Souris
Etude des facteurs protecteurs contre l’inflammation du cerveau à l’aide d’un modèle animal de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont l'état se dégrade nettement sont tuées immédiatement, puis analysées. 405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 pour l'élevage, mises à mort à un an. Chacune subit un prélèvement de 2 mm au bout de la queue, quatre injections abdominales consécutives, puis deux injections sous la peau et dans l'abdomen d'un mélange qui déclenche une inflammation du système nerveux reproduisant la sclérose en plaques. Le porteur affirme avoir choisi des conditions d'induction produisant des symptômes "modérés", sans douleur ni perte de poids significative, et annonce que les retombées "devraient sans nul doute" ouvrir des pistes thérapeutiques chez l'humain.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du cerveau et de la moelle épinière qui conduit à une destruction progressive de la gaine de protéines qui entoure les neurones. Elle est dévastatrice et conduit à la paralysie du patient. Une partie des cellules immunitaires, les macrophages du cerveau appelés microglies (MG), protègent normalement le système nerveux central du développement de la SEP. Il a été récemment découvert que les MG contiennent une substance nommée la protéine P, qui contrôle la fonction des MG et leur capacité de protection contre les maladies du cerveau. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo le rôle de la protéine P dans la progression de la SEP chez des souris transgéniques, en induisant la maladie par un traitement chimique. Nous étudierons également comment la protéine P modifie l'activité des MG. Nous espérons que notre projet permettra d'identifier de nouveaux outils diagnostics et thérapeutiques dans le contexte de la SEP.
Bénéfices attendus
Le rôle de la protéine P dans un modèle murin de SEP n'a jamais été testé et permettra de confirmer des résultats préliminaires in vitro sur son rôle dans la progression de la SEP. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics, et peut-être thérapeutiques, en découvrant les gènes contrôlés par la protéine P dans les MG, qui seront des cibles thérapeutiques potentielles. Les retombées de ce travail seront utiles pour la compréhension des mécanismes pathologiques de la SEP et devraient sans nul doute faire découvrir de nouveaux outils de prévention et des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.
Procédures
Les souris auront une biopsie de la queue, qui consiste à prélever 2 mm de l'extrémité de la queue. Elles recevront pendant quatre jours consécutifs une injection dans le ventre d'un produit permettant de supprimer la protéine P chez les souris ayant une modification génétique spécifique. Cette injection dure moins de deux minutes. Quatorze jours plus tard, les souris recevront deux injections sous la peau et dans le ventre d'une combinaison de substances produisant le modèle de sclérose plaques chez l'animal. Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour éviter tout stress chez l'animal. Toutes les souris seront observées quotidiennement pour évaluer l'évolution de la pathologie. Celles présentant une dégradation importante de leur état seront immédiatement euthanasiées et analysées.
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue peut causer une brève douleur et un léger saignement qui seront arrêtés par une légère pression exercée localement.Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Clorhexidine). Des injections répétées pendant quatre jours consécutifs peuvent être une source de stress pour les animaux.
Devenir
Les 45 souris utilisées pour l’élevage seront euthanasiées à l’âge d’un an. Les 360 souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude (10 à 15 semaines pour les souris euthanasiées au pic de la maladie et 12 à 17 semaines pour les souris euthanasiées 30 jours après induction de la maladie). Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées dans le cerveau de ces souris.
Remplacement
Toutes les données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages (MG) du cerveau et contrôle leur fonction. La lignée de souris qui n’exprime plus P dans les MG nous permettra de mimer au mieux la sclérose en plaques, une maladie très sévère qui conduit à la paralysie des patients et à leur mort. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues par d’autres méthodes, étant donné la complexité physiologique du développement de la sclérose en plaques. Nous sommes donc obligés de travailler à l'échelle de l'organisme. L'inactivation de la protéine P ne peut être réalisée que sur l'animal et la complexité du cerveau ainsi que les interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués dans la maladie ne peuvent pas être reproduites in vitro par des cultures cellulaires.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir des résultats robustes qui pourront ensuite être transposés chez l’homme. L’induction de la maladie sera réalisée en trois séries d'expériences : 1). - pour suivre l’état clinique des animaux pendant un mois ; 2) - pour isoler les macrophages du cerveau (MG) au pic de la maladie et les analyser ; 3)- pour isoler les macrophages du cerveau des souris avec ou sans la protéine P, en absence de la maladie. Cette dernière étape nous indiquera des marqueurs qui pourront être utilisés pour prédire la progression de la maladie. Le nombre total de souris est de 360. 45 souris seront utilisées comme géniteurs dans l'élevage. Pour réduire le nombre total de croisements et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, parce que la maladie SEP ne montre pas de différence due au genre.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées par groupe de cinq dans des cages ventilées. La température, l'humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec un bâtonnet en bois, des cotons et du kraft, pour permettre aux souris de jouer et avoir une activité diversifiée. Avant les injections sous-cutanées, les souris seront anesthésiées pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. D’ailleurs, nous avons choisi des conditions d’induction de la maladie qui permettent un développement modéré des symptômes de la maladie sans induction de douleur et sans perte significative de poids des aliments spécifiques qui permettront aux souris de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Le suivi des souris malades deux fois par jour permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance. Enfin, nous nous attendons à ce que le blocage de la protéine Pax6 induise la maladie plus tôt et avec un phénotype plus marqué. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris, car c'est le meilleur modèle pour créer des animaux transgéniques et comparer le développment des maladies chez ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des maladies humaines. Toutes nos données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages du cerveau et régule l'état inflammatoire de ces cellules. La lignée de souris qui permet d'inactiver la protéine P chez l’animal adulte, exclusivement dans les microglies (les macrophages du cerveau), est un modèle idéal pour étudier le rôle de la protéine P dans le développement de la sclérose en plaques (SEP). Ce modèle de SEP chez la souris est de loin le meilleur moyen de mimer la SEP humaine, l'une des maladies les plus sévères et dévastatrices, liée à une activation aberrante des microglies, qui sont les macrophages du cerveau, et qui jouent un rôle protecteur contre l'inflammation du cerveau. Toutes les souris devront être adultes, âgées de 6 à 8 semaines, parce que la maladie SEP se développe chez l'être humain adulte.
Gestion de la production de 2 lignées de souris transgéniques utilisées comme modèles de l’hypophosphatémie liée à l’X
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Sur les 1 100 souris que cet élevage fera naître, 710 seront tuées parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, 150 gardées vivantes pour la reproduction et 240 intégrées à des projets de thérapie génique. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au titre de la gestion de deux lignées modèles de l'hypophosphatémie liée à l'X. L'unique acte déclaré est une biopsie de moins de 2 mm à l'oreille, pratiquée aux ciseaux sur animal vigile pour le génotypage, décrite comme une douleur "légère et passagère". Seuls les mâles porteurs de la mutation serviront de modèle, les femelles hétérozygotes n'exprimant que peu ou pas d'anomalie, ce qui explique le nombre de souris tuées sans avoir été utilisées.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de produire des souris utilisées comme modèles de l'hypophospahtémie liée à l'X appartenant à deux lignées très proches l'une de l'autre qui différent par leur fond génétique : HypDuk-BALB/c et HypDuk-B6. On parle de lignées congéniques. Chez les patients, l' hypophosphatémie liée à l'X est une maladie génétique héréditaire qui se manifeste par du rachitisme pendant la croissance et des atteintes musculo-squlettiques chez l'adulte. Elle est due à une mutation sur un gène dit "phex" qui fait que lorsque cette anomalie génétique et présente, elle se traduit par un défaut de minéralisation elle-même liée à une perte de phosphate au niveau des reins et une baisse de phosphate dans le sang. Les hommes et les femmes sont tous deux affectés par cette maladie car l'anomalie génétique est dominante. Les souris prises comme modèles de cette maladie dans ce projet ont un taux de phosphate dans le sang faible mais qui ne se traduit pas par des atteintes osseuses comme chez les patients. Ainsi, bien que le gène altéré est dominant chez les patients et affecte les hommes et les femmes, les femelles souris dites hétérozygotes qui possèdent un exemplaire du gène muté et un exemplaire du gène sain expriment peu ou pas d'anomalie . De fait, seuls les mâles portant la mutation sur le chromosome sexuel seront utilisés comme modèle d'étude et de thérapie génique de la maladie.
