Souris
Etude d’une protéine associée au recepteur sensible au calcium sur la formation de l’émail chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Pour observer la formation de l'émail dentaire, des germes de dents sont prélevés sur des souriceaux mutants puis implantés sous la capsule rénale de souris adultes. 81 souris vont être utilisées, dont 54 souriceaux tués sans réveil et 27 receveuses opérées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'intervention chirurgicale dure une vingtaine de minutes, précédée d'une injection d'analgésique puis d'une anesthésie. Les souriceaux donneurs sont tués à la naissance pour récupérer leurs germes dentaires, les receveuses deux mois plus tard pour récupérer les dents formées dans leur rein.
Objectifs
L'amélogenèse imparfaite (AI) constitue un groupe de maladies génétiques rares du développement affectant la structure de l'émail de toutes les dents. C’est le cas de l'hypercalcémie hypocalciurie familiale (FHH) qui est une maladie génétiquement hétérogène, qui provoque divers troubles du métabolisme minéral. L’objectif de cette recherche est d’étudier le rôle direct ou indirect des gènes causant la FHH dans l’amélogenèse en implantant des germes dentaires des souriceaux mutants dans la capsule rénale de souris adultes sauvages. Ce modèle, déjà bien établi dans la littérature, permet la formation complète d’une dent. Ceci permettra d’étudier tous les stades de l’amélogenèse dans un environnement nourricier contrôlé et idéal.
Bénéfices attendus
Pour évaluer le rôle direct de l’absence de ces gènes sur la formation de l’émail, des germes dentaires de souriceaux dont les gènes d’intérêt ont été invalidés seront implantés dans la capsule rénale de souris sauvages afin d’étudier tous les stades de l’amélogenèse, les germes continuant à se développer après implantation dans le rein. La capsule rénale est un compartiment bien isolé, accessible, richement vascularisé qui permet donc un afflux de nutriments et de minéraux qui va donc favoriser le développement et la minéralisation des germes inclus. Cette étude pionnière apportera des données essentielles sur la compréhension de l’axe du calcium dans l’amélogenèse. Les retombées de cette étude seront à la fois scientifiques mais aussi de manière plus générale apporteront des données nouvelles sur la formation de l’émail et ses dysfonctionnements. Il est à savoir qu’un nombre considérable de patients avec des maladies rares comme l’hypercalcémie familiale mais aussi des maladies chroniques comme la carie dentaire présentent des perturbations au niveau de l’émail. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’amélogenèse devrait apporter un bénéfice réel à la fois pour la connaissance scientifique et pour la population car cela pourrait ouvrir des pistes vers de nouvelles thérapies à la fois préventives et interventionnelles pour ce type de maladies.
Procédures
Les souris receveuses (27 au total) recevront des injections sous cutanées d'analgésiques 30 minutes avant la chirurgie et d'anesthésiques juste avant la procédure chirurgicale ce qui nécessite leur préhension et cause un stress léger et une légère douleur au point d’injection. La procédure chirurgicale est d'une durée d'environ 20 min.
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales mises en œuvres causent un stress et une douleur moyenne sur une courte durée. La procédure est bien maîtrisée au laboratoire et les souris recupèrent rapidement un comportement normal.
Devenir
Les souriceaux donneurs sont mis à mort à la naissance pour récupérer les germes dentaires. Les souris receveuses sont mises à mort 2 mois après le début de l’expérience pour collecter les germes dentaires dans la capsule rénale.
Remplacement
La formation d’une dent est un processus physiologique complexe qui fait intervenir différents types cellulaires et de nombreux facteurs de croissance qui n’ont pas tous été identifiés. Par conséquent seul un modèle animal intégré permet à l’heure actuelle ce développement et il n’y a pas de méthode alternative de remplacement.
Réduction
Des test statistiques seront mis en oeuvre afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
Les analyses se feront sous anesthésie générale avec une médication antidouleur systématique en pré et également post-opératoire. Des tapis chauffants seront utilisés pendant la chirurgie et en phase de réveil. Un gel ophtalmique est utilisé pendant la chirurgie. Le suivi régulier des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur. Les souris seront maintenues dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
L’étude de la dent chez la souris est aujourd’hui bien documentée et permet d’appliquer de nombreuses techniques expérimentales pour l’analyse de son développement. Des souris de 3 mois seront utilisées car à cet âge, leurs reins sont assez développés pour pouvoir réaliser les implantations de germe. Les souriceaux génétiquement modifiés seront utilisés dans les premiers jours après la naissance ce qui antérieur à la formation de l'émail dentaire des germes des molaires.
Etude de signaux influant le développement du système immunitaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 84 un niveau léger. Elles reçoivent des injections dans la veine et dans le ventre, une irradiation de dix minutes au maximum sous anesthésie profonde, une greffe de moelle osseuse et des prélèvements de sang. Le porteur signale une immunodéficience transitoire et une dépigmentation après l'irradiation, cette dernière étant qualifiée de sans conséquence sur le bien-être de l'animal. Il conclut que la maturation du système immunitaire ne peut s'étudier que sur un "organisme entier".
Objectifs
Les cellules immunitaires nous protègent des infections et de l'émergence de tumeurs. Cependant, pour être pleinement efficace, elles doivent se maturer progressivement durant les périodes d'homéostasie, c'est-à-dire lorsque l'organisme est en équilibre, en l'absence d'infections ou de pathologies. Notre objectif est de définir les mécanismes qui favorisent un développement optimal des cellules immunitaires pendant ces périodes d'homéostasie où tout va bien.
Bénéfices attendus
En identifiant les facteurs contribuant au développement correct des cellules immunitaires en l’absence de pathologie, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies préventives contre diverses infections. Il pourrait aussi permettre d’augmenter les réponses immunitaires chez des populations à risque.
Procédures
- Injection dans la veine dans des souris sous anesthésie gazeuse (1 fois 2min/souris) - Injections dans le ventre (1 fois 20s/souris) - Injection dans le ventre (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie et application d'analgésie locale ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections ; ii) le stress généré par l’anesthésie et les contentions lors des prises de poids; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. Légère perte de poids transitoire suite à l’irradiation. - Immunodéficience transitoire due à l’irradiation. Dépigmentation du fait de l’irradiation sans conséquence sur le bien-être de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. Nous préléverons alors différents tissus pour établir différentes analyses.
Remplacement
La maturation du système immunitaire est un processus complexe qui implique l'interaction de divers acteurs, tels que le microbiote (la flore microbienne), le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif, et ne peut actuellement être étudiée qu'à l'échelle de l'organisme entier. Par ailleurs, nous avons renforcé nos hypothèses et éliminé un grand nombre de pistes en effectuant une recherche bibliographique exhaustive et en réalisant divers tests in vitro, réduisant ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet.
Réduction
Nous avons toute l’expertise technique. Ainsi, il n’y a pas de mises au point nécessaires. Le nombre de souris proposées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Ce nombre a été calculé à partir d’outil statistique. Ce nombre peut encore être réduit si les tests de prises de décisions (préliminaires) ne valident pas nos hypothèses avancées. Utilisation de technologie de pointe nous permettant de faire certaines analyses de façon combinée réduisant significativement le nombre d’animaux utilisés. Nous utilisons également à la fois les souris mâles et femelles.
Raffinement
En complément des suivis réglementaires quotidiens des zootechniciens, un suivi 5 fois par semaine sera fait par les expérimentateurs permettant un repérage rapide des premiers signes de mal-être. – Des points limites définis et précoces nous permettant d’agir rapidement ont été mis en place. – Hébergement et manipulation des souris dans un environnement stérile - Anesthésie des animaux lors de manipulations invasives comme l’injection dans la veine et ainsi réduire le stress de l’animal et éviter des mouvements de l’animal pouvant le blesser. – Pour favoriser le bien-être des animaux, leur environnement sera enrichi de nids en cartons pour se cacher et de bâtonnets en coton pour créer un nid. - Après l'irradiation, une alimentation plus souple, comprenant des croquettes humidifiées et du gel hydratant, sera mise à disposition dans les cages pendant quelques jours pour faciliter la récupération des animaux. - Une anesthésie locale sera administrée pour réduire la douleur résultant de l’injection ou de la prise de sang. - Pas d’isolement des souris pour respecter au tant que faire ce peu le comportement social des souris.
