Souris

Anesthésiées pour recevoir dans le cerveau une injection de cellules de glioblastome humain, parfois accompagnée de la pose d'un implant lors d'une intervention d'une heure trente, 580 souris immunodéficientes sont ensuite suivies chaque semaine par IRM. Une partie est transportée sur 95 kilomètres, une heure à l'aller et autant au retour, pour une séance de radiothérapie externe, avant de revenir subir jusqu'à deux actes intracérébraux. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur attend fatigue, stress, mauvaise cicatrisation, perte de poids et prostration. Toutes sont tuées, au motif d'éviter la souffrance liée à la pousse du glioblastome qu'il leur a lui-même implanté.

Objectifs

L’identification récente de nouvelles "cibles", pouvant constituer de véritables moteurs de la maladie cancéreuse fait naitre de nouveaux espoirs de prise en charge du glioblastome (GB), tumeur du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’homme. L'objectif de ce projet est : - dans un premier temps d'étudier la tumorigénicité et la radiorésistance, en utilisant la radiothérapie externe aux rayons X en tant que traitement de référence, des cellules de Glioblastome humaines exprimant ces "cibles" et en parrallèle, de concevoir des thérapies spécifiques dirigés contre ces "cibles" - dans un second temps d'appliquer ces thérapies dans le GB pour anéantir la fonction tumorigénique de ces "cibles". Deux modalités d’administration locorégionale sont envisagées : l’injection directe sur la tumeur en place et l’application d'implants pour une délivrance « long terme » au sein des cavités de résection. Ce projet permettra d’explorer davantage ces "cibles" dans le GB et de qualifier de nouveaux outils afin si possible d’ouvrir la voie à des essais chez l’homme. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (ici référencés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place. Mais également une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavités d'éxérèse dans le glioblastome en synergie avec d'autres thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose d'implants (durée d'environ 1h30) réalsiée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de thérapies spécifiques (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 2. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire à l'EU1. L'un des actes, la radiothérapie externe sera réalisé à l'EU2 et inclut un transport d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure) pour aller à de l'EU1 à l'EU2 et la même durée pour revenir à l'EU1.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe 1. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovantes sur tumeur en place et au travers de bio-implants polymères sur cavité d'exérèse pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des lignées) et celle d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par SiRNA et ASOs sur tumeur en place et sur la cavité d'exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernière validation dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces lignées cellulaires contrôles et exprimant les "cibles" ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu. Les mesures de raffinement pour le transport des animaux incluent : l’évaluation de la santé des animaux pour ne transporter que les animaux en bonne santé, le choix des contenants appropriés, la température et humidité contrôlées (véhicules climatisés), l’alimentation et hydratation, la minimisation du stress et la planification de l’arrivée.

Choix des espèces

Nous étudions la tumorigénicité de "cibles" d'intérêts dans des lignées cellulaires humaines qui nécessite donc que ce modèle soit utilisé chez la souris CB17-SCID. Les souris seront utilisés à 8 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

Une chirurgie stéréotaxique du cerveau pouvant durer une heure trente, puis sept prélèvements de sang à la queue en deux heures pour une partie des animaux : 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement du cerveau. Le porteur, qui cherche à savoir comment les odeurs de nourriture modulent deux populations de neurones de l'hypothalamus, résume les nuisances attendues en une phrase et affirme que toutes les précautions seront prises. Sa grille de points limites décrit pourtant des souris prostrées, au poil hérissé, présentant des signes neurologiques ou perdant jusqu'à 20 % de leur poids, mises à mort par dislocation cervicale si le score persiste plus de quarante-huit heures. Il indique aussi s'entraîner aux gestes chirurgicaux sur des souris nées de croisements sans le génotype recherché, qu'il désigne comme des animaux "produits mais non utilisés".