Bénéfices attendus
Cette demande s'inscrit dans le projet de développement d'une thérapie génique pour l'hypophosphatémie liée à l'X. Ces procédures justifient la production des colonies HypDuk-Balb/c et HypDuk-B6 et leur gestion.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de moins de 2 mm de diamètre à l'oreille pour le génotypage. Une paire de ciseaux fins sera utilisée à cet effet qui sera désinfectée à l'alcool et rincée à l'eau stérile entre chaque prélèvement. Cet acte est exécuté par du personnel zootechnique entraîné et ne nécessite que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement à l'oreille réalisé à des fins de génotypage est le seul effet indésirable du projet. Il induit une douleur légère et passagère.
Devenir
- 240 animaux seront inclus dans des projets scientifiques de thérapie génique pour traiter l'hypophosphatémie - 150 animaux seront gardés en vie pour les besoins de la reproduction et la gestion des élevages - 710 animaux seront euthanasiés car ne présentant pas un génotype d'intérêt pour l'expérimentation ou la reproduction.
Remplacement
Dans le cadre du projet de développement d'une thérapie génique pour le traitement de l'hypophosphatémie liée au chromosome sexuel X, nous avons nécessairement besoin d'utiliser le modèle animal car: i) Nous mesurons des paramètres biochimiques dans les fluides biologiques tels que le taux de phosphate dans le sang ; ii) Nos vecteurs de thérapie génique agissent simultanément dans différents compartiments sur le foie, les reins, et les os ; iii) Nous avons besoin d'un organisme corps entier pour évaluer les réponses de l'organisme à notre traitement comme les réponses immunitaires dirigées contre nos vecteurs et qui peuvent en affecter l'efficacité. Il n'existe donc pas de remplacement possible aux prélèvements de tissus et de sang à partir desquels nous procéderons à des explorations fonctionnelles dans le cadre de projets de thérapie génique pour le traitement de l'hypophosphatémie liée à l'X.
Réduction
La production des 2 lignées de souris objet de ce projet repose sur des croisements spécifiques et des stratégies d'accouplement en sorte d'adapter au plus juste la production aux besoins expérimentaux des projets de thérapie génique. Notre équipe dispose d'un historique lui permettant d'ajuster le nombre d'accouplement en tant que de besoin. A l'origine de cet historique, le nombre de couples avait été mis en place à l'aide d'un outil qui relie le nombre de reproducteurs nécessaires aux objectifs de production.
Raffinement
Pour la biopsie de l'oreille à des fins de génotypage, les souris vigiles seront maintenues en contention (manuelle) par du personnel zootechnique entrainé qui possède une parfaite maitrise du geste de manière à prélever moins de 2 mm de tissu sans saignement. Lorsque l'animal est remis dans sa cage, il est surveillé pendant au moins 5 minutes pour détecter un éventuel comportement qui traduirait une gêne occasionnée par l'acte.
Choix des espèces
A notre connaissance, les seuls modèles animaux mimant l'hypophosphatémie liée à l'X sont les deux modèles murins objets de cette demande. Les animaux sont prélevés à 7 jours.
Rôles du facteur de transcription hypothalamique Mafa dans la régulation physiologique du sommeil chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois heures de chirurgie pour poser des électrodes crâniennes, puis six semaines d'isolement dont trois passées seule dans un baril de plexiglas : 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. L'objet du projet est d'établir si le dysfonctionnement d'un groupe de neurones de l'hypothalamus explique les troubles du sommeil qui accompagnent le diabète. Le porteur reconnaît que cet isolement peut induire un stress, qu'il qualifie de léger et rapidement estompé, et met en avant les contacts visuels et olfactifs conservés entre quatre barils voisins. Il écarte la mouche et le poisson zèbre, dépourvus de sommeil paradoxal, et juge que les organoïdes, les cultures sur puces et l'intelligence artificielle "ne constituent pas encore d'alternatives crédibles".
Objectifs
Le diabète est fréquemment associé à des troubles du sommeil (fragmentation, cauchemars, apnées, fatigue diurne) et de la température corporelle (sueur, hypothermie). Notre équipe a récemment observé chez la souris qu’un gène contrôlant la fabrication de l’insuline par le pancréas jouerait également un rôle dans une région du cerveau impliquée dans des fonctions vitales comme le sommeil et la thermorégulation. Conduit chez la souris, ce projet expérimental vise donc à (1) caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones de cette région du cerveau ; (2) étudier leur lien avec le glucose ; et (3) établir dans quelle mesure leur disfonctionnement pourrait être responsable des troubles du sommeil liés au diabète. Seul le troisième axe de ce projet plus large fait l’objet de cette présente DAP.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à renforcer nos connaissances sur le sommeil physiologique mais aussi pathologique accompagnant le diabète et des troubles de la température corporelle. Nos travaux et ceux de nos collaborateurs apporteront un éclairage nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir sur le long terme des pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles du sommeil chez les patients diabétiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale (3h) sous anesthésie et analgésie générales requises pour la pose des électrodes permettant d’enregistrer le sommeil. A l’issue de la chirurgie, les souris seront placées à l’isolement partiel pendant 6 semaines dont 3 en cage double avec séparateur pendant la récupération post-opératoire et 3 en baril individuel pendant les enregistrements. Ce baril sera placé dans une enceinte contenant 3 autres barils. Quelques interactions sociales sont ainsi maintenues sans contact tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure est classée de sévérité modérée. Les lignées de souris transgéniques mises en œuvre dans ce projet sont normales et viables. L’anesthésie chirurgicale entraîne une légère baisse de la température corporelle rapidement compensée par l’utilisation d’une couverture chauffante. Chirurgie : possible douleur au réveil, contrôlée par des médicaments appropriés. Récupération post-opératoire en quelques heures en cage double avec grillage facilitant des interactions sociales sans contact. Lors de l’enregistrement du sommeil, chaque souris sera hébergée dans un baril individuel placé dans un caisson contenant 3 autres barils, facilitant ainsi quelques interactions sociales. Cet isolement peut induit un léger stress qui s’estompe rapidement au cours de la période d’habituation à ce nouvel environnement. Les expérimentations induisent une perturbation réversible transitoire du rythme veille-sommeil (3h) qui fait l’objet de la présente étude.
Devenir
Toutes les souris pour ce projet de recherche seront mises à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement des cerveaux.
Remplacement
Il est impossible d’étudier une fonction vitale comme le sommeil hors d’un organisme vivant. Aussi, les modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire, comprendre et modéliser des mécanismes neurobiologiques complexes. La souris est particulièrement bien adaptée aux études neurophysiologiques (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge, lignées génétiquement modifiées). Par ailleurs, ses mécanismes nerveux du cycle veille-sommeil sont communs à tous les mammifères, incluant l’homme. Des animaux moins évolués comme la mouche ou le poisson zèbre sont parfois utilisés (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal et leur cerveau ne présente pas la même complexité anatomique et fonctionnelle. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation et l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces ou les organoïdes mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles et pertinentes aborder des processus aussi complexes que le sommeil et comprendre des pathologies qui l’affectent comme le diabète, les apnées du sommeil ou la narcolepsie.
Réduction
Notre estimation porte sur un besoin de 80 souris réparties en 8 lots expérimentaux. Les expériences proposées ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux tout en maximisant les effets statistiques. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos études chez la souris publiées récemment. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes de la procédure expérimentale, la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des conditions d’enregistrement du sommeil au cours du temps pouvant rendre les interprétations fonctionnelles aléatoires, mais aussi la nécessité́ de ne pas compromettre la reproductibilité́ et la significativité́ des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques adaptés aux petits échantillons).
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès la phase post-opératoire pour optimiser leur récupération (médicaments adaptés si nécessaire, suivis du poids, de la mobilité et du comportement). Notre préoccupation est de détecter rapidement si certains paramètres physiologiques et comportementaux se dégradent pendant la procédure, constituant des points limites avec mise à mort pour prévenir une quelconque souffrance. Pour la durée de la procédure, chaque animal est hébergé dans un baril individuel en plexiglas transparent. Quatre barils sont placés dans le caisson d’enregistrement pour que les animaux gardent des contacts visuels, auditifs, olfactifs, limitant les effets possiblement angoissants liés à l’isolement social. Des enrichissements conventionnels (roue, coton, bâtonnet de bois, lanière de carton) sont fournis pour la fabrication du nid et réduire l’anxiété générée par cet isolement social. Les souris sont habituées à ingérer volontairement, sans intervention de l’expérimentateur, le principe actif à la dose de travail pour éviter le stress intense provoqué par leur manipulation lors d’une injection par piqure, avec des effets physiologiques confondants évidents sur le sommeil.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées ouvrent d’immenses possibilités de recherche scientifique sur des mécanismes nerveux complexes. Il est ainsi possible de corréler l’action d’un gène avec à une fonction vitale comme le sommeil. La compréhension de ces mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par des techniques encore impossibles chez l’homme mais applicables chez la souris. Des animaux plus simples que la souris sont parfois utilisés (mouches, poissons rouges etc) mais ils ne sont pas pertinents pour comprendre le sommeil et ses fonctions chez l’homme. Des souris jeunes adultes (3-5 mois) seront utilisées car leur sommeil est mature et consolidé à cet âge-là.
Rôle des hormones dans la régulation du métabolisme chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à quinze injections, subir vingt-huit jours consécutifs de contention et d'administration hormonale par pousse-seringue, puis passer sept jours seule en cage métabolique. S'y ajoutent, selon les groupes, une injection bilatérale dans le crâne de vingt-cinq minutes, la pose de canules ou de pompes osmotiques sous la peau, trois mois de régime obésogène et un jeûne de six heures. Toutes sont tuées à l'issue, la moitié pour prélever cerveau, foie et tissus adipeux, l'autre moitié lors d'une chirurgie menée sous anesthésie sans réveil. Le bénéfice annoncé, de nouvelles stratégies contre l'obésité, l'anorexie et le déclin métabolique lié à l'âge, tient en une phrase au conditionnel, et l'effectif n'est justifié que par la mention d'un "nombre minimum d'animaux le plus réduit possible".
Objectifs
Comme chez les humains, les souris possèdent des récepteurs et des hormones similaires que l'on peut étudier pour mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme. L'objectif de cette étude est de comprendre comment les hormones régulent le métabolisme en agissant sur le cerveau chez les souris : - Nous nous intéresserons dans une première partie à ces mécanismes de régulation du métabolisme dans le cadre d'un régime alimentaire conduisant à l'obésité. - La seconde partie s'intéressera aux effets du vieillissement sur ces mécanismes de régulation. Il est bien établi que le vieillissement est associé au déclin du métabolisme mais aussi des taux sanguins des hormones : notre objectif est de savoir si un lien existe entre ces deux déclins dans la dérégulation du métabolisme chez le sujet âgé.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l'obésité et/ou l'anorexie mais aussi pour ralentir et limiter le déclin du métabolisme associé au vieillissement.
Procédures
- Injections intrapéritonéales (5 max par souris ; durée
Impact sur les animaux
Les différentes injections sous cutanées ou intrapéritonéales peuvent induire un stress et une douleur légère de courtes durées. Lors de l’intervention chirurgicale (10 ou 25 minutes par souris), l’anesthésie conduit à des modifications physiologiques transitoires de l’animal. La perforation et l’ouverture du plan cutané entrainera une nuisance directe de cet acte le temps de la cicatrisation des tissus osseux et cutanés d’une durée de plusieurs jours. Suite à la chirurgie, les plaies chirurgicales peuvent présenter des signes d'infections ou d'inflammation. La pose de pompes osmotiques et de canules d'administrations locales peut entrainer une gêne légère et nécessitera un temps d'adaptation pour les souris. Pour les administrations locales, la contention de l'animal peut générer également un stress transitoire. Lors de l’étude du comportement alimentaire et pour la mesure des paramètres métaboliques, les animaux sont isolés dans leur cage métabolique (nouvel environnement pendant 7 jours) pour recueillir les données individuelles. Cet isolement est incontournable et peut générer un stress léger transitoire. Le jeûne de 6h sera réalisé pendant la période d’activité des animaux (période nocturne) et peut générer des troubles relationnels (agressivité modérée). Suite au jeûne, l’incision du bout de la queue pour les prélèvements de sang pour les tests de la glycémie peut éventuellement générer un stress très furtif.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Une moitié d’entre eux sera utilisée pour la collecte de structures cérébrales et d’organes périphériques (foie, tissus adipeux...) pour des études de biologie moléculaire. La seconde moitié fera l’objet d'une chirurgie sans réveil sous anesthésie (études histologiques).
Remplacement
Une veille bibliographique a été réalisée pour ce contexte scientifique. A ce jour, il n’existe pas dans la littérature de modèle de remplacement pour étudier le comportement alimentaire animal. Pour réaliser les tests de comportement alimentaire et mesurer le métabolisme énergétique, nous devons utiliser des animaux vivants.
Réduction
L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux le plus réduit possible. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale profonde pour éviter toute douleur et des antalgiques sont prévus en pré et post-opératoire. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront regroupées et placées en cages dans un milieu enrichi pour réaliser une nidification à façonner (matière fibres végétales). Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Les gènes des récepteurs hormonaux sont exprimés aussi bien dans le cerveau de l'homme que dans celui de la souris. La souris présente l’avantage de faciliter en termes d’élevage et de reproduction. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Des souris jeunes adultes (3-7 mois) ou âgées (16-19 mois) seront utilisées. Ces deux niveaux d’âges nous permettent ainsi d’évaluer l’effet du vieillissement sur les processus de régulation du comportement alimentaire et du métabolisme énergétique.
miR-Gut | Rôle des microRNAs hépatiques et du microbiote intestinal dans les maladies métaboliques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des souris utilisées est de lignée ob/ob, obèse par construction génétique, les autres étant rendues obèses par trois mois de régime à 60 % de matières grasses. 300 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections dans la queue trois fois par semaine pendant deux semaines, puis subissent trois tests métaboliques successifs, chacun exigeant une incision de la queue et jusqu'à huit prises de sang échelonnées sur deux heures, avec un risque d'hypoglycémie marquée pour les souris témoins. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes, le porteur affirmant que le recours à l'animal est "irremplaçable" faute de modèle in vitro reproduisant l'effet du microbiote intestinal.
Objectifs
Ce projet a pour but de comprendre le rôle des miRs hépatiques dans les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2, surtout en ce qui concerne la physiopathologie hépatique, en relation avec le microbiote intestinal et ses altérations. En effet, aujourd'hui nous avons bien identifé le rôle clé du microbiote intestinal dans la physiopathologie des maladies métaboliques. De plus, les altérations du microbiote intestinal, dites dysbioses, induisent et aggravent la stéatose hépatique, qui caracterise obésité et diabète de type 2. Par contre les mécanismes moléculaires qui gouvernent la stéatose hépatique ne sont pas encore clairement identifiés. Les microRNAs ou miRs, sont des petites ARNs capable de reguler l'expression génique et leur expression est sous contrôle du microbiote intestinal. De plus, nous avons montré que les miRs hépatiques sont fortement corrélés au degree de stéatose hépatique et au microbiote intestinal. Pour cela, dans ce projet nous comptons moduler les miRs hépatiques et le microbiote intestinal, afin de moduler la stéatose hépatique.
Bénéfices attendus
Identification des miRs hépatiques qui controlent la physiopathologie du foie et qui sont sous contrôle du microbiote intestinal. Cela pourrait permettre la mise en place d'une thérapie basée sur la modulation des miRs hépatiques, comme c'est déjà le cas pour les thérapies qui modulent les miRs du pancrèas dans le cadre des cancers pancrèatiques.
Procédures
Injection intracaudale sur animaux vigiles de molécules anti-miRs, trois fois par semaine, sur deux semaines. Test intrapéritonéale de tolérance à l’insuline (IPITT) : une goutte de sang sera prélevée à la veine caudale aux temps 0, 10, 30 et 60 minutes après la première injection d’insuline ; une incision à la queue de moins de 0,5 mm sera réalisée pour la mesure de la glycémie. Test orale de tolérance au glucose (OGTT) : une goutte de sang sera prélevée à la veine caudale aux temps -30, 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après la première injection de glucose, une incision à la queue de moins de 0,5 mm sera réalisée pour la mesure de la glycémie. Test intrapéritonéale de tolérance au pyruvate (IPPTT) : Une goutte de sang sera prélevée à la veine caudale aux temps -30, 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après la première injection de pyruvate, une incision à la queue de moins de 0,5 mm sera réalisée pour la mesure de la glycémie. Chaque test ci-dessus sera réalisé une seule fois par procédure.
