Souris
Étude pilote : mise en place d’un modèle in vivo d’étude de l’impact des cellules sénescentes sur les cellules cancéreuses.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
La lignée de souris retenue est dépourvue de certaines cellules immunitaires, ce qui écarte le rejet des cellules cancéreuses greffées. 50 de ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe tumorale sur les deux flancs, dix d'entre elles se voyant en plus implanter une pastille d'hormones quatre jours plus tôt, et les tumeurs sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur écrit que les animaux sont tués à l'issue parce qu'ils "servent d'individu receveur de greffe" et ne serviront pas à d'autres projets, cette étude pilote visant seulement à choisir le modèle qui sera utilisé ensuite.
Objectifs
La sénescence cellulaire est un programme cellulaire déclenché en réponse à divers stimuli tels que des dommages à l’ADN. Les cellules sénescentes sécrètent un cocktail de molécules appelé SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) qui peut modifier l’architecture de la tumeur et ainsi promouvoir la croissance tumorale, l’évasion immunitaire et les métastases. La compréhension des interactions entre cellules sénescentes, leur SASP et les cellules cancéreuses offre l’opportunité de découvrir de nouvelles thérapies efficaces.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets des cellules sénescentes et les molécules qu’elles sécrètent sur plusieurs types de cancer (cancer du poumon, du sein ou du foie). Cette étude pilote nous permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour la suite de notre étude in vivo.
Procédures
Toutes les souris recevront une greffe de cellules cancéreuses sur chaque flanc (deux au total par animal) qui formeront des tumeurs solides. Chaque greffe sera réalisée sous anesthésie générale qui durera moins de 5 minutes, le temps d'une piqure d'aiguille. Pour les souris receveuses de greffe de cellules de cancer du sein : chaque animal (10 au total) recevra la greffe d'une pastille d'hormones 4 jours avant la greffe de cellules pour que la tumeur se forme. Cette intervention durera moins de 5 minutes sous anesthésie générale. Après une semaine d'acclimatation et trois fois par semaine jusqu'à euthanasie : l'état global de chaque animal sera observé et pesé (10 secondes par pesée), le volume de chaque tumeur sera mesuré avec un pied à coulisse.
Impact sur les animaux
Nous allons greffer des cellules cancéreuses à des souris et le suivre le développement de tumeurs. Le greffes seront réalisées sous anesthésie légère qui durera moins 5 minutes pour chaque animal. Les procédures que vont subir les animaux peuvent causer du stress et de légères douleurs. Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après la greffe ou lorsque la tumeur atteindra une taille limite. Certaines souris (10 au total) recevront la greffe d'une pastille d'hormones qui durera moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale. Cette procédure peut causer du stress et de légères douleurs au niveau de la zone de greffe. Le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive, le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par mesure avec un pied à coulisse et seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude 3 fois par semaine. Les possibles nuisances liées aux gestes et intervention que vont subir les animaux : stress dû à l'anesthésie, douleur au niveau de la zone de greffe de cellules, douleur au niveau de la zone d'incision pour la pastille d'hormone, stress dû à la manipulation régulière.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils servent d'individu receveur de greffe et ne serviront pas pour d'autres projets.
Remplacement
La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas les cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées.
Réduction
Les effectifs de 5 animaux par groupe ont été choisi. Chaque animal recevra deux greffes identiques (une sur chaque flanc), cela nous permet d’obtenir un grand nombre de tumeurs en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Nous obtiendrons une réponse statistiquement significative et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. En raison du déficit immunitaire partiel des souris choisies, des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. La nourriture ansi que l’eau sera desinfecté ou stérilisé. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 3 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas certaines cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées. Nous utiliserons des souris âgées de 5 à 6 semaines. C'est un âge où l'animal est considéré adulte et peut supporter au mieux la greffe de cellules.
Etudes de l’implication de la boucle fronto-pariétale au cours de la mémoire de travail 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées sous anesthésie pour une injection virale dans le cerveau, parfois suivie de la pose d'un implant pendant deux heures trente, les souris sont ensuite isolées en cage individuelle pour treize semaines au plus. Vient la restriction hydrique, huit à douze semaines au maximum, destinée à les motiver à exécuter les tâches, puis trois injections espacées de deux jours et les séances en tête restreinte. 3 000 souris vont être utilisées dans ce premier volet, dont 2 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, pour des enregistrements d'électrophysiologie in situ et des analyses histologiques.
Objectifs
La mémoire de travail est une des fonctions cognitives les plus importantes car elle assure la continuité entre le passé immédiat et les actions à venir en agissant comme carrefour d’échanges entre les informations sensorielles entrantes, la mémoire long-terme et la prise de décisions. Le cortex préfrontal a été proposé comme étant l’unique siège de la mémoire de travail depuis les années 70. Cependant de plus en plus d’études chez les primates non-humains et cliniques mettent en avant la nature distribuée de la mémoire de travail, notamment au niveau du cortex pariétal postérieur dans le réseau fronto-pariétal. Néanmoins, l'interaction fonctionnelle entre ces deux aires corticales au niveau des réseaux neuronaux et cellulaires a été très peu étudiée. Cette méconnaissance est principalement due aux limitations méthodologiques d'enregistrement. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’enregistrement électrophysiologique de large population de neurones permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central. De plus, le développement de nouveaux outils cellulaires permet l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses impliquées spécifiquement durant la mémoire de travail. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts. L’objectif général de notre projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, est d’investiguer l’activité neuronale dans le réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail afin d’élucider son rôle spécifique ainsi que les mécanismes généraux y orchestrant. Ceci pourrait nous éclaircir sur la physiopathologie et le développement de nouvelles cibles thérapeuthiques pour des maladies comme la dépression et les troubles de l’attention où la mémoire de travail est particulièrement affectée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de réseaux et cellulaires qui soutiennent la mémoire de travail et ainsi la manière dont notre cerveau traite cette tâche cognitive. De par les résultats qui en découlent, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aideront donc à mieux comprendre non seulement comment la mise en place de la mémoire de travail s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liés à une altération de cette mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est d’utiliser de nouveaux outils cellulaires pour répondre directement à de nombreuses questions sur les mécanismes cellulaires mis en jeu lors de la mobilisation de la mémoire de travail en faisant le lien entre physiologie synaptique et activité de réseau. Pour cela, nous avons mis en place des approches multidisciplinaires allant de la physiologie synaptique à l’analyse d’activité de réseau. Nos données seront utilisées pour alimenter des réseaux de neurones artificiels pour mettre en lumière les mécanismes fondamentaux de la mémoire de travail afin de mettre en œuvre de meilleures stratégies pour contrebalancer son altération dans des maladies neuropsychiatriques telles que la schizophrénie.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, l’ensemble des animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour infection virale (30 min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour la totalité de l’expérimentation, soit pour une durée de 13 semaines maximum, afin d’éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Le test comportemental requiert le jeûne hydrique de 8-12 semaines maximum pour motiver les animaux à effectuer la tâche. Lors des tests comportementaux de mémoire de travail, réalisés dans le second établissement utilisateur, les animaux subiront 3 injections (30 min/injection, 1 injection/2 jours). Les animaux effectueront différentes taches comportementales se faisant sur 8-12 semaines consécutives maximum. Les animaux subiront 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant euthanasie et 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant l’imagerie intrinsèque.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entraînent des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures.L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations et lors du contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique est également induit lors des contentions et lors de la tâche comportementale en tête restreinte. L'injection dans le péritoine provoque un stress physique dû à la contention et entraîne un effet indésirable de l’injection.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques tel que le t-test, pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien-être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de réflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d’un anti-inflammatoire non stéroïdien est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra une injection quotidienne d’un anti-inflammatoire non stéroïdien jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux mâles et femelles de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Étude des mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets du stress de contrainte et de l’inflammation sur le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques murines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immobilisées deux heures d'affilée sans pouvoir bouger, manger ni boire, et pour certaines sept jours de suite, les souris subissent ensuite une irradiation, une injection imitant une infection virale et une greffe de cellules souches. 1 692 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 116 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur cherche à savoir si l'accumulation d'épisodes de stress vieillit prématurément les cellules souches du sang, et rapproche la contention forcée de la situation des patients placés en isolement protecteur après une greffe. Il écrit que ce temps d'immobilisation "est suffisant pour induire de la peur ou de l'anxiété, sans causer de blessures physiques", et annonce par ailleurs perte de poids, agressivité, anxiété et dépression parmi les effets attendus.
Objectifs
5.5.2. Le processus de formation du sang, appelé hématopoïèse, repose sur les cellules souches hématopoïétiques (CSH), définies par leur capacité à se renouveler et à produire d’autres cellules sanguines. Les CSH résident dans la moelle osseuse, où elles sont protégées des influences extérieures et se trouvent le plus souvent dans un état non prolifératif. En raison du besoin constant de renouvellement du système sanguin, il est essentiel de maintenir le nombre et le potentiel des CSH tout au long de la vie. L’accumulation d’inflammation est l’un des facteurs qui poussent les CSH au repos à proliférer, ce qui altère leurs capacités, un phénomène observé dans le processus de vieillissement. Le vieillissement du système hématopoïétique peut entraîner un dysfonctionnement de l’hématopoïèse et augmenter la susceptibilité à diverses pathologies hématologiques telles que la myélodysplasie, la leucémie et le lymphome. Nos résultats précédents ont montré qu’en inhibant l’inflammation médiée par une protéine, les CSH restent dans un état non prolifératif, conservent mieux leur capacité de différenciation et présentent un effet anti-inflammatoire lié au vieillissement. Nous supposons que le vieillissement physiologique résulte de l’accumulation d’épisodes de stress. Dans ce projet, nous testerons l’hypothèse selon laquelle les signaux de stress provoquent certains changements communs constituant l’identité du vieillissement des cellules souches sanguines. Étant donné que nos souris à faible inflammation montrent des signes réduits de vieillissement, nous examinerons si cette réduction de l’inflammation peut partiellement compenser les effets du stress sur le vieillissement des CSH.
Bénéfices attendus
La croissance constante du nombre de personnes âgées est l'une des principales préoccupations socio-économiques des sociétés occidentales. Cette augmentation de la population âgée s'accompagne d'une hausse des maladies liées à l'âge. Tout au long de leur vie, les individus sont soumis à une accumulation de stress, qu'il soit physique ou mental, ce qui peut conduire au développement de diverses maladies. Cependant, la relation entre ces différents facteurs, le processus de vieillissement et le développement des maladies reste ambiguë. Ce projet vise à éclaircir un aspect de cette problématique, en se concentrant sur l'impact du stress psychologique et des infections sur la prolifération et la différenciation des cellules souches sanguines, ainsi que sur la possibilité que la réduction des niveaux d'inflammation puisse inverser ces effets, apportant ainsi des éléments de compréhension sur la manière de minimiser les effets du vieillissement sur le bien-être.
Procédures
- Stress aigu dû à la contention : 1 fois, 2 heures - Stress chronique lié à la contention : 1 fois, 2 heures par jour pendant 7 jours. - Infection : 1 fois (15 secondes), injections intrapéritonéales (polyI:C ou NaCl 0,9) - 2 irradiations à 4 et 6 heures d'intervalle pour une durée de 5 minutes. - 1 injection intraveineuse de cellules (15 secondes) - 3 analyses de sang à 4, 8 et 12 semaines après l'injection des cellules (15 secondes)
Impact sur les animaux
Un stress intense sera induit par des tests de contrainte aiguë (2 heures) ou chronique (7 x 2 heures), au cours desquels les animaux seront immobilisés et ne pourront ni bouger, ni manger, ni boire. Ce temps minimal est suffisant pour induire de la peur ou de l'anxiété, sans causer de blessures physiques. Effets secondaires liés au stress : perte de poids, agressivité, anxiété, dépression. L’injection, qui imite une infection virale, sera réalisée par injection intrapéritonéale et pourra entraîner des rougeurs ou un léger gonflement au site d’injection. Effets secondaires liés à l’affaiblissement du système immunitaire dans les 24 heures suivant l’irradiation : infections possibles. Réactions inflammatoires (rougeurs et gonflements) au site d’injection intraveineuse des CSH pour la transplantation. Possibilité de rejet de greffe après la transplantation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'isoler et d'étudier les cellules souches hématopoïétiques.
Remplacement
Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les effets du stress en laboratoire, en utilisant des cultures cellulaires. Cependant, cette approche ne permettrait pas d'analyser pleinement les dynamiques complexes de l'hématopoïèse, qui se produisent à l'échelle de tout l'organisme. La réponse au stress psychologique implique une interaction complexe entre le système nerveux, le système endocrinien et le système immunitaire, avec des effets sur l’ensemble du corps. C’est pourquoi il est essentiel d'étudier ces effets chez un être vivant, et plus précisément sur les cellules souches sanguines. L'ajout d'hormones de stress dans une culture cellulaire ne suffit pas à reproduire la physiologie complète d'un organisme vivant. En outre, la différenciation des cellules souches sanguines dépend étroitement de leur environnement dans la moelle osseuse, un facteur impossible à reproduire en dehors du corps. Enfin, le stress par contrainte, comme celui subi par les patients en isolement protecteur après une transplantation, offre une meilleure modélisation de ces effets physiologiques complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé afin de limiter la variation inter-individuelle et d’atteindre un niveau statistiquement validé par une analyse prédictive. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour récupérer la quantité de matériel requise pour l'expérience et obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous réaliserons deux répétitions pour vérifier si la variation entre les conditions est significative. Si les deux premières expériences donnent des résultats identiques, la troisième expérience sera annulée afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de surveiller le bien-être des animaux pendant notre procédure expérimentale et de limiter autant que possible toute douleur et/ou souffrance non nécessaire, nous avons établi une grille d'observation. Cette grille définit les points de terminaison les plus précoces et les plus précis à partir desquels des actions seront entreprises pour limiter toute souffrance et/ou douleur inutile. Elle indique également les mesures que nous prendrons dès l'apparition des premiers signes de douleur. Toutes les souris irradiées et transplantées seront traitées avec des antibiotiques afin de prévenir le risque d'infection. Elles seront contrôlées et notées pendant 5 jours après la transplantation, ainsi que pendant les jours de travail de la deuxième semaine. Au cours des semaines suivantes, elles seront notées deux fois par semaine. En cas de légère fatigue ou de difficulté à se déplacer, de la nourriture hydratée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles idéaux pour étudier la production des cellules sanguines, car leur système est très similaire à celui des humains. Le vieillissement des cellules sanguines chez les souris suit un processus bien défini, et il existe une correspondance d’âge entre les souris et les humains. Des études antérieures ont montré que le stress psychologique peut influencer les signaux chimiques dans le corps et modifier l’expression des gènes chez les souris. Nous supposons donc que le stress, qu’il soit dû à des contraintes physiques ou à une infection, pourrait également affecter les cellules souches responsables de la production des cellules sanguines chez les souris. Cela pourrait nous aider à mieux comprendre les effets du stress sur ces cellules chez les humains. De plus, l'isolement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines est bien défini, et ces cellules peuvent être conservées dans leur niche en maintenant leur quiescence. Les procédures comme la transplantation sont également bien maîtrisées chez les souris, grâce aux protocoles d’irradiation en place. Les animaux utilisés dans l'étude seront répartis en deux groupes : jeunes (4-6 mois) et d'âge moyen (10-14 mois), afin de déterminer si le stress affecte davantage les individus plus âgés. Ces âges correspondent à ceux des jeunes adultes (20-30 ans) et des adultes d'âge moyen (40-45 ans) chez l'humain. Toutes les souris recevant la transplantation auront 3 mois, un âge optimal pour une transplantation efficace. L'expérience de transplantation nous permet d’étudier la capacité des cellules souches hématopoïétiques à s'auto-renouveler et à repeupler la moelle osseuse. Cette étude porte uniquement sur les cellules, indépendamment des souris receveuses. Nous utilisons des animaux âgés de 3 mois pour garantir une transplantation réussie et efficace.
EU2/2 Evaluation par imagerie par résonance magnétique de l’efficacité de traitements innovants dans le cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiées pour recevoir une greffe de tumeur pancréatique, les souris reçoivent ensuite une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis une radiothérapie de cinq minutes par jour pendant cinq jours, avant cinq passages en IRM d'une heure trente sous anesthésie. 1 080 souris vont être utilisées dans ce volet du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre deux établissements, ce que le porteur compte parmi les sources de stress, et développent des tumeurs entraînant une perte de poids. Toutes sont tuées à l'issue pour que les tumeurs soient analysées.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,
Procédures
Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.
Devenir
A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées
Remplacement
Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.
Choix des espèces
Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.
Programme de formation continue pour le personnel de recherche préclinique.
- Formation professionnelle
Les souris sont tuées à la fin de la formation pour que le personnel s'exerce aux méthodes de mise à mort. 300 d'entre elles vont être utilisées sur cinq ans, à raison de quinze tous les trois mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit successivement tous les gestes du programme : gavage quotidien pendant sept jours, injections sous-cutanées et intrapéritonéales tous les trois jours, prélèvement sanguin hebdomadaire sous anesthésie, tests de motricité, de stress et de mémoire chaque semaine. Le programme entretient les compétences techniques d'une équipe de zootechnie de trois personnes, que le porteur prévoit de doubler.
Objectifs
L’objectif principal du projet est de garantir la formation complète et continue du personnel de notre centre de recherche préclinique, dans le respect des normes éthiques et réglementaires, afin d'assurer le bien-être animal lors des expérimentations. Pour ce faire, plusieurs modules de formation sont proposés à l’ensemble du personnel utilisant des animaux à des fins scientifiques. Ces formations, exclusivement axées sur le modèle murin (souris), couvrent les thématiques suivantes : • Techniques de contention : méthodes appropriées pour manipuler les souris en minimisant leur stress. • Administration des substances : Par voie sous-cutanée Par voie intra-péritonéale (dans la cavité péritonéale : ventrale) Par gavage • Pratiques d'anesthésie : utilisation d’un appareil à chambre d’anesthésie (Induction et maintien sous anesthésie). • Prélèvements : Prélèvement sanguin en sous-mandibulaire • Tests de comportement pour évaluer le stress et la locomotion •Mise à mort : formation du personnel sur les méthodes de mise à mort du laboratoire. Ces formations visent à harmoniser les pratiques et à renforcer les compétences techniques du personnel, tout en maintenant un haut niveau d'exigence en matière de bien-être animal.
Bénéfices attendus
La formation en interne du personnel offre plusieurs bénéfices. Elle garantit une meilleure maîtrise des procédures spécifiques à l'établissement, renforçant ainsi la conformité aux réglementations éthiques et légales. En assurant une formation uniforme, elle favorise la réduction du stress et de la variabilité expérimentale, ce qui améliore la qualité des données obtenues. De plus, elle permet un suivi continu et une adaptation rapide aux nouvelles pratiques ou technologies, tout en renforçant l'engagement du personnel envers le bien-être animal. Enfin, elle contribue à créer une culture de responsabilité et de sensibilité éthique au sein de l'organisation.
Procédures
Interventions sur animaux, chaque souris est utilisée pour toutes les interventions : 1) Administration par gavage sur souris vigiles (Durée 15 sec ; 1x tous les jours pendant 7 jours) 2) Contention et administration sous-cutanée et intra-péritonéale (1x tous les 3 jours, 30 sec) sur souris vigiles. 3) Prélèvement sanguin (1x/7 jours, pendant semaines, durée 2 min) sur souris anesthésiées. 4) Tests de comportement pour évaluer la motricité, le stress ou encore la mémoire (1x par semaine, durée 10 min) sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Les techniques utilisées pour manipuler les souris et administrer des substances peuvent leur provoquer un stress important. Ce stress peut être causé par les manipulations répétées, les prises de sang, ainsi que les injections, qui peuvent entraîner des douleurs et des hématomes. Les tests comportementaux et les interventions sur des animaux éveillés génèrent également du stress, parfois prolongé, à cause de l'inconfort et de la peur occasionné Les prélèvements sanguins fréquents, réalisés chaque semaine, peuvent entraîner des effets indésirables comme de la fatigue, des ecchymoses ou une déshydratation. De plus, l'anesthésie peut également provoquer un léger stress. Cependant, nos méthodes d'euthanasie sont spécifiquement conçues pour limiter le stress des animaux.
Devenir
A l’issu des formations les souris seront mises à mort pour permettre au personnel de se former aux méthodes de mise à mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est indispensable pour ces formations, dont l'objectif est précisément de former le personnel à l'expérimentation animale. Cependant, lors des premières étapes de formation, telles que la contention, l'administration sous-cutanée ou l'euthanasie, des modèles mimant l'animal peuvent être utilisés. Cette approche permet au personnel d'acquérir les gestes techniques de base tout en réduisant l'exposition initiale des animaux à des manipulations potentielles, assurant ainsi une meilleure préparation avant les interventions sur des sujets vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet a été estimé sur la base des besoins en formation du personnel. Nous prévoyons l'utilisation de 15 souris tous les trois mois, pendant une période de 5 ans, pour assurer la formation continue et complète de notre équipe. L'équipe de zootechnie actuelle se compose de 3 personnes, et ce nombre devrait doubler au cours des prochaines années. L’estimation repose sur le nombre d'expérimentations et de techniques que le personnel doit maîtriser, ainsi que sur la fréquence des formations pour chaque nouveau projet ou nouvel arrivant. La période de trois mois correspond aux sessions de formation, et cette fréquence pourra être réduite selon les besoins des projets et des nouveaux arrivants. Le nombre de souris par session de formation sera également ajusté en fonction des besoins spécifiques. Chaque animal sera utilisé pour l’ensemble des gestes et procédures nécessaires à la formation, maximisant ainsi l'utilisation de chaque individu dans le cadre des objectifs d’apprentissage.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos formations. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux seront suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. Enfin, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse afin de minimiser le stress induit par cet acte sur les animaux.
Choix des espèces
Notre laboratoire n’est équipé que pour l’hébergement de souris, ainsi l’ensemble des formations dispensées au sein de notre laboratoire sera réalisé chez la souris. Des souris à différents stades de développement (Post-sevrage, juvéniles, adultes, adultes âgés) seront utilisées lors les formations, permettant au personnel de s'exercer aux gestes techniques sur des animaux de tailles variées. Cette approche offre également l'opportunité d'observer et de mieux comprendre les différentes étapes du développement de la souris, favorisant ainsi une adaptation des pratiques en fonction des spécificités liées à chaque stade.
Gestion de lignées de souris génétiquement modifiées par les techniques d’embryologie : congélation, revitalisation et décontamination
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 275 souris femelles reçoivent des injections d'hormones destinées à leur faire produire un maximum d'ovocytes, 875 subissent une chirurgie utérine de quinze minutes sous anesthésie pour recevoir des embryons, et 80 mâles sont vasectomisés. 3 355 souris vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet est présenté comme un moyen de "diminuer considérablement les volumes d'élevage" grâce à la congélation d'embryons et de sperme. Produire ces embryons passe par la mise à mort des femelles donneuses au moment du prélèvement des ovocytes, et par celle des mâles vasectomisés après dix mois d'accouplements stériles, les femelles receveuses étant maintenues en vie jusqu'au sevrage des souriceaux.
Objectifs
Le projet consiste à offrir aux équipes du centre de recherche la possibilité d’arrêter l’élevage de certaines lignées de souris lorsqu’un projet est terminé ou n’est plus soutenu financièrement, de stocker les lignées par cryoconservation, processus qui consiste à congeler et conserver des embryons ou des spermatozoïdes à ultra basse température afin de préserver leur intégrité et de les revitaliser lorsque nécessaire. Ce procédé permet d’assurer la sauvegarde des modèles et de diminuer considérablement les volumes d'élevage. Par ailleurs, l’échange d’embryons ou de spermes congelés est également le moyen de transférer des lignées de souris entre animaleries en s’affranchissant des statuts sanitaires puisque la réimplantation d’embryons permet de se débarrasser d’un certain nombre d’opportunistes que de nombreuses animaleries excluent de leurs élevages. La décontamination de lignées de souris par transfert d’embryons permet également d’intégrer des animaux de statut sanitaire non compatible dans notre animalerie exempte de pathogènes nuisibles pour la souris. Pour cela, nous prévoyons de réaliser en 5 ans au sein de notre animalerie : 1) 50 cryoconservations de lignées par congélation d’embryons et 50 cryoconservations de lignées par congélation de spermes pour la sauvegarde et l’arrêt des élevages. 2) 100 reviviscences de lignées pour les contrôles qualité des congélations d’embryons et de spermes et 25 reviviscences pour le redémarrage des élevages de lignées à partir d’embryons congelés ou à partir de spermes congelés par fécondation in vitro. 3) 50 décontaminations de lignées par transfert d’embryons pour intégrer des animaux de statut sanitaire non compatible dans notre animalerie. Pour le bien-être des animaux, nous respecterons les 5 libertés universelles, ils seront hébergés en groupe, disposeront de nourriture et d’eau ad libitum et d’enrichissements dans les cages. Dans le souci d’éviter et de réduire toute douleur ou souffrance animale, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et sous analgésie. La surveillance quotidienne sera effectuée, elle permettra le contrôle post-opératoire et de déceler d’éventuels signes de souffrance dont l’évaluation à l’aide d’une grille de score conduira à la mise en place d’une médication adaptée.
Bénéfices attendus
Le projet donne la possibilité d’arrêter l’élevage des lignées de souris lorsqu’un projet scientifique est terminé ou n’est plus financé, de stocker les lignées par cryoconservation, processus qui consiste à congeler et conserver des embryons ou des spermatozoïdes à ultra basse température afin de préserver leur intégrité et de les revitaliser lorsque nécessaire. Il permet donc d’assurer la sauvegarde des modèles et de diminuer considérablement les volumes d'élevage. Par ailleurs, l’échange d’embryons ou de spermes congelés et la décontamination par transfert d’embryons sont des moyens de transférer des lignées de souris entre animaleries en s’affranchissant des statuts sanitaires.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à des injections d'hormones, cela concernera 3275 animaux et les injections dureront quelques secondes. Les animaux mâles seront vasectomisés chirurgicalement sous anesthésie générale, cela concernera 80 animaux et l’intervention durera 15 minutes. La réimplantation d’embryons dans l'utérus des femelles receveuses se fera chirurgicalement sous anesthésie générale, cela concernera 875 animaux et l’intervention durera 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les injections d’hormones, anesthésiques et antalgiques, la pose de sutures et d’agrafes lors des étapes de chirurgie constitueront une nuisance pour les animaux et pourrons être source d'angoisse, de douleur ou d’apparition de lésions.
Devenir
Les animaux femelles dont le nombre d'ovules produits est augmenté par des injections d’hormones seront mises à mort pour le prélèvement des ovocytes ou des embryons. Les animaux mâles vasectomisés seront mis en accouplement pour induire un état propice à l'implantation des embryons chez les femelles receveuses pendant 10 mois puis mis à mort. Les animaux femelles dont le cycle ovarien est synchronisé par des injections d'hormones seront accouplées avec les animaux mâles vasectomisés pour induire un état favorable à l'implantation des embryons, puis ré-implantées avec les embryons et maintenues en vie jusqu’au sevrage des souriceaux.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant et entier peut produire les gamètes nécessaires à l’archivage ou à la reviviscence des lignées de souris génétiquement modifiées. Nous proposons de réaliser les contrôles qualité des lots d’embryons et de sperme congelés par des tests in vitro, en nous assurant de la bonne évolution des embryons du stade 2 cellules au stade blastocyste en milieu défini, évitant ainsi l’utilisation d’animaux avec une ré-implantation des embryons dans des femelles receveuses. Afin d’éviter de dupliquer la cryoconservation des lignées de souris génétiquement modifiées, une recherche systématique dans les banques d’archivage de lignées sera réalisée et conditionnera la réalisation de la procédure.
Réduction
Nous arrêterons les congélations d’embryons lorsque nous aurons atteint 250 à 400 embryons (en fonction du nombre de modifications génétiques et de la fertilité des modèles) congelés et validés. Nous privilégierons la congélation de sperme qui nécessite très peu d’animaux pour les lignées avec une seule modification génétique. Les expérimentations de décontamination et de revitalisation seront limitées à l’obtention des animaux porteurs du généotype d'intêret nécessaires à l’établissement des lignées. Afin de réduire le nombre d’animaux femelles à accoupler avec les mâles vasectomisés pour la production de femelles dans un état de l'utérus propice pour la réimplantation des embryons, nous réaliserons une synchronisation du cycle ovarien des femelles à l’aide d'hormones car seules les femelles en ovulation acceptent l'accouplement avec les mâles.
Raffinement
Afin d’éviter les risques de perforations suite aux injections dans le péritoine, nous réaliserons les injections d’hormones en sous-cutané car l’efficacité est équivalente pour la production d'ovocytes chez les animaux femelles. Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes afin d’éviter le stress de l’isolement. Pour la même raison, les animaux mâles devant être maintenus isolés, seront par intermittence hébergés en présence de femelles. Les procédures chirurgicales de vasectomie des mâles et de réimplantation des embryons dans les femelles receveuses seront réalisées sous anesthésie, une analgésie et un suivi seront mis en place. La réimplantation des embryons dans les femelles receveuses se fera dans une seule corne utérine et nécessitant une seule incision. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne minutieuse par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille d’évaluation du bien-être (traitement cutané avec un désinfectant en cas de signes d'infection, pose de nouveaux points de suture ou d'agrafes sous anesthésie générale en cas de perte d'agrafes ou rupture de points de suture externes, analgésie en cas d'apparition de signes de souffrance et sans amélioration, programmation de la mise à mort).
Choix des espèces
Le projet consiste à assurer la sauvegarde des modèles animaux souris et à diminuer les élevages par la cryoconservation mais aussi à décontaminer les lignées de souris pour les transférer entre animaleries de statuts sanitaires différents. La décontamination par transfert d’embryons et la congélation d’embryons nécessitent la production d'un grand nombre d'ovocytes chez les femelles donneuses, leur mise en accouplement et la récupération des embryons après mise à mort. Ces techniques nécessitent également la réimplantation des embryons dans les femelles receveuses dont l'utérus est en état propice obtenu par la mise en accouplement avec des mâles vasectomisés stériles. Le projet nécessite donc le recours aux animaux. Les femelles donneuses d’embryons seront stimulées par injection d’hormones en début de puberté (5 semaines) car c’est l’âge qui permet de recueillir le plus d’ovocytes matures. Les mâles qui seront vasectomisés seront des mâles pubères adultes (6-8 semaines) et donc capables de s’accoupler avec les femelles receveuses. Les femelles receveuses pour les réimplantations d’embryons seront des femelles pubères adultes (6-20 semaines) afin que la réimplantation soit efficace grâce à des cornes utérines fonctionnelles et une bonne imprégnation hormonale après accouplement avec les mâles vasectomisés.
Prélèvements de tissu en routine pour la caractérisation de souris génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
Un à deux millimètres de queue coupés aux ciseaux, dix secondes par animal : ce geste est appliqué à 198 000 souris, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Il sert au génotypage des lignées génétiquement modifiées élevées par le laboratoire pour ses travaux sur les pathologies cardiovasculaires et rénales. Les souris porteuses du génotype recherché passent ensuite dans d'autres projets, celles qui ne l'ont pas sont tuées, et le RNT ne dit pas combien relèvent de chaque cas. Le porteur indique que son établissement développe des organoïdes et des organes sur puce "pas suffisamment au point", et ne justifie nulle part l'effectif de 198 000 animaux.
Objectifs
Nos équipes de recherche s'intéressent aux pathologies cardiovasculaires et rénales. L'objectif direct du projet est de prélever du tissu de souris afin de caractériser génétiquement les souris génétiquement modifiées élevées dans l'animalerie du laboratoire.
Bénéfices attendus
Fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour les projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP d’expérimentation) et caractériser génétiquement des lignées pour optimisation de la gestion des élevages.
Procédures
prélèvement de l'extrémité de la queue (1 à 2 mm) à l'aide d'une paire de ciseaux, 1 fois (exceptionnellement 2), durée 10 secondes. Exceptionnellement, un prélèvement d'oreille (1,5 mm x 1,5 mm).
Impact sur les animaux
douleur et stress légers et de faible durée
Devenir
Les animaux du génotype d'intérêt sont utilisés dans les projets de recherche du laboratoire. Les animaux qui n'ont pas le bon génotype sont mis à mort.
Remplacement
Les équipes du laboratoire développent et utilisent des méthodes alternatives à l'utilisation des animaux (organoides, organes sur puce...) mais qui ne sont pas suffisamment au point ou élaborées pour permettre de s'affranchir complètement de l'animal modèle.
Réduction
La production des souris génétiquement modifiées est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Nous utilisons des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles ». Quand cela est possible nous utilisons des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage. Les élevages des lignées non utilisées sont arrêtées.
Raffinement
Nous utilisons une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions cardiovasculaires et rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. Au sevrage des animaux, entre 3 et 4 semaines de vie. A l'âge adulte si un second prélèvement est nécessaire.
1/2 Essais thérapeutiques préventifs et curatifs dans un modèle murin de la maladie génétique du Cavernomatose cérébrale familiale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 072 souris seront tuées pour que leurs tissus cérébraux soient analysés, et 144 autres, écartées parce qu'elles portent le "mauvais génotype", partiront vers d'autres projets comme animaux témoins. Au total 1 216 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des malformations vasculaires cérébrales reproduisant les angiomes caverneux humains, reçoivent une injection quotidienne pendant trois jours, passent jusqu'à une heure sous anesthésie en imagerie, parfois après induction d'une inflammation, avant une chirurgie de quinze minutes destinée à récupérer les tissus. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut remplacer l'animal vivant dès lors qu'il s'agit d'un "organe entier", et qualifie le passage à la souris d'étape "indispensable".
Objectifs
L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs et a pour objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs capacités à arrêter la formation des lésions vasculaires dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement médicamenteux disponible pour les angiomes caverneux et la suppression par chirurgie n'est pas toujours possible. De plus, le risque de nouveaux saignements dans les années suivant la chirurgie est élevé. Ce projet vise à tester des traitements afin de savoir si ces derniers bloquent la formation des lésions vasculaires dans nos modèles atteints de la maladie. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à la découverte d’un traitement thérapeutique efficace sans effet secondaire.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, seule l’élevage et la reproduction des animaux sera réalisée. Dans le second établissement utilisateur, la distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Puis, l’étude impliquera une injection du traitement de 30 secondes, une fois par jour pendant trois jours suivie d’une imagerie d’une durée de 1h maximum, réalisée sous anesthésie, suite, ou non à l’induction d’une inflammation. Et enfin, une chirurgie d’une durée de 15 minutes sera réalisée afin de récupérer les tissus à analyser.
Impact sur les animaux
La distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Ces résultats permettront d’adapter le protocole d’administration sur les animaux présentant la pathologie. Ces derniers recevront un traitement administré pendant 3 jours consécutifs, pouvant induire une légère douleur, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. L’évolution des lésions et la réponse au traitement sont suivies par imagerie, d’une durée de 1h maximum et peuvent engendrer un léger stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés. Les 144 animaux réutilisés correspondent aux souris de mauvais génotype, qui pourront être réutilisées pour des prélèvements ou d'autres projets comme animaux sauvages.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé ou une espèce autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidat pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animaux est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Tous les croisements réalisés viseront à obtenir exclusivement des animaux viables ayant les mêmes symptômes que les patients avant déclaration de la pathologie.
Choix des espèces
Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Les animaux auront entre 6 et 12 semaines lors des expérimentations afin d’être en conditions semblables à la pathologie humaine étudiée.
Travaux pratiques de physiopathologie – pharmacologie in vivo sur souris.
- Enseignement supérieur
Deux injections, sept ponctions à la veine caudale et six tests comportementaux par séance, exécutés par des étudiants de première année en cours de formation. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue puis congelées pour servir aux séances de dissection. Le porteur indique que les manipulations peuvent provoquer une hypoglycémie "potentiellement sévère" et des effets psychotropes, dans une pièce qu'il décrit lui-même comme bruyante et agitée. La finalité déclarée est l'obtention du certificat d'expérimentation animale de niveau applicateur, que l'arrêté du 1er février 2013 conditionne à la manipulation d'animaux vivants. Le même RNT annonce deux injections par animal, puis précise qu'une seule sera réalisée lors des travaux pratiques.
Objectifs
Les manipulations sont menées dans le cadre des Travaux pratiques du module de physiopathologie - pharmacologie in vivo destinés aux étudiants de 1ère année de Bachelor Universitaire de Technologie (BUT) du département génie biologique parcours Biologie médicale et Biotechnologie (BMB). En effet, les compétences visées dans ce module sont de savoir « mettre en oeuvre les techniques d’expérimentation animale pour des études du métabolisme et de pharmacodynamique ». Les modalités de mise en oeuvre indiquées dans le Programme Pédagogique National (PPN) sont « l’évaluation en TP de l’activité biologique de molécules médicamenteuses de référence sur des modèles in vivo ». De plus, certains étudiants effectuent leur stage dans es établissements utilisateurs d’animaux, ou y postulent pour faire des vacations, une poursuite d’étude en alternance, ou encore, pour un emploi. Il est donc très intéressant pour eux d’avoir des connaissances théoriques et pratiques sur l’expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Cet enseignement permettra aux étudiants de découvrir le monde de l'expérimentation animale, de pouvoir passer le Certificat d’expérimentation animale niveau applicateur et de pouvoir travailler pendant l’année scolaire comme vacataire dans un établissement utilisateur d’animaux. Ce projet permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre du BUT parcours BMB. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence : Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques. Le contenu de ce projet répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques de la Ressource "Physiologie et Expérimentation animale" et de la Situation d’Apprentissage et d’Evaluation (SAé) associée.
Procédures
Les animaux seront observés de façon détaillée avant le début de chaque séance de Travaux pratiques (TP) afin de s’assurer que les animaux sont sans signes cliniques avant chaque séance de TP. Les animaux seront à jeun au maximum 6h. Les animaux vigiles recevront 2 injections. 7 prélèvements au niveau de la veine caudale seront effectués afin d’étudier l’impact de l’insuline ou de la solution de glucose sur la glycémie. Ces manipulations se font sur animaux vigiles avec une légère contention et durent entre 1 à 2 min. Des tests comportementaux pourront être effectués afin d’étudier l’impact de psychotropes sur les souris. 6 tests seront effectués, chacun durant quelques minutes. 6 tests de comportement sont réalisés et la durée des tests est de 30 secondes à 2 minutes maximum. Pendant le reste du TP les étudiants observent les animaux pour observer les signes cliniques éventuels. Lors d'une autre séance, les animaux recevront 2 injections et 5 tests de salivation seront effectués Ces manipulations se font sur animaux vigiles avec une légère contention et durent environ 1 minute par mesure.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés par des étudiants en cours de formation, sous la surveillance d'un ou deux enseignants formés. Cela peut entrainer du stress pour les animaux d'être manipulés par différentes personnes. Les procédures appliquées peuvent entrainer des nuisances (prélèvements répétés, hypoglycémie potentiellement sévère, effets psychotropes, etc.) De plus l’environnement de la pièce de manipulation pourra être bruyant avec de l’agitation. Il est à noter qu’une seule injection par animal sera réalisée lors de TP.
Devenir
A la fin des séances de Travaux pratiques (TP) les animaux sont euthanasiés. Les animaux euthanasiés seront congelés afin d’être utilisé dans d'autres séances de TP de dissection.
Remplacement
Pour cet apprentissage, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux vivants par une autre méthode pour observer et manipuler rats et souris. Les objectifs de ces TP sont d’être capable de mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmacocinétique, d’études du métabolisme ou de pharmacodynamie. Afin de respecter le programme national publié en 2021 par le ministère, un remplacement n’est pas possible dans ce contexte car, les titulaires du diplôme BUT du département génie biologique parcours Biologie médicale et Biotechnologie (BMB) pourront être en mesure d’intervenir en expérimentation animale in vivo et in vitro. De plus, la certification en expérimentation animale « niveau applicateur » ne peut être obtenu qu’après manipulation sur animal vivant (arrêté du 1er fevrier 2013).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au maximum en prenant en compte que la formation s’adresse à de 2 groupes de 15 étudiants. Concernant les séances de TP les étudiants seront 4 pour un enseignant présent. Dans ce TP, afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les étudiants sont regroupés par binôme ou quadrinôme. De plus, les animaux morts sont utilisés ensuite pour des séances de dissections en travaux pratiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages standards aux normes européennes, avec enrichissement. Le bienêtre des animaux est suivi quotidiennement. Sous la surveillance d’un enseignant ou d’un responsable de l’animalerie, les étudiants, en petit groupe, s’assurent du bien-être des animaux chaque jour (vérification de la nourriture, eau), des friandises adaptées peuvent être données (si cela n’impacte pas les TP), des bouts de bois, pour ronger et du papier (pour les nids) sont mis dans les cages. Il est demandé aux étudiants de ne pas mettre de parfum, ou déodorants forts, d’éteindre leurs téléphones et de chuchoter lorsqu’ils sont dans l’animalerie. Des points limites adaptés sont également mis en place lors de la manipulation, notamment en étudiant le comportement de l’animal. Un anesthésique local (Lidocaïne) sera utilisé avant les prélèvements au niveau de la queue de l’animal. Une attention particulière sera apportée aux souris lors de ce TP surtout pour les animaux ayant reçu une injection d’insuline car une diminution brutale de la glycémie peut être provoquée entrainant une hypothermie et donc des tapis chauffants seront utilisés lors de ces TP afin d’éviter les hypothermies. Des friandises seront données aux animaux à la fin des TP.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale. Ce sont donc des animaux sur lesquels les étudiants seront susceptibles de travailler. De plus, la souris est un modèle qui est adapté à ce type d’expérience : en effet, les mesures réalisées ici sont directement extrapolables à l’homme, permettant ainsi d’illustrer et approfondir les enseignements de physiologie. Les animaux seront des adultes, car il n’y a pas besoin de condition d’âge particulière, et que la taille est ainsi suffisante.
Etude du rôle des convertases, Furin et PC7 dans le recrutement des cellules du sytème immunitaire par les tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 609 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 912 d'entre elles sont tatouées aux phalanges puis amputées de l'extrémité de la queue pour le génotypage, 1 680 reçoivent une implantation de cellules d'adénocarcinome suivie de chimiothérapie trois fois par semaine et d'irradiations, et 1 008 subissent une chirurgie de vingt minutes créant des métastases hépatiques. Le porteur écrit que la croissance tumorale peut provoquer perte d'appétit, perte de poids et signes moteurs, quand le débouché thérapeutique évoqué se limite à des inhibiteurs qui "pourraient" être utilisés un jour. Il conclut que la souris reste "indispensable" pour observer ces enzymes dans un "organisme entier proche de l'homme".
Objectifs
Le système immunitaire joue un rôle important dans la mise en place et le développement des cancers. Notre projet vise à déterminer le rôle des protéines convertases (PCs) dans le recrutement du système immunitaire par les tumeurs. Les PCs sont des enzymes dont les quantités sont fortement augmentées dans de nombreux cancers et qui sont impliquées dans la progression des tumeurs et l’établissement des métastases. De plus, dans le cancer du colon les PCs sont nécessaires à la régulation de l’activité des cellules immunitaires que sont les lymphocytes T. Dans ce projet, nous souhaitons identifier précisément quelles convertases jouent un rôle dans le recrutement des cellules du système immunitaire par les tumeurs, nos candidats sont la Furine et PC7. Pour mettre en œuvre ce projet, nous créerons une lignée de souris génétiquement modifiées qui n’exprimeront ni PC7, ni la Furine dans les lymphocytes T. Ce nouveau modèle nous permettra de définir le rôle de PC7 et de la Furine dans la progression tumorale et l'adaptation des cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Les protéines sont des molécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes. Lors de leur synthèse, elles peuvent nécessiter des modifications pour devenir actives biologiquement. Ces modifications sont mises en œuvre par les PCs et jouent un rôle important dans dans l’acquisition des caractéristiques cancéreuses des cellules, et dans l'adaptation du système immunitaire. Ce projet amènera à une meilleure compréhension du rôle des PCs , PC7 et Furine dans l'établissement des tumeurs. Nous nous intéressons plus particulièrement à ces deux convertases car des inhibiteurs spécifiques pourraient être utilisés comme de nouvelles thérapies ciblées seuls ou en combinaison avec des agents déjà existants et/ou la radiothérapie pour le traitement de certains cancers.
Procédures
2912 animaux seront soumis à deux gestes invasifs consécutifs pour être tatoués et génotypés par le personnel qualifié et expérimenté de notre établissement utilisateur: 1/ Identification par tatouage digital (réalisé une fois et durée de quelques secondes) et 2/ biopsie de la queue (réalisé une fois et durée de quelques secondes). Pour l'étude de la prolifération tumorale nous implanterons des cellules tumorales d'adenocarcinomes chez 1680 animaux. Les injections auront lieu une fois et durent 5 minutes. Les traitements avec la chimiothérapie seront faits 3 fois par semaine et durent moins d'une minute. Les traitements par irradiation des tumeurs durent entre 3 et 15 minutes et sont répétées deux fois à deux jours d'intervalle. Enfin le modèle de métastases hépatiques nécessitera une chirurgie réalisée sur 1008 animaux en 20 minutes par souris, une seule chirurgie par animal. Le suivi des tumeurs par bioluminescence dure entre 6 et 25 minutes, une à deux fois par semaine. Un prélèvement de sang par animal sera réalisé sous anesthésie et analgésie et dure en moyenne 15 min.
Impact sur les animaux
Le génotypage est composé de deux actes techniques invasifs, le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets et la biopsie de la queue qui consiste en un prélèvement de l'extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L'animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Le développement de tumeurs ou de metastases hépatiques peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes physiques ou moteurs. L'irradiation peut induire des irritations locales pour les tumeurs sous-cutanées. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge et des mesures compensatoires seront appliquées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les tumeurs et les organes seront collectés pour analyses immunohistochimiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Des tests sur des cellules tumorales et des cellules immunitaires en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de l'inhibition de PC7 et de la Furine. Nous avons aussi utilisés des organoides pour intégrer une structure tridimensionnelle à nos cultures de cellules tumorales ainsi que des co-cultures (cellules tumorales et cellules immunitaires). Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action des PCs dans un organisme entier proche de l'homme, incluant lors du développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques, le système vasculaire et le système immunitaire, qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées pour comparer 4 groupes ( WT, Furin Fl/Fl*CD4-Cre+, PC7 KO/KO et PC7 KO/KO*Furin Fl/Fl*CD4-Cre+). Afin de limiter le nombre d'animaux, tous les individus porteurs d'un génotype d'intérêt seront utilisés dans nos expériences de prolifération tumorale mais aussi pour des approches in vitro réalisées à partir de prélèvements post-motem (comme par exemple l'isolation des cellules immunitaires à partir de la rate ou de la tumeur). Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre une puissance statistique satisfaisante qui correspond à 14 souris ( 7 mâles et 7 femelles) pour l’analyse de survie par le test de Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prévoyons de répéter 3 fois les expériences, avec des lots de 14 souris pour les implantations sous-cutanées. Le sexe des animaux n'ayant pas d'influence sur nos résultats, nous utiliserons des animaux femelles et mâles
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos reproductions et expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Les animaux sont hébérgés dans des cages aux normes (au minimum 2 par cage et 5 au maximum) suivant l'âge et le poids des animaux. Des enrichissements (maisons rouges, jouets) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, un suivi attentif quotidien des animaux est fait par du personnel compétent et formé, weekend, vacances et jours fériés compris. Les animaux en expérimentation sont pesés un fois par semaine, dès qu'une perte de poids est observée, du nursing et une pesée quotidienne est mis en place. Une fiche de suivie des animaux est remplie par le personnel de l'animalerie. Des mesures compensatoires sont prises si nécessaires. En revanche si l'état de l'animal malgré les mesures compensatoires ne s'améliore pas, le responsable de projet décidera de l'arrêt de l'expérience pour cet animal. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des injections d'analgésique pourront être réalisées et renouvelées en fonction de la souffrance de l'animal. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant l’opération, et lors de la phase de réveil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. Les séquences peptidiques des convertases sont bien conservées entre l'homme et la souris. De plus, l’organisation du système vasculaire de la souris et sa relation avec le microenvironnement tumoral sont très proches de ceux observés chez l’homme. Enfin, nous avons des modèles transgéniques disponibles uniquement chez la souris pour lesquels nous pourrons utiliser des lignées tumorales syngéniques. Les souris seront tatouées et génotypées entre 7 et 12 jours après leur naissance. Dans les expériences d’implantation de cellules tumorales, les souris auront entre 14 et 16 semaines . Ces adultes présentent de bonnes réponses immunitaires et sont faciles à manipuler.
Etudes de l’implication de la boucle fronto-pariétale au cours de la mémoire de travail 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Craniotomie, injection stéréotaxique dans le cerveau, pose d'un implant crânien de deux heures trente : 3 000 souris subissent ces interventions, 2 880 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Les animaux implantés vivent seuls pendant treize semaines au maximum pour éviter la perte de l'implant, et une restriction hydrique pouvant durer huit à douze semaines les motive à exécuter la tâche. L'objectif déclaré est de décrire l'activité du réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail, les retombées annoncées sur la schizophrénie étant renvoyées à de futures stratégies. Le RNT parle de "différentes tâches comportementales" en tête restreinte, sans jamais dire lesquelles.
Objectifs
La mémoire de travail est une des fonctions cognitives les plus importantes car elle assure la continuité entre le passé immédiat et les actions à venir en agissant comme carrefour d’échanges entre les informations sensorielles entrantes, la mémoire long-terme et la prise de décisions. Le cortex préfrontal a été proposé comme étant l’unique siège de la mémoire de travail depuis les années 70. Cependant de plus en plus d’études chez les primates non-humains et cliniques mettent en avant la nature distribuée de la mémoire de travail, notamment au niveau du cortex pariétal postérieur dans le réseau fronto-pariétal. Néanmoins, l'interaction fonctionnelle entre ces deux aires corticales au niveau des réseaux neuronaux et cellulaires a été très peu étudiée. Cette méconnaissance est principalement due aux limitations méthodologiques d'enregistrement. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’enregistrement électrophysiologique de large population de neurones permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central. De plus, le développement de nouveaux outils cellulaires permet l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses impliquées spécifiquement durant la mémoire de travail. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts. L’objectif général de notre projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, est d’investiguer l’activité neuronale dans le réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail afin d’élucider son rôle spécifique ainsi que les mécanismes généraux y orchestrant. Ceci pourrait nous éclaircir sur la physiopathologie et le développement de nouvelles cibles thérapeuthiques pour des maladies comme la dépression et les troubles de l’attention où la mémoire de travail est particulièrement affectée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de réseaux et cellulaires qui soutiennent la mémoire de travail et ainsi la manière dont notre cerveau traite cette tâche cognitive. De par les résultats qui en découlent, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aideront donc à mieux comprendre non seulement comment la mise en place de la mémoire de travail s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liés à une altération de cette mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est d’utiliser de nouveaux outils cellulaires pour répondre directement à de nombreuses questions sur les mécanismes cellulaires mis en jeu lors de la mobilisation de la mémoire de travail en faisant le lien entre physiologie synaptique et activité de réseau. Pour cela, nous avons mis en place des approches multidisciplinaires allant de la physiologie synaptique à l’analyse d’activité de réseau. Nos données seront utilisées pour alimenter des réseaux de neurones artificiels pour mettre en lumière les mécanismes fondamentaux de la mémoire de travail afin de mettre en œuvre de meilleures stratégies pour contrebalancer son altération dans des maladies neuropsychiatriques telles que la schizophrénie.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, l’ensemble des animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour infection virale (30 min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour la totalité de l’expérimentation, soit pour une durée de 13 semaines maximum, afin d’éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Le test comportemental requiert le jeûne hydrique de 8-12 semaines maximum pour motiver les animaux à effectuer la tâche. Lors des tests comportementaux de mémoire de travail, réalisés dans le second établissement utilisateur, les animaux subiront 3 injections (30 min/injection, 1 injection/2 jours). Les animaux effectueront différentes taches comportementales se faisant sur 8-12 semaines consécutives maximum. Les animaux subiront 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant euthanasie et 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant l’imagerie intrinsèque.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entraînent des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures.L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations et lors du contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique est également induit lors des contentions et lors de la tâche comportementale en tête restreinte. L'injection dans le péritoine provoque un stress physique dû à la contention et entraîne un effet indésirable de l’injection.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques tel que le t-test, pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien-être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de réflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d’un anti-inflammatoire non stéroïdien est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra une injection quotidienne d’un anti-inflammatoire non stéroïdien jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux mâles et femelles de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Optimisation et évaluation de l’efficacité d’une approche de thérapie cellulaire chez la souris.1/2. Amendement 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Les autorités réglementaires exigent des données pharmacologiques avant tout essai clinique, et c'est ce qui conduit à utiliser 1 048 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation sur animal vigile, des injections dans le sinus orbital sous anesthésie, dans la veine caudale en tube de contention et dans le péritoine, un gavage quotidien pendant trois semaines, et pour 400 d'entre elles une greffe de cellules tumorales sous la peau suivie de mesures au pied à coulisse trois fois par semaine. La mise à mort sert à prélever les organes. Le porteur affirme que ces études précliniques "ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro", et décrit le système immuno-hématologique de la souris comme "très similaire" à celui de l'humain.
Objectifs
La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques. Le projet se déroulera sur deux EU différentes.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle. AMENDEMENT : Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des progéniteurs lymphoïdes qui pourront avoir un éventuel effet antitumoral.
Procédures
Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois (EU1). 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris (EU1) 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera
Impact sur les animaux
De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal. AMENDEMENT : L’injection sous-cutanée de tumeurs peut entrainer un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. La manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. Le transport entre les deux animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.
Remplacement
Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.
Réduction
La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles). AMENDEMENT : L’utilisation de l’imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort sequentielle d’animaux.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal. AMENDEMENT : Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Lors du transfert, les souris seront transférées dans des boites de transport avec de l’enrichissement et de la nourriture, les 2 établissements étant sur le même palier. Des mesures analgésiques adaptées seront mises en œuvre avec le vétérinaire pour limiter la douleur.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.