur environnement, ce qui ouvre des possibilités pour de nouvelles thérapies. Étant donné l'importance des macrophages pro-tumoraux dans la leucémie, nous souhaitons tester dans ce projet plusieurs approches pharmacologiques pour reprogrammer les macrophages en macrophages anti-tumoraux dans des souris leucémiques et ainsi améliorer le traitement de référence. Ainsi, l'ensemble des résultats obtenus nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte de la leucémie aigue myéloide et par conséquent améliorer la survie des patients atteints de leucémies.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle in vivo de leucémie, nous pourrons 1/ déterminer l'importance des cellules immunitaires, et notamment des macrophages, dans la physiopathologie de la leucémie aigue myéloide mais également 2/ développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires afin de les réactiver dans le but d'améliorer la prise en charge de la leucémie chez l'homme.
Procédures
1- Contentions répétées des souris (13 fois, 30 secondes / Souris) 2- Injection de cellules leucémique chez la souris (1 fois, 20 sec /souris) 4- Prélèvements sanguins avant traitement (J0 et J10) puis tous les 5 jours durant la durée du traitements (20 jours), soit 6 prélèvements/souris (30 sec / souris) 5- Injections intrapéritonéales répétées (5 injections/souris sur 5 jours, 30 sec/souris) 6- gavages répétés (10 gavages/souris sur 10 jours, 1 min /souris)
Impact sur les animaux
1/Stress légers liés à la préhension et la contention des animaux, 2/Perte de poids suite à l’injection des cellules cancéreuses et aux différents traitements, 3/Stress et douleurs modérées liées aux prélèvements sanguins répétés, 4/Stress et douleurs modérées liées aux injesctions intrapéritonéales répétées avec possibilité d'inflammations locales, 3/Inconfort et douleurs modérées liées aux gavage répétés avec possibilité d'irritation de l'œsophage.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin de réaliser l'ensemble des analyses biologiques et biochimiques nécessaires à l'obtention des résultats
Remplacement
Les seuls modèles à notre disposition à ce jour sont des lignées cellulaires leucémiques de patients ou de souris isolées à partir d’animaux malades. Néanmoins, Il a été montré que les propriétés tumorales, sécrétrices et fonctionnelles de ces lignées diffèrent in vitro et in vivo d’où la nécessité d’induire la leucémie chez l’animal pour son étude. Ainsi et après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs traitements ayant des effets capable de reprogrammer les macrophages en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces molécules peuvent améliorer les effets de la chimiothérapie dans un modèle murin de leucémie. Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.
Réduction
Nous avons décidé de réaliser deux procédures dans le but de réduire le nombre d'animaux. Ainsi, la première procédure permettra d'établir la meilleure dose à utiliser de nos traitements d'intérêt sur un nombre minimal de souris et établira la preuve de concept d'efficacité de nos molécules à potentialiser les effets de la chimiothérapie de réference. L’objectif de cette procédure est donc de démontrer un effet notable de nos molécules sur la réduction de la masse tumorale en combinaison avec le traitement de référence . L'utilisation d'un logiciel de statistique recommande des groupes de 8 souris chacun afin d'établir cette preuve de concept. La seconde procédure établira statistiquement l'intérêt de moduler la polarisation des macrophages afin d'améliorer le traitement de référence . Afin d'établir le nombre de souris à utiliser, nous avons utilisé un logiciel pour faire des prévisions statistiques. Ainsi, ce logiciel recommande des groupes de 10 souris chacun et de répéter au moins 3 fois l'expérience. Nous avons donc décidé de constituer des groupes de 10 souris et de répéter l'expérience trois fois de manière indépendante. Si les résultats s’avèrent statistiquement significatifs dès la deuxième expérience, nous stopperons l'expérimentation et nous ne ferons pas la 3ème expérience.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et matériel de nidification). Des points limites précoces et adaptés notamment appuyés sur la mesure de marqueurs sanguins qui permettent de suivre précocement de la progression de la pathologie et de limiter la gravité des procédures seront mis en place. Si les efficacités de nos molécules sont démontrées avant les 20 jours de traitements, les procédures de traitements et de prélèvements seront arrêtées.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer la capacité de molécules capables de réactiver le système immunitaire dans le but d'améliorer les traitements actuels de la leucémie aigue myeloïde. Dans cet objectif, le modèle murin est le plus à même de reproduire un système immunitaire complexe. L'injection des cellules leucémiques s'effectuera à l'âge de 6 semaines, âge correspondant à l'âge optimal de prise tumorale.
Test d’une molécule à visée thérapeutique pour lutter contre l’atrophie musculaire et le vieillissement du muscle.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une baisse de la température corporelle, relevée chaque semaine à partir de quinze mois, est retenue comme signe précurseur de la mort et déclenche la mise à mort de l'animal. 1 018 souris porteuses d'une mutation qui accélère leur vieillissement vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour que muscles et organes soient prélevés. Chacune subit au sevrage une biopsie de l'oreille pour identification génétique, quatre-vingts d'entre elles une prise de sang sous anesthésie, et toutes une perte progressive de masse musculaire à partir du douzième mois, jusqu'à une modification de la démarche. Le porteur annonce que le projet "pourrait ouvrir la voie" à des traitements du déclin musculaire lié à l'âge, l'étude elle-même se limitant à tester une supplémentation alimentaire chez ce modèle.