Impact sur les animaux
Des éventuels effets indésirables lors de tests métaboliques pourraient être liées à une réponse trop importante lors du test de tolérance à l’insuline et donc à une hypoglycémie importante, surtout chez les souris contrôles sous régime normal. Pour cela, du glucose 5% sera éventuellement utilisé pour augmenter la glycémie rapidement. Pour les souris ob/ob, le risque est d'avoir une hyperglycémie trop importante (marquée HI sur le glucomètre) : dans ce cas, pas prevu avec la dose de glucose envisagée (0,5 mg/Kg), le plan d'action prevoit de surveiller l'animal, retest 30 min après, et eventuellement animal sorti du protocole et mis à mort par dislocation cervicale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes et réaliser les analyses moléculaires organe-spécifiques.
Remplacement
L’utilisation des méthodes alternatives in vitro a permis de mettre en évidence les effets de la modulation des miRs au niveau cellulaire. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car aucun modèle in vitro ne permet de récapituler l’impact du microbiote intestinal dans ce type de modulation.
Réduction
Le n=10 prévu pour chaque groupe nous permettra d’attendre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés. Pour l'analyse d'un paramètre, par exemple la glycémie, entre deux groupes de souris, nous utiliserons un test non apparié. Pour l’analyse de deux ou plus paramètres comme la glycémie et le temps, par exemple lors d’un test de tolérance au glucose, nous utiliserons l’analyse 2-ANOVA. Une veille de la littérature est effectuée constamment afin de ne pas répéter des expériences déjà réalisée par d’autres travaux scientifiques. Les animaux contrôles ne pourront pas être mutualisés pour plusieurs expériences, car cela ne permettrait pas de comparer les microbiotes intestinaux au même temps.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en raison de 3 souris maximum par cage moyenne ou 6 souris maximum par grandes cages (adaptées à partir de cages de rats), à cause de leur état d'obésité. Des points limites adaptés sont prévus en fonction de l'évolution de l'état d'obésité des souris : hyperglycémies précoces (HI sur le glucomètre) à l’état nourri et /ou à jeun des souris sous régime gras ou des souris ob/ob.
Choix des espèces
Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’Homme, surtout en condition pathologique. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’Homme pourrait être faite rapidement. Nous utiliserons des souris de 18 semaines d’âge au moment des traitements avec les sondes anti-miR d’intérêt. Cet âge tient compte du traitement par régime gras 60%HFD (3 mois). Dans ce dernier cas, les souris à traiter avec le régime gras diabétogène/obésogène arriveront à l’âge de 4 semaines et commenceront le traitement régime gras à 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 16 semaines.
Etude pilote pour l’implémentation d’une nouvelle technique d’Induction des cancers du foie
- Recherche appliquée
- Cancers
Une injection unique sous anesthésie, une échographie deux semaines plus tard, puis une imagerie chaque semaine pendant six semaines : 180 souris suivent ce protocole pendant que se développe dans leur foie une tumeur qui peut comprimer les organes, provoquer une jaunisse et des métastases, et gêner leurs déplacements. Les procédures sont classées en niveau de souffrance sévère. Le porteur présente pourtant ce projet comme une manière de rendre les expériences "plus éthiques" et d'améliorer le bien-être des animaux non-humains, en remplaçant une technique d'induction jugée trop complexe. Toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever les tumeurs et les foies.
Objectifs
Nous allons mener une étude pilote dans le but de développer un modèle d'étude du cancer du foie. L'objectif est de créer une méthode plus accessible, facile à mettre en place, et moins invasive pour les animaux. Actuellement, les méthodes utilisées pour étudier le cancer du foie peuvent être complexes et nécessiter des procédures invasives qui peuvent nuire au bien-être des animaux. En testant cette nouvelle approche, nous cherchons à rendre les expériences scientifiques plus éthiques tout en obtenant des résultats fiables pour mieux comprendre cette maladie.
Bénéfices attendus
Nous allons remplacer une technique actuellement utilisée, qui est complexe et difficile à mettre en œuvre, par une autre méthode qui sera non seulement plus simple à réaliser, mais aussi moins stressante pour les animaux. L'objectif est de réduire le stress que ces techniques peuvent entraîner pour les animaux, tout en continuant à obtenir des résultats fiables et pertinents pour la recherche. En adoptant cette nouvelle approche, nous espérons améliorer le bien-être des animaux tout en maintenant la rigueur scientifique nécessaire pour faire avancer nos connaissances.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique, réalisée sur animaux anesthésiés qui durera moins d’une minute. Le suivi commencera par une échographie deux semaines après l'injection, puis les animaux seront imagés à partir de la troisième semaine, et ce, chaque semaine pendant six semaines, avec une échographie hebdomadaire. Les échographies seront réalisées sur animal anesthésié et dureront 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’injection entraine du stress de contention et une perte de conscience, puis un développement de tumeur qui peut entrainer une compression des organes, une jaunisse, des métastases et des difficultés à se déplacer.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
L'injection sera effectuée sous anesthésie et analgésie. Pendant les 14 jours d'acclimatation, les souris seront laissées sans manipulation pendant 2 à 3 jours, puis progressivement habituées à la contention afin de minimiser le stress. Les animaux seront logés en cages collectives (maximum 5 par cage) sur des portoirs ventilés, avec un environnement enrichi comprenant des tubes en coton pour la nidification et des briques de tremble pour leur permettre de ronger. Des points limites ont été définis pour prévenir toute souffrance animale. En cas de douleur, des traitements analgésiques seront mises en place pour soulager les symptômes.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 6 à 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.
Effets d’une exposition gestationnelle au PFOS à un niveau représentatif de l’exposition de la femme enceinte sur le rôle du placenta dans la régulation des apports en hormones thyroïdiennes de la mère au foetus
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour le prélèvement de leurs placentas et de leurs fœtus, 68 souris femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un composé perfluoré par l'eau de boisson après un gavage initial, sont pesées deux fois par semaine, subissent jusqu'à deux lavages vaginaux, puis une injection d'hormone thyroïdienne et une prise de sang sous sédation. L'effectif se déduit d'un calcul : six temps de prélèvement, quatre souris par temps, deux groupes, soit 48 femelles gestantes, portées à 68 parce que la mise à la reproduction n'aboutit que dans 70 % des cas. Le porteur écarte l'usage de placentas humains recueillis après un accouchement, au motif qu'ils ne renseigneraient pas sur la formation du placenta.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer si une exposition gestationnelle à un contaminant environnemental à des niveaux représentatifs de l’exposition de la femme enceinte peut altérer la fonction placentaire régulant les apports en hormones thyroïdiennes de la mère au fœtus. Pour cela, nous caractériserons, conjointement dans les compartiments maternel et fœtaux, l'évolution des concentrations d'une hormone thyroïdienne au cours du temps suite à une administration de cette hormone chez la souris.
Bénéfices attendus
Les composés perfluorés sont très persistants conduisant à une exposition importante des populations humaines. Des études suggèrent un lien entre une exposition pendant la grossesse à ce type de composés et des perturbations des fonctions thyroïdienne et placentaire. Or, un apport adéquat d’hormones thyroïdiennes de la mère au fœtus régulé par le placenta est critique pour le développement du système nerveux central. Dans ce projet nous testerons l’hypothèse qu’une exposition à un composé perfluoré peut altérer les échanges fœtaux maternels en hormones thyroïdiennes. Le projet devrait fournir des bases scientifiques pour une meilleure en prise en compte de l’exposition des femmes enceinte à ce composé et ainsi contribuer de façon significative à l’analyse du risque pour la santé humaine de ce contaminant.
Procédures
Administration du contaminant : 1 fois, maximum 30 secondes. Pesées bi-hebdomadaires : maximum 1 min/pesée. Lavage vaginal : 2 fois maximum, maximum 2 min/lavage. Administration d'hormone thyroïdienne sous sédation : 1 fois, maximum 3 min. Prise de sang sous sédation : 1 fois, maximum 30 secondes.
Impact sur les animaux
La dose en contaminant administrée aux souris est faible et des données préliminaires indiquent que le traitement n'induit pas d'effet toxique détectable en termes de prise alimentaire, abreuvement, prise de poids, comportement, nombre de foetus. Dans de rares cas, un hématome peut se collecter lors de l'administration de l'hormone thyroïdienne. Le prélèvement de sang présente une nuisance limitée pour les animaux car il sera fait sous anesthésie. Les manipulations de routine (pesées bihebdomadaires) peuvent engendrer un état de stress. Toutefois, si les conditions sont bien contrôlées (phase du cycle lumineux, personnel expérimenté, calme) ; l'habituation des animaux se fait vite sans effet notable.