Objectifs

Dans ce projet nous nous intéressons à la modulation de la régulation de la prise alimentaire par les odeurs. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences menées dans ce projet porteront sur 2 populations de neurones, les neurones sécrétant la pro-opiomélanocortine (POMC) ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire et les neurones exprimant la protéine liée à l'agouti (AgRP) ayant une action opposée. Les premiers s’activent au cours des repas et diminuent leur activité lorsque les réserves énergétiques baissent. Les neurones AgRp auraient une réponse opposée. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments en quantité mais également à des signaux sensoriels associés à la présence de nourriture. Ainsi les neurones de ce réseau peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur capacité à moduler la physiologie des neurones POMC et AgRP. Des aires cérébrales impliquées dans le traitement des informations olfactives, l’amygdale médiale et le cortex piriforme postérieur seront inactivées par une approche chémogénétique pour étudier leur rôle dans cette modulation olfactive de l’hypothalamus.

Bénéfices attendus

Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire par le système olfactif.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée maximale de 1h et 7 prélèvements sanguins seront réalisés à la queue en 2h en fin de procédure. Une autre partie des animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée maximale de 1h30.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront principalement dues à la chirurgie stéréotaxique mais toutes les précautions seront prises pour réduire la douleur ou les infections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux dans le but soit de réaliser les expériences d'électrophysiologie ex vivo soit de vérifier la bonne implantation des fibres optiques.

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal l’effet d’odeurs sur le réseau de neurones hypothalamiques impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude du comportement de recherche de nourriture et de prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. Pour les chirurgies, nous nous entrainons sur des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de parfaire les gestes chirurgicaux et réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes (Analyses de Variance et test posthocs paramétriques).

Raffinement

En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage (excepté après chirurgie où les souris implantées sont 2 à 3 par cage pour diminuer le risque d'arrachement des implantations par bagarre), présence de différents enrichissements (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Nous rédigeons un protocole pour chaque expérimentation, soumis à l'équipe animalerie qui doit le valider avant de démarrer afin d'assurer de bonnes conditions d'expérimentation. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) -Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2. Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.

Choix des espèces

Le projet proposé porte sur l’étude de 2 populations particulières de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler ces populations neuronales afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation des populations neuronales étudiées dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire (comme l’humain). Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Le présent projet s'intéresse aux effets des odeurs sur le cerveau mature. Néanmoins, les expériences d'électrophysiologie fonctionnent mieux avec des souris jeunes. Les procédures expérimentales débuteront donc à l’âge de 5 semaines (mise sous régime gras sucré). Les mesures neurophysiologiques et comportementales seront réalisées chez l'adulte après la 13ème semaine de vie (pour tenir compte des 8 semaines d'exposition au régime alimentaire hypercalorique).

Jusqu'à dix injections d'antidouleur autour d'une seule pose de mini-pompe sous la peau, et une perte de poids pouvant atteindre 15 % dans les cinq jours suivant l'induction de la maladie : 630 souris vont être utilisées sur ce premier site, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une endométriose profonde leur est induite avant que des traceurs d'imagerie ne soient testés sur elles. Le porteur retient des femelles de plus de six semaines et indique que le modèle est bien documenté et que les souris sont compatibles avec ses appareils d'IRM, de scanner et de scintigraphie. Il note qu'une étude préliminaire n'a montré aucun signe de souffrance sur vingt-huit jours, ce que le classement de l'ensemble des procédures en souffrance modérée contredit.

Objectifs

L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Cette maladie entraîne des douleurs importantes (dysménorrhée), et une infertilité. Le diagnostic repose souvent sur de l’imagerie, mais avec une sensibilité à ce jour faible, i.e. l’endométriose n’est pas toujours détectée. Ce projet, qui se déroulera sur deux sites, a pour but de tester de potentiels traceurs d’imagerie dans un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose pour faciliter la détection de l’endométriose. La création du modèle sera faite sur le site 1, pendant que l’imagerie sera faite sur le site 2. En résumé, ce projet a pour objectif de détecter plus facilement les lésions endométriosiques avec des nouveaux traceurs plus sensibles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation diagnostique dans l’endométriose. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies diagnostiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Avant les traitements, les animaux sont randomisés pour former des groupes homogènes en poids. Pour certains animaux, une mini pompe osmotique sera implantée en sous cutanée. La pose sera réalisée sur le site 1 sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques(

Impact sur les animaux

Avec ce modèle nous nous attendons à une douleur modérée et des pertes de poids transitoires qui résultent de l’inflammation générée. La perte de poids maximum attendue est de 15% suite à l’induction de l’endométriose (pendant les 5 premiers jours) puis une prise de poids (Yan et al., 2019 et un premier essai interne). Une étude préliminaire de développement du modèle n’a pas montré de signe de souffrance chez les animaux sur toute la période de l’étude (jusqu’à 28 jours après induction de l’endométriose). La pose de mini pompe sous la peau des animaux nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée. Au début de l’étude, les animaux seront répartis dans différents groupes selon leur poids ce qui peut être source de stress. Le transport entre les deux sites (moins de 1 km) et les sessions d’imageries (durée maximale d’une heure) pourront également être source de léger stress. Enfin, l’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer la spécificité des composés sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Les molécules que nous allons tester dans ce projet ont d’abord été choisies après des essais en laboratoire (in vitro) pour vérifier leur efficacité, qu’elles agissent de façon ciblée et qu’elles ne sont pas dangereuses. Si possible, nous avons également pris en compte leurs propriétés après avoir été testées dans un organisme vivant (in vivo). Cependant, ces tests ne suffisent pas à prédire si elles seront vraiment efficaces dans le corps humain, car il est difficile de reproduire une maladie complexe comme l’endométriose en laboratoire surtout quand plusieurs types de cellules ou tissus sont concernés. Il faudra donc tester les molécules les plus pertinentes dans des modèles animaux, en choisissant ceux qui se rapprochent le plus de la maladie chez la femme. Enfin, pour comprendre comment une molécule se comporte dans le corps, on doit passer par des études sur des animaux puisqu’il est impossible de mimer toutes les fonctions du corps humain sans un organisme vivant.

Réduction

Dans chaque étude les animaux seront répartis en plusieurs groupes en fonction de critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes dépendra de ce que nous souhaiterons comparer. De manière générale il y aura trois groupes, le nombre d’animaux dans chaque groupe sera adapté à la question scientifique et variera entre 3 et 10 animaux par groupe. Ce nombre pourra varier après les premières études en fonction de la variabilité observée. Le nombre d’animaux dans le groupe des donneuses sera ajusté en fonction du nombre total d’animaux dans l’étude et sera généralement entre la moitié et le même nombre que celui du groupe receveuses. Ce nombre pourra être modifié en fonction des résultats observés dans les premières études.

Raffinement

En début d’étude, les animaux seront répartis en groupes uniformes en poids, ce qui peut être à l’origine de changement de groupes. Les animaux seront surveillés afin de détecter des signes d’agressivité ou de stress. Les animaux agressifs seront séparés de leurs congénères et en cas de stress des enrichissements supplémentaires seront apportés. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage. Pour éviter au maximum la souffrance des animaux, des point limites pour les expériences ont été définis et seront mis en place avant le début du travail pratique. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal en cas d’atteinte d’un point limite, dans ce cas un traitement antalgique pourra être administré. En outre, les procédures requises seront effectuées sous anesthésie et des médicaments analgésiques préopératoires et postopératoires seront administrés pour soulager la douleur dans la mesure du possible.

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour les études pharmacologiques nous avons une grande connaissance de leur ADN, de leurs principales fonctions corporelles comme celles des reins et du foie qui sont semblables à celles des humains. De plus, les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. Elles sont également compatibles avec nos appareils d’imagerie (comme l’IRM, le scanner et la scintigraphie) ce qui aide à passer plus facilement de la recherche au traitement chez l’Homme. Nous utiliserons de jeunes souris adultes femelles (âgées de plus de 6 semaines) puisque le modèle d’endométriose profonde est bien établi chez les animaux adultes. .

Tuées à dix semaines de vie, avant que leur état général ne se dégrade, pour analyse du sang, des urines et des organes, 208 souris porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance rénale spontanée vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre semaines, elles subissent une castration chirurgicale, ovariectomie ou orchidectomie, puis reçoivent un gavage cinq jours par semaine et deux implantations sous-cutanées de capsules d'hormones. S'y ajoutent des prises de sang et une mesure de la filtration rénale par injection rétro-orbitaire, capteur fixé sur le dos pendant quarante-cinq minutes. Le porteur écrit avoir retenu la souris parce que la littérature en fait l'espèce "la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse" dans les conditions de la procédure.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale. Le traitement de l’IRC doit être adapté en fonction du sexe car son incidence et sa gravité sont différents entre les femmes et les hommes. L’objectif du projet est d’étudier l’influence du sexe sur le développement et le traitement de l’IRC. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. Le projet sera mené chez des souris Alport chez qui l’IRC se développe spontanément et rapidement (quelques semaines) en raison d’une mutation homozygote (KO) dans un gène essentiel pour la fonction rénale. Des expériences menées au laboratoire ont montré que chez ces souris, l’IRC était plus fort chez les femelles que chez les mâles au même âge. De plus, seules les femelles étaient sensibles à l’effet protecteur contre l’IRC d’un agent pharmacologique : l’AP#1. Dans le present projet, nous souhaitons tester l’hypothèse de l’implication des hormones sexuelles dans ces dimorphismes sexuels. A cette fin, nous étudierons l’impact de la castration [ovariectomie (OVX) ou orquiectomie (ORX)] et des hormones sexuelles exogènes sur le développement de l’IRC et de son traitement par l’AP#1. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes responsables du dimorphisme sexuel dans l'installation et le traitement de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport.

Procédures

Les souris femelles et males seront soumises à une castration (sous anesthésie gazeuse et analgésie, durée maximale d’environ 10 minutes) à l’âge de 4 semaines, puis traitées à un agent pharmacologique par gavage (5 fois par semaine) combiné ou non à des hormones sexuelle (estradiol ou dihydrotestostérone sous forme de capsules implantés sous la peau 2 fois au cours du protocole). Tous les animaux seront soumis à des prises de sang (sous anesthésie gazeuse) et à une mesures de leur fonction rénale (sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée). Toutes les procédures non terminales et la mise à mort des animaux seront sont réalisées dans l’EU1. Dans le cas où le matériel nécessaire et/ou des salles de sacrifice seraient indisponibles à l’EU1, la mise à mort des animaux sera réalisée à l’EU2.

Impact sur les animaux

- Castration chirurgicale (OVX, ORX) et implantation de capsules en sous-cutanée: ces interventions peuvent provoquer de la douleur (administration d’anti-douleur) et du stress et des complications sont possibles (saignement, complications au niveau de la cicatrice). Les problèmes de cicatrisation sont des risques faibles- Gavage et collecte d’urine peuvent induire un léger stress - Prise de sang : les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie - Evaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’insuffisance rénale chronique. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, limitant les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre connaissance du modèle utilisé, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 208 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique non paramétrique ou paramétrique (en fonction de la taille des groupes et de leurs distributions). La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autres test statistique.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés (service de zootechnie agréé par le ministère) par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et les points limites seront soit l’atteinte du score 3 sur l’un des critères, soit l’atteinte du score 2 sans amélioration après 48h de surveillance. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport.

Choix des espèces

L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les chirurgies seront effectuées avant la puberté à l’âge de 4 semaines. A cet âge, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent pas encore d’altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Quel que soit le génotype, les traitements pharmacologiques débuteront à 5 semaines et seront poursuivis jusqu’à 10 semaines (avant détérioration de leur état général), et les animaux seront alors mis à mort.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir jusqu'à sept traitements, six à dix injections d'antidouleur autour de la chirurgie et huit séances d'imagerie sous anesthésie générale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une endométriose profonde leur est induite, avec une perte de poids attendue allant jusqu'à 15 % dans les cinq premiers jours, et une mini-pompe osmotique est implantée sous la peau de certaines d'entre elles. Le bénéfice avancé, de nouvelles stratégies de diagnostic pour une maladie qui touche environ une femme sur dix, est renvoyé au long terme, quand les lésions induites et les passages sous anesthésie sont immédiats.

Objectifs

L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Cette maladie entraîne des douleurs importantes (dysménorrhée), et une infertilité. Le diagnostic repose souvent sur de l’imagerie, mais avec une sensibilité à ce jour faible, i.e. l’endométriose n’est pas toujours détectée. Ce projet, qui se déroulera sur deux sites, a pour but de tester de potentiels traceurs d’imagerie dans un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose pour faciliter la détection de l’endométriose. La création du modèle sera faite sur le site 1, pendant que l’imagerie sera faite sur le site 2. En résumé, ce projet a pour objectif de détecter plus facilement les lésions endométriosiques avec des nouveaux traceurs plus sensibles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation diagnostique dans l’endométriose. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies diagnostiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Avant les traitements, les animaux sont randomisés pour former des groupes homogènes en poids. Pour certains animaux, une mini pompe osmotique sera implantée en sous cutanée. La pose sera réalisée sur le site 1 sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques (

Impact sur les animaux

Avec ce modèle nous nous attendons à une douleur modérée et des pertes de poids transitoires qui résultent de l’inflammation générée. La perte de poids maximum attendue est de 15% suite à l’induction de l’endométriose (pendant les 5 premiers jours) puis une prise de poids. Une étude préliminaire de développement du modèle n’a pas montré de signe de souffrance chez les animaux sur toute la période de l’étude (jusqu’à 28 jours après induction de l’endométriose). La pose de mini pompe sous la peau des animaux nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée. Au début de l’étude, les animaux seront répartis dans différents groupes selon leur poids ce qui peut être source de stress. Le transport entre les deux sites (moins de 1 km) et les sessions d’imageries (durée maximale d’une heure) pourront également être source de léger stress. Enfin, l’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer la spécificité des composés sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Les molécules que nous allons tester dans ce projet ont d’abord été choisies après des essais en laboratoire (in vitro) pour vérifier leur efficacité, qu’elles agissent de façon ciblée et qu’elles ne sont pas dangereuses. Si possible, nous avons également pris en compte leurs propriétés après avoir été testées dans un organisme vivant (in vivo). Cependant, ces tests ne suffisent pas à prédire si elles seront vraiment efficaces dans le corps humain, car il est difficile de reproduire une maladie complexe comme l’endométriose en laboratoire surtout quand plusieurs types de cellules ou tissus sont concernés. Il faudra donc tester les molécules les plus pertinentes dans des modèles animaux, en choisissant ceux qui se rapprochent le plus de la maladie chez la femme. Enfin, pour comprendre comment une molécule se comporte dans le corps, on doit passer par des études sur des animaux puisqu’il est impossible de mimer toutes les fonctions du corps humain sans un organisme vivant.

Réduction

Dans chaque étude les animaux seront répartis en plusieurs groupes en fonction de critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes dépendra de ce que nous souhaiterons comparer. De manière générale il y aura trois groupes, le nombre d’animaux dans chaque groupe sera adapté à la question scientifique et variera entre 3 et 10 animaux par groupe. Ce nombre pourra varier après les premières études en fonction de la variabilité observée. Le nombre d’animaux dans le groupe des donneuses sera ajusté en fonction du nombre total d’animaux dans l’étude et sera généralement entre la moitié et le même nombre que celui du groupe receveuses. Ce nombre pourra être modifié en fonction des résultats observés dans les premières études.

Raffinement

En début d’étude, les animaux seront répartis en groupes uniformes en poids, ce qui peut être à l’origine de changement de groupes. Les animaux seront surveillés afin de détecter des signes d’agressivité ou de stress. Les animaux agressifs seront séparés de leurs congénères et en cas de stress des enrichissements supplémentaires seront apportés. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage. Pour éviter au maximum la souffrance des animaux, des point limites pour les expériences ont été définis et seront mise en place avant le début du travail pratique. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal en cas d’atteinte d’un point limite, dans ce cas un traitement antalgique pourra être administré. En outre, les procédures requises seront effectuées sous anesthésie et des médicaments analgésiques préopératoires et postopératoires seront administrés pour soulager la douleur dans la mesure du possible.

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour les études pharmacologiques nous avons une grande connaissance de leur ADN, de leurs principales fonctions corporelles comme celles des reins et du foie qui sont semblables à celles des humains. De plus, les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. Elles sont également compatibles avec nos appareils d’imagerie (comme l’IRM, le scanner et la scintigraphie) ce qui aide à passer plus facilement de la recherche au traitement chez l’Homme. Nous utiliserons de jeunes souris adultes femelles (âgées de plus de 6 semaines) puisque le modèle d’endométriose profonde est bien établi chez les animaux adultes.