Souris
Contribution de la dystrophine dans différents domaines musculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une échelle de douleur à quatre niveaux encadre le protocole, le niveau 3 correspondant à une paralysie des membres, qui déclenche un analgésique plus puissant puis la mise à mort si nécessaire. 454 souris mâles porteuses de la dystrophie de Duchenne vont être utilisées, 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un virus vecteur par voie intramusculaire à six semaines, dans l'abdomen à deux à quatre jours de vie, ou dans le sinus rétro-orbitaire à dix-sept mois, et la mesure de la force contractile se fait sous anesthésie par huit stimulations successives, sans réveil. Le porteur écrit collecter les biopsies musculaires de tous les animaux et ne prévoir ni réutilisation ni adoption.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie dégénérative grave et progressive causée par des mutations du gène DMD codant pour la protéine dystrophine. Malgré des efforts considérables, la DMD reste incurable et de nombreuses questions fondamentales sur ses mécanismes pathologiques restent en suspens. Une question particulièrement importante est de savoir quelle partie du muscle la dystrophine (perdue dans la DMD) est fonctionnellement importante pour prévenir le développement de la DMD. La dystrophine est une protéine structurelle clé qui aide à maintenir l'intégrité des fibres musculaires pendant la contraction. Il y a trois décennies déjà, il a été reconnu qu’elle est plus fortement exprimée à la jonction neuromusculaire (JNM) et à la jonction myotendineuse (JMT), que dans le reste de la myofibre. Ces sites sont essentiels à la fonction musculaire : la JNM est l'endroit où les impulsions nerveuses déclenchent la contraction musculaire, et la JMT est l'endroit où les fibres musculaires se connectent aux tendons, dissipant ainsi la force de contraction. L'accumulation de preuves commence à suggérer que la dystrophine pourrait être plus importante dans certaines zones musculaires que d'autres. Par exemple, des études récentes sur l'expression génétique ont révélé que le gène responsable de la pathologie est plus fortement exprimé dans la JMT. De plus, une étude de thérapie génique à faible dose a suggéré que la restauration de ce gène dans la JMT pourrait être suffisante. En outre, des perturbations de la JMT et de la JNM ont été signalées chez les souris mutantes pour ce gène avant le début de la nécrose. Compte tenu de ces observations, il devient de plus en plus essentiel de comprendre les contributions fonctionnelles de la dystrophine dans les différents domaines musculaires. Cependant, cette question est difficile à étudier avec les constructions génétiques conventionnels chez la souris car ils n'ont pas de spécificité spatiale. Nous avons donc développé de nouvelles constructions génétiques permettant de manipuler uniquement les noyaux de la JNM ou de la JMT. L'objectif de notre projet est maintenant de répondre à cette question en utilisant notre approche unique. De plus cette nouvelle approche pourrait donner lieu à une thérapie génique plus ciblée et donc potentiellement avec moins d’effets secondaires.
Bénéfices attendus
La réponse à la question de notre projet de recherche devrait avoir un impact significatif sur la façon dont nous comprenons la DMD et sur l'élaboration de meilleures stratégies thérapeutiques. Cependant, les outils précédemment disponibles dans le domaine musculaire ne peuvent pas être utilisés car ils n'ont pas de précision spatiale à l'intérieur des cellules musculaires. En revanche, les outils que nous avons développés permettent de manipuler la dystrophine uniquement dans des zones précises de la cellule musculaire et donc d’aller plus loin dans la compréhension du fonctionnement de la pathologie et de sa prise en charge.
Procédures
1. Injection intramusculaire d’AAV (Virus Adéno Associé) sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les jeunes adultes de 6 semaines, injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours et injection d’AAV dans le sinus retro-orbitale sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les animaux âgés de 17 mois. 2. Prélèvement de sang au sinus retro-orbital sera immédiatement suivi de la mesure de la force contractile sous la même anesthésie générale (sans réveil). Le prélèvement ne durera qu’une minute. 3. Mesure de la force contractile in situ (sans réveil) : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation et les souris encore sous anesthésie seront mises à mort.
Impact sur les animaux
La souris que nous utiliserons dans ce projet est un modèle animal largement utilisé pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. En tant que telles, ces souris sont atteintes de dystrophie, elles présentent un phénotype de faiblesse de sévérité légère musculaire à partir de l’âge de 4 mois, qui n’est pas encore visible d’un point de vue physique ou comportemental, puis une fibrose et des faiblesses évidentes au niveau des muscles du diaphragme et du cœur de sévérité modérée aux alentours de 17 à 22 mois pouvant entraîner des difficultés pour se déplacer et donc se nourrir et s’abreuver. Bien que nous générions de nouvelles lignées en croisant les souris atteintes de DMD avec d’autres lignées, ces autres lignées elles-mêmes n'ont pas de phénotype. Par conséquent, le phénotype des nouvelles lignées est équivalent à celui des souris atteintes de DMD. Nous espérons supprimer ou atténuer les symptômes chez ces souris mutantes injectées avec notre AAV (Virus Adéno-Associé), en restaurant la présence d’une protéine dystrophine courte et donc passer d’une sévérité modérée à une sévérité légère pour les animaux âgés et de légère à pas de phénotype visible pour les jeunes animaux et les adultes de moins de 4 mois. Les jeunes animaux qui seront injectés avec des AAV ayant pour but de muter la dystrophine devraient voir apparaître un phénotype semblable aux souris présentant la DMD et donc passer de «pas de phénotype » à un phénotype de sévérité légère. Nous utiliserons également différentes techniques d'injection à différents âges : l’injection intraveineuse dans le sinus retro-orbital, l’injection intra-musculaires, le prélèvement de sang dans le sinus retro-orbital. L’injection intraveineuse et le prélèvement de sang ne seront réalisés qu’une seule fois par animal sous anesthésie. Il s’agit de techniques fiables qui n’induisent pas d’effets indésirables. L’injection intramusculaire qui sera aussi réalisée sous anesthésie provoque une douleur musculaire passagère due à l’introduction de l’aiguille qui endommage les fibres musculaires. Les animaux seront aussi soumis à la mesure de la force de contraction musculaire sous anesthésie finale.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de différencier les cellules musculaires in vitro, ces cellules ne contiennent pas de domaines musculaires (JNM et JMT) et sont toujours immatures. Par conséquent, de nombreux aspects de la DMD ne peuvent pas être modélisés en culture cellulaire. De plus, notre projet vise à étudier l'impact thérapeutique sur la physiologie animale complète qui implique de multiples types de cellules et de tissus. L'expérimentation animale est donc essentielle à la réalisation de notre projet.
Réduction
Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous choisirons un point temporel par condition expérimentale. Grâce à des recherches antérieures approfondies dans le domaine de la DMD, ces points expérimentaux sont déjà bien établis, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux. L’utilisation d’AAV nous permet de produire moins d’animaux pour obtenir nos animaux d’expériences. Nous avons déterminé que 7 animaux par groupe de traitement seront nécessaires afin d'obtenir une robustesse statistique. Nous n'utiliserons que des souris mâles car le gène responsable de la pathologie est localisé sur le chromosome X et les patients atteints sont principalement des hommes. Nous utiliserons également des contrôles internes pour réduire le nombre d'animaux. Pour l'injection intramusculaire, le muscle controlatéral sera injecté avec un virus vide pour servir de contrôle négatif. Pour l'injection intrapéritonéale chez les nouveau-nés, des animaux sans génotype complet mais injectés avec le virus serviront de contrôle négatif. Ces considérations permettent d'éviter de mettre à mort des animaux supplémentaires pour obtenir des échantillons de contrôle.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre traité ou non, type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres traités ou non), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les injections, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les prélèvements sanguins et la mesure de la force musculaire in situ seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter et les animaux seront mis à mort avant leur réveil.
Choix des espèces
Les outils génétiques que nous avons construits sont créés chez la souris car les modifications génétiques utilisées sont mieux établies dans ce modèle. De plus, la souris mutante que nous utiliserons est un modèle de DMD déjà existant et bien connu. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. En fonction de l'objectif des expériences, nous devrons modifier le temps d'injection. Pour obtenir une promesse de thérapie rapide et simple, l'injection intramusculaire sur un jeune animal (6 semaines) est appropriée. Pour obtenir un effet de « sauvetage » (réexpression de la protéine active) et prévenir la maladie, une injection intrapéritonéale précoce sur un nouveau-né est appropriée. Enfin, pour pouvoir guérir une maladie déjà existante ou tardive, l'injection dans le sinus retro-orbital sur un animal âgé (17 mois) est appropriée. Notre projet couvre ces trois scénarios pathologiques. Nous attendrons l’apparition des phénotypes dommageables qui devraient survenir à partir de l’âge de 4 mois pour réaliser le dosage de la créatine kinase sérique, la mesure de la force contractile et collecter les tissus pour les analyses histologiques. Les animaux seront donc testés et mis à mort à l’âge de 6 mois sauf pour l’injection dans le sinus retro-orbital sur animaux âgés qui seront mis à mort à 22 mois.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement du glioblastome : évaluation thérapeutique et dosimétrique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles orthotopiques syngéniques murins
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour comparer des radiopharmaceutiques émetteurs alpha contre le glioblastome, une tumeur cérébrale est greffée par chirurgie stéréotaxique puis le traitement injecté par la même voie, chaque opération durant quarante-cinq minutes. 459 souris vont être utilisées, 333 en souffrance modérée, 120 en souffrance sévère et 6 opérées sans réveil, toutes tuées pour prélever leurs organes. S'ajoutent une IRM hebdomadaire sous anesthésie pendant cent cinquante jours et cinq prélèvements sanguins, le porteur signalant que le traitement peut exposer certains organes à une dose proche du seuil toxique. Le choix de la souris plutôt que du rat est justifié par son poids dix fois plus faible, qui divise d'autant le coût du vecteur radioactif et l'irradiation des expérimentateurs.
Objectifs
Le glioblastome est le cancer du cerveau le plus agressif chez l’homme. Même avec différents traitements, la majorité des patients ne survivent pas plus de 15 mois, car les cellules du glioblastome résistent souvent à la radiothérapie et à la chimiothérapie, même après une opération. Une nouvelle méthode prometteuse est l’utilisation de la radiothérapie interne avec des particules appelées émetteurs alpha. Ces particules peuvent détruire des cellules tumorales qui, normalement, sont difficiles à éliminer. De plus, on a découvert qu’une grande partie des glioblastomes exprime une protéine spécifique à leur surface. Dans nos recherches, nous avons vu que l'utilisation d'un anticorps ciblant cette protéine, couplé à un émetteur alpha a considérablement amélioré la survie des souris atteintes de glioblastome. Le but de notre projet est d'approfondir et d'améliorer ces résultats. Pour cela, nous souhaitons : Comparer nos résultats avec ceux obtenus en utilisant deux nouveaux traitements. Evaluer ces résultats par rapport à un traitement actuellement testé sur des patients. Étendre nos recherche en utilisant un autre modèle de souris avec un glioblastome. Mieux comprendre comment ces traitements se distribuent dans la tumeur et dans le cerveau pour saisir comment fonctionnent ces émetteurs alpha. En bref, nous cherchons à perfectionner un nouveau type de traitement pour améliorer la survie des patients atteints de glioblastome.
Bénéfices attendus
Le succès de la radiothérapie interne vectorisée dépend de deux choses : Une bonne dose de radioactivité : Il faut injecter juste assez de radioactivité pour attaquer les tumeurs tout en préservant les organes sains. L’utilisation d’émetteurs alpha : Ces particules sont prometteuses car elles ont une portée plus courte et une énergie plus élevée que d'autres types, appelés émetteurs bêta. Cela signifie qu'elles peuvent délivrer plus d'énergie directement à la tumeur tout en épargnant les tissus sains voisins, comme le cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre les doses de rayonnement que nos traitements envoient aux tumeurs. Cela nous aidera à choisir le meilleur traitement pour les essais cliniques. En plus de cela, nous allons également étudier comment ces traitements affectent biologiquement et immunitairement le corps. Comprendre ces effets peut renforcer la réponse du système immunitaire des patients, ce qui pourrait les aider à vivre plus longtemps après le traitement. En résumé, nous travaillons à optimiser un nouveau type de traitement pour le cancer qui cible les tumeurs efficacement tout en réduisant les risques pour la santé.
Procédures
Greffe stéréotaxique de la tumeur sur souris analgésiées et anesthésiées (45 minutes) Injection stéréotaxique du traitement sur souris analgésiées et anesthésiées (45 minutes) Suivi IRM hebdomadaire sur souris anesthésiées (15 à 20 minutes) sur 150 jours. Prélèvements sanguins (5) sur souris analgésiées et anesthésiées (1minute)
Impact sur les animaux
La procédure d’étude d’efficacité thérapeutique peut entrainer une exposition proche de la dose toxique pour certains organes. Pour toutes les expériences prévues, c'est l'étape de greffe orthotopique puis l'évolution tumorale qui peuvent induire des nuisances aux souris. A savoir : -1 Les greffes orthotopiques se font par chirurgie ce qui induit de la douleur. Cette douleur est gérée par un traitement analgésique préventif et postopératoire adapté. 2 L'injection en stéréotaxie du radiopharmaceutique se fait par chirurgie ce qui induit de la douleur. Cette douleur est gérée par un traitement analgésique préventif et postopératoire adapté. 3- L'évolution tumorale peut également engendrer de la douleur notamment dans les groupes contrôle.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des traitements est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées avec des frisottis pour pouvoir faire un nid , avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne ce qui permet de déterminer le palier de douleur. L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Par ailleurs, l’imagerie permet de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc de pouvoir, en parallèle de l’observation comportementale, d’adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à la mise à mort. Pendant l’acquisition d’imagerie, les souris sont anesthésiées durant les 15 à 20 minutes de l’examen. Elles sont placées dans une cellule d’imagerie chauffante et une goutte de gel est déposée sur leurs yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Elles sont replacées dans leur cage dès le réveil avec libre accès à la nourriture et à l’eau.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris. Il existe plus de modèles de souris que de rats. Les quantités de vecteur sont proportionnelles au poids de l'animal. Un rat pèse environ 200 grammes et une souris entre 20 et 30 grammes. Il faudrait donc injecter 10 fois plus de vecteur radiomarqué à un rat qu'à une souris pour un coût 10 fois plus élevé et une irradiation multipliée par 10 pour les expérimentateurs. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes et les glioblastome touchent principalement les adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe
Etude d’un candidat médicament sur l’activité quotidienne et les défauts moteurs d’individus atteints de maladies liées au défaut de transport axonal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris utilisées portent les mutations de la maladie de Huntington ou du syndrome de Rett et développent avec l'âge une démarche irrégulière, des tremblements, des difficultés respiratoires et une perte de poids continue. 188 vont être utilisées, dont 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes des mâles. Elles reçoivent un candidat médicament, subissent un prélèvement de sang à la queue au début et à la fin du traitement, et passent des tests de motricité et de force musculaire d'une durée maximale de trente minutes, que le texte ne nomme pas. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et documenter le mécanisme d'action du traitement.
Objectifs
Le projet de recherche vise à étudier l’effet d’un candidat médicament sur l’activité quotidienne, très diminuée chez d’individus atteints de la maladie de Huntington ou du syndrome de Rett. Ce candidat médicament a déjà montré des résultats positifs dans le traitement de symptômes moteurs et cognitifs caractéristiques de ces maladies. Ce projet a donc pour objectif de voir si, en plus d’avoir des effets positifs sur les symptômes des maladies, ce médicament démontre aussi un effet positif sur l’activité quotidienne, très diminuée dans ce genre de maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet permettront de, premièrement, valider que l’administration du médicament possède un intérêt thérapeutique dans un modèle de souris de cette maladie génétique et deuxièmement, d’évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes, ou les ralentir. Ces résultats permettront le développement clinique du médicament ciblant les symptômes de cette maladie avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.
Procédures
Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de la souris au début et à la fin du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin qui n’engendrera qu’un léger stress à l’animal. L’efficacité du traitement sera appréciée par des tests comportementaux, d’une durée maximale de 30 minutes. Ainsi, sur chaque animal, des tests de comportement moteur seront réalisés afin d’évaluer l’efficacité du traitement sur la motricité et sur la force musculaire.
Impact sur les animaux
Les modèles animaux de ces deux maladies présentent des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Les animaux présentent notamment une démarche irrégulière, des tremblements, des difficultés respiratoires et une perte de poids constante, progressive et indépendante de la prise alimentaire.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de ces maladies sont atténués voire résorbés par le traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec notre molécule sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de ces maladies. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Nos précédentes études ont montré que notre molécule améliorait certains symptômes caractéristiques de ces maladies neurodégénératives. Ce projet vise maintenant à étudier l’effet de notre molécule sur l’activité quotidienne, fortement altérée chez les patients atteints de ces maladies. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de ces maladies
Réduction
La variabilité entre individus est réduite par l'utilisation de souches de souris dont le risque de dérive génétique est maitrisé, limitant au minimum le nombres d’animaux nécessaire pour mener à bien ce projet. Ce nombre est par ailleurs validé par des tests de puissance statistiques robustes. Pour les deux modèles, nous limiterons nos études aux mâles puisque les différences phénotypiques mâles/femelles empêchent de regrouper les résultats au sein d’un seul et même groupe de traitement. L’utilisation de femelles obligerait donc à doubler l’effectif d’animaux par groupe afin que la puissance statistique soit conservée.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages dédiées permettant l’étude de l’activité quotidienne sans intervention extérieure, donc sans perturber les animaux. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites adaptés au développement de maladies liées au défaut de transport axonal. De plus, un protocole d’intervention ayant pour but de limiter ou arrêter l’inconfort de l’animal avant que les symptômes ne deviennent trop importants sera mis en place. Par ailleurs, des croquettes ainsi que de l’alimentation hydratée et hypercalorique seront posées à même la cage afin de limiter l’effort que l’animal doit fournir pour se nourrir et s’hydrater. Les tests comportementaux seront réalisés par le personnel compétent et sensibilisé à la contention douce, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ces tests.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de ces maladies.
Impact du microbiote implanté à la naissance par une supplémentation anténatale en Human Milk Oligosaccharides (HMO) sur la prévention de l’allergie alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des femelles gestantes reçoivent un complément alimentaire jusqu'au dix-neuvième jour de gestation, puis sont tuées pour une césarienne. Les nouveau-nés sont confiés à des femelles adoptantes dont la portée est tuée aussitôt le remplacement fait, et les adoptantes le sont à leur tour après le sevrage. La descendance reçoit deux injections d'allergène à vingt-huit et trente-huit jours, puis un gavage à quarante-cinq jours qui déclenche la réaction allergique, chute de température, irritation de la bouche et des oreilles, isolement, avant d'être tuée à son tour. 193 souris vont être utilisées au total, 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et aucun des trois groupes ne sort vivant du protocole.
Objectifs
La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.
Procédures
L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendants au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur la descendance. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.
Devenir
Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes seront mises à mort après le sexage et la fin du sevrage. La descendance seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.
Réduction
Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendants) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.
Choix des espèces
Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles et femelles seront séparés, afin de poursuivre le protococole.
Etude des évènements vasculaires précoces dans la physiopathologie de l’AVC ischémique : développement d’une nouvelle approche en imagerie chez l’animal vigile
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Un AVC est provoqué chirurgicalement chez des souris éveillées, après pose d'un cathéter veineux et, pour 1 280 d'entre elles, d'une prothèse crânienne, l'opération durant de quarante-cinq minutes à une heure et demie. 1 760 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur écarte tout maintien en vie au motif qu'il n'est pas concevable de réhabiliter ou de réutiliser des souris ayant subi une ischémie, et affirme que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité". Deux tests comportementaux sont annoncés pour évaluer la récupération sensorielle et motrice avant l'AVC puis vingt-quatre heures après, sans que le texte précise lesquels.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur à la fois pour la santé publique et pour les patients eux-mêmes. Chaque année environ 17 millions de personnes dans le monde connaitront un épisode d'AVC pouvant entrainer des séquelles plus ou moins sévères voir la mort de l’individu. Actuellement, le traitement des AVC repose sur l’injection intraveineuse d'un médicament aidant à dissoudre le caillot sanguin (tPA ou activateur tissulaire du plasminogène) associée ou non intervention pour retirer le caillot (thrombectomie). Toutefois, seule une faible proportion des patients (moins de 10%) y sont éligibles. L’AVC est donc un problème de santé publique et nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin d’élargir la prise en charge des patients. Pour cela, un travail doit être réalisé afin de se placer dans les conditions les plus proches de la clinique humaine et permettre ainsi de mieux appliquer les résultats obtenus en laboratoire aux phases cliniques. Dans cette volonté d’adopter une démarche translationnelle dans les projets de recherche, un modèle davantage en adéquation avec la clinique doit être mis en place. C’est ce qui a été fait précédemment au laboratoire via la mise en place d’un modèle murin d’AVC ischémique chez l’animal éveillé permettant d’exclure tout impact de l’anesthésie qui pourrait perturber les résultats. Les anesthésiques peuvent modifier le fonctionnement cérébral et notamment la circulation sanguine ce qui peut interférer avec l'évolution de l’AVC mais aussi biaiser les résultats obtenus quant à l’efficacité de certaines traitements. Le but de ce projet est de caractériser les évènements vasculaires survenant au plus proche de l'AVC ainsi que les modifications et altérations des vaisseaux sanguins post-AVC afin de déterminer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques. Les différents modèles utilisés dans cette étude permettront de recréer les différents profils d’AVC ischémiques observés en clinique. Cette étude pourra à terme permettre d'améliorer la prise en charge de patients suspectés d'AVC et minimiser ainsi ses conséquences à long terme. Enfin, une nouvelle méthode d’imagerie par ultrasons sera utilisée pour évaluer si elle peut être utilisée en tant que technique de diagnostic rapide, directement au lit des patients, pour confirmer la présence d’un AVC.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les évènements vasculaires précoces survenant très tôt après le début d'un AVC afin de déterminer leur rôle dans le développement de l'ischémie et des séquelles à long terme. Les différents modèles utilisés dans cette étude permettront d’être au plus proche des situations rencontrées en clinique humaine. Dans ce but, nous proposons de caractériser les différents évènements vasculaires survenant au cours d’un AVC ischémique chez l’animal éveillé à l'aide de deux approches permettant d'induire un AVC avec des caillots sanguins de compositions différentes comme cela est le cas en clinique mais également chez l'animal anesthésié présentant une diversité des zones cérébrales atteintes de part une localisation aléatoire des caillots sanguins formés. Le bénéfice de ce projet serait donc de pouvoir caractériser et étudier les différents évènements vasculaires survenant lors d’un AVC ischémique et cela au plus près de la survenue de ce dernier. Ceci nous permettrait également de comprendre les mécanismes physiopathologiques survenant au plus près de l’AVC et amènerait ainsi l’opportunité de déboucher sur des études cliniques et la possibilité d’augmenter le succès de transpositions de résultats précliniques à la clinique humaine. De plus, ce projet offre la possibilité d'évaluer le potentiel diagnostique d'une nouvelle méthode d'imagerie à ultrasons offrant l'avantage de pouvoir être réalisée au lit du patient. In fine, ce projet offrirait la possibilité d’adapter les pratiques cliniques en modifiant les protocoles de prises en charge et/ou thérapeutiques des patients sujets à un AVC et adopter une approche d'imagerie plus accessible en clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis a: 1 - Pose d’un cathéter intraveineux (n=1760, durée de la procédure :15 minutes); 2 - Chirurgie pour induire un AVC (n=1760 souris, durée de la procédure entre 45 minutes et 1.5 heures); 3 - Pose de prothèse crânienne (n=1280, durée de la procédure: 30minutes); 4 - 5 procédures d'imagerie : (n=1780, durée de la procédure : 30 minutes); 5- 3 protocoles comportementaux : 5.1 Habituation à la contention et aux examens d'imagerie : une habituation par jour pendant 5jours consécutifs, avec des sessions augmentant progressivement de 15minutes jusqu'à 1h30 au total (n=1280). 5.2 2 tests comportementaux pour évaluer la récupération des fonctions sensorielles et motrices (avant induction de l'AVC et 24heures après; durée de la procédure: 5min, n=1760).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux lors de la procédure seraient : - un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, - des douleurs postopératoires après la pose de prothèse, - une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC, - des douleurs post-opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, - un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, - des douleurs post-opératoires après l'induction de l'AVC sous anesthésie, - des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC. Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement dans le cas où une personne compétente atteste de l’état de bien-être de l’animal suite à chaque étape de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet (1760) feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subi une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, les tissus générés permettront des observations histologiques étudiant ainsi l'intégrité anatomique et vasculaire ainsi que les altérations induites suite à la survenue d'un AVC.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, il s’agit d’étudier un modèle vivnat avec tous les mécanismes vasculaires survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo. Ce projet concerne les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre d’étude sur l’AVC et les connaissances acquises notamment dans la réalisation de procédure chez l’animal éveillé rendent l’emploi de la souris particulièrement intéressantes pour les études portant sur l’AVC. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce (souris) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.
Réduction
Conformément à la règle des 3R, avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour obtenir des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs afin de souscrire au principe de réduction . Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. A partir de ces données, nous avons utilisé des outils statistiques afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Ainsi, les procédures décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasif (IRM, échographie) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés et de réaliser un suivi longitudinal contribuant à la réduction des groupes expérimentaux tout en disposant de données obtenues à partir des différents paramètres étudiés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les animaux seront hébergés dans des cages standards. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les cages seront enrichies (coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que des paillettes et un morceau de bois). Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, au comportement de chaque animal et à leur bien-être. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans les neurosciences, et notamment dans le développement de thérapies et d'outils diagnostiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. Les connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’AVC ischémique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. De plus, un travail préliminaire de développement du modèle d’AVC ischémique chez l’animal éveillé a été mené au laboratoire chez la souris et permet d’avoir une expertise pour l’application du protocole. Deux types de souris, présentant des réseaux vasculaires et des réponses à l'ischémie différentes comme observées chez l'homme, seront utilisés. Ces souris sont régulièrement utilisées en recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines (5 semaines lors du début du protocole, et 9 semaines arrivées à la fin du protocole). Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes adultes soit des animaux de même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC nous permettant ainsi de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données obtenues au laboratoire sur les modèles d’AVC. Les animaux seront commandés à l'âge de 5 semaines afin de leur laisser un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement.
Etude des effets thérapeutique et immunitaire de la combinaison chimio-immunothérapie et thérapie ciblées dans les modèles murins de cancers du côlon, du poumon et du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 900 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur greffée sous la peau du flanc et recevant jusqu'à neuf injections d'immunothérapie en trois semaines, plus neuf gavages quotidiens de thérapie ciblée. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner les déplacements et dégrader l'état général, la mise à mort intervenant quand la croissance de la tumeur atteint le seuil fixé. Le but déclaré est d'optimiser des combinaisons de chimiothérapie et d'immunothérapie déjà utilisées en clinique, la perspective d'essais thérapeutiques dans les cancers du poumon et du pancréas restant au conditionnel.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association de traitement anticancéreux (immunothérapie et chimiothérapies) utilisées en clinique dans plusieurs modèles de cancers du côlon, du poumon ou du pancréas chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’évaluer des combinaisons de traitement utilisable chez l’homme et ayant des propriétés anti-tumorales. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre l’impact de ces nouvelles associations sur la croissance du cancer et d’évaluer l’effet qu’ils peuvent avoir sur la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons en particulier à la capacité de certaines chimiothérapies et de thérapies dites « ciblées » (spécifique de la cellule cancéreuse) d’augmenter l’effet des médicaments d’immunothérapies. In fine, notre projet devrait nous permettre d’optimiser l’utilisation de ces traitements et de proposer la mise en place d’essais thérapeutiques dans le cancer du poumon et du pancréas.
Procédures
- Injection sc des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Traitements par chimiothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 30 secondes - Traitements par immunothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum par animal - Durée : 1 minute - Traitements par thérapie ciblée par voie orale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration par jour pendant 9 jours par animal - Durée 1 minute - Traitements par anticorps (ip): - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum par animal - Durée : 1 minute
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Gêne et douleur associées à l’administration des traitements par gavages et par injections en i.p.
Devenir
Dans ce projet deux axes de travail sont prévus : Nous avons prévu de faire des analyses de croissance tumorale et de survie. Lorsque les points limites seront atteints (en lien avec la croissance de la tumeur), les souris seront euthanasiées comme décrit précédemment. Si des souris présentent une guérison à long terme une récupération d’organes (rate, ganglion) et de sang sera faite de manière à évaluer la mémoire immunologique dirigée contre la tumeur. Enfin, nous avons prévu d’étudier la réponse immunitaire dans les tumeurs à différents temps d’analyse.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. Par ailleurs, les thérapies que nous cherchons à évaluer impliquent la présence d’un système immunitaire compétent. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour tous les modèles, les expériences d’immunomonitoring ainsi que les expériences sur le rôle des lymphocytes T CD8, T CD4, NK et de la voie CXCR/IFNAR1 (partie II) ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Certains points limites peuvent survenir, ce qui conduira dans un premier temps à un arrêt des traitements, puis si persistance à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Etude du dialogue cellules épithéliales-fibroblastes dans le cancer colorectal
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une colite est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson pendant six à sept jours, répétée sur plusieurs cycles, avec diarrhées et perte de poids de 5 à 10 %, et des injections dans l'abdomen déclenchent ensuite un cancer du côlon. 5 004 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le dialogue entre cellules épithéliales et fibroblastes du côlon, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur écrit que la colite provoque une douleur qu'il ne peut traiter ni par analgésique ni par anti-inflammatoire, ceux-ci fausseraient les résultats, et détaille par ailleurs les cabanes en carton, la pâtée et le fond musical installés dans l'animalerie.
Objectifs
Le cancer colorectal est le 3° cancer le plus répandu et le 2° cancer qui tue le plus de patients au monde. Les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, présentent un risque accru de développer un cancer du côlon. Les patients atteints d’un cancer du côlon suite à une inflammation présentent un pronostic plus sombre que ceux atteints d’un autre type de cancer du côlon, car l’inflammation chronique augmente leur agressivité. De plus, souvent indolore, il est fréquemment diagnostiqué aux derniers stades de la croissance tumorale, ce qui diminue l’efficacité des traitements proposés aux patients et augmente la résistance des tumeurs à ces mêmes traitements. Malgré l’ampleur de cette pathologie dans la population, les cellules et les molécules responsables du déclanchement et de la progression de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de cas ne sont pas efficacement diagnostiqués puis soignés. Notre projet est centré sur l’étude du dialogue entre les deux types de cellules les plus importantes du côlon. Ces deux types de cellules interagissent entre elles pour maintenir la structure du côlon, le réparer et coordonner la réponse immunitaire mise en place en cas d’agressions. Leur nombre est très fortement augmenté en pathologie et notamment lors d’une inflammation ou pendant la progression du cancer. Découvrir le rôle précis de ces deux types de cellules et les molécules qu’elles libèrent, pourrait ouvrir la voie vers de nouveaux traitements. Les modèles animaux de pathologies intestinales (inflammation aigue et chronique ou cancer du côlon) constituent des outils importants pour étudier le déclanchement et le développement de ces maladies. Par exemple, ils permettent de suivre les changements des tumeurs depuis une tumeur bégnine à une tumeur plus agressive comme cela a été observé chez l’homme. Enfin, les modèles animaux permettent aussi de tester de nouveaux traitements et étudier la réponse des tumeurs à ces traitements.
Bénéfices attendus
Notre projet, centré sur l’étude du dialogue entre les deux types cellulaires majoritaires du côlon, permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes favorisant ou inhibant le développement du cancer colorectal. A court terme, l’utilisation des modèles animaux des colites aigues, chroniques et du cancer colorectal permettront de délimiter les similitudes entre ces pathologies induites chez l’animal et les caractéristiques des maladies humaines correspondantes. A long terme, la description de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans le dialogue entre les fibroblastes et les cellules épithéliales pourront être proposées dans le traitement des patients atteints de cancer colorectal liés à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin.
Procédures
Les seules interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales. Ces injections sont soit unique, comme celle d’un agent inducteur de mutation pour induire un cancer ; soit double, à deux jours d’intervalle, pour induire la perte du gène d’intérêt. Étant donné notre expérience, chaque injection ne dure pas plus 2-3 secondes avant que l’animal ne revienne dans sa cage. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les injections en intrapéritonéal représentent le premier effet indésirable attendu chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance chez les animaux (prostration). Les effets indésirables attendus chez les animaux résultent essentiellement de la prise, dans l’eau de boisson, du traitement qui induit une inflammation localisée au niveau du colon. La prise du traitement pendant 6 ou 7 jours induit une altération de la paroi du colon qui provoque une perte de poids entre 5 à10% chez les souris. Cette perte est due à une mauvaise absorbation des aliments et une perte d’eau suite à des diarrhées. Ces effets apparaissent au jour 6 après le début du traitement pour une perte maximale à jour 8 ou 9, puis les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. Nous n’avons jamais observé une prise d’eau augmentée par les souris au cours de cette procédure, qui pourrait révéler une déshydratation des animaux. D’après la littérature et notre expérience de cette procédure, la perte de poids survient majoritairement lors du 1er cycle de traitement car il est courant que les souris perdent moins de poids lors des deux cycles suivants. Enfin, nos observations des projets précédents montrent que les souris sont susceptibles de développer de multiples tumeurs du côlon avec ce modèle, sans que leur mobilité, leur appétit et leurs relations sociales soient altérées. Comme chez l’homme, la présence de polypes intestinaux est souvent asymptomatique.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans chaque procédure de ce projet seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous pouvons envisager de faire des expériences in vitro sur des cellules épithéliales intestinales et des fibroblastes isolés du colon pour étudier le caractère autonome des modifications génétiques dans ces deux types cellules. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle des nouveaux gènes de notre étude dans le dialogue qui peut se mettre en place entre les cellules épithéliales tumorales et les cellules de l’environnement comme les fibroblastes. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt.
Réduction
La demande de projet actuelle reprend des procédures déjà réalisée sur d’autres lignées de souris (dans une demande précédente). Ceci nous permet de définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe, pour chaque procédure, afin de générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Ce nombre a été validé par le service de statistique de notre institut pour atteindre un chiffre permettant de valider statistiquement les résultats observés.
Raffinement
Les colites entrainent une douleur pour laquelle il n’est pas possible d’administrer de traitement analgésique ni anti-inflammatoire, qui interféreraient avec le processus de régénération/cancérisation et donc modifieraient les résultats de l’expérimentation. La surveillance des animaux se fera de manière accrue lors de visites quotidiennes. Certaines souris pouvant être gênées plus que d’autres par la colite, de la nourriture pourra également être placée à même le sol de la cage pour s’assurer que toutes les souris puissent se nourrir correctement. De plus, elles auront à leur disposition dans la cage de la pâtée alimentaire en complément de leurs croquettes habituelles pour favoriser leur réhydratation. L’administration des produits permettant l’élimination des gènes d’intérêts ou l’induction du cancer se fera par voie intrapéritonéale, en changeant d’aiguille à chaque souris pour éviter que celle-ci ne s’émousse et provoque de la douleur chez les animaux. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu grâce à l'ajout dans les cages de cabanes en carton et de cotons à décortiquer. Un fond musical est assuré pour éviter les variantions sonores trop importantes entre les périodes d’expérimentation et les périodes de repos ce qui pourraient générer un stress supplémentaire chez les animaux.
Choix des espèces
La disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les molécules que nous étudions justifie l'utilisation de ce modèle pour nos expériences. Le protocole d'induction du cancer colorectal que nous utilisons est bien standardisé chez la souris et largement admis comme le modèle de référence mimant au plus près les étapes du développement du cancer suite à une inflammation chronique. Notre étude porte sur le dialogue entre les cellules épithéliales et les fibroblastes du colon. Pour cela, nous éliminerons des lignées de souris dans lesquelles les gènes d’intérêt seront supprimés soit dans les cellules épithéliales soit dans les fibroblastes. Les gènes que nous étudions ont été démontrés comme : - Impliqués dans d'autres types de cancer que le cancer colorectal. - sur-exprimés ou sous-exprimés chez les patients atteints de cancer colorectal sans que leur fonction soit encore parfaitement déterminée. Les animaux seront utilisés à partir de 2 ou 3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer colorectal ou de colites chroniques.
Évaluation de thérapies permettant l’inhibition des canaux mécanosensibles sur la progression des malformations caverneuses cérébrales chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris reçoivent un traitement qui provoque des malformations vasculaires et des saignements dans le cerveau, puis une injection quotidienne pendant quatre mois, soit jusqu'à 81 injections par animal éveillé, auxquelles s'ajoutent douze séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces administrations de source d'une "légère douleur" et l'imagerie hebdomadaire d'un "léger stress", tout en indiquant que les lésions cérébrales entraînent des complications à cinq mois, raison pour laquelle les souris sont utilisées avant quatre mois afin d'éviter la mortalité. Toutes sont tuées en fin de traitement pour prélever les tissus.
Objectifs
L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. L’objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs effets sur des lésions vasculaires qui sont sur le point de se former ou qui sont déjà établies dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester des molécules candidates pour le traitement des angiomes caverneux. L'utilisation de modèles animaux porteurs de la maladie permettra d'évaluer l'efficacité de ces molécules dans un contexte proche de la pathologie humaine. Ces recherches pourraient ainsi représenter une avancée majeure dans la prise en charge des angiomes caverneux chez les patients.
Procédures
L’étude implique une injection quotidienne du traitement aux animaux éveillés, pendant maximum 4 mois. Les animaux vigiles (au maximum 372) recevront 81 injections (une injection par jour, moins de 10 secondes de manipulation) pour l’expérience la plus longue c’est-à-dire 4 mois. L’étude implique également une session hebdomadaire (maximum 12 sessions) d’imagerie non invasive d’une durée maximum d’une heure, réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées. Pour vérification du génotypage, une biopsie à l’oreille sera effectuée sur 20 animaux répartis tout le long du projet.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un traitement afin d’induire les angiomes caverneux impliquant des saignements dans le cerveau. En parallèle, les animaux recevront un traitement expérimental administré quotidiennement, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. Ces administrations peuvent induire une légère douleur. L'évolution des lésions et la réponse au traitement seront suivies par des imageries hebdomadaires qui peuvent engendrer un léger stress. La formation des lésions vasculaires dans le cerveau s’effectue de façon progressive sur 5 mois et peut induire une perte de poids.
Devenir
En fin de traitements, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidats pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animal est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Pour évaluer les effets des traitements, le nombre d’animaux tient compte des risques d’exclusion d’un animal lors de la réalisation des expériences. De plus, le nombre d’animaux pourra être réduit en fonction des résultats d’imagerie. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et analgésique adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué. Une échelle de cotation de douleur sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Ce n’est qu’à 5 mois que les lésions cérébrales entraînent des complications inhérentes à la pathologie. Nous utilisons les animaux avant 4 mois afin d’éviter cette mortalité et la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Nous utilisons les souris dès leur naissance pour induire la maladie et, ainsi, pouvoir évaluer l’effet préventif ou curatif de différentes molécules sur les lésions qui sont sur le point de se former ou qui sont déjà établies.
Etude de la connectivité des différentes populations de neurones granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soixante embryons reçoivent une injection dans le cerveau via vingt-cinq femelles gestantes, et soixante-quinze souris adultes en subissent deux, espacées de onze semaines. 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si les neurones nés pendant la vie embryonnaire et ceux nés à l'âge adulte se branchent sur les mêmes réseaux du gyrus denté, les retombées sur la mémoire étant renvoyées au long terme. La seule nuisance annoncée tient en une ligne, la douleur liée à la chirurgie. Le porteur justifie le choix de la souris par le fait que ce projet fait suite à un autre projet mené chez la souris.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre si les nouveaux neurones produits dans le cerveau, soit pendant le développement, soit à l'âge adulte, s'intègrent aux mêmes réseaux de communication. Nous nous concentrons sur une région du cerveau impliquée dans la mémoire, appelée le gyrus denté. Pour cela, nous allons étudier comment ces neurones se connectent : reçoivent-ils des messages des mêmes types de neurones ? Envoient-ils eux-mêmes des messages à des groupes de neurones similaires ou différents ?
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le fonctionnement du gyrus denté et le rôle des différents neurones qui se forment à différentes étapes de la vie. À long terme, cela nous aidera à mieux cerner leur impact sur la mémoire, les émotions et d'autres fonctions essentielles du cerveau.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection cérébrale pendant la vie embryonnaire (25 min, 60 embryons provenant de 25 gestantes), à la naissance (5 min, 60 souriceaux provenant de 20 gestantes), à 3 semaines (30 min, 60 animaux) ou à 12 semaines de vie (30 min, 60 animaux). Les injections lors de la vie embryonnaire seront réalisées en utilisant des souris gestantes. D'autres animaux recevront deux injections cérébrales, la première à l'âge adulte et la seconde 11 semaines plus tard (75 animaux).
Impact sur les animaux
La nuisance majeure que pourrait subir les souris est la douleur associée à la chirugie.
Devenir
Tous les animaux injectés seront mis à mort car leurs cerveaux sont récupérés pour les analyses.
Remplacement
N'existant pas de modèle in vitro et in silico permettant de reproduire l'environnement complexe caractéristique du gyrus denté (multiples types cellulaires, architecture complexe, afférences variées..) et ce à différents moments de la vie, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal ex vivo ou in vivo.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Pour réduire toute souffrance liée à la chirurgie, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 2- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Un suivi post-opératoire sera assuré afin d'évaluer le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement . Des points limites stricts et précis sont définis pour détecter précocément d'éventuelles souffrances des animaux. Si l'animal est en souffrance, un analgésique sera injecté. Un soin particulier sera également accordé à leurs conditions d’hébergement.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait suite à un autre projet réalisé chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, les neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal: 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance (P0), 3) en période juvénile (P21) et à 4) l'âge adulte (P84). Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.
Etude du rôle bénéfique du régime cétogène et/ou du composé X dans la cicatrisation chez la souris diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Deux plaies sont taillées dans la peau du dos de souris rasées, puis maintenues ouvertes par des disques de silicone cousus, opération d'une vingtaine de minutes par animal. 740 souris vont être utilisées, 560 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 180 un niveau léger, toutes tuées à la fin pour prélever des organes. Les pansements sont changés chaque jour sous anesthésie, et des injections intrapéritonéales quotidiennes alternent d'un côté puis de l'autre, l'objectif déclaré étant de tester si un composé produit lors d'un régime cétogène accélère la cicatrisation chez la souris diabétique. Le porteur écrit que ce composé, produit naturellement par l'organisme, "ne présente donc pas d'effet nuisible", et ne dit rien des deux plaies chirurgicales.
Objectifs
Le composé X est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est altérée comme lors d’un diabète.
Bénéfices attendus
Au-delà des informations fondamentales les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. La cicatrisation de personnes atteintes de diabète est altérée, non seulement elle est plus lente mais les surinfections sont également plus fréquentes. Le composé X est produit naturallement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est diminuée comme lors d’un diabète.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime spécifique ou seront traités par des injections intrapéritonéales du composé X ou seront traités directement en topique avec le composé X. Les 3 traitements seront réalisés sur des souris ayant subi une chirurgie afin d’induire deux lésions cutanées sur le dos de l’animal (modèle de cicatrisation). Les injections intrapéritonéales sont rapides et n’excèdent pas quelques secondes de manipulation. Elles seront réalisées alternativement à droite et à gauche d’un jour à l’autre afin de réduire la douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et antidouleur local. Le temps de raser les animaux, de réaliser la plaie, d’appliquer et de fixer les disques de silicones avec des points de suture, une vingtaine de minutes sont nécessaires par souris. Les pansements des plaies des animaux seront changés chaque jour sous anesthésie. Le temps de changer les pansements, de faire l’acquisition d’images afin de suivre l’évolution de la cicatrisation et d’appliquer le composé X sur les plaies environ 5 minutes sont nécessaires par souris.
Impact sur les animaux
Le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et ne présente donc pas d’effet nuisible sur les animaux.
Devenir
La totalité des animaux (740) sera mis à mort à la fin des 2 procédures pour prélèvement d’organes post mortem.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en oeuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, les souris seront hébergées en cages collectives (3 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique d’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la relative facilitée d'hébergement et de soins, à la grande taille des portées et au temps de génération court. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car l’insulinémie augmente brusquement à partir du sevrage pour atteindre son maximum à l’âge de 2-3 mois puis elle chute.
Etude des mécanismes cérébraux de la prise de décision dans les troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
407 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie de 45 minutes à 1 h 30, avec craniotomie, pour l'implantation d'électrodes, puis des stimulations optogénétiques qui peuvent provoquer des mouvements involontaires, et certaines reçoivent quatre injections intrapéritonéales sous contention. Elles passent des tests fondés sur des récompenses, désignés comme des "jeux de décisions" sans que leur déroulé soit décrit, pour étudier la flexibilité comportementale et le rôle de la protéine Shank3 dans l'autisme. Elles sont tuées pour vérifier l'emplacement des implants, et le porteur affirme que son protocole comportemental "augmente le bien-être des animaux".
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA), caractérisés par des déficits de flexibilité comportementale, résultent parfois d'une mutation monogénique de gènes codant pour les protéines d'échafaudage interagissant avec les récepteurs synaptiques, régulant l'équilibre entre stabilité et plasticité de la force des connexions synaptiques (plasticité synaptique). L'équilibre entre plasticité et stabilité synaptique constitue probablement une base neurale de la "flexibilité" :la capacité à apprendre vite quand l’environnement change, mais à ne pas forcément changer de croyances quand l’environnement est stable. La flexibilité comportementale est un processus central au développement social et cognitif typique des individus, et est fortement altérée dans les TSA. Nous testerons le lien entre les protéines d'échafaudage liées aux TSA, la plasticité neuronale dans le cortex préfrontal, et la flexibilité dans un contexte d'apprentissage.
Bénéfices attendus
Précisement, nous déterminerons: - le rôle causal des aires préfrontales dans la flexibilité - le codage au niveau neuronal de la flexibilité dans les différentes aires préfrontales - le rôle de l'échauffadage des synapses glutamatergiques (protéine "Shank3") dans ces processus.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des neurochirurgies. La durée de l'opération est de 45 minutes à 1h30, avec toutes les précautions possibles pour éviter la douleur (anesthésie gazeuse, anesthéisques locaux, morphiniques en péri-opératoire). Les seules manipulations quotidiennes consisteront en un branchement des implants à électrodes (geste non douloureux). Des injections intra-péritonéales seront réalisées pour certains animaux (4 injections par animal sur la totalité de l'expérience). Le reste des procédures implique des tests comportementaux de type "jeux de décisions", basés sur des récompenses, et décrits comme positifs pour le bien-être animal dans la littérature.
Impact sur les animaux
Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir (artefacts moteurs) et troubler l'activité locomotrice (un mouvement incontrolable mais non douloureux comme lever une patte ou tourner un peu la tête). Les animaux d'une des procédures auront des contentions (pour lesquelles ils seront habitués en douceur) en vue d'injections intrapéritonéales sur quatre jours. La lignée de souris ne présente pas de phénotype dommageable.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour vérifier que les sites stéréotaxiques d'injection et d'implantation sont corrects.
Remplacement
Nous cherchons à évaluer le rôle des neurones pendant le comportement de décision, il est donc impossible de remplacer les méthodes in vivo par des methodes in vitro.
Réduction
Nous avons déjà effectué des expériences similaires (pour étudier d'autres zones cérébrales) ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire. De plus nous développons un modèle informatique de réseau de neurones récurrent capable de modéliser la prise de décision. L'activité électrique des neurones y est fonction des connexions synaptiques, qui elle-mêmes évoluent en fonction de l'activité électrique des neurones et des récompenses reçues par l'animal (plasticité synaptique). ce modèle fournira des prédictions précises sur ce qu'il est important d'enregister comme activité électrique, ce qui réduit le nombre d'animaux.
Raffinement
Pour diminuer et abolir les douleurs chirurgicales, nous utilisons une combinaison d'anesthésiques et d'anti-inflammatoires pendant la chirurgie et en péri-opératoire. De la pommade antifongique ainsi que du désinfectant seront appliqués pour prévenir les infections. Nous stopperons les expériences d'optogénétique en cas d'artefact locomoteur. Le protocole sera interrompu si les points limites définis sont atteints, à savoir une perte de poids durable de l’animal, des signes de souffrances évalués par l’échelle Mouse Grimace Scale et une prostration, malgré les mesures prises. Nous tiendrons une feuille de suivi post-opératoire sur les deux jours suivant l'opération pour évaluer rapidement ces points. Le stress de l’animal sera limité par un enrichissement permanent de l’environnement (igloos, tunnels, nesting), ainsi qu’une habituation quotidienne à l’expérimentateur/rice et à la salle expérimentale. Le protocole de comportement consiste en un jeu de décisions et augmente le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le système de décision (circuit mésocorticolimbique) est plus proche anatomiquement et fonctionnellement entre mammifère (rongeurs et Humains) qu'entre mammifères et invertébrés, poissons ou oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux. Enfin, nos tâches comportementales de type "jeux" ont été spécifiquement développées et adaptées à l'étude des prises de décision de la souris, tout en assurant leur bien-être. Ce projet implique d'utiliser des groupes de souris de même stade de développement (8 semaines) qui est un stade classique dans les études sur les prises de décision (8 semaines étant considéré comme le début de l'âge adulte dans cette espèce).
Méthode de prélèvement pour génotypage de souris génétiquement modifiées en condition d’élevage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un à deux millimètres du bout de la queue sont coupés sur des souriceaux âgés de sept à vingt-trois jours, ou un morceau d'oreille au-delà de vingt-quatre jours, sans analgésie. 92 112 souris sont concernées sur deux ans, dans des procédures classées en souffrance légère, pour génotyper 200 lignées entretenues au profit d'une trentaine d'équipes. Le porteur écrit vouloir prélever "de manière à optimiser au maximum le bien-être animal", et indique dans le même paragraphe qu'aucune analgésie ne pourra être pratiquée, la crème à la lidocaïne étant écartée parce que l'animal se lécherait. Le devenir reste flou, les souris rejoignant d'autres projets, l'accouplement ou le tutorat, et le porteur annonce que les mises à mort d'animaux "non utilisables" seront effectuées "avec parcimonie", sans en chiffrer le nombre.
Objectifs
Unité mixte de service et recherche technologique, notre centre offre une expertise reconnue en génétique de la souris et en immunologie. Nous offrons à nos utilisateurs et partenaires académiques ou privés une suite unique de plateformes technologiques intégrées et spécialisées dans la conception, le développement de modèles de souris pré-cliniques et leur caractérisation en conditions normales et pathologiques (inflammation, auto-immunité, cancer, infection). L’unité de service participe à plusieurs programmes de recherche et alliances nationaux et internationaux portant sur l'immunologie, l'infection, le cancer, et les maladies rares. Nous sommes également membre fondateur de plusieurs Infrastructures nationales et membre de plusieurs consortia internationaux. L'objectif de cette demande est de permettre aux chercheurs pour lesquels nous hébergeons des lignées murines d'identifier et de caractériser leur souris au niveau génétique. Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation et caractérisation de modèles animaux génétiquement modifiés pour les projets de recherche. Il vise à permettre la gestion de 200 lignées murines génétiquement modifiées pour trentaine d’équipes de recherche. L’identification des animaux ainsi que le prélèvement de queue ou de bout d'oreille est un indispensable pour le suivi des lignées murines et la production de lot pour trentaines d’ équipes de recherche et/ou plateformes technologiques hébergées dont les chercheurs et ingénieurs n’ont pas accès à l’animalerie.
Bénéfices attendus
Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation et caractérisation de modèles animaux génétiquement modifiés pour les projets de recherche. Il vise à permettre la gestion de 200 lignées murines génétiquement modifiées pour trentaine d’équipes de recherche. L’identification des animaux ainsi que le prélèvement de queue ou de bout d'oreille est un indispensable pour le suivi des lignées murines et la production de lot pour trente équipes de recherche hébergées dont les chercheurs ne rentrent pas dans l’animalerie. Ce projet permettra de - réaliser une identification permanente de qualité sur les souris afin de les distinguer en fonction de leur génotype - réaliser un prelevement de qualité - identifier et récupérer une biopsie sur les souris de manière à optimiser au maximum le bien-être animal - permettre aux utilisateurs des équipes de recherche de faire un suivi individuel des animaux en fonction de leur caracteristiques genetiques -permettre l’utilisation de ces animaux dans de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société.
Procédures
Biopsie de 1-2mm du bout de la queue : 1 fois par animal dans sa vie (entre 7 et 23 jours de vie) Biopsies d'oreille: 1 fois par animal dans sa vie ( à partir de 24 jours )
Impact sur les animaux
Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation ainsi que pour les parents. La douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements pour analyse génétique (biopsie de la queue et d'un bout d'oreille). Les animaux seront surveillés de façon accrue afin de vérifier leur santé et la potentielle survenue d’infection ou autre pathologie.
Devenir
Les animaux du projet seront utilisés dans des projets scientifiques ou mis en accouplement ou utiliser pour tutorat. Les mises à mort d'animaux car non utilisables seront effectués avec parcimonie.
Remplacement
Dans ce projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous passer du modèle animal. Les projets scientifiques dépendant de notre production de modèle utilisent tous la souris afin de répondre à des questions à l'échelle d'un organisme entier en condition inflammatoire, infectieuse notamment.
Réduction
L'établissement d'élevage gère environ 900 cages de croisements de lignées par an pour lesquelles l'identification individuelle et le génotypage sont nécessaires. Le projet comprend donc 92 112 animaux sur 2 ans. Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin et autorisé. Les demandes d'accouplements sont données par les équipes de recherche via le logiciel de gestion de lignées afin d'accoupler les animaux des génotypes d'intérêt pour leurs projets de recherche. Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien-être animal (SBEA). Sans justification scientifique du maintien en élevage d'une lignée, la cryoconservation de sperme sera systématiquement proposée. Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Concernant le prélèvement d’un bout d’oreille, certaines des équipes hébergées travaillent sur les cellules dendritiques et ont besoin que les oreilles soient non impactées pour leurs expérimentations d’où l’utilisation de la biopsie de la queue. Nous ne pourrons pas effectuer d'analgésie lors de ce prélèvement. En effet la seule analgésie pouvant etre envisagée est la crème à la Lidocaïne. Apres application un temps de pose de trente minutes est nécessaire pour que ce médicament soit efficace. En relâchant la souris après application elle va certainement se laver en se léchant (ou la mère le fera) pouvant provoquer un endormissement de la langue et avoir un effet néfaste sur l’abreuvement de la souris. Les animaux seront hébergés en zone protégée avec leurs parents puis en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft . Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et les signes cliniques seront observés. Un signe clinique sévère entrainera, si des soins ne sont pas envisagés par notre vétérinaire réfèrent, une mise à mort pour souffrance
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme Tous les souriceaux, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés à partir de 7 jours de vie (plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée). Pour la procédure 3 les animaux peuvent être biopsés entre 4 et 8 semaines.