Objectifs
Au cours du vieillissement, la perte progressive de la masse musculaire squelettique entraîne une incapacité du muscle à fonctionner correctement. Au niveau cellulaire, cela se traduit par des dérégulations moléculaires et une mauvaise communication entre les différents éléments qui composent la cellule. Ce projet, à travers un modèle murin unique de vieillissement prématuré, a pour objectif de restaurer le niveau cellulaire d’une molécule qui diminue avec l’âge, par le biais d’une supplémentation alimentaire. Cette molécule joue un rôle crucial au niveau de l’ADN et du métabolisme de la cellule. Le but est de rééquilibrer le niveau de cette molécule afin d'améliorer le fonctionnement et les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’ADN et le métabolisme cellulaire. Il permettra donc d’évaluer l’impact du traitement sur la structure du tissu musculaire et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans le dialogue entre différents éléments cellulaires lors de stress chronique et d'accumulation de dommages cellulaires. Ainsi, l’étude vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables des dérégulations qui apparaissent avec le vieillissement et les maladies associées. A plus long terme, elle pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de ce type de molécules comme stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce modèle offrira la possibilité d’aborder les aspects encore peu explorés de la biochimie, de la biologie cellulaire et les aspects de la biologie de l’ADN au cours de la vie postnatale saine et pathologique. Il permettra également de déterminer de nouveaux marqueurs de vieillissement, et plus largement d’évaluer l’impact du muscle sur les autres organes pour faire la relation avec des troubles cardiovasculaires, métaboliques et cognitifs fréquemment retrouvés chez l’homme pour à plus long terme envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet, grâce à l'utilisation de notre modèle murin de vieillissement accéléré, constitue une occasion unique d’élucider le rôle des mécanismes moléculaires dans le maintien des fibres musculaires au fil du temps. Il vise à évaluer, d'une part, l'impact de la restauration de la molécule défaillante sur la structure du tissu musculaire et, d'autre part, à approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans les interactions entre les noyaux et les différent conposant de la cellule sous l'effet de stress chroniques et de l'accumulation de dommages à l'ADN. La compréhension des mécanismes cellulaires régissant la régulation musculaire spécifique aux tissus des mammifères est essentielle pour le développement de futures thérapies. De plus, une dégradation musculaire peut à elle seule entraîner des dysfonctionnements dans d'autres organes, réduisant ainsi l'espérance de vie. De manière plus large, ce protocole permettra également d'évaluer l'impact du traitement sur d'autres organes et les interactions inter-tissulaires. À plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement de stratégies thérapeutiques contre le déclin musculaire lié à l’âge.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie d’un millimètre (durée 1 seconde) au moment du sevrage, soit à l’âge de 21 jours, afin de permettre leur identification génétique. Le temps du geste par animaux est inférieur à 1min. Les animaux seront répartis en différent groupes en fonction des paramètres d’analyses à étudier. Ainsi, un prélèvement de sang sera réalisé uniquement sur un groupe de 80 souris anesthésiées (sous anesthésie gazeuse et locale), sa durée est inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
A partir de 12 mois, les effets indésirables attendus sont une perte lente et progressive de la masse musculaire, qui se manifestera par une lente diminution du poids. Cette perte de masse musculaire pourra très progressivement emmener à un éventuel changement dans la démarche des souris. La contention induira un léger stress, et la biopsie de l’oreille génèrera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les muscles et les organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques approfondies.
Remplacement
Des cellules ont été isolées et immortalisées à partir des animaux transgéniques afin de réaliser des expériences sur lignées cellulaires quand cela est possible. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude au-delà de quelques jours ce qui n’est donc pas suffisant pour observer certaines dérégulations cellulaires, mécanismes ou encore l’effet de certains traitements. D’autre part, le modèle murin reste l’unique moyen pour étudier fonctionnellement le muscle dans son entièreté au cours du vieillissement et pour évaluer l’impact des défauts musculaires dans la communication au niveau de l’organisme entier. Pour ce type de projet longitudinal de vieillissement, de traitement à long terme et de compréhension des mécanismes moléculaire dérégulés mis en jeu, il n'est pas possible de réaliser ce type de travaux directement à partir de biopsies de volontaires humains.
Réduction
Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal mais suffisant pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et de réduire la variabilité, et donc de dimensionner précisément le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs moyens de 10 animaux par groupe seront privilégiés. Le personnel est formé à ces analyses. Les animaux seront traités par petites cohortes séquentielles, ce qui permettra, si les résultats statistiques le permettent, d’utiliser moins de souris. Chaque animal sera utilisé de manière optimale pour nos analyses, avec le prélèvement de plusieurs types de muscles ainsi que d’autres organes. Cela permettra la réalisation d’études parallèles à partir d’une même souris. Par ailleurs, l’ensemble des tissus collectés d’une même souris pourra être évalué par différentes techniques complémentaires, comparé entre eux et, si la quantité de tissu le permet, réutilisé pour des analyses à postériori. Cette approche vise à maximiser l’exploitation du matériel collecté, faire des études comparatives, et à répondre à un plus grand nombre de questions biologiques.
Raffinement
Une surveillance régulière des animaux sera réalisée par l’expérimentateur pour détecter les signes de souffrance et la prise en compte des points limites. Les animaux seront pesés une fois par mois de 6 mois à 11 mois afin de déterminer leur poids maximal, puis toutes les deux semaines à partir du 12eme mois jusqu’à détection d’un début de perte de poids. A partir de là les animaux seront pesés 2 fois par semaine jusqu’à l’atteinte des points limites. De manière concomitante à la pesée, le comportement sera évalué. Un changement dans la démarche des souris et sa capacité à se déplacer, associé à la perte de poids, sera considéré comme un point limite. A partir de 15 mois, une prise de température hebdomadaire avec un thermomètre thermique sera ajoutée afin de détecter une baisse de température corporelle qui serait un signe précurseur de mort. Grâce à ce suivi et ces paramètres, nous sommes capables de détecter précocement les premiers signes d’un phénotype et du vieillissement, et d’accroître l’observation et la vigilance des cages concernées si besoin. Ces points limites mis en place sont suffisamment prédictifs pour éviter toute souffrance des animaux. Au-delà de ses points limites la procédure sera arrêtée. Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus collectés. Le traitement via l’alimentation des souris est susceptible d’améliorer leurs conditions de vie. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux et dans un environnement adapté. Au cours de ces procédures, des souris peuvent se retrouver seule par cage. Dans cette éventualité l’enrichissement de la cage sera alors renforcé. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sous anesthésie générale et locale sur certaines souris afin de limiter le stress et la douleur.
Choix des espèces
Malgré des différences entre la symptomatologie chez les souris et les hommes, le modèle murin est extrêmement utile pour les études mécanistiques, physiopathologiques et la mise au point de traitements thérapeutiques. Plus spécifiquement, le muscle, que ce soit en termes de structure, de fonctionnement et de pathologie, est extrêmement proche de celui de l’Homme. Le modèle murin s’avère donc être un système idéal et indispensable pour étudier le rôle de gènes sur le plan moléculaire, cellulaire, tissulaire et fonctionnel au sein d’une entité. Pour répondre à notre problématique et mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les dérégulations du génome et du métabolisme qui apparaissent au cours du vieillissement et des pathologies associées, l’étude sera réalisée sur 2 stades d’âge : un premier à 12 mois pour investiguer les effets à court terme du traitement sur le muscle et évaluer les mécanismes moléculaires précoces mis en place, et un deuxième à 28 mois pour évaluer les bénéfices du traitement sur le muscle et l’organisme plus généralement, et pouvoir comparer les mécanismes moléculaires mis en place sur le long terme par rapport à la première condition. Ces stades sont nécessaires pour comprendre les dérégulations engendrées et déterminer de nouveaux marqueurs de veillissement et de pathologies associées, afin d’envisager à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un monofilament est poussé dans la carotide interne jusqu'à l'artère cérébrale moyenne d'une souris anesthésiée, l'obstrue pendant 45 minutes, puis une seconde chirurgie vient le retirer. Le lendemain, l'animal passe onze minutes d'IRM, avant quatorze jours de tests comportementaux nommés : force d'agrippement, reconnaissance d'objet nouveau, retrait d'adhésif, test du spaghetti. 704 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour comparer quatre stratégies thérapeutiques contre l'accident vasculaire cérébral, à deux doses chacune. Le réveil provoque une désorientation prononcée qui fait tourner les souris sur elles-mêmes, et le projet se termine par une chirurgie sans réveil au cours de laquelle le cerveau est prélevé.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), intraveineuse (i.v) ou par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.
Bénéfices attendus
Chez l’Homme, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monolfilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirugical durera 15 minutes. 45 minutes plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament. Cet acte chirugical durera 10 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suivront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement. La première séance d’acquisition du test NOR durera 8 minutes. 3 heures plus tard une seconde acquisition de 8 minutes est prévue. La mesure de la sensibilité digitale par le test de retrait d’adhésif durera 10 minutes puis les mesures du spaghetti dureront en moyenne 5 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sans réveil. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 10 sauf pour les SHAM au nombre de 20. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.
Raffinement
Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le devenir des lésions induites par un AVC ainsi que la récupération fonctionnelle. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Fourniture de tissus et réactifs d’origine animale pour les études de Recherche et Développement (R&D)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Rats : 100
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 100
Lapins : 200
Produire des anticorps et des tissus pour valider les tests in vitro d'un industriel du vaccin : 1 000 animaux vont être utilisés dans ce seul but, 500 souris, 200 lapins, 100 rats, 100 cochons d'Inde et 100 hamsters dorés, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les animaux immunisés reçoivent des antigènes ou des germes entiers, par voie intramusculaire le plus souvent, ce qui peut provoquer rougeur, gonflement, durcissement des tissus, poils hérissés, hyperthermie et baisse de réactivité. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la complexité des réponses immunes et que le recours à l'animal de laboratoire "s'avère donc indispensable". Vingt lapins seront réutilisés et quarante proposés à l'adoption sous réserve d'un avis vétérinaire, les autres animaux étant tués pour prélèvement d'organes ou parce que les volumes de sang prélevés ne permettent pas de les maintenir en vie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’assurer la fourniture des tissus et réactifs d’origine animale nécessaires à la réalisation des projets de Recherche et Développement (R&D). Les tests de R&D permettent le développement de nouveaux vaccins de haute qualité et répondent ainsi à des besoins médicaux non satisfaits. Les tissus (sang, fluide, peau…) et réactifs (anticorps polyclonaux, cellules immunes spécifiques …) seront issus d’études in vivo, pour les tissus sur animal non immunisé et pour les réactifs sur animal immunisé. Ils sont nécessaires pour la mise en œuvre de tests in vitro (permettant l’analyse de la réponse humorale telle que les techniques immunoenzymatiques, ou la réponse cellulaire telle que les techniques de cytométrie ou d’histochimie). Les tissus ou réactifs seront des contrôles positifs ou négatifs, ils permettent de valider l'ensemble des expérimentations que cela soit intra- ou inter-tests.
Bénéfices attendus
Les tissus et réactifs issus d’études sur animal seront utilisés pour mettre en place et valider les techniques in vitro afin d’étudier les réponses immunes qui sont essentielles pour évaluer les candidats vaccins ou anti-infectieux. Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché ou l’utilisation en essai clinique, de différentes préparations vaccinales ou de traitements anti-infectieux. La découverte de nouveaux candidats permettra de lutter contre des maladies pour lesquelles il n'existe pas de thérapies ou de prophylaxies suffisamment efficaces, et de sauver ainsi des vies humaines dans le monde.
Procédures
Les études de production de tissus ou réactifs consistent à administrer ou non des antigènes ou germes entiers dont la dose peut être unique ou multiple sous différentes voies d’immunisation en vue de générer des anticorps polyclonaux ou cellules immunes spécifiques qui serviront de réactifs positifs ou négatifs dans le développement de test nécessaire à l’évaluation des candidats vaccins ou thérapeutiques. Plusieurs voies d'administration peuvent être utilisées, la voie intramusculaire étant majoritairement utilisée. Ces différents types d’injection durent moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Dans le cas de la production de tissus, les nuisances attendues sont liées au mode de prélèvement et sont à priori de gravité légère : isolement de moins de 30 min pour un prélèvement de fèces piqûre pour un prélèvement sanguin sur animal vigile, prélèvement cutané (biopsie) sous anesthésie et analgésie. Dans le cas de la production de réactifs, l’administration des antigènes, des germes entiers ou inactivés en présence d’adjuvant ou non peut générer des signes cliniques légers avec réactogénicité locale avec principalement de l’érythème, voire parfois un gonflement et une induration des tissus, rarement des poils hérissés et une perte de poids transitoire de moins de 10%, et pouvant aller jusqu’à des signes plus modérés pour la production de certains anticorps polyclonaux avec des produits induisant une réaction inflammatoire connue avec des poils hérissés, une baisse d’activité modérée, hyperthermie, faiblesse de la réactivité.
Devenir
Les animaux pour lesquels les volumes sanguins prélevés permettent le maintien en vie seront réutilisés ou adoptés. Dans le cadre de volumes sanguins plus important et des prélèvements d’organes, les animaux seront euthanasiés. Le placement des animaux n’ayant pas fait l’objet ni d’un prélèvement terminal ni d’une injection par un germe entier sera possible et analysé au cas par cas sous réserve que : – l’état de santé de l’animal, certifié par un vétérinaire, le permette ; – il n’existe aucun danger pour la santé publique, la santé animale et l’environnement – des mesures appropriées aient été prises pour préserver son bien-être.
Remplacement
Les produits d’origine animale sont utilisés uniquement lorsque des produits fabriqués in vitro (anticorps monoclonaux par exemple) ne sont pas disponibles ou adaptés à l’utilisation visée. De plus, à ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour reproduire la complexité des réponses immunes. Ainsi, les anticorps générés in vivo sont polyclonaux et couvrent une multitude d’épitopes dont certains ont un rôle clé dans l’immuno-protection, cette couverture restant beaucoup plus restreinte en utilisant une combinaison d’anticorps monoclonaux non-dérivés d'animaux. Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est calculé au plus juste de façon à répondre aux besoins de tests sur la période (quantité de réactifs). Ce calcul tient compte des durées de péremption des produits mais aussi des évolutions technologiques pour les tests considérés. Les personnes utilisant ces réactifs sont sensibilisées sur leur origine animale et la nécessité de gérer au mieux les stocks.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés au sol (lapins), dans des modules (lapins, cobayes) ou dans des cages (souris, hamsters, cobayes) contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Pour chaque étude, une période d’acclimatation est prévue et permet de diminuer le stress des animaux avant les manipulations. L’ensemble des contentions et des gestes techniques sont réalisés par du personnel qualifié. Les médications utilisées pour supprimer la douleur sont l’anesthésie couplée à des analgésiques. Suivant l'application, des points limites avec une grille d’évaluation sont mis en place, dans le cas d’un degré de gravité modéré, portant sur plusieurs paramètres physiques (l’aspect général, les signes neurologiques, la réactivité et les signes respiratoires). En 2019, le Comité d’Ethique de l’entreprise a revu une Position Institutionnelle encadrant l’utilisation de l'adjuvant de Freund pour la génération d'anticorps polyclonaux et définissant la politique de l’entreprise sur ce sujet. Ainsi, l'Adjuvant Complet de Freund (ACF) est proscrit de tous nos tests en R&D. D’autres adjuvants moins réactogènes sont utilisés. En fonction des procédures réalisées et des traitements administrés pour la production de réactifs (produit de classe 1 non infectieux par exemple), les animaux peuvent être proposés à l’adoption.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est sélectionné en fonction des antigènes évalués, de la réponse immune analysée et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. Plusieurs critères entrent en ligne de compte pour le choix de l’espèce, voire de la souche : - développant une maladie et/ou une réponse immunitaire similaire à l’homme - type d’antigènes : protéines, polysaccharides, pathogènes (vivants, atténués, non réplicatifs ou inactivés), acides nucléiques, anticorps en présence d’adjuvant ou non. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : âge et taille des animaux (voie ou volume administrés, volume de prélèvement…), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris transgéniques constituent une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire et à la protection. Elles seront à phénotype non dommageable et ne nécessiteront pas de génotypage. Dans la plupart des protocoles, les rongeurs et les lapins sont tous utilisés après sevrage au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature.
Humanisation du foie de souris et modélisation de pathologies hépatiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Après la greffe qui humanise leur foie, une partie des souris peut passer dans d'autres projets de l'établissement, dont une formation interne aux gestes techniques, et les autres sont tuées, faute de pouvoir retrouver leur état de santé. 8 800 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques. Elles reçoivent des injections de composés qui tuent leurs cellules du foie et leurs cellules souches, puis une greffe de cellules humaines, dont l'injection par la veine porte comporte un risque hémorragique accru, et, en parallèle, les produits testés par voie respiratoire, orale ou injectable. L'humanisation ne réussit que chez environ une souris sur deux, ce qui porte à 7 800 l'effectif de 78 études de 50 souris. Le porteur écrit : "Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'effectif étant estimé d'après les études des années antérieures, avec une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.
Procédures
1 ou plusieurs injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.
Réduction
Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.
Impact du stress in utero sur les réponses immunes antitumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tuées après anesthésie à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient prélevés, 5 274 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les mères gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous une lumière vive, trente minutes, trois fois par jour, du treizième au dix-huitième jour de gestation. Leur descendance devenue adulte reçoit sous la peau une injection de cellules tumorales, dont la croissance provoque une douleur locale et une détresse décrites comme modérées. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"incontournable" au motif que la réponse antitumorale engage "l'organisme entier", puis énumère parmi les raisons du choix de la souris ses "coûts réduits", ses cycles de reproduction courts et sa "facilité de transport".
Objectifs
Le stress prénatal (PS) est provoqué par des événements traumatisants (comme le décès d’un proche, la dépression, une agression, une infection, etc.) survenant pendant la grossesse. Il a été observé que le stress prénatal entraîne chez les enfants diverses psychopathologies (telles que la dépression, l'anxiété, l'autisme, la schizophrénie, etc.), des troubles neuro-développementaux, ainsi que des dysbioses intestinales. Le PS peut également avoir divers effets sur le système immunitaire des enfants, notamment en augmentant leur susceptibilité à développer des dermatites et des allergies telles que des inflammations pulmonaires et de l’asthme allergique. L'impact du PS sur le développement du cancer demeure largement inexploré et les mécanismes impliqués restent à élucider. Une étude portant sur une cohorte humaine de 6 millions d’enfants a révélé que les enfants nés de mères ayant subi la perte d'un bébé ou de leur conjoint pendant la grossesse présentaient un risque accru de développer certains cancers liés aux fonctions immunitaires et endocriniennes, comme la leucémie, le cancer des testicules et du foie. Cependant, cette étude n’a pas établi de lien de causalité entre le PS et le cancer. Ainsi, notre projet vise à étudier, à l'aide d'un modèle de stress prénatal développé par notre équipe, les mécanismes par lesquels le PS influence la réponse immunitaire anti-tumorale chez la progéniture. Pour ce faire, nous analyserons l’impact du PS sur la réponse immune antitumorale dans trois modèles murins complémentaires.
Bénéfices attendus
Les facteurs environnementaux peuvent influencer le développement du système immunitaire et avoir un impact durable sur la progéniture, ce qui peut ultérieurement influencer les réponses immunitaires normales et pathologiques. Cette étude sur l'effet du stress prénatal sur la réponse immunitaire de la progéniture chez la souris offre une approche expérimentale pour explorer les mécanismes sous-jacents à ces interactions complexes, en mettant l'accent sur le microbiote. Cela pourrait permettre d'identifier des souches bactériennes ou des métabolites du microbiote qui pourraient être ciblés thérapeutiquement pour traiter les pathologies cancéreuses.
Procédures
Les souris gestantes seront soumises au stress du 13ème au 18ème jour de gestation en utilisant un tube de contention sous une lumière vive pendant 30 minutes, trois fois par jour. La progéniture adulte recevra une injection en sous-cutanée des cellules tumorales. Le modèle implique l'injection sous-cutanées de cellules tumorales murines présentant le même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes. Ces modèles sont couramment utilisés pour évaluer l'efficacité des thérapies car ils reproduisent la complexité de la physiopathologie observée chez l'homme En cas d’apparition de phénotypes dommageables, notamment des signes d’inflammation excessive ou de dérèglement immunitaire, une intervention rapide sera mise en place. Cela inclut des soins vétérinaires pour évaluer l’état de santé des animaux, ainsi que la mise en œuvre de protocoles d’euthanasie en cas de souffrance excessive ou de détérioration clinique significative. Les signes à surveiller incluent l’amaigrissement, les comportements anormaux (comme la posture courbée ou le poil éparse), ainsi que tout signe de détresse respiratoire ou inflammatoire.
Impact sur les animaux
Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris consiste à injecter des cellules tumorales murines génétiquement compatibles dans des souris immunocompétentes, permettant d'étudier l'efficacité des thérapies dans un contexte physiopathologique proche de l'humain. Ce modèle peut provoquer une douleur légère à modérée au site d'injection, suivie d'une inflammation locale liée à la croissance tumorale. La progression de la tumeur entraîne un stress physique prolongé et une détresse modérée due à des altérations physiologiques et comportementales, telles qu'une perte d'appétit
Devenir
À la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés après anesthésie. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire.
Remplacement
L'évaluation du statut immunitaire de l'animal est souvent peu représentative de la pathologie humaine. Par conséquent, ces limitations rendent le recours à l'expérimentation animale incontournable, car le stress, la réponse immunitaire et la croissance tumorale sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans leur intégralité. Cependant, une revue de la littérature sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été développées. L'utilisation de l'espèce animale choisie pour ce projet (la souris) permet de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines. De plus, cette espèce présente certains avantages pratiques décisifs justifiant son utilisation dans ce type de projet : coûts réduits, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De surcroît, notre recherche repose sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés, ce qui nécessite l'utilisation des souris. Aucune autre espèce animale n'est disponible à cet effet. Il est également important de souligner que chez la souris, nous disposons d'outils précieux tels que des anticorps et des protéines recombinantes indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans notre étude.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans chaque expérience a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variance biologique des résultats obtenus dans des expériences réalisées au laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, tous les échantillons prélevés sont stockés à -80°C et dans une banque de données, où ils peuvent être réutilisés ultérieurement ou servir de témoins dans d'autres expériences. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience étaient nécessaires. Pour les modèles utilisés, les animaux seront régulièrement suivis dans le temps par des techniques non invasives telles que le suivi du poids et la mesure de la croissance tumorale. L'utilisation de ces techniques non invasives permet d'observer l'évolution d'un seul animal au fil du temps, là où auparavant l'information devait être obtenue par l'euthanasie et l'autopsie de multiples individus à chaque étape d'une seule étude, permettant ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Une analyse rétrospective sera réalisée à la fin de chaque expérience afin de déterminer les possibilités de diminution supplémentaire du nombre d'animaux.
Raffinement
Dès le début de la période d'acclimatation, une surveillance quotidienne des animaux (poids, désydratation, température, respiration, état générale...) ainsi qu'un contact humain quotidien sont assurés. Les conditions expérimentales font l'objet d'un suivi rigoureux du bien-être animal. Des points limites (perte de poids >20%, activité extreme, hypotherlmie, ...) ont été définis pour chaque procédure afin de limiter la souffrance ou l'angoisse des animaux, et toute atteinte à ces limites entraînera l'euthanasie de l'animal. Des mesures seront mises en place pour réduire l'anxiété et l'impact environnemental sur les souris, telles que l'enrichissement de l'environnement avec des cachettes et des objets à ronger. Les animaux seront maintenus dans leur cage avec leurs congénères habituels et auront un accès libre à l'eau potable. Une surveillance quotidienne par le personnel animalier ou l'expérimentateur permettra de détecter toute éventuelle souffrance chez les animaux, comme spécifié pour chaque expérience. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective sera menée afin d'identifier les possibilités d'amélioration des procédures pour réduire la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques similaires à celles de l'espèce humaine. De plus, notre projet de recherche repose sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées. En outre, cette espèce présente divers avantages pratiques essentiels justifiant son utilisation comme modèle dans ce type de projet : coûts réduits, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, manipulation aisée et adaptation adéquate aux conditions expérimentales. Les mères seront soumises au stress du 13e au 18e jour de gestation, conformément à la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite, les progénétures utilisées seront âgées d'au moins 6 semaines, car nous visons à utiliser des animaux adultes et matures. De plus, cet âge est communément utilisé dans la littérature pour ces modèles.
Etude du rôle de l’hepcidine et de la voie JAK-STAT dans l’arthrite et de leurs implications dans la réponse thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Pour mesurer le rôle d'une hormone du métabolisme du fer dans l'arthrite, 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 320 d'entre elles reçoivent deux injections dans l'abdomen à 72 heures d'intervalle qui déclenchent une arthrite, 70 sont gavées deux fois par jour pendant dix jours. Le porteur décrit une inflammation et des douleurs articulaires du septième au onzième jour, terme du protocole, puis un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie avant la mise à mort. Il indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % arrête l'expérimentation et déclenche la mise à mort des souris concernées.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique touchant 0,5 à 1% de la population. Cette pathologie dépend du développement d’auto-anticorps et d’un recrutement de cellules inflammatoires dans les articulations, menant à une destruction des os et du cartilage. Des molécules activées par l'inflammation perturbent le métabolisme du fer en régulant l’expression de l’hepcidine. L’hepcidine est un petit peptide circulant, il réduit le fer sanguin en inhibant son absorption par l’intestin et sa libération des tissus de stockage. L’hepcidine est principalement exprimée par le foie, mais des études ont montré une synthèse extra-hépatique de l’hepcidine dans plusieurs organes périphériques. Dans un contexte inflammatoire, l’hepcidine aurait un rôle délétère dans ces tissus puisque localement, elle peut augmenter la rétention du fer toxique et accentuer l’inflammation. En effet, l’hepcidine est une protéine inflammatoire de phase aigue. Cependant, le rôle de l’hepcidine dans la PR, reste à ce jour non élucidé. L’équipe a montré que l’hepcidine est produite au niveau de l’articulation de manière significativement supérieure chez des patients atteints d’arthrite comparés à ceux atteints d’arthrose (maladie articulaire non inflammatoire). Des inhibiteurs d'une des voies de régulation importante de l’hepcidine représentent une nouvelle classe thérapeutique capable de cibler l’inflammation des patients atteints d’arthrite. Ainsi nos objectifs dans ce projet sont d’évaluer d’une part l’implication de l’hepcidine locale dans l’exacerbation de l’inflammation et dans les mécanismes de destruction ostéo-articulaire, et d’autre part, d’évaluer ses consequences sur le métabolisme du fer et sur le développement de la pathologie dans un modèle murin d’arthrite.
Bénéfices attendus
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire touchant les articulations qui affecte actuellement en France 0.5 à 1% de la population, ce qui représente plus de 300 000 personnes. De ce fait, une meilleure compréhension de cette pathologie et le développement de traitements ciblés représentent un enjeu de santé publique majeur. Nos données récentes chez les patients ont montré que l’hepcidine, un peptide qui régule le métabolisme du fer, était présente au niveau de l’articulation en conditions d’arthrite et qu’elle pouvait jouer un rôle important dans la pathologie. Ce projet permettra d’apporter de nombreuses connaissances sur le métabolisme du fer local dans la polyarthrite rhumatoïde, un domaine non étudié à ce jour. Parmi les derniers traitements développés, le filgotinib montre des résultats encourageants chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde modérée à sévère. Ce projet nous permettra d’apporter plus de connaissances concernant les mécanismes d’action de ce traitement dans la polyarthrite rhumatoïde. De plus nous apporterons des résultats sur l’impact de ce traitement sur le métabolisme du fer qui intervient dans de nombreux processus physiologiques.
Procédures
320 animaux subiront 2 injections intrapéritonéales réalisées à 72h d’intervalle. Ce geste, rapide (quelques millisecondes à quelques secondes) et indolore pour les animaux, sera réalisé sur animaux vigiles. 70 animaux seront soumis à des gavages deux fois par jour pendant 10 jours (de J0 à J9). Cette technique réalisée en quelques secondes sera réalisée par des personnes expérimentées sur animaux vigiles. L’ensemble des souris subiront également un prélèvement sanguin intracardiaque (quelques secondes) réalisé sous anesthésie avant leur mort.
Impact sur les animaux
Les animaux qui développeront une arthrite peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires à partir de la mise en place de la pathologie (J7) jusqu’à la fin du protocole expérimental (J11).
Devenir
Notre projet nécessite la récupération de prélèvements moléculaires, cellulaires et tissulaires, ce qui ne nous permet pas de garder les animaux en vie après prélèvements. De plus le projet ne nécessite pas de faire une cinétique sur nos animaux. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale.
Remplacement
Notre projet repose sur des études préliminaires réalisées in vitro ayant montré que l’arthrite modulait le métabolisme du fer et que ce dernier avait un impact sur la pathologie. La polyarthrite rhumatoïde étant un système complexe impliquant de nombreux partenaires cellulaires, les études in vitro ne permettent pas de représenter l’ensemble de la pathologie. De ce fait, le modèle in vivo reste le meilleur modèle permettant d’étudier la polyarthrite rhumatoïde dans le cadre de notre projet. Nos résultats in vitro nous permettent de justifier l’intérêt scientifique de notre projet dans un système concret qu’est le système in vivo.
Réduction
Notre projet a été pensé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Sur un même animal, nous réaliserons des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyse des cellules articulaires et circulantes), et moléculaires (dosages). Les techniques utilisées dans notre projet sont des techniques que nous maitrisons et que nous réalisons régulièrement au laboratoire. Les analyses statistiques seront effectuées à l’aide d'un logiciel adapté. Des tests statistiques pertinents seront utilisés.
Raffinement
Notre projet a été conçu afin de limiter le mal-être des animaux. Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, notre étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale. Afin de limiter le stress des animaux, les souris seront acclimatées pendant une semaine suite à leur arrivée dans la zootechnie et avant de débuter l’expérimentation. De plus, elles seront hébergées avec d’autres souris tout au long du protocole (5 souris par cage) dans des cages d’une superficie de 500 cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Des objets enrichissants seront disposés dans chaque cage pour limiter le stress des animaux. Notre projet nécessite un suivi quotidien du développement de la maladie chez les animaux. De ce fait, nous observerons attentivement les animaux de manière quotidienne et si ces derniers présentent des altérations physiques, des signes de douleur et/ou des comportements anormaux (flan creusé, dos voûté, poils sales, perte de poids, déshydratation, agressivité, prostration…), un analgésique sera administré si necessaire et si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les animaux concernés seront euthanasiés. A la fin de la procédure, avant l’euthanasie des animaux, un prélèvement intracardiaque sera réalisé. Pour réduire la douleur et le stress des animaux générés par cette procédure, les animaux seront anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine et de xylazine.
Choix des espèces
Les modèles murins de polyarthrite rhumatoïde sont couramment utilisés pour étudier la physiopathologie de cette maladie. De plus, le choix d’utiliser des modèles murins a été conforté par le fait que nous possédons de nombreuses connaissances sur ce modèle, nous permettant un plus grand nombre d’analyses possibles. Les souris utilisées seront âgées de 7 à 8 semaines, ce qui est en conformité avec les études publiées utilisant ce modèle murin d’arthrite.
Rôle d’un gène d’une bactérie de la maladie de Lyme sur la réponse inflammatoire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
78 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le derme une injection de Borrelia afzelii, la bactérie de la maladie de Lyme, puis passent cinq anesthésies, une par semaine, pour suivre en imagerie la dissémination des bactéries. La dernière anesthésie ne se termine pas par un réveil : les souris sont tuées pour que soient prélevés peau, articulations, cœur, cerveau, rate et sang. Les retombées annoncées, des molécules ciblant le gène étudié, sont renvoyées au plus long terme, et le porteur indique qu'aucun modèle in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ces interactions.
Objectifs
En 10 ans, l'incidence de la borréliose de Lyme en France a pratiquement doublé, constituant ainsi un problème majeur de santé publique. Cette maladie infectieuse est causée par une bactérie du genre Borrelia, transmises par les tiques, ces dernières agissant comme de véritables vecteurs de ces agents pathogènes en infectant l'homme ou les animaux domestiques lors de leur repas sanguin. En France et en Europe, l'espèce Borrelia afzelii est très fréquente et s'étend. L'objectif principal de ce projet est d'étudier in vivo le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination des bactéries chez la souris et la réponse inflammatoire qui en découle. Ce gène de la bactérie Borrelia permet la production d’une molécule qui leur sert à communiquer entre-elles impactant ainsi leur virulence et leur résistance aux antimicrobiens. Dans notre projet, des souris seront infectées par voie intradermique, pour mimer la voie de pénétration chez l’homme, par Borrelia afzelii qui aura été ou non préalablement modifiées génétiquement pour supprimer l’expression du gène du gène d’intérêt. Les bactéries ayant le gène d'intérêt normal sont appelées sauvage alors que les bactéries où le gène d'intérêt a été supprimé sont dites mutées. A partir de ce point de départ cutané, l’infection sera suivie chez l’animal pendant 28 jours à l’aide d’un système d’imagerie in vivo pour étudier la dissémination des bactéries dans les différents organes et tissus cibles. Au terme de ce suivi, ces tissus cibles de l’infection par Borrelia seront collectés (peau, articulations, tissu cardiaque, système nerveux central, rate, sang) dans le but de quantifier la charge bactérienne ainsi que l’expression des médiateurs de la réponse inflammatoire. La contribution du gène d’intérêt à la dissémination bactérienne et à la réponse inflammatoire développée par les animaux infectés sera mise en évidence par la comparaison des infections entre les souches sauvages et mutées.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination de la bactérie lors de l’infection d’un organisme hôte, sa virulence et la réponse inflammatoire de ce dernier. Ils permettront à plus long terme d’envisager l’utilisation de molécules ciblant le gène d’intérêt pour le traitement de la borréliose de Lyme. Ce champ d’investigation présente un intérêt manifeste, étant donné que l’Homme et les animaux domestiques sont de plus en plus exposés aux tiques et susceptibles d’être infectés par Borrelia afzelli, une espèce qui s’étend en France et en Europe.
Procédures
Tous les animaux (78) seront anesthésiés 5 fois à raison d'une fois par semaine pour faire le suivi de la dissémination bactérienne par imagerie. Lors de la première anesthésie d'une durée de 30 min maximum, les animaux seront rasés au point d'injection et une injection de bactéries dans le derme sera pratiquée avant l'imagerie. Les anesthésies suivantes dureront 10 min environ. Lors de la dernière anesthésie, après l'imagerie, les animaux encore anesthésiés seront mis à mort pour des prélèvements.
Impact sur les animaux
- L’injection pour induire l’anesthésie au début et à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. - L'induction de l'anesthésie gazeuse et le réveil après anesthésie provoque un stress léger et transitoire des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de manière à collecter les différents tissus cibles au sein desquels la bactérie Borrelia est susceptible de se propager à partir du point d'injection cutané. Pour chaque échantillon biologique collecté, la charge bactérienne sera déterminée et les marqueurs de la réponse inflammatoire seront également analysés.
Remplacement
Des expériences in vitro ont été réalisées au préalable pour étudier l’impact de la mutation du gène d’intérêt de Borrelia afzelii sur la croissance bactérienne. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier l’impact de cette délétion du gène d’intérêt sur la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte, ainsi que sur la réponse inflammatoire de l’organisme en réponse à l’infection, qu’il est impossible d’étudier in vitro, compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu. De plus, il n'existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.
Réduction
A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Ainsi, nous proposons d’utiliser 18 animaux par lot en effectuant 3 expériences indépendantes avec 6 souris par lot. Ce découpage en 3 expériences indépendantes permettra d’envisager une démarche de réduction par analyse de tendance en cours de projet, dans le cas où des différences statistiques significatives seraient observées.
Raffinement
Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues (rasage, injection de bactéries, imagerie) avec contrôle de la température par tapis chauffant. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d’une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en œuvre précocement en cas de besoin.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infection bactérienne par la bactérie Borrelia sont fréquemment utilisés pour étudier in vivo la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte et la réponse inflammatoire induite. La réponse inflammatoire de la souris est par ailleurs décrite et étudiée depuis des décennies et autorise des comparaisons avec la réponse inflammatoire humaine. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse inflammatoire de l’hôte en réponse à l’infection et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l’Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système inflammatoire est bien développé.
Régénération de cellules productrices d’insuline chez la souris à partir des cellules intestinales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
480 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une trentaine d'injections, dont celles d'un composé qui provoque le diabète, subit une ou deux transplantations d'organoïdes intestinaux sous anesthésie et 22 prélèvements sanguins, dont un par semaine pendant quatorze semaines. Il s'agit de savoir si des cellules intestinales reprogrammées sécrètent bien de l'insuline dans un organisme vivant, l'application chez les personnes diabétiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que le recours aux animaux est "essentiel" parce que le diabète ne peut pas être modélisé entièrement en laboratoire sans eux, et retient des souris privées de défenses immunitaires pour que les greffes ne soient pas rejetées.
Objectifs
Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules β pancréatiques responsables de la production d'insuline. Cette destruction entraîne des hyperglycémies chroniques, pouvant entraîner de graves complications vasculaires. Nous avons précédemment montré que la surexpression d'un gène appelé Pax4 dans les cellules α productrices de glucagon (une hormone permettant d'augmenter la glycémie) du pancréas induit leur régénération et leur conversion en cellules β fonctionnelles. Ces nouvelles cellules β peuvent produire de l'insuline et rétablir une glycémie normale chez la souris diabétique. Il est intéressant de noter que ce phénomène de conversion a également été observé dans l'intestin. Cependant, il est encore difficile de savoir si l'amélioration de la glycémie chez ces souris provient du pancréas ou de l’intestin. L’objectif de notre étude est donc de comprendre quelle contribution chaque organe apporte à cette amélioration. Pour ce faire, nous allons réaliser des expériences de transplantation et de retrait d’organoïdes intestinaux (structures tridimensionnelles créées à partir de cellules de l’intestin, imitant les propriétés de l’organe) dans un modèle de souris diabétiques. Cela nous permettra d’étudier spécifiquement la fonction des cellules de type β provenant de l'intestin. Pour ce projet, nous aurons besoin de 480 souris. Nous suivrons les principes des 3R pour respecter le bien-être des animaux : Remplacement (nous utilisons des animaux parce que le diabète ne peut pas être modélisé entièrement en laboratoire sans eux); Réduction (nous limiterons le nombre d'animaux au minimum nécessaire et ajusterons nos expériences en fonction des résultats obtenus); Raffinement (nous utiliserons une grille de score pour surveiller le stress et la souffrance des animaux, avec des mesures prises précocement en cas de besoin).
Bénéfices attendus
L’objectif de ces travaux est de montrer, dans un modèle vivant, que les cellules de type β provenant de l’intestin sont capables de produire de l’insuline en réponse à un apport en sucre. Nous cherchons ainsi à démontrer que les cellules de l’intestin, une fois reprogrammées, pourraient devenir une source de cellules de type β capables de produire de l’insuline, et ainsi aider à rétablir une glycémie normale chez les patients atteints de diabète de type 1.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, des transplantations et des retraits d’organoïdes intestinaux seront effectués. Chaque intervention durera environ 20 minutes par animal. Selon le groupe, chaque animal subira une ou deux interventions, espacées de 10 semaines. Avant chaque intervention, les animaux seront mis à jeun pendant une période définie et recevront une anesthésie d’une durée d’environ 30 minutes. Concernant les injections, le protocole prévoit environ 32 administrations par animal sur une période de plusieurs semaines. Chaque injection durera environ 30 secondes. Pour surveiller l’évolution des paramètres biologiques, un prélèvement sanguin de faible volume sera effectué chaque semaine pendant 14 semaines. En fin de procédure, des prélèvements supplémentaires seront réalisés, portant le total à 22 prélèvements, incluant un prélèvement initial. Chaque prélèvement durera environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes utilisées dans cette étude sont particulièrement sensibles aux infections, qu’elles proviennent de germes courants, opportunistes ou de leur propre flore intestinale. Les transplantations et retraits d’organoïdes intestinaux prévus nécessitent une période de jeûne et une anesthésie, ce qui peut entraîner des effets secondaires comme une douleur postopératoire, de légers saignements, un risque d’infection et un stress lié à la manipulation. Pour induire un diabète modéré, les souris recevront, sur plusieurs jours, des injections d’un composé capable de provoquer cette condition. Ces injections peuvent provoquer un inconfort au site d’injection, de légères douleurs et un faible risque de complications. D'autres injections administrées sur plusieurs semaines peuvent également causer un inconfort similaire. À fortes doses, un léger gonflement temporaire peut apparaître, mais cet effet est indolore et sans impact sur la santé ou le comportement des animaux. Un test de tolérance au glucose sera également réalisé. Il nécessitera une période de jeûne suivie d’une injection destinée à augmenter temporairement la glycémie. Après cette injection, plusieurs prélèvements sanguins de faible volume seront effectués à intervalles réguliers. Ces prélèvements peuvent entraîner une douleur légère et passagère ou un inconfort local. Toutefois, le risque d’infection sera minimisé grâce à des procédures strictes d’asepsie.
Devenir
À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Dans cette étude, l’utilisation de modèles animaux est essentielle pour comprendre comment les cellules intestinales reprogrammées en cellule de type β peuvent contribuer à réguler la glycémie. Ce processus est complexe et implique l’interaction de plusieurs organes, ce qui ne peut pas être entièrement reproduit en laboratoire. Bien que nos premières expériences réalisées ex vivo soient encourageantes, seule une étude sur des animaux vivants (in vivo) permet de tester de manière complète et fiable l’efficacité de ces cellules pour traiter le diabète.
Réduction
Nous nous engageons à limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés pour nos recherches. Des analyses préalables ont montré que 15 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des résultats fiables, sans avoir besoin de répéter inutilement les expériences.
Raffinement
Un anesthésique sera utilisé pour réduire le stress et l’anxiété des animaux, tout en garantissant une anesthésie stable pendant les procédures chirurgicales. Avant l’anesthésie, un analgésique sera administré pour prévenir toute douleur pendant et après l’intervention, assurant ainsi un meilleur confort postopératoire. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang prélevée dans la veine caudale. Avant l’incision, une crème analgésique à base de lidocaïne sera appliquée sur l’extrémité de la queue pour assurer une anesthésie locale. La ponction sera réalisée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Pour les injections intrapéritonéales, la zone d’injection sera désinfectée avant et après chaque administration afin de limiter les risques d’infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour minimiser la douleur et les traumatismes tissulaires. Les volumes injectés seront ajustés pour éviter tout inconfort. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive afin de détecter d’éventuels signes de détresse. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront un accès permanent à de l’eau stérilisée et à des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Pendant toute la durée de l’étude, une grille de score sera utilisée pour évaluer objectivement la souffrance éventuelle des animaux, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous cherchons à comprendre si les cellules de type β issues de l’intestin peuvent fonctionner correctement, c’est-à-dire sécréter de l’insuline, dans un organisme vivant. Pour cela, nous utilisons des souris immunodéficientes. Ces souris sont idéales pour ce type de recherche, car elles permettent, d’une part, de greffer des cellules sans risque de rejet et, d’autre part, elles facilitent l’étude de la reprogrammation cellulaire dans un contexte vivant. Cela offre ainsi la possibilité d’évaluer précisément la fonctionnalité des cellules de type β intestinales et de suivre leur évolution à long terme. Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 et 20 semaines. Ces âges correspondent au stade adulte, ce qui est optimal, car les souris à ce stade ne sont plus influencées par les changements métaboliques liés au sevrage. En sélectionnant deux groupes d’âges différents, nous pourrons également examiner si l’âge ou le vieillissement a un impact sur la capacité des cellules intestinales à se régénérer et à produire de l’insuline.
EU1/2 Evaluation par imagerie par résonance magnétique de l’efficacité de traitements innovants dans le cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 080 souris vont être utilisées dans le premier volet du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées pour la greffe d'un fragment tumoral pancréatique, elles reçoivent une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, une radiothérapie quotidienne pendant cinq jours, et cinq séances d'IRM d'une heure trente. Le bénéfice avancé tient à des marqueurs d'imagerie que le porteur juge "facilement transposables" en clinique, quand la perte de poids et la croissance tumorale sont, elles, décrites comme attendues. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du milieu tumoral, et compte l'IRM comme une réduction puisqu'elle évite de tuer des souris à chaque temps d'imagerie.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,
Procédures
Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.
Devenir
A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées
Remplacement
Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.
Choix des espèces
Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.
Mécanisme d’action thérapeutique des antidépresseurs et des anticonvulsivants dans un modèle murin de douleur neuropathique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
12 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune pouvant subir jusqu'à 24 tests comportementaux répartis sur six semaines. Une chirurgie de la cuisse droite leur inflige une douleur neuropathique chronique d'une dizaine de semaines, avec des difficultés à se déplacer pendant les 48 à 72 heures qui suivent. Les souriceaux sont amputés d'un bout de queue avant l'âge de dix jours pour le génotypage, moment où le porteur estime la souffrance moindre. Cette douleur, indique le RNT, "ne peut pas être soulagée, car c'est le sujet de la recherche", face à des traitements dont il espère seulement qu'ils pourraient un jour être mieux ciblés.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique, une douleur causée par des lésions ou des maladies du système nerveux, touchant environ 6 % de la population en France. Actuellement, certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont les meilleures options disponibles, mais ils ne fonctionnent pas pour tout le monde et ont de nombreux effets secondaires. De plus, on comprend mal comment ces médicaments soulagent la douleur neuropathique. Comprendre comment ces médicaments fonctionnent est essentiel pour améliorer les traitements actuels et en développer de nouveaux, plus ciblés. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels les antidépresseurs et les anticonvulsivants soulagent la douleur neuropathique. Nos recherches ont déjà montré que ces traitements ont un effet anti-inflammatoire et influencent le système circadien, qui régule nos cycles biologiques. Nous voulons maintenant explorer plus en détail ces cibles pour améliorer les traitements de la douleur neuropathique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique mais également de trouver de nouvelles cibles thérapeutique. Nous pensons que les résultats de ce projet pourraient non seulement améliorer les traitements actuels en permettant une meilleure utilisation clinique grâce à une meilleure compréhension de leur fonctionnement, mais aussi aider à développer de nouveaux traitements plus ciblés et avec moins d'effets secondaires que ceux existants.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale induisant une douleur chronique pendant environ 10 semaines. La chirurgie, réalisée au niveau de la cuisse droite, durera environ 5 minutes sous anesthésie générale. Certains animaux subiront une injection au niveau thoracique sous anesthésie générale, tandis que d'autres recevront une unique injection au niveau lombaire à 25 jours sous anesthésie gazeuse. Une partie des animaux recevra un traitement (soit administré pendant 3 semaines dans leur eau de boisson, soit par gavage vigile une unique fois). De plus, les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux d'une durée de 3 à 10 minutes chacun (avec un maximum de 24 tests par animal sur une période de 6 semaines), avec un intervalle minimum de 24 heures entre chaque test. Enfin, une biopsie de queue pour génotypage sera réalisée sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux ressentiront une douleur modérée qui ne peut pas être soulagée, car c’est le sujet de la recherche. Une douleur transitoire sera également induite lors de la biopsie de queue pour le génotypage des animaux transgéniques. Après la chirurgie neuropathique, les animaux auront des difficultés à se déplacer pendant 48 à 72 heures. Certains animaux recevront des injections dans la région lombaire. Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer la douleur, ce qui génèrera un léger stress. Les animaux recevront des traitements d’antidépresseurs ou d'anticonvulsivants, soit en dose unique, soit en traitement prolongé, sans nuisances attendues.
Devenir
Les animaux n’ayant pas le génotype attendu seront mis à mort. Les animaux en fin de projet seront également mis à mort pour la réalisation de prélèvements nécessaires aux analyses moléculaires, car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.
Remplacement
Pour notre étude, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Pour analyser l'effet des antidépresseurs ou des anticonvulsivants sur la douleur chronique et les réactions émotionnelles, nous devons observer le comportement des animaux vivants.
Réduction
Nous essayons de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats scientifiques fiables. D'après les études et la variabilité individuelle, chaque groupe expérimental comprendra au maximum 12 souris mâles et 12 femelles. Un calcul statistique a été fait pour s'assurer que nos résultats seront valides. Les animaux passeront par plusieurs tests comportementaux pour réduire leur nombre. Les analyses statistiques finales seront réalisées pour confirmer la validité de nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont logés par groupes de 4 ou 5 pour répondre à leurs besoins sociaux. Nous mettons du coton dans les cages pour qu'ils puissent faire des nids et des barreaux en bois pour qu'ils puissent ronger, ce qui réduit l'agressivité. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Pendant les chirurgies, des anesthésies sont toujours utilisées et un suivi post-chirurgical est effectué. Des points limites sont mises en place pour garantir leur bien-être. Si de nouvelles méthodes moins stressantes ou douloureuses sont découvertes, nous les intégrerons à nos procédures.
Choix des espèces
Le modèle d’animal neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe). En outre, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles, facilitant ainsi l’étude génétique des mécanismes. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés avant d'avoir 10 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits. Pour toutes les autres procédures, étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).