Devenir
Les femelles seront euthanasiées pour récolte des placentas et des fœtus post-mortem.
Remplacement
Le projet porte sur l’impact d’un contaminant sur la fonction placentaire. Des modèles in vitro existent mais aucun ne permet de rendre compte de la complexicité structurale et fonctionnelle d’un placenta in vivo qui détermine et régule les échanges fœtomaternels. Des placentas humains perfusés collectés lors d’accouchements pourraient être une alternative mais cela ne permettrait de déterminer que les interactions directes entre le contaminant et les facteurs placentaires impliqués dans le transfert des hormones thyroïdiennes. En aucun cas ce modèle ne permettrait d’évaluer des effets sur la formation du placenta. Seul un modèle in vivo permet donc de rendre compte de ce niveau de complexité impliquant deux organismes à part entière (la mère et le fœtus) et une barrière physiologique (le placenta).
Réduction
Afin de bien pouvoir caractériser les échanges fœto-maternels d'une hormone thyroïdienne, il faut pouvoir déterminer les concentrations en cette hormone dans le sang maternel, le placenta et les fœtus à différents temps après l’administration de cette même hormone. Des modèles mathématiques permettent de déterminer que 6 temps de prélèvement et 4 souris par temps sont nécessaires pour pouvoir déterminer si le contaminant étudié a un impact sur les échanges fœto-maternels de l'hormone ciblée, soit 2 groupes (animaux traités ou non avec le contaminant)*6 temps*4 souris = 48 femelles gestantes. De plus, le taux de réussite de mise à la reproduction de la souche de souris étant de l’ordre de 70%, 68 souris seront finalement incluses dans le projet.
Raffinement
L’hébergement des souris par paire devrait permettre de limiter le stress des animaux. Les animaux seront traités par l’eau de boisson de façon à éviter toute intervention de type gavage chronique. Le gavage initial permet quant à lui d’atteindre d’emblée l’état d’équilibre des concentrations et ainsi de réduire la durée de traitement. L'administration d'hormone thyroïdienne et le prélèvement de sang seront fait sous anesthésie. Des points limites ont été déterminés avec différents niveaux d'action (de la surveillance à la mise à mort des animaux). Un enrichissement du milieu est prévu sous forme d’abri inox et morceaux de bois à ronger et mise à disposition de matériel de nidification. Les animaux seront placés en cycle lumineux inversé de façon à ce que les interventions de routines (pesée, changes, vérification du bouchon vaginal) réalisées le matin puissent être faites juste au début de leur période d’activité (fin de phase éclairée). Des pesées bi-hebdomadaires seront réalisées de façon à détecter de façon précoce un trouble général. L'administration d'une hormone marquée différentiable lors des dosages de l'hormone endogène permet de s'affranchir d'une ablation de la thyroïde sur ces animaux.
Choix des espèces
Il existe de grandes différences interspécifiques dans la structure histologique du placenta et sa fonctionnalité. Chez la plupart des primates dont l’humain et les rongeurs, le placenta est « hémochorial » : les villosités placentaires fœtales pénètrent jusque dans les vaisseaux sanguins maternels et sont directement en contact avec le sang. La prolificité de l’espèce permet d’obtenir un grand nombre d’échantillons placentaires et fœtaux pour une seule femelle et ainsi de prendre en compte le sexe du fœtus dans l’analyse des données et de réaliser des tests statistiques paramétriques plus résolutifs. La procédure sera mise en œuvre sur de jeunes adultes au pic de fertilité et ayant achevé leur croissance (10 -12 semaines).
Délivrance ciblée d’une nanomolécule immuno-modulatrice par une approche d’ultrasons dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Quatre injections de toxine en une journée, deux heures d'intervalle entre chacune : 408 souris reçoivent ainsi le produit qui reproduit la maladie de Parkinson, et environ 10 % d'entre elles en meurent dans les vingt-quatre heures. Au total 1 416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 600 d'entre elles et sévère pour 816. Chacune est anesthésiée jusqu'à huit fois pour recevoir un candidat médicament, puis exposée autant de fois à des ultrasons destinés à ouvrir la barrière qui protège le cerveau, 816 subissant en plus jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Le porteur qualifie pourtant l'injection de la toxine de procédure "rapide et indolore", tout en attribuant la mortalité observée à une chute de la température corporelle et à un effet cardiovasculaire direct.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’utilisation d’un dispositif d’ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique, ou BHE pour adresser efficacement un candidat médicament pour le traitement de la maladie de Parkinson. La BHE a pour rôle principal de protéger le cerveau en l’isolant de la circulation sanguine. De fait, le franchissement de cette barrière est un frein pour le traitement des maladies neurologiques dont la maladie de Parkinson, ainsi que pour le développement clinique de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Nous avons montré précédemment que le candidat médicament a une faible capacité à passer la BHE. Pourtant, pour qu’il ait un effet thérapeutique, il est nécessaire qu’une quantité suffisante de ce candidat médicament atteigne le cerveau. Le dispositif que nous envisageons d’utiliser permettra au candidat médicament d’atteindre le cerveau en passant par le sang, afin qu’il puisse avoir un effet anti-inflammatoire local dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris. À terme, nous espérons que ce système de passage à travers la BHE nous permettra de prouver l’efficacité de ce candidat-médicament contre la maladie de Parkinson, qui reste aujourd’hui incurable.
Procédures
1- Injection de produits : 1 416 souris seront anesthésiée pour administrer des produits spécifiques y compris le candidat médicament. Selon les groupes, cette intervention sera faite entre 1 et 8 fois. Durée estimée : moins de 2 minutes. 2- Application d’ondes spéciales, des ultrasons, pour permettre le passage du candidat médicament au cerveau : Ces 1 416 souris seront également exposées aux ultrasons pour permettre au candidat médicament d’atteindre le cerveau. La fréquence de cette procédure sera aussi de 1 à 8 fois selon les groupes. Durée estimée : moins de 10 minutes. 3- Injections de la toxine permettant de modéliser la maladie de Parkinson : un sous-groupe de 408 souris recevra des injections de la toxine. Quatre injections seront faites sur une journée, avec deux heures entre chaque injection. Cette procédure est rapide et indolore. Durée estimée : 5 secondes. Un autre sous-groupe de 408 souris recevra des injections de solution saline. 4- Prélèvements sanguins : les 816 souris, citées ci-dessus, subiront des prélèvements sanguins de faible volume sous anesthésie légère. Entre 1 et 4 prélèvements seront réalisés en fonction des groupes de souris. Durée estimée : moins de 2 minutes. 5- Procédure d’euthanasie : Toutes les souris (1416) seront euthanasiées par surdosage avec un mélange d'anesthésiants.
Impact sur les animaux
L’administration du médicament par la technique utilisée peut causer une augmentation locale de la température de 1.5°C au site d’application des ultrasons mais sans que cela n’engendre des brûlures. En ce qui concerne l'administration de la toxine pour modéliser la maladie de Parkinson chez la souris, elle présente un effet indésirable : une mortalité aiguë relativement élevée (environ 10 %). Cette mortalité ne semble pas être liée directement aux effets de la toxine sur le cerveau, mais plutôt à une baisse de la température corporelle et à un impact direct sur le système cardiovasculaire. Ces effets sont visibles pendant 24h post-administration.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des analyses anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les cerveaux et le sang des animaux utilisés dans ce projet seront réalisés.
Remplacement
Les animaux sont utilisés après des analyses réalisées in vitro afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité. Les études sont systématiquement optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum et les effectifs des cohortes sont limités par l’outil statistique. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux sont suivis quotidiennement, leur masse, leur posture, leur mobilité seront observés, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Si l’animal présente des altérations physiques signes de douleur tels que des tremblements continus (4h), le dos constamment courbé et des problèmes d’équilibre, une anomalie respiratoire sévère, une diminution forte de la mobilité ou une perte de poids de plus de 20%, alors l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. La douleur liée à l’expérimentation sera limitée par l’utilisation systématique d’analgésiques. En outre, les responsables du projet ont été formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux vivants est essentielle dans la création de nouveaux médicaments, surtout pour démontrer l’efficacité potentielle de la molécule en développement. Ce projet a pour objectif de prouver que le candidat médicament peut agir efficacement dans un modèle de maladie de Parkinson (MP) grâce à une technique qui permet d’ouvrir de façon transitoire la barrière qui protège le cerveau. Les rongeurs, et en particulier les souris, sont souvent utilisés pour étudier des maladies du cerveau comme la maladie de Parkinson. Dans ce modèle, on induit la maladie en administrant une toxine, qui provoque chez les souris des symptômes similaires à ceux de la maladie de Parkinson, tels que la perte des neurones spécifiques impliquées dans le contrôle des mouvements. Ce modèle permet ainsi de mieux comprendre la maladie et de tester les effets des traitements potentiels. Le choix d’utiliser des souris se justifie aussi par la disponibilité d’outils d’analyse spécifiques qui sont bien développés pour cette espèce par rapport à d’autres. Ces outils facilitent l’étude des effets du traitement sur les tissus cérébraux des souris. Le principal facteur de risque dans des maladies comme la maladie de Parkinson est l’âge. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux adultes pour modéliser au mieux la progression de la maladie. Les effets de la toxine, qui reproduit certains symptômes de la maladie, ainsi que ses effets secondaires, varient beaucoup selon les différentes souches de souris. Cette sensibilité peut aussi être influencée par des facteurs comme le sexe, le poids et l’âge des animaux. Pour ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 12 semaines, car elles présentent une sensibilité bien documentée à cette toxine, ce qui en fait un modèle fiable pour cette étude.
Travaux pratiques sur rongeurs dans le cadre des formations continues pour les personnes amenées à réaliser les procédures expérimentales sur l’animal
- Enseignement supérieur
Rats : 330
Écartés des projets de recherche pour leur génotype ou leur sexe, 330 souris et 330 rats issus de l'élevage de l'établissement vont être utilisés dans des travaux pratiques de formation continue. Tous seront tués, 220 sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Chaque participant dispose d'un animal sur lequel il pratique des injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire et intraveineuse, un gavage, une anesthésie gazeuse puis pharmacologique et trois types de prélèvements sanguins, avant d'apprendre le prélèvement d'organes et l'autopsie sur le cadavre. Le porteur affirme que la maîtrise de ces gestes passe par un apprentissage sur l'animal et ne peut être remplacée, la formation répondant à une obligation réglementaire de vingt-et-une heures sur six ans.
Objectifs
L’objectif du projet est la mise en place de travaux pratiques sur rongeurs dans le cadre des formations continues pour les personnes amenées à réaliser les procédures expérimentales sur l’animal afin de les aider à acquérir, entretenir, améliorer et/ou développer des compétences et connaissances professionnelles en accord avec le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
La formation des agents qui manipulent les animaux est très importante et incontournable car permet la réduction du stress et de la souffrance chez les animaux. Des agents bien formés seront plus attentif aussi aux signes de détresse des animaux. Cette formation est en conformation aux exigences réglementaires de formation continue des personnels impliqués dans le domaine de l’utilisation des animaux à des fins scientifiques (21h sur 6 ans).
Procédures
Les animaux seront soumis à : une anesthésie gazeuse (1 fois, 5 min) ; une anesthésie pharmacologique (injection intra-péritonéale ou sous-cutanée, 1 fois, 5 min) ; à une injection sous-cutanée, intra-péritonéale, Intra-musculaire, Intra-véneuse et gavage (1 fois, 3 min par injection/gavage) sur animal vigile; à 3 types de prélèvements sanguins sous anesthésie pharmacologique (1 fois, 15 min). L’euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des épisodes de contention des animaux vigiles et d’anesthésie, des administrations (sous-cutanée, intra-péritonéale, Intra-musculaire, Intra-véneuse, gavage) et des prélèvements sanguins. Ces différentes manipulations peuvent entrainer un stress chez l’animal. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les risques liés à l’anesthésie peuvent être : l’hypothermie, difficultés de réveil et respiratoires.
Devenir
Les animaux utilisés sont des animaux de réforme et seront tous euthanasiées à l’issue de période de maintien afin de permettre également aux participants des travaux pratiques d’apprendre les modalités de prélèvement d’organes et d’autopsie pouvant être nécessaire dans le cadre de leur activité professionnel.
Remplacement
Savoir mettre en œuvre les gestes techniques de façon appropriée pour la manipulation des rongeurs, dans le respect de leur bien-être, est fondamental pour le personnel manipulant les animaux. L’acquisition et la maitrise des bonnes pratiques nécessitent un apprentissage sur l’animal, encadré par un formateur pédagogue et expérimenté. L’utilisation d’animaux ne peut pas être remplacée dans ce contexte.
Réduction
Les séances des travaux pratiques seront organisées avec la participation de 10 personnes en présence de 2 formateurs. Chaque participant aura à disposition 1 animal (1 rat lors de la séance rat et 1 souris lors de la séance souris). Les formateurs utiliseront 1 animal (1 souris ou 1 rat selon la séance). Étant donné qu’il s’agit de travaux pratiques dispensés dans le cadre d’une formation continue, il est essentiel que chaque participant puisse mettre en œuvre de manière individuelle les gestes enseignés et de limiter le nombre d’interventions sur chaque animal. Les séances seront dédiées seulement aux souris ou aux rats. Il y aura 2 séances par semestre (4 séances par an) avec l’utilisation en totale de 660 animaux (330 souris et 330 rats) sur 5 ans. Pour ces travaux pratiques, seulement des animaux de réforme de la structure (qui héberge la formation) seront utilisés. Ces animaux, n’ayant subi aucune expérimentation au préalable, sont destinés à l’euthanasie car ne disposant pas des critères d’inclusion pour les projets de recherche (génotype, sexe, etc).
Raffinement
La stabulation des animaux sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, température et hygrométrie adaptées, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 7h du matin à 7 h du soir) et ils recevront un régime alimentaire normal ad libitum ainsi que l'eau par abreuvement automatique. L’enrichissement consiste à placer des nids végétaux et des tunnels en carton dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi. Les animaux seront manipulés par les agents de la structure lors du change des cages afin de les habituer à la manipulation avant les travaux pratiques. Les animaux seront transférés dans la salle des Travaux pratiques le jour de la séance (3h avant le début de la séance). Par semestre, il y aura une séance dédiée aux souris et une dédiée aux rats (afin d’éviter les odeurs et ajouter du stress par la présence de plusieurs espèces pendant la même séance). Pour chaque séance pratique, il y aura un maximum de 10 participants et 2 formateurs expérimentés (1 pour 5 participants) qui veilleront à la bonne réalisation par les étudiants des gestes enseignés. Un animal sera utilisé par stagiaire et par formateur, ce qui évite de multiplier les interventions sur un même animal et permet à chaque participant d’être actif et réaliser les gestes enseignés, objectif de la formation. Pendant certaines travaux pratiques, les animaux seront soumis à l’anesthésie gazeuse et/ou chimique. Pendant l’anesthésie, les animaux seront placés sous tapis chauffants, leur température sera suivie à l'aide d'une sonde rectale ainsi que leur réveil.
Choix des espèces
Les formations proposées concernent la manipulation des rongeurs car les souris et rats constituent près de 75 pour cent des animaux utilisés à des fins scientifiques. Nous utiliserons des rongeurs adultes (à partir de 6 semaines) pour faciliter la manipulation des animaux par les participants à la formation.
Etude des mécanismes de sensibilité et évaluation de l’efficacité d’un traitement combinant le Dasatinib et l’Arsenic Tri-Oxide avec la chimiothérapie conventionnelle dans des modèles précliniques de leucémies humaines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules leucémiques prélevées chez des patients sont injectées à des souris immunodéficientes, qui développent une leucémie humaine, perdent du poids, voient leur rate grossir et finissent prostrées. 920 souris vont être utilisées, 710 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau sévère, avec des ponctions de moelle osseuse douloureuses au point de piqûre. Toutes sont tuées, le porteur jugeant la mise à mort "indispensable" pour isoler et caractériser les cellules leucémiques après traitement. La chimiothérapie administrée provoque une perte de poids et une anémie, et se trouve décrite dans le même paragraphe comme apportant "une meilleure condition physique" aux souris.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à améliorer la prise en charge des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), cancers du sang agressifs affectant aussi bien les enfants que les adultes. Lorsque ces leucémies résistent à la chimiothérapie classique, les chances de guérison diminuent fortement. Pour mieux comprendre ces résistances et trouver de nouvelles solutions, des modèles de recherche ont été développés à partir de cellules leucémiques prélevées chez des patients. Une particularité de ces cellules est la présence d’anomalies génétiques qui influencent leur comportement face aux traitements. Un premier médicament déjà testé, le Dasatinib, permet de réduire la maladie, mais des cellules cancéreuses survivent et provoquent des rechutes. Pour améliorer l’efficacité du traitement, une autre molécule, l’Arsenic Trioxyde, déjà utilisée pour d’autres types de leucémies, pourrait être une solution prometteuse. Des premiers tests ont montré que la combinaison de ces deux traitements semblait fonctionner. L’objectif est maintenant de mieux comprendre leur action et d’évaluer leur efficacité lorsqu’ils sont associés à la chimiothérapie classique, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques. . Trois objectifs spécifiques sont définis : Objectif 1 : Comprendre la sensibilité aux traitements. Nous testerons l’efficacité de Dasatinib + Arsenic Trioxide dans trois types de LAL et étudierons la cause de leur sensibilité aux traitements. Objectif 2 : Suivre la migration des cellules leucémiques Nous étudierons la capacité des cellules leucémiques humaines porteuses des fusions d’intérêt à migrer dans la moelle osseuse des souris, un aspect crucial pour évaluer la progression de la maladie. Objectif 3 : Evaluer l’efficacité de la combinaison de plusieurs traitements. Nous testerons l'efficacité de la combinaison Dasatinib + Arsenic Trioxide avec la chimiothérapie conventionnelle sur des souris greffées avec les cellules leucémiques d’intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche revêt une importance scientifique et de santé publique considérable. Les avancées récentes de la recherche en génétique ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques avec la mise en lumière de nouveaux gènes mutés impliqués dans les LAL. L'identification d'une nouvelle fusion oncogénique dans la LAL éclaire des aspects inexplorés des mécanismes sous-jacents de cette maladie. Cette découverte nécessite des recherches pour comprendre comment certaines fusions géniques influent sur l'évolution de la maladie et sur la réaction aux traitements, ce qui permettrait de développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées et efficaces. Nos travaux pourraient améliorer la prise en charge des patients en fournissant des informations cruciales sur les mécanismes de sensibilité et en proposant des traitements adaptés à chaque profil de patient. Cela inclut la possibilité de développer des thérapies personnalisées qui prennent en compte les caractéristiques moléculaires spécifiques de chaque tumeur, améliorant ainsi les résultats cliniques et la qualité de vie des patients atteints de LAL.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions limitées dans le temps : 1. Une injection unique des cellules leucémiques sera effectuée sous anesthésie. Cette procédure est rapide et ne dure que quelques secondes. 2. Selon les protocoles, certaines souris recevront entre 1 à 4 traitements administrés en moins d’une minute, soit sous anesthésie, soit lorsqu’elles sont éveillées. 3. Trois prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et après analgésie. Cette procédure durera moins de cinq minutes.
Impact sur les animaux
Notre expérience dans la réalisation de protocoles similaires nous permet de prévoir des nuisances pour les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : • L'injection des cellules leucémiques et/ou de certaines drogues utilisées en chimiothérapie est effectuée sous anesthésie, ce qui minimise le stress opératoire pour l'animal. Le stress principal est lié à la contention avant anesthésie.. Cependant, une douleur peut être provoquée par la piqûre au site d'injection, similaire à ce que ressentent les patients traités par certaines chimiothérapies. • L'expansion des cellules leucémiques humaines dans le modèle murin entraîne à long terme une perte de poids de l'animal et une augmentation de la taille de la rate. À un stade avancé, nous observons parfois une prostration ou un manque de mobilité de l'animal. • La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids et peut entrainer une anémie, due aux effets adverses des agents utilisés. Cette chimiothérapie qui réduit le nombre de cellules leucémiques apporte une meilleure condition physique aux souris chez lesquelles les leucémies se sont amplifiées. • Le prélèvement de moelle osseuse et de sang en tant que procédures invasives dans nos protocoles, peut provoquer une douleur au niveau du site de ponction.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans nos procédures seront euthanasiés. L'euthanasie est indispensable pour isoler, caractériser et étudier les cellules leucémiques présentes après les différents traitements ou à différents temps après injection et donc mesurer l’efficacité des thérapeutiques appliquées.
Remplacement
Dans ce projet de recherche, nous avons besoin d'utiliser des modèles animaux, en particulier des souris, pour étudier la leucémie. Ces modèles sont essentiels car ils reproduisent de manière précise comment cette maladie se développe. Bien que nous ayons des méthodes de culture pour certaines expériences, elles ne peuvent pas recréer toutes les étapes complexes de la leucémie qui se produisent dans la moelle osseuse et d'autres organes du corps. Ces modèles animaux ne peuvent pas être remplacés par des systèmes de culture cellulaire en laboratoire pour étudier comment la leucémie se développe. Ils sont complémentaires et indispensables pour notre recherche. En parallèle, les expériences réalisées en laboratoire ne peuvent pas reproduire de manière exacte les réponses variées que l'on observe dans le corps humain, ce qui est crucial pour évaluer les effets de potentiels traitements, chez les patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique. En résumé, bien que les cultures cellulaires soient utiles pour certaines expériences, elles ne peuvent pas remplacer les modèles animaux nécessaires pour comprendre et traiter la leucémie de manière efficace. Ces souris sont essentielles pour ce projet car elles nous offrent une méthode précise et fidèle pour tester de nouveaux traitements dans un environnement qui ressemble à celui des humains.
Réduction
Chaque patient réagit différemment à la chimiothérapie. Nous avons observé cette variabilité de réponse à travers nos modèles de xénogreffes. Il est donc judicieux d'utiliser 3 à 4 échantillons de cellules leucémiques de patients par type de leucémie aiguë lymphoblastique. Par ailleurs, les concentrations des médicaments à utiliser sont déjà établies dans la littérature et dans le laboratoire : leur efficacité est confirmée par des résultats précédents du laboratoire. Il n'est donc pas nécessaire de faire des ajustements qui exigeraient plus d'animaux dans cette étude. Le nombre minimum d'animaux requis pour atteindre chaque objectif avec une puissance statistique adéquate a été déterminé à l'aide d’un logiciel spécifique.
Raffinement
Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter les souffrances, douleurs et angoisses inutiles, avec des points limites définis à cet effet. Afin d'éviter toute douleur, souffrance et angoisse liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de la moelle osseuse afin de prévenir les douleurs pouvant survenir après l'intervention. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Nous utilisons en laboratoire des souris adultes immunodéficientes depuis de nombreuses années, car elles ne rejettent pas les greffes de cellules humaines. Ce modèle est particulièrement pertinent pour étudier les cancers du sang, car il reproduit fidèlement l'expansion des cellules leucémiques observée chez les patients. Les cellules cancéreuses provenant de patients interagissent avec tous les éléments cellulaires et moléculaires de la souris, de la même façon qu’elles interagissent dans l'organisme humain. Ce modèle nous permet également d'explorer une question cruciale liée à la diversité inter-individus face à une même maladie. En effet, le terme "leucémie" regroupe plusieurs sous-types, chacun présentant des variations qui influencent la réponse au traitement. Contrairement à des modèles murins où seule une leucémie murine se développe, notre approche de transplantation de cellules humaines chez des souris immunodéficientes permet d'aborder cette diversité inter-patients. Ainsi, ce modèle devient une référence préclinique pour étudier la maladie humaine dans un contexte murin bien établi et documenté dans la littérature spécialisée.
Etude préclinique pour tester l’effet de 2 molécules sur le phénotype cardiaque des souris Chchd10S59L/+
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique et reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant seize semaines, avec deux échographies cardiaques sous anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes et deux prélèvements sanguins. Le porteur teste deux molécules déjà utilisées chez l'être humain dans d'autres maladies et renvoie l'effet sur les troubles neurologiques à une étude ultérieure. Un amendement ajoute soixante souris au protocole, "suite à un problème lors de la première tentative de réalisation", dans un projet qui présente par ailleurs son effectif comme réduit au minimum.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie affectant le système neuromusculaire et entraine la mort par insuffisance respiratoire dans les 3 à 5 ans suivant l'apparition des symptômes. L'une des causes probable de cette maladie est une mutation génétique modifiant une protéine. Pour comprendre le rôle de cette protéine, une souris portant la même mutation a été générée. Ces souris présentent des déficits similaires à la maladie humaine, notamment au niveau cardiaque. A ce jour, il n’existe aucun traitement efficace contre la SLA. Le but de cette étude est de tester deux molécules déjà utilisée chez l'Homme dans d'autres pathologies. Leur mécanisme d'action pourrait en effet lutter contre les effets de la mutation de cette protéine. Nous réaliserons ainsi un traitement de 8 à 24 semaines d’âge pour tester l'effet des 2 molécules sur les symptômes cardiaques des souris. Pour cela, nous effectuerons des échographies cardiaques et un suivi du poids des animaux durant l'ensemble de la durée du traitement. Des analyses sanguines seront aussi effectuées. L’effet du traitement sur le l'aspect neurologique qui apparait plus tardivement, fera l’objet d’une autre étude.
Bénéfices attendus
Aucun traitement n’étant disponible à ce jour pour agir contre la SLA, il est primordial de mieux comprendre cette pathologie, et notamment les mécanismes responsables de la mort des neurones moteurs, dans l’optique à plus long terme de développer des recherches à visée thérapeutique. La réalisation de cette étude préclinique sur un modèle murin est indispensable pour savoir s'il est possible d'améliorer les maladies des motoneurones en général mais aussi les troubles cardiaques et musculaires développés par ces animaux. Une meilleure connaissance du modèle sera aussi obtenue avec des tests permettant de déterminer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique de ces animaux, permettant une possible modélisation de l'aspect neurologique des pathologies modélisées
Procédures
2 prélèvements sanguins qui durent quelques minutes. Une injections intrapéritonéales par jour pendant maximum 16 semaines. 2 évaluations cardiaques réalisées par imagerie avec une anesthésie gazeuse de 45 minutes environ. un autre lot d'animaux aura uniquement une injection intraveineuse et un prélévement sanguin, sous anesthésie. Ces deux gestes ne durent que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une anesthésie gazeuse lors des échographies cardiaques induisant un stress léger ainsi que des prélévements sanguins induisant une légère douleur. Les injections journalières par contention induiront un stress modéré.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences ont été réalisées précédemment sur des cellules de patients porteurs de mutations de ce gène d'intéret. Ces expériences ont montré que les troubles cliniques de SLA chez l’homme n’étaient pas limités au système nerveux central et que d’autres tissus, tels que les muscles, étaient affectés. Il n'est malheureusement pas possible de tester des traitements sur ces cellules musculaires en culture pour mettre en évidence une restauration de la fonction cardiaque. Seul un modèle animal permettra d’appréhender tous ces aspects : effets de la mutation d’intérêt dans différents tissus et à différents âges. Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction de ce gène dans un organisme vivant. Dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué de 15 animaux, cet effectif étant suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). Nous souhaitons donc employer un total de 60 souris pour ce protocole, en comparant des animaux exprimant ou non le gène d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou suite à un traitement. Par ailleurs, nous utiliserons également 48 animaux produits dans la fécondation in vitro permettant la création de la cohorte expérimentale. Ces derniers permettront de mieux connaitre la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique afin d'envisager ensuite une analyse de l'effet thérapeutique des molécules sur les troubles neurologiques existants à un stade plus tardif. Amendement 1: Un deuxième groupe de 60 souris devra être employé suite à un problème lors de la première tentative de réalisation du protocole.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est l’animal modèle de choix pour cette étude préclinique. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux seront des souris âgées de 8 semaines au début du protocole, afin de travailler sur un modèle adulte où la fonction cardiaque est développée mais avant l’apparition de l’altération du phénotype afin d’agir de façon précoce avec le traitement avec les deux molécules.
Etude pilote sur l’utilisation d’un modèle de souris humanisées diabétiques pour la greffe d’ilots pancréatiques.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Vingt-et-une prises de sang par animal, à la queue et à la mâchoire, s'ajoutent à une greffe chirurgicale d'îlots pancréatiques de vingt à trente minutes. 15 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un diabète leur est provoqué par deux injections avant la greffe, et le porteur retient parmi les risques une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site greffé. Cette étude pilote sur quinze animaux doit poser les bases d'une thérapie cellulaire "virtuellement sans limitation" pour le diabète de type 1, perspective renvoyée à des travaux ultérieurs.
Objectifs
Le diabète de type 1 est une maladie où le système immunitaire attaque par erreur les cellules du pancréas qui produisent l’insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. Cela entraîne un manque d’insuline et une augmentation du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Pour traiter cette maladie, les patients reçoivent généralement des injections régulières d’insuline, mais cela peut causer des effets secondaires comme des hypoglycémies ou une prise de poids. Des thérapies plus avancées, comme la greffe de cellules pancréatiques provenant de donneurs décédés, ont montré des résultats prometteurs. Cependant, elles sont limitées par la rareté des donneurs et nécessitent des médicaments pour éviter le rejet par le système immunitaire, ce qui peut augmenter les risques d’infections. Une alternative en développement consiste à utiliser des cellules souches modifiées pour produire de l’insuline. Ces cellules peuvent être fabriquées en grande quantité, mais elles nécessitent encore des traitements pour empêcher leur rejet par le corps. L'objective de ce projet vise à poser les bases pour une nouvelle approche, testée sur des souris avec un système immunitaire humain, utilisant des celules ces cellules souches génétiquement modfiées pour qu’elles soient mieux tolérées par le système immunitaire. Cette méthode pourrait offrir une solution innovante pour traiter durablement le diabète de type 1.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet fourniront les bases pour un approche de thérapie cellulaire allogénique pour le diabète de type I virtuellement sans limitation d’îlots disponible à la greffe et avec une meilleure efficacité par rapport au protocoles actuels. En plus, cette nouvelle méthode pourrait être adaptée pour générer cellules thérapeutiques universelles dans de nombreux domaines comme la médecine régénérative ou l'oncologie en utilisant de différents types cellulaires comme les cellules souches, les lymphocytes, les fibroblastes. Grâce à cela, de nombreux patients pourrait recevoir des « cellules-médicaments » bien plus efficaces et plus faciles à produire à grande échelle. La thérapie cellulaire pour bien d’autres maladies pourrait donc également avoir bénéfice de nos résultats
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes: - 2 injections intrapéritonéales à 1 semaine d’intervalle. - 7 prises de sang (queue) pour valider l’induction du diabète. - 1 procédure chirurgicale sous anesthésie (20-30 minutes). - 7 prises de sang (queue) à 4 moments (Semaines 2, 4, 6 et 8), sur une durée de 4 heures (10-15 secondes par prise). - 7 prises de sang submandibulaires aux jours 0, 1, 3, puis aux Semaines 1, 3, 6 et 8 (10-15 secondes par prise). Les prises de sang des points 4 et 5 servent également au suivi hebdomadaire de la glycémie.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances possibles sont associé à la procédure chirurgicale, qui est classée comme sévère. Elles incluent des complications inattendues lors de la chirurgie, ainsi qu’une mauvaise cicatrisation post-operatioire, un saignement ou une infection au niveau du site de la greffe. Des nuisances légères pourraient engendrer du stress chez la souris lors des manipulations manuelles, des prélèvements ou des injections.
Devenir
À la fin des la procedure, les souris seront mises a mort pour prélever le foie effectuer les analyses histologiques pour évaluer la taille et la qualité des îlots greffés, ainsi que la récupération métabolique de l’animal (histologie, contenu en triglycérides et en glycogène).
Remplacement
Des études préliminaires sur îlots produits en vitro ont étés menés pour valider la capacité de notre protocole à générer des ilots humaines fonctionnels. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude et évaluer l’efficacité de notre protocole à inhiber le rejet allogénique.
Réduction
Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. Ce projet pilote vise à évaluer sur un petit nombre de souris la faisabilité de la procédure, avant de s’engager dans un nombre plus important d’animaux qui pourrait se révéler non optimale.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en œuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social.
Choix des espèces
Aucune méthode en laboratoire ou modèle alternatif ne peut reproduire la complexité du système immunitaire humain. Pour avancer dans cette étude, un modèle de souris humanisées sont utilisées. Ces souris permettent d’étudier, en conditions réelles (in vivo), les interactions entre le système immunitaire humain et des îlots pancréatiques dérivés de cellules souches humaines. Ce modèle est bien maîtrisé, avec des protocoles établis et des outils d’analyse disponibles. Les souris seront immunisées directement par le fournisseur. Elles seront livrées à l’âge de 16 semaines (intervalle 13-18 semaines), après validation. Elles seront utilisées rapidement après leur arrivée en animalerie.