Choix des espèces
L'utilisation du modèle souris se justifie car nous disposons de toute l’expertise scientifique et technique. Les souris sont un modèle très utilisé en recherche pour adresser les différentes branches du système immunitaire et ainsi la communauté scientifique dispose de divers modèles génétiques et outils scientifiques nous permettant d’adresser ce projet le plus efficacement possible. Le stade adulte (souris 2 mois) est choisi de façon à avoir un système immunitaire mature.
Mécanismes impliqués dans la persistance des cellules immunes, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un virus est inoculé par inhalation, trente secondes par narine, sur des souris placées sous anesthésie profonde. 325 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un quart d'entre elles subit jusqu'à quinze prélèvements sanguins, à raison d'un par mois, certaines étant gardées jusqu'à quinze mois après l'infection. Le virus utilisé n'est jamais nommé, et le porteur range parmi les effets attendus les blessures de bagarre qui cicatrisent mal chez les animaux âgés.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la vaccination permet, en moyenne, d’éviter chaque année 3,5 à 5 millions de décès par an. La vaccination est basée sur la persistance d’une protection immunitaire contre un pathogène donné mais les mécanismes qui assurent le maintien d’une telle protection sur le long terme ne sont pas encore totalement compris. De même, la persistance d'une protection immunitaire est à la base de la réussite, sur le long terme, des immunothérapies anti-cancéreuses actuelles. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui assurent la préservation d’une protection immunitaire, en fonction du temps.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant la persistance de l'immunité après une infection virale, et d’identifier potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques pour la favoriser et améliorer les vaccins. Ces résultats serviront également à l’amélioration des immunothérapies anti-cancéreuses, afin d’éviter les rechutes chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par animal – durée 30 secondes ; - Injection (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes; - Infection par inhalation (sous anesthésie profonde) - 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine; Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie gazeuse) : 1 fois par mois pendant toute la durée de la procédure (jusqu’à 15 prélèvements pour ¼ des animaux) - durée 30 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont: i) une douleur modérée et un stress généré par les prélèvements sanguins; ii) une légère douleur générée par les injections (pour l’anesthésie profonde); iii) le stress généré par la procédure d’inoculation du virus par inhalation; iv) une perte de poids transitoire générée par l'infection virale qui sera contrôlée; v) un léger délai de cicatrisation en cas de blessure sur des animaux agés, qui pourrait survenir suite à une bagarre; vi) des signes cliniques liés à l’âge tel que une perte de poids et/ou une diminution de la température corporelle
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes et effectuer des analyses cellulaires et moléculaires dans le but de comprendre les mécanismes qui assurent le maintien d’une protection immunitaire sur le long terme.
Remplacement
La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, le maintien d’une protection immunitaire sur le long terme dépend de signaux reçus dans différents endroits de l’organismes qui ne peuvent être récapitulés in vitro.
Réduction
Nous avons calculé par des approches statistiques, le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans toutefois compromettre une analyse robuste des résultats. De plus, une optimisation des protocoles a été réalisée in vitro en amont, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour les analyses moléculaires (qui demandent beaucoup de matériel cellulaire).
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections par inhalation seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue jusqu’au réveil de l’animal; ii) les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse après application d’un anestésique local; iv) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux; v) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. En cas d'apparition de signes de douleur modérée, les animaux recevront un traitement anti-douleur pour les soulager (par exemple le doliprane).
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur le maintien d’une protection immunitaire à long terme. De plus, la souris est une espèce dans laquelle un grand nombre d'outils sont disponibles, permettant des analyses précises. Les animaux utilisés dans le projet sont des adultes de 6 semaines à 18 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (entre 6 et 12 semaines, le système immunitaire des souris est stable, selon nos expériences antérieures) et certains animaux seront gardés jusque 15 mois après infection.
Etude de l’activité antitumorale et sénolytique d’anticorps couplés à des drogues dans des modèles de xénogreffes humaines (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
Des cellules cancéreuses humaines sont implantées sous la peau du flanc droit de souris anesthésiées, qui reçoivent ensuite une injection intraveineuse par semaine pendant deux à six semaines, avant une ponction intracardiaque terminale. 674 souris NMRI nude, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles changent d'établissement entre la greffe et les irradiations. Le porteur écrit vouloir s'assurer que les animaux ne subissent aucune souffrance, dans un protocole qui repose sur la croissance d'une tumeur greffée, des injections hebdomadaires et une irradiation.
Objectifs
La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des pathologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules sénescentes dans les tumeurs. Il s'agit d'un projet multisite.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules sénescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules sénescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.
Procédures
Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées. L'EU1 sera en charge des xénogreffes sur les animaux ( environs 20 jours de charge) avant leur transfert vers l'UE2 qui prendra en charge les irradiations ainsi ques les injections d'AEDC (30 jours environ).
Impact sur les animaux
Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.
Remplacement
Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etant donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. Lors du transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2, nous utiliserons des boîtes de transport de type Novopac opaque (1 seule fenêtre permettant de contrôler les souris ) contenant différents éléments d'enrichissement brique de bois, sciure et nourriture humidifiée (gel diet).
Choix des espèces
La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.
Etude du rôle du lactate dans le couplage neuro-métabolique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour mesurer les échanges de lactate entre cellules du cerveau. Chacune subit environ une heure de chirurgie sous anesthésie, le temps d'implanter une fenêtre crânienne au-dessus du cerveau et de fixer une barre de contention sur sa tête. Suivent jusqu'à quinze séances d'imagerie de deux heures, des perfusions, des injections de colorants et d'insuline, un prélèvement de sang toutes les quinze minutes, et pour une partie des souris des observations éveillées après deux semaines d'habituation au poste. Le cerveau est prélevé sur 52 animaux, les 188 autres étant tués au motif qu'ils portent une fenêtre crânienne et ont reçu des injections, ce qui les rend impossibles à replacer.
Objectifs
L’objectif général du projet est d’approfondir notre connaissance du métabolisme cérébral et de sa régulation, pour mieux comprendre son altération dans les maladies neurodégénératives liées au vieillissement. L’activité électrique des neurones est la principale source de dépense énergétique du cerveau. Ainsi, le cerveau qui ne représente que deux pour cent de la masse corporelle, contribue à vingt pour cent des dépenses énergétiques du corps. Une série d’études ont montré que le glucose était le principal substrat énergétique du cerveau en condition physiologique. Cependant, d’autres travaux ont également démontré que le lactate, produit final de la fermentation du glucose et traditionnellement considéré comme un déchet métabolique, pouvait être substitué au glucose et permettre le maintien de l’activité neuronale de tranches de cerveaux maintenues en culture. En effet, bien qu’issue de la dégradation du glucose, la molécule de lactate reste relativement riche en énergie. Par ailleurs, il a été découvert que les astrocytes, un autre type de cellules cérébrales, pouvaient produire et libérer du lactate, conduisant ainsi à l’hypothèse d’un transfert de lactate des astrocytes vers les neurones. D’autre part, certaines études récentes suggèrent qu’une altération de la voie d’utilisation du glucose dans les astrocytes et donc de la libération de lactate par ces astrocytes, pourrait participer aux déficits cognitifs observés dans des modèles murins de la maladie d’Alzheimer. Comprendre quelle part de l’énergie utilisée par les neurones dérive de leur utilisation directe du glucose et-ou du lactate produit par les astrocytes est donc d’une importance fondamentale pour toute approche thérapeutique visant à restaurer le métabolisme cérébral dans différentes formes de démence. Notre projet vise donc à établir si la dynamique de production de lactate dans les astrocytes et de ses fluctuations dans l’espace extracellulaire et dans les neurones est compatible avec l’hypothèse d’un transfert de lactate des astrocytes vers les neurones. Par ailleurs, ce projet nous permettra également de déterminer si ce processus est impliqué dans le couplage neuro-vasculaire, c’est-à-dire l’ensemble de processus qui conduisent à une augmentation localisée du flux sanguin à la suite d’une activation neuronale, celui-ci étant dysfonctionnel dans différentes formes de démence.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du métabolisme cérébral et notamment de l’utilisation du lactate astrocytaire par les neurones devrait contribuer à mieux comprendre les processus par lesquels ce métabolisme devient dysfonctionnel au cours de certaines maladies (comme les dégénérescences liées au vieillissement). Par ailleurs, savoir si les neurones utilisent de manière substantielle du lactate dans des conditions physiologiques devrait également permettre d’orienter certaines thérapies visant à compenser un métabolisme neuronal défectueux, mais aussi de mieux comprendre l’impact de certains facteurs environnementaux sur le métabolisme cérébrale (l’activité physique élève le taux plasmatique de lactate, certaines bactéries du microbiote intestinal produisent du lactate, certains aliments sont riches en lactate…).
Procédures
Les animaux sont tous soumis à une intervention chirurgicale d’environ une heure sous anesthésie et analgésie permettant d'implanter une fenêtre crânienne au-dessus du cerveau ainsi qu’une barre de contention sur la tête pour nos observations. Une partie des animaux recevront un agent sous anesthésie (intervention de 3 minutes maximum, une seule fois). Tous les animaux seront observés sous anesthésie durant des sessions d’imagerie n’excédant pas 2 heures et 15 fois maximum durant le projet (espacement de 3 jours minimum entre les observations). Durant les expériences d’imagerie, les animaux recevront une perfusion de solutions ainsi qu’une injection de colorants. Ils recevront également une injection d’insuline (maximum une fois par mois) et un prélèvement de sang sera effectué toutes les 15min pour suveiller leur glycémie durant le temps de l'imagerie. Les animaux seront également observés éveillé, après une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur. Les animaux sont exposés à un léger risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie. La chirurgie peut provoquer une douleur transitoire et une perte de poids durant les 3 jours suivants l’opération. Certains animaux recevront une perfusion intraveineuse lente de solution durant les expériences sous anesthésie qui peut provoquer une légère douleur, un stress, ainsi qu’un très faible risque d’hémorragie au réveil à la fin de l’expérience. Certains animaux seront observés éveillés sous le microscope, après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage.
Devenir
Les 240 animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 52 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires. Le reste des animaux (188), étant déjà injectés par des agents et porteurs d’une fenêtre crânienne sont euthanasiés car il n’est pas possible de les replacer.
Remplacement
Toutes les études métaboliques et celles s’intéressant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal vivant. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées non utilisables en recherche clinique. Nos recherches portent sur le métabolisme cérébral et plus particulièrement sur les fluctuations du lactate dans le cerveau or il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico satisfaisant, capable de reproduire la complexité des mécanismes cellulaires impliqués dans la régulation du lactate dans le cerveau.
Réduction
Ce projet nécessitera l’utilisation d’au maximum 240 souris. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles. Ce nombre a été déterminé à partir d’une analyse de puissance à l’aide d’un logiciel adapté prenant en compte la valeur moyenne de nos réponses en condition basale pour chacune des 3 lignées transgéniques utilisées et des 13 molécules injectés.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois et igloo et roue), et nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par la structure du bien-être animal pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie générale et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie, un apport d’air oxygéné et un suivi de température sera réalisé. Après la chirurgie et l’imagerie les animaux recevront un antidote à l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Après la chirurgie, ils recevront une gelée nutritive et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours, avec pesée quotidienne sera mis en place. Durant ce temps, les cages seront signalées grâce à une étiquette de soins postopératoires. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents, nous permettant ainsi de suivre l’activité de différents types cellulaires. Dans ce projet les souris seront utilisées entre 2 mois et 15 mois. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.
Comprendre les maladies de l’aorte à l’aide de modèles de souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une mini-pompe est implantée sous la peau du dos pour diffuser pendant vingt-huit jours une molécule qui provoque un anévrysme de l'aorte. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent des séances d'imagerie cardiaque et un transport à pied entre deux établissements, et l'un des gènes étudiés tue l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent. Les effets déclarés se limitent à un léger stress et à une suture qui peut être irritée légèrement, alors que le même texte reconnaît qu'une dissection aortique et une mort subite peuvent survenir en fin de traitement.
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Les anévrysmes de l’aorte thoracique (AAT) sont un gonflement d'une region spécifique de l'aorte qui relie le coeur au reste du corps humain. Ce gonflement à pour conséquence une fragilsation importante du reste du réseau cardiaque. La rupture de l’aorte qui consiste en un dechirement de celle-ci est alors favorisée et mortelle. Aucun traitement n’est pour le moment disponible pour ralentir la progression de la pathologie en raison de connaissances insuffisantes sur les mécanismes impliqués. Le but de notre recherche est d’identifier les gènes impliqués dans les AAT (anévrysme aortique thoracique) car a ce jour, seuls 30 % des patients ont une cause génétique connue. Il a été identifié 4 gènes qui sont potentiellement impliqués dans les anévrysmes mais leur rôle exact reste à établir. Pour mieux comprendre leur implication dans les anévrysmes de l'aorte thoracique, des modèles murins ont été générés afin de pouvoir etudier leur mécanismes. Un modèle de souris par gène identifié sera mis en place pour lequel nous induirons par la suite un anévrysme de l'aorte à l'aide d'une molécule déjà connue de la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider des gènes impliquées dans les AAT et ainsi réduire le nombre de patient dont la cause génétique n'est à ce jour pas connue. L'identification du rôle de ces gènes nous amenera a mieux comprendre leur mécanisme et ainsi offrir un meilleur suivi de l'anévrysme aux patients. La connaissance approfondie des potentiels acteurs impliqués dans les anévrysmes nous permettra de prévenir les conséquences fatales de la progression de cette pathologie et potentiellement de développer des solutions thérapeutiques.
Procédures
Dans l'EU1, une incision sous la peau au niveau du dos sera réalisée sur animal anesthésié pour implanter une mini-pompe qui délivrera une molécule pendant 28 jours pour induire un anévrysme. La durée de l’acte est de 10 min. Au préalable, sur un groupe d’animaux, il sera administré pendant une semaine dans l’eau de boisson une molécule connue de la littérature pour augmenter l’apparition de l’anévrysme. Pour suivre l'évolution du développement des anévrysmes, une imagerie cardiaque sera effectuée dans l'EU2 soit 10 min par souris.
Impact sur les animaux
La mise en place des pompes à AngII (pompes avec Angiotensine II qui est un hypertenseur) peut induire un léger stress à la souris. La suture peut être irritée légèrement. En fin de traitement, une possible dissection aortique peut survenir et donc une mort subite. Les échographies sont rapides et bien supportées par les animaux. L'un des gènes étudiés entraine la mort de l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés et des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour analyses.
Remplacement
Les prélèvements chez l'humain après opérations sont limités en nombre et en nature (seulement des petites parties de la paroi anévrysmale sont retirées par les chirurgiens). Cette pathologie est complexe et fait intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bein sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, le modèle murin nous permet d'être en mesure de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler un gène en particulier. Des expériences ont été menées sur des cellules humaines isolées afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux. Cependant, la complexité des mécanismes à l'origine des anévrysmes requiert l'utilisation d'un organisme complet.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Un lot expérimental nécessite 10 souris pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif est déduit de nos expériences précédentes. Toutefois, si nous constatons une différence statistiquement significative à un effectif plus faible, nous conclurons l'étude. La production d'animaux nécessaire sera réduite au minimum des besoins expérimentaux.
Raffinement
Nous raffinerons l'environnement des animaux par enrichissement de leur milieu de vie. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture ainsi que de la boisson. Nous veillerons à ce que les animaux ne soient pas laissé isoler dans les cages durant toutes les expériences afin de ne pas perturber les groupes souciaux. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés lors du projet pour couvrir les douleurs opératoires. De plus, les yeux seront couverts d'ocrygel pour eviter la déshydratation des yeux. Une surveillance quotidienne sera efféctué par l'expérimentateur ainsi que le personnel de l'animalerie, cette surveillance pourra être augmentée en cas de nécéssité. Le suivi sera quotidien. Nous établirons une grille d'évaluation des effets/nuisances susceptibles de toucher les animaux. Les critères observés seront l’apparence, le comportement, la mobilité et la perte poids. Les animaux recevront une injection d'un anti-douleur toutes les 8 heures pendant 2 jours en cas de besoin. En cas de déshydratation, les animaux recevront une injection de sérum physiologique au niveau de l’abdomen. Lors du transport des animaux de l'EU1 à l'EU2, nus ferons ce transport à pied (5min), à l'abri des regards, avec des hydrogels dans les cages et un peu de nourriture et des igloos en carton pour éviter le stress.
Choix des espèces
Les lignées murines impliquant les 4 gènes étudiés ont déjà été générées et nous y avons accès. De nombreux modèles murins ont déjà été décrits et développés pour les AAT nous permettant ainsi de comparer les modèles entre eux afin de mieux comprendre les mécanismes sous jacents. Les animaux seront utilisés au stade adulte (12 semaines), car les anévrismes de l’aorte thoracique se déclarent majoritairement chez l’Homme adulte et chez la souris à 12 semaines.
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres nerveuses sensorielles de type C dans la modulation de la douleur neuropathique périphérique chimio-induite
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris utilisées ont été génétiquement modifiées pour qu'une classe de leurs neurones sensoriels soit détruite, afin d'observer ce qu'il reste de la douleur quand ces fibres manquent. 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent cinq gavages successifs, puis six injections intrapéritonéales de deux molécules anticancéreuses réparties sur plusieurs semaines, avant des tests répétés de sensibilité de la patte arrière au toucher, au froid et à un gradient de température. Le porteur indique que ces injections provoquent une hypersensibilité mécanique, une hyperalgésie thermique et une allodynie au froid, et que tous les animaux sont tués pour prélever les tissus destinés aux analyses.
Objectifs
Plusieurs études dont certaines réalisées au sein de notre équipe, montrent qu’une classe particulière de fibres somato-sensorielles est impliquée dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. Environ 30% des patients atteints de cancer et traités par des agents anti-cancéreux développent des douleurs chroniques notamment des douleurs neuropathiques périphériques. Chez les rongeurs, l’apparition de neuropathie périphérique induite par l’administration d’agents anti-cancéreux est réversible au bout de vingt jours. Afin de pouvoir démontrer directement la fonction de ces fibres somato-sensorielles in vivo, dans la modulation de la douleur neuropathique périphérique, nous avons créé des souris génétiquement modifiées dans lesquelles ces neurones sensoriels sont supprimés sélectivement. Ces souris seront exposées à 2 molécules anti-cancéreuses différentes afin d’évaluer l’impact de la suppression de ces neurones sensoriels dans la mise en place de la douleur neuropathique périphérique chimio-induite. Afin d’inclure le sexe en tant que variable biologique, comme requis depuis 2005 dans le domaine de la recherche sur la douleur, notre étude portera sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important. En particulier, les patients traités par des molécules anti-cancéreuses peuvent développer des douleurs chroniques plusieurs années après l’arrêt du traitement, détériorant grandement leur qualité de vie. Ainsi comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mise en place de la neuropathie périphérique chimio-induite reste un enjeu majeur pour permettre le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Dans ce projet, nous chercherons à caractériser le rôle d'une classe de neurones sensoriels dans la douleur neuropathique périphérique induite par chimiothérapie. Nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par l’administration de molécules anti-cancéreuses.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 gavages de 2 min toutes les 24h puis de 2 injections à 2 jours d'intervalle. 4 semaines après, 4 nouvelles injections seront administrées, espacées de 2 jours. 3 tests comportementaux alternativement seront réalisés sur ces animaux durant une semaine puis une à 2 fois par semaine pendant 5 semaines. Ces tests consistent à évaluer la sensibilité de la patte arrière de la souris à des stimulis mécaniques ou thermiques (au froid et à un gradient de température). Chaque stimulation varie de 3 à 20 sec en fonction des tests. La durée totale de ces tests est d'environ 1 min maximum par souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir des administrations de composés par gavage et par injection intrapéritonéale. La contention pour gavage et les injections intrapéritonéales sont susceptibles de générer du stress mais le personnel est formé à la réalisation de ces actes. Sur la base des données bibliographiques, nous savons que l’injection par voie intrapéritonéale des composés chimio-thérapeutiques va générer chez une souris sauvage une hypersensibilité mécanique, une hyperalgésie thermique et une allodynie au froid.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans chaque procédure sont euthanasiés afin de prélever les tissus nécessaires aux besoins de l'analyse.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Sur la base d’études pilotes, nous avons réduit au minimum nos effectifs permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. L’optimisation de notre plan expérimental (enchaînement de différents tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, partage de tissus) permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. L’utilisation d’outils informatiques prenant en compte la variabilité liée au traitement, aux tests comportementaux ainsi que le nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable, nous permettent de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement, ainsi que dans les analyses moléculaires prévues dans ce projet. Le nombre indiqué tient compte de toutes ces variables.
Raffinement
Les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire au mieux voir supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité de locaux d'expérimentation, de matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) limitant le stress des animaux et favorisant la validité des expériences ; b) recours à l'anesthésie/analgésie ; c) établissement d’une grille de score et des points limites les plus précoces possibles. Les expérimentateurs ont été formés et maitrisent les méthodes notamment l’administration par « voie orale ». Une surveillance accrue des souris sera réalisée durant la première semaine d’administration des molécules anti-cancéreuses et précédant chaque test de comportement. Si une anomalie est constatée, les zootechniciens en charge de la surveillance quotidienne contacteront le porteur de projet et les membres du bien-être animal et des mesures seront prises, si nécessaire (y compris les points limites adaptés) afin de minimiser la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrits chez la souris. Nos tests comportementaux et nos analyses cellulaires et moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car à ce stade du développement, le système somato-sensoriel primaire arrive à maturation. Néanmoins, l'expérimentation sera débutée chez ces souris âgées de 3 et 3.5 semaines afin de supprimer de façon optimale la population de neurones sensoriels d’intérêt.
Comorbidités des rhumatismes inflammatoires chroniques : physiopathologie et traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1750
1 750 rats et 750 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 650 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite leur est provoquée, avec érythème et gonflement des pattes, perte de poids, écoulements des yeux et du nez, mobilité réduite et vocalises que le porteur lit comme les signes d'un état de souffrance plus marqué. S'y ajoutent, selon les groupes, une marche rapide de trente minutes par jour sur tapis roulant pendant plusieurs semaines, des séances de rotarod, un spray froid appliqué sur les pattes, des gavages et un cathétérisme de la carotide sous anesthésie suivi de la mise à mort. Le projet porte sur les maladies concomitantes de la polyarthrite rhumatoïde, et le porteur justifie l'usage de deux espèces par le fait que les cultures cellulaires, les organoïdes et les approches in silico ne permettraient pas d'évaluer l'influence du sexe biologique, qu'il juge "indispensable" à la valeur prédictive des résultats.
Objectifs
Notre projet est un projet de recherche fondamentale, préclinique, qui vise à identifier des nouveaux traitements pour les patients atteints de rhumatismes inflammatoires chroniques (RIC). Ces maladies, dont les plus fréquentes sont la polyarthrite rhumatoïde et les spondyloarthrites, sont des maladies inflammatoires causées par un dérèglement du système immunitaire. Les patients souffrent de douleurs et de déformations de leurs articulations qui entraînent un handicap et a des conséquences socio-professionnelles importantes. Il est moins connu que ces patients développent également des pathologies concomitantes à leur maladie rhumatismale (comorbidités), qui réduisent l’espérance de vie, telles les comorbidités cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral, insuffisance cardiaque) ou altèrent encore plus leur qualité de vie, comme les comorbidités cognitives (troubles de la mémoire, dépression) et les comorbidités intestinales (inflammation intestinale). Alors que beaucoup de données scientifiques sont disponibles sur les mécanismes et traitements du problème articulaire de ces patients, très peu d’études ont été consacrées à la prise en charge spécifique de ces comorbidités. Les effets des traitements antirhumatismaux sur ces comorbidités sont inconnus ou controversés, et aucun traitement spécifique de ces comorbidités n’a été pour l’instant identifié. Pour ces raisons, ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes impliqués dans les comorbidités associées aux RIC et d’identifier d’autres options thérapeutiques innovantes. Il mettra en œuvre plusieurs modèles animaux d’arthrite, chez le Rat ou la Souris, qui sont complémentaires les uns des autres vis-à-vis des comorbidités à étudier. Sur la base des données de la littérature, et selon les mécanismes que nous aurons identifiés, différentes approches thérapeutiques seront évaluées chez les animaux souffrant d’arthrite : approches médicamenteuses (voie orale ou voie injectable) et approches non médicamenteuses (cryothérapie appliquée sur les pattes, ou activité physique à un temps de l’arthrite compatible avec cette pratique). Il est attendu que toutes les approches qui seront testées n’aient soit pas d’effet aggravant de l’arthrite, soit réduisent l’intensité de l’inflammation articulaire.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints de rhumatismes inflammatoires chroniques, de réduire la surmortalité associée à leur maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Interventions non-invasives. Cette catégorie d’intervention est réalisée soit sur un animal vigile, soit sur un animal anesthésié. Elle n’engendre pas de douleur, mais uniquement une gêne à la nouveauté de l’expérience. La durée varie selon l’intervention, voir le tableau suivant. En cas d’intervention qui demande une contention des animaux, une phase d’habituation est programmée au préalable. Par exemple : - Mesure de pression artérielle à la base de la queue : habituation, en condition vigile, quelques minutes à chaque mesure. - Marche rapide sur tapis roulant : habituation, en condition vigile, 30 minutes /jour, pendant plusieurs semaines - Rotarod (coordination sur tige tournante) : habituation, en condition vigile, 5 à 10 minutes /jour, pendant plusieurs jours - ECG : sous anesthésie gazeuse, pendant quelques minutes, le réveil s’effectue 2 à 3 minutes après l’arrêt de l’exposition à l’anesthésique Application ou administration de traitements Si le traitement est administré par voie parentérale, une douleur similaire à la douleur d’une piqûre d’une aiguille est engendrée. Autrement, les conditions d'applications dépendent du type de traitement. Par exemple : -Cryothérapie par spray froid sur les pattes après contention manuelle en condition vigile pendant quelques minutes. - Injection sous-cutanée, intra-péritonéale, intradermique après contention manuelle vigile en moins d’une minute, - Gavage après contention manuelle en condition vigile en moins d’une minute - Administration orale par eau de boisson : dans la cage, en condition vigile avec accès à volonté au biberon -Administration orale dans la nourriture : dans la cage vigile avec ccès à volonté à la mangeoire. Pour les modèles d’arthrite générant une douleur et une atteinte articulaire, un soin particulier sera apporté aux animaux lors de la manipulation. Un système de points limites définit au préalable le seuil de souffrance à ne pas dépasser. Sa détermination quotidienne permet de suivre le bien-être de l’animal et d’envisager sa mise à mort, le cas échéant. Procédures chirurgicales : cathétérisation carotidienne, mesure de la courbe pression-volume cardiaque. Ces procédures doivent respecter les aspects réglementaires définis : sous anesthésie générale, après analgésie, avec température contrôlée, et respiration vérifiée, par un expérimentateur habilité à la chirurgie expérimentale. L’animal est mis à mort à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1 de gravité sévère, une perte de poids et des écoulements nasaux sont observés au moment du développement d’arthrite et associés à l’apparition d’érythème et de gonflements des pattes antérieures et postérieures. Une douleur est associée à l’arthrite, et la mobilité des animaux est réduite lors de la phase inflammatoire de la maladie. Des écoulements au niveau des yeux et l’expression de vocalises peuvent apparaitre traduisant un état de stress et de souffrance plus marqué. A une phase plus tardive, des croutes cutanées peuvent apparaitre au point d’injection au niveau de la queue. Cette procédure étant considérée « sévère » au cours des phases inflammatoires des modèles d’arthrite, un suivi journalier de points limites est appliqué pendant ces phases inflammatoires. Dans les procédures 2 et 3 de classe légère, les administrations multiples par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent aussi engendrer un inconfort pour les animaux. Ainsi, les injections doivent se faire à différents points afin de ne pas sursolliciter une seule région. L'état des points d'injection doit être vérifié le lendemain de chaque administration.
Devenir
Notre démarche de recherche inclut des explorations fonctionnelles chez l’animal vigile ou anesthésié. Mais elle implique aussi des explorations biomoléculaires sur les tissus d’intérêt. Ainsi, à l’issue de chaque procédure nous avons besoin de collecter les organes/tissus afin de réaliser des analyses. Tous les animaux de ce projet sont donc mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est nécessaire car la compréhension de nouveaux mécanismes tissulaires/moléculaires et l’étude de nouvelles approches thérapeutiques ne peuvent pas être d’emblée réalisées chez les patients, et nécessite des explorations à des stades précliniques de la maladie, irréalisables chez le patient. Les méthodes d’analyses in vitro sur cellules ou organoïdes en culture, ou in silico, ne reproduisent pas intégralement les communications complexes inter-organes (nerveuses, endocrines, immunologiques) impliqués dans les RIC et ne permettent pas d’évaluer l’influence du sexe biologique, indispensable pour garantir la valeur prédictive des résultats chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux se base sur le nombre de modalités thérapeutiques qui seront testées, avec notamment la notion d’effet-dose pour les études pharmacologiques, le nombre requis d’animaux selon la procédure réalisée (qui tient compte de la variabilité de la technique de mesure et du test statistique utilisé), et la nécessité d’étudier la variabilité liée au sexe pour des paramètres qui n’ont jamais fait l’objet d’études antérieures de l’influence du sexe biologique en cas d’arthrite. Des effectifs plus réduits seront utilisés pour les expériences préliminaires de recherche de doses efficaces des nouveaux médicaments, ou pour l’apprentissage de techniques d’exploration fonctionnelles complexes. Dans la mesure du possible, les techniques non invasives d’évaluation de la comorbidité d’intérêt seront toujours privilégiées aux mesures invasives. Pour chaque expérience, une banque de tissus sera réalisée afin de ne pas répéter ultérieurement des expériences.
Raffinement
Un raffinement sera apporté à chaque procédure afin de limiter le stress des animaux. Les effets de l’arthrite et des traitements sur les différentes comorbidités seront évalués à l’aide de différents tests, dont certains seront réalisés chez l’animal anesthésié et analgésié. Les modèles d’arthrite pouvant générer une douleur, un soin particulier sera apporté aux animaux lors de leur manipulation, un suivi clinique sera effectué, l’accès à la nourriture sera facilité. Quotidiennement, la détermination de points limites est réalisée afin de limiter la souffrance animale, en procédant à la mise à mort de l’animal selon le niveau de souffrance atteint. Cette évaluation sera réalisée conjointement avec la structure du bien-être animal, et éventuellement après sollicitation du Vétérinaire, le cas échéant. Pour les procédures nécessitant une anesthésie de l’animal, un tapis chauffant sera utilisé pour prévenir l’hypothermie.
Choix des espèces
Nos travaux s’intéressent à deux types de maladies inflammatoires chroniques : polyarthrite rhumatoïde et spondylarthropathie. Le Rat et la Souris sont les espèces de référence pour modéliser ces pathologies et ses comorbidités. La Souris offre en plus l’avantage de créer des lignées transgéniques permettant d’étudier l’effet de l’altération ou de rajout partiel ou total d’un gène codant une protéine d’intérêt. Dans tous nos modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte. Dans tous nos modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 5 mois.
Étude et caractérisation de l’effet de CLEC-1 dans l’immunosuppression liée au sepsis dans un modèle de pneumonie de souris. 2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une sonde de gavage enduite de lidocaïne descend dans la trachée de souris anesthésiées pour y déposer des bactéries et déclencher une pneumonie septique. 3 118 souris vont être utilisées de cette manière, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que ces interventions "n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire", tout en prévoyant une ou plusieurs injections de morphinique sur animal vigile selon le score de douleur relevé chaque jour. La rubrique consacrée au choix de l'espèce ne justifie rien : elle reprend mot pour mot le texte sur l'hébergement et le transport, et l'effectif de 3 118 souris tient en une ligne, réduit "au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable".
Objectifs
Pour ce projet nous allons déterminer le rôle d’un récepteur cellulaire dans la réponse immunitaire suite à une infection pulmonaire aigüe (sepsis). Ensuite nous allons tester si l’utilisation d’une molécule thérapeutique ciblant ce récepteur peut apporter un bénéfice dans le traitement de ces infection pulmonaires. Finalement, nous allons étudier les interactions de ce récepteur immunitaire avec d’autres mécanismes immunitaires.
Bénéfices attendus
Le sepsis et une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Ce projet vise à déterminer le lien entre l’activité d’un récepteur immunitaire et l’établissement de l’immunosuppression induite par le sepsis. Mieux comprendre les mécanismes biologiques responsables de ce phénomène pourrait mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques utiles dans le traitement du sepsis.
Procédures
Afin d’induire une pneumonie et après anesthésie générale, les animaux seront placés sur le dos. Une injection de bactéries sera réalisée directement dans la trachée à l’aide d’une sonde de gavage, enduite d’analgésique. Cette injection intratrachéale dure moins d’une minute et sera réalisée sur une majorité des animaux (EU1). Afin de s’assurer du bien-être des animaux et de l’absence de douleur, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles expérimentaux a été mis en place. En fonction de l’évaluation, si un animal présentait des signes de douleur, une ou plusieurs injections de morphiniques pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Ce geste dure moins d’une minute (EU1). Certains animaux auront des administrations intraveineuses (IV) en caudale et en vigile (EU1). Le geste d’IV est très rapide et ne dure au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours), sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre les différents compartiments immunitaires et non immunitaires du poumon pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (Annexe 9). En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) pour d’anesthésier localement la trachée. Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Concernant le transport des animaux, ceux-ci seront transporté dans des cages contenant un maximum de 5 animaux par compartiment, avec accès à de la nourriture et de l’eau, par un transporteur agrée.
Choix des espèces
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (Annexe 9). En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) pour d’anesthésier localement la trachée. Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Concernant le transport des animaux, ceux-ci seront transporté dans des cages contenant un maximum de 5 animaux par compartiment, avec accès à de la nourriture et de l’eau, par un transporteur agrée.
Approche de thérapie génique dans le modèle murin d’une maladie génétique rare, la mucopolysaccharidose de type 3A
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
La lignée de souris utilisée développe un pelage rêche, une posture voûtée, une baisse d'activité, parfois une opacité de la cornée et une paralysie des pattes arrière vers sept mois, avant une mort prématurée entre sept et dix mois. 420 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 330 et modéré pour 90. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue vers sept à dix jours, une partie recevant ensuite une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, puis jusqu'à sept séries de trois tests moteurs espacées de deux mois. Sur les 420, 90 seulement sont utilisées pour l'évaluation thérapeutique et l'étude de survie, les autres étant tuées comme animaux d'élevage ou parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni replacées ni réutilisées du fait de leur modification génétique.
Objectifs
La Mucopolysaccharidose de type IIIA (MPSIIIA), ou maladie de San Filippo A, est une maladie rare dite de surcharge lysosomale, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances chez l’Homme en Europe. Elle se caractérise par une atteinte sévère du système nerveux central. Elle débute le plus souvent aux âges de 2 à 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. L'espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l'ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. L’objectif du projet sera d’élever une lignée de souris génétiquement modifiée, modèle de la maladie MPSIIIA, afin dans un deuxième temps d’évaluer les effets d’une approche de thérapie génique pour lutter contre cette maladie chez ce modèle animal.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de prouver la non-toxicité et l’efficacité d’une thérapie génique pour le traitement de la mucopolysaccharidose de type IIIA chez un modèle murin. A plus long terme cela pourrait permettre d’identifier et proposer une nouvelle piste de traitement chez l’Homme pour cette pathologie actuellement incurable.
Procédures
Dans le cadre de l’élevage pour obtenir nos lots expérimentaux il sera nécessaire de réaliser un prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux. Cet acte sera fait une fois sur de jeunes animaux vigiles (durée 1 minute par animal environ). Une partie des animaux auront une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie générale (durée 5 min, une fois). Tous les animaux utilisés dans l’évaluation thérapeutique participeront à trois tests comportementaux différents pour mesurer leurs capacités motrices et évaluer l’effet du traitement sur ces capacités motrices (20 min test 1, 3x5 min test 2 et 2 minutes test 3). Cette série de 3 tests sera réalisée au maximum 7 fois avec un minimum de 2 mois entre chaque série. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique. Il existe un risque rare cardio-respiratoire et un risque d’hypothermie durant l’anesthésie. L’animal pourra ressentir un stress lors des contentions et manipulations mais également lors de l’induction de l’anesthésie. L’animal pourra ressentir une légère douleur et un inconfort lié à la piqure de l’aiguille suite à l’injection intraveineuse La lignée de souris utilisée dans ce projet présente un phénotype dommageable en lien avec sa modification génétique se traduisant par un pelage rêche, une réduction d’activité et une posture voutée. Une opacité cornéenne et une paralysie des pattes arrières pourront également intervenir vers le 7ème mois de vie. Ces animaux décèderont de manière prématurée entre le 7ème et le 10ème mois d’âge.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux qui auront reçu la thérapie génique seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité. Les animaux d’élevage et les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés dans d’autres projets du fait de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Le projet vise à valider une thérapie génique pour la mucopolysaccharidose de type IIIA incurable chez l’Homme à ce jour. Les modèles in vitro ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire et cellulaire de l’approche de thérapie génique ; elle nécessite à présent d’être validée dans un premier contexte physiologique chez un mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez un modèle pertinent de la pathologie, dans notre cas la souris.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats statistiquement fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre maximal de 12 souris par groupe a été défini pour évaluer l’effet thérapeutique de notre approche, et 6 pour l’étude de survie, afin de réaliser des tests statistiques fiables. Au total nous utiliserons 72 souris pour l’évaluation de l’effet thérapeutique et 18 souris pour l’étude de survie. Nos résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Afin d’obtenir ces animaux des lots expérimentaux nous produirons au total 420 animaux au cours de ce projet en pilotant de manière raisonnée notre élevage et en ne produisant que le nombre d’animaux strictement nécessaires.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne apportée par l’équipe de zootechnie, la mise en place de points limites et de soins adaptés. Pour l'évaluation de l'effet de notre thérapie nous inclurons uniquement des animaux qui font plus de 10g pour une meilleure récupération des animaux à l'anesthésie et à l'intervention. Lors de l'anesthésie pour injection nous maintiendrons la température de l'animal en le plaçant sur un tapis chauffant thermorégulé à 37 degrés Celsius et en assurant son réveil dans une chambre de réveil chauffée. Un gel ophtalmique sera appliqué au niveau des yeux pour prévenir tout inconfort suite à l'injection. Cette injection est faite avec le plus petit diamètre d'aiguille possible. Un suivi rapproché est effectué au réveil et dans les jours suivants l'injection. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux est réalisé sur de jeunes animaux (moins de sensibilité à la douleur et cicatrisation rapide) et de la plus petite taille possible. C’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Nous adapterons nos accouplements pour produire nos lots expérimentaux de la manière la plus optimisée possible. Le suivi du phénotype dommageable sera pris en charge (observation, assistance nutritionnelle), les tests de comportements sont raffinés avec un test par jour. Pour l'euthanasie médicamenteuse nous réaliserons une pré-sédation des animaux afin de faciliter l'injection de l'euthanasiant et limiter la douleur associée.
Choix des espèces
Le modèle murin est particulièrement adapté pour reproduire et étudier des maladies humaines (modification génétique possible, outils moléculaire disponible...). Nous utilisons pour ce projet le modèle de souris génétiquement modifiées qui reproduit le phénotype de la maladie MPSIIIA présent chez l’Homme. Cela nous permettra donc d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche. Les animaux seront prélevés à l’âge de 7 à 10 jours pour connaitre leur patrimoine génétique. Ils seront ensuite utilisés soit entre 3 semaines et 6 mois pour l’étude de l’effet thérapeutique soit jusqu’à ce qu’ils présentent des signes spécifiques ou à maximum 18 mois pour l’étude de survie.
Thérapie génique du syndrome de Prader Willi chez le nouveau-né de souris – Étape 2 : Évaluation du traitement sur les effets post-nataux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Le lendemain de leur naissance, des souriceaux vigiles reçoivent une injection dans le cerveau, une crème anesthésiante ayant été posée trente minutes plus tôt sur le crâne. Une semaine après, l'extrémité de leur queue est prélevée pour savoir s'ils portent la mutation, puis viennent sept pesées, sept mesures de taille, cinq mesures de tête et des tests de redressement répétés. 150 souris au maximum vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur relevant chez les souriceaux modèles de la maladie de Prader-Willi une mortalité accrue de 10 à 15 % dans la première semaine de vie. Les souriceaux porteurs de la maladie sont tués au sevrage, tandis que 57 animaux, dont 18 femelles reproductrices, seront réutilisés dans d'autres projets et trois mâles gardés en vie pour maintenir la lignée.
Objectifs
La maladie de Prader-Willi est due à la perte de certains gènes et se manifeste dès la naissance. Pour compenser ce manque, un traitement administré au plus tôt chez le nouveau né malade pourrait contrecarrer le développement de la maladie. Ainsi, dans ce projet, nous voulons mettre en lumière les effets positifs sur le développement de jeunes souriceaux, d’un nouveau médicament validé précédemment sur des cellules en culture et qui sera administré un jour après la naissance. Nous testerons trois doses différentes afin de déterminer la plus efficace, qui pourra alors être utilisée comme valeur de référence dans les thérapies contre la maladie de Prader Willi chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Cette phase du projet va tester la capacité d'un médicament à corriger certains symptômes de la maladie de Prader-Willi chez des souris nouveau-nées. Nous veillerons à déterminer la dose la plus efficace pour traiter les enfants atteints par cette maladie qui touche environ 250 nouveau-nés par an en France. Nous espérons observer chez les animaux malades traités une diminution de la faiblesse de leurs mouvements, un poids et une taille générale semblables ou se rapprochant de ceux des animaux témoins, ainsi qu’une vitesse de développement des mouvements équivalente. En outre, nous espérons observer chez les animaux traités un intérêt envers l’environnement identique à celui de nos animaux témoins. De même nous évaluerons la réduction des comportements répétitifs chez ces groupes traités.
Procédures
L’ensemble des souriceaux subira une injection unique du médicament dans le cerveau le lendemain de leur naissance (environ 10 secondes), puis, au terme d’une semaine d’existence, un prélèvement de l’extrémité de la queue afin de savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal (environ 5 secondes). Les juvéniles subiront un ensemble de mesures du développement incluant suivi pondéral (7 pesées de 10 secondes espacées de 3 jours), 7 mesures de taille de 10 secondes (espacées de 3 jours), 5 mesures de la longueur de la tête de 10 secondes (espacées de 3 jours), ainsi que 2 tests d’évaluation du neurodéveloppement de durées inférieures ou égales à 120 secondes, réalisés 4 fois aux âges précoces et séparés de 1 journée chaque.
Impact sur les animaux
Les animaux modèles de la maladie de Prader-Willi sont généralement plus petits que les animaux témoins et ont des comportements modérément affectés. Ils ne montrent pas de signes de douleur ou de difficultés à survivre, mais une mortalité accrue de 10-15% la première semaine après la naissance est néanmoins relevée. Le retrait transitoire (de 20s à 2min30s environ) des souriceaux nouveau-nés de la portée pour les expérimentations comportementales, les pesées et les mesures de taille peuvent entrainer un stress léger de courte durée et sans douleur. L'injection unique du médicament dans le cerveau chez souriceaux vigiles peut entrainer un inconfort transitoire lié à la contention des souris, tandis que l'injection peut entrainer un stress léger et une douleur modérée de courte durée. L'inconfort lié à la position du corps au début du test de redressement est limitée temporellement par le comportement de l'animal qui va naturellement chercher à redresser sa position ; si un animal échoue en cela, le test sera arrêté au bout de 2 minutes ce qui bornera ses effets à un stress léger et de durée limitée. Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal peut entraîner un stress léger sans douleur.
Devenir
La mise à mort des 30 à 150 juvéniles d’intérêt sera réalisée au sevrage. Les animaux des trois groupes constitués d’individus sains injectés par le traitement test aux doses D1 à D3 pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche une fois leur sevrage atteint. Les trois mâles reproducteurs seront gardés en vie pour le maintien de cette lignée dans notre structure. Les 18 femelles reproductrices seront réutilisées pour d'autres projets de recherche.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer l'effet d'un traitement de thérapie génique chez de jeunes souris modèles de la maladie de Prader-Willi. Ce traitement a déjà été étudié et validé par des expérimentations préliminaires menées sur des lignées cellulaires humaines, sans utilisation d’animaux. L'efficacité du traitement selon 3 doses testées sera maintenant étudiée sur un modèle animal et ce, via plusieurs critères biologiques qui ne peuvent être évalués sans l’utilisation d’animaux tels que la croissance des individus, leur métabolisme et leur comportement.
Réduction
Ce projet utilisera 30 souriceaux (au minimum), effectif qui pourra s’étendre à 150 au maximum. Les effectifs les plus faibles permettant d’obtenir un effet statistique significatif ont été calculés et retenus pour les expériences ; pour ce faire, nous avons utilisé un logiciel informatique afin de déterminer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données issues de précédentes recherches.
Raffinement
Les souris porteuses de la maladie de Prader-Willi présentent 0 à 15% de mortalitéle jour de leur naissance. A partir du second jour de vie, il n’est pas reporté d’excès de mortalité chez ces souris en condition classique d’élevage et d'hébergement : les animaux sont en mesure de se déplacer et de se nourrir correctement, les petits ne sont pas rejetés par les mères et, hormis une petite taile, ils ne montrent pas d’incapacité fonctionnelle justifiant de mesures de raffinement spécifiques. Les mâles porteurs de la maladie de Prader-Willi seront d'abord acclimatés avec des éléments d’enrichissement simples. Après deux semaines, ils seront mis en accouplement à raison de deux femelles par mâle. Ensuite, les femelles gestantes seront hébergées seules jusqu’à la mise bas. Pour les souriceaux nouveau-nés injectés, de la crème anesthésiante sera appliquée sur le crâne 30 minutes avant l’injection. Après l'injection, les petits seront roulés dans la litière de leur cage d’origine et un suivi de l'absence de rejet par la mère sera opéré lors de son replacement dans sa portée d’origine. Si un petit était rejeté par sa mère, une démarche de ré-adoption par une autre femelle sera alors mis en place. Tous les animaux de ce projet seront surveillés quotidiennement ainsi que lors des tests réalisés afin de surveiller si les points limites établis sont atteints.
Choix des espèces
La souris est le seul animal pour lequel un modèle de la maladie de Prader Willi existe. Le développement de la maladie chez la souris est proche de celui observé chez l’humain. Dans notre projet, le traitement dès le lendemain de la naissance est choisi afin de mimer le traitement en bas-âge des patients Prader Willi.
Caractérisation et étude d’un nouvel agent de contraste à potentialité multimodale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un cathéter posé dans la veine de la queue, une heure d'IRM sous anesthésie, puis deux nouvelles séances d'imagerie à quatre et vingt-quatre heures : 62 souris suivent ce protocole, dont une partie après avoir reçu sous la peau une injection de cellules tumorales. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger pour 42 souris et modéré pour 20. L'objet du projet est de tester si trois enrobages polymères rendent des nanoparticules assez discrètes vis-à-vis du foie et du système immunitaire pour circuler plusieurs heures dans le sang et atteindre une tumeur. Toutes les souris sont tuées pour le prélèvement des organes et de la tumeur, celles dont la tumeur dépasse 10 % du poids corporel ou qui perdent plus de 20 % de leur poids étant sorties de l'étude et mises à mort avant terme.
Objectifs
Après une étude préalable réalisée in vitro sur des cellules en culture, l’objectif de ce projet est l’évaluation in vivo de nouveaux composés issues des nanotechnologies comme agents de contraste pour l’imagerie médicale. Ces composés sont prometteurs pour l'amélioration du diagnostic et la thérapie du cancer. Ils permettent notamment une augmentation de contraste des images obtenues par résonance magnétique nucléaire (IRM). La difficulté majeure rencontrée pour l'utilisation de ces composés est qu'ils sont très rapidement captés en quelques minutes par les systèmes de défense de l'organisme comme le foie et les cellules du système immunitaire. Si les composés ne restent pas suffisamment longtemps dans la circulation sanguine, ils n'ont pas le temps de passer dans le tissu tumoral. Des modifications de la surface de ces composés par greffage de polymères particuliers permet de les rendre relativement invisibles du système de défense. Ainsi, leur temps de présence dans le sang s'allonge, augmentant la probabilité de passage du composé dans le tissu tumoral. Pour ce projet nous allons tout d'abord évaluer avec pour critère principal de sélection, l’invisibilité biologique pour 3 types de polymères à 3 concentrations différentes. Le temps de présence dans la circulation attendu est de plusieurs heures avec nos composés Puis sur un modèle de souris porteuse d'une tumeur, nous testerons les 2 meilleurs agents à 2 concentrations différentes. L’imagerie sera réalisée avec un IRM dédié au petit animal sous anesthésie pour éviter les mouvements durant les acquisitions.
Bénéfices attendus
Ces nouveaux agents de contraste sont développés dans le but de limiter les doses à injecter chez les patients, et pour pallier le fait qu’une seule technique d’imagerie se révèle souvent insuffisante pour poser un diagnostic précis. La mise au point d’agents de contraste bimodaux (combinant deux types d’imagerie complémentaires) et vectorisés (aptes à cibler sélectivement la zone d’intérêt), devient une nécessité en matière de santé. Leur utilisation permettrait d’accéder rapidement à un diagnostic plus précis et de définir le traitement le plus approprié, limitant ainsi les effets secondaires, améliorant la prise en charge des patients, et réduisant les coûts de santé. Des études menées auprès de professionnels du secteur montrent qu’un intérêt particulier se dégage pour une sonde associant la précision spatiale de l’IRM à la grande sensibilité de l’imagerie nucléaire, du fait de leur complémentarité et du développement d’appareils combinant IRM et imagerie nucléaire. Pour autant, et même si de nombreuses publications rapportent la synthèse de sondes associant IRM et imagerie nucléaire, aucune sonde duale adaptée n’est actuellement disponible sur le marché. Les nanomatériaux sont de bons candidats pour le développement de tels outils bimodaux, notamment par les possibilités de vectorisation/modification qu’ils apportent.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions dans ce projet : (1) une imagerie par IRM sous anesthésie in vivo non invasive et non traumatique, 3 sessions : la première dure 1 h, la seconde dure 10 min et est réalisée après 4h suivant l’injection de l’agent de contraste, enfin la dernière est réalisée 24h après la première. (2) pose d’un cathéter réalisé en moins de 10 minutes pour injection par voie intraveineuse à la première session d’imagerie, le cathéter est enlevé à la fin de la première session d’imagerie, l’animal étant toujours sous l’effet de l’anesthésie gazeuse. (3) pour certains animaux, une injection sous-cutanée de cellules tumorales, durée incluant la préparation 10 min.
Impact sur les animaux
- La pose d’un cathéter : le cathéter est posé dans la veine caudale , il peut induire un hématome et une altération temporelle de la veine. -Induction tumorale : la génération d'une tumeur peut entrainer une perte de poids de l’animal, des souffrances et éventuellement des troubles fonctionnels.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux sont mis à mort car les organes sont prélevés pour analyse. A l'issue de la procédure 2 sur les animaux porteurs d’une tumeur solide, tous les animaux sont mis à mort car les organes et la tumeur sont prélevés pour analyse.
Remplacement
Certaines phases d'optimisation des nano-particules (vérification de la stabilité, toxicité cellulaire) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité à intégrer la tumeur.
Réduction
L'imagerie, par opposition aux bio-distributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en œuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session après 4h et après 24h suivant l’injection de l’agent de contraste). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique paramétrique ou non paramétrique selon la distribution des données. Pour la première phase de caractérisation de nos nano-sondes, des animaux non inclus dans un protocole dont la mise à mort était programmée pourront être utilisés.
Raffinement
La première phase de caractérisation in vivo des nano-sondes sera menées sur des souris saines pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de tumeur sous-cutanée. Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur dépassant 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une injection sous-cutanée de cellule tumorales, l'anesthésie sera réalisée classiquement par induction à l'isoflurane. Les animaux sont maintenus dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une dose d’analgésique sera administrée, si l’état général de l’animal ne s’améliore pas dans les 48h et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de la souris est reconnu comme pertinent pour l'évaluation préclinique des caractéristiques des agents de contraste en imagerie. La souris possède comme l’homme une vésicule biliaire ce qui permet de visualiser la voie d’élimination hépatique. Le modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris est bien maitrisé. Les animaux pour la phase d’évaluation de la furtivité seront utilisés au stade de jeunes adultes à adulte (de 7 à 16 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Des animaux jeunes de 4 à 6 semaines seront utilisés pour la génération d’une tumeur sous-cutanée. Ce stade est optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses. Ces animaux seront explorés par IRM (entre 7 et 10 semaines).