Souris

Opérées pendant environ quarante minutes pour se voir implanter une fibre optique dans le cerveau, puis soumises à quatre injections quotidiennes de tamoxifène sans anesthésie, 100 souris subissent une lésion du nerf sciatique ou une injection d'adjuvant de Freund destinée à provoquer une douleur chronique. Elles passent quatre à onze semaines en enregistrement par photométrie, à raison de séances d'environ trois heures, et subissent deux jours de tests comportementaux par semaine, dont le porteur ne précise pas la nature. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, la lésion nerveuse entraînant selon lui une douleur et des comorbidités anxiodépressives pendant environ six semaines. Toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau, une mise à mort qu'il présente comme un moyen de leur éviter toute souffrance inutile.

Objectifs

Avenant : nos résultats préliminaires montrent que la douleur est encodée différement au niveau du cortex cingulaire antérieur (ACC) en fonction du stimulus douloureux appliqué (mécanique ou thermique) mais également en fonction de l'évolution de la pathologie dans le temps. Afin de rafiner notre analyse, nous souhaitons enregistrer sélectivement les neurones pyramidaux de ce cortex, notamment ceux exprimant l'isoforme gamma de la protéine kinase C.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre comment les neurones pyramidaux du cortex cingulaire antérieur (ACC) sont impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoires selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux (n=100) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Ils recevront également tous 4 injections consécutives de tamoxifen, 1 fois par jour. Cet acte maîtrisé par le laboratoire est réalisé sans anesthésie et dure moins d'une minute. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

La chirurgie Spared Nerve Injury (SNI) consiste à réaliser une lésion nerveuse du nerf sciatique et entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection d'Adjuvant Complet de Freund (CFA) entraine une inflammation cutanée et une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h. L'injection intrapéritonéale de tamoxifen entraine une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature

Pour savoir si une inflammation cérébrale accélère la dégradation de la morphine, 360 souris, dont 120 mutantes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent du lipopolysaccharide, qui provoque fièvre, perte de poids, diarrhées et une sensibilité accrue à la douleur, puis passent des mesures du seuil de douleur sur plaque chaude ou froide et un test locomoteur de dix minutes. Un seuil maximal de stimulation borne les tests de douleur, même sans réaction de la souris. Une chirurgie terminale sous anesthésie précède leur mise à mort, pratiquée pour prélever leurs tissus cérébraux et les analyser en spectrométrie de masse.

Objectifs

Le sepsis, résultant d’une inflammation systémique induite par un pathogène, est à l'origine de 20% des décès mondiaux (11 millions en 2017). Dans 70% des cas cette pathologie entraine des problèmes neurologiques qui pourraient être liés à une dégradation accrue de certains neurotransmetteurs. Lors d’un sepsis, l’AhR (Aryl hydrocarbone Receptor) initie une voie de signalisation intracellulaire qui induit une augmentation des enzymes de dégradation des neurotransmetteurs qui sont dégradés de la même manière que la morphine. Notre but est d’étudier la dégradation des neurotransmetteurs (et de la morphine qui représente un traceur de l’activité de dégradation) dans un modèle de sepsis chez la souris. Nous voulons également déterminer si l’inhibition de l’AhR peut restaurer des niveaux normaux de neurotransmetteurs et ainsi faciliter la guérison.

Bénéfices attendus

Notre but est de définir si une neuroinflammation globale induite par le lipopolysaccharide (qui induit le facteur de transcription Aryl hydrocarbone Receptor, AhR), provoque une dégradation accrue de la morphine et une diminution de ses effets analgésiques. Par ailleurs, notre but est d’identifier les molécules endogènes (neurotransmetteurs) dégradées par ces enzymes et de déterminer si l’inhibition de l’AhR par la Stemregenine 1 (SR1) ou la délétion génétique astrocytaire peut être bénéfique. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre les neuroinflammations induites par le sepsis. Ces travaux permettront de déterminer l’implication de l’AhR dans la dégradation de la morphine en condition septique. Ils permettront également de déterminer quelles molécules endogènes sont sur-dégradées et de déterminer si le SR1 peux normaliser les taux de neurotransmetteurs, permettant ainsi une meilleure récupération.

Procédures

12 groupes de souris subiront des injections de substances sur animal vigile (30sec) et 8 groupes auront des tests de mesure du seuil de douleur (25sec) et 4 groupes d’animaux auront un test de comportement locomoteur (10min). Les 12 groupes auront une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min).

Impact sur les animaux

L’injection de lipopolysaccharide chez la souris induit une inflammation aiguë. Elle est aussi associée à une fièvre et une perte de poids transitoires chez les animaux. Par ailleurs, le lipopolysaccharide ne provoque pas de douleur mais induit une sensibilité accrue à la douleur (allodynie et hyperalgésie). Elle induit également une diminution de l'activité locomotrice et des diarrhées. Un stress thermique bref sera appliqué afin de déterminer l’effets de nos traitements. Le traitement à la Stemregenine 1 (SR1) pourrait potentiellement diminuer les effets de l’inflammation.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour obtenir des tissues cérébraux à analyser en spectrométrie de masse .

Remplacement

Nos études utilisant des cultures cellulaires primaires de cellules gliales ont montré que le LPS augmentait le métabolisme de la morphine et que le SR1 abolissait cette augmentation. Cependant, les cultures primaires de cellules gliales ne reflètent pas le contexte intégré du cerveau qui comporte d’autres types cellulaires qui interagissent. In vivo, l’injection de LPS induit une neuroinflammation aiguë qui provoque une diminution de l’activité motrice, ainsi qu’une hyperalgie et une allodynie qui ne peux pas se mesurer in vitro. Le but du projet est de montrer, chez la souris, que l’AhR qui induit une enzyme de dégradation diminue les quantités de morphine et de certains neurotransmetteurs. De fait, nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur et/ou la locomotion. (2) les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau entier.

Réduction

360 animaux (120 souris mâles et 120 souris femelles C57BL/6J + 60 souris mâles et 60 souris femelles mutantes) sont nécessaires aux études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe étaient généralement suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement analgésique en conditions neuropathiques. Les effectifs de 10 animaux prennent également en compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure (par exemple suite à des blessures consécutives à des bagarres) ou de la possibilité d’un problème technique. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte avec tous les groupes contrôles devra être rajoutée ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions.

Raffinement

Les interactions sociales seront stimulées par des cages enrichies avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation, ainsi que de la frisure et des bâtons de bois. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Les blessures superficielles consécutive à des bagarres sont désinfectées. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e., boites du test, enceinte de la plaque chaude/froide) est réalisée durant 14 jours. Dans les tests comportementaux où on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) et ce, même en absence de réaction de l'animal. Par ailleurs des points-limites ont été établies pour chacune des procédures réalisées. La chirurgie terminale sera effectuée sous anesthésie générale et sous analgésie locale. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer tout nouvel élément contribuant au bien- être animal aux procédures.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés et les modèles inflammatoires induit par le LPS sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de la souris est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur neuropathique. Nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voies métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études précliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du SNC et du système opioïde est uniquement mature chez l’adulte.

Organisme de recherche contractuelle, ce laboratoire teste ce qu'il appelle des "molécules-clients" sur des rongeurs engraissés par un régime hypercalorique, dès l'âge de 3 semaines si le client le demande. 900 rongeurs, 600 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des jeûnes de trois à six heures, jusqu'à trois tests de tolérance au glucose ou à l'insuline, des gavages ou des injections répétés et jusqu'à une prise de sang par semaine. Leurs organes, prélevés après la mise à mort, servent à caractériser l'inflammation. Le bénéfice annoncé, réduire l'impact de l'obésité "à tous les niveaux", reste renvoyé "à terme".

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses. La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués, tels que la synthèse de médiateurs cytokiniques et lipidiques clés. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques.

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1) Deux sessions de jeûne de 3 à 6h, espacées de 48h minimum, dans le cas de la réalisation de tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (d'une durée de 4h maxiumum chacun). Les animaux ont accès à l’eau mais pas à la nourriture. Au maximum, 3 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline pourront être réalisés au cours d’une étude. 2) Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage (sonde en acier inoxydable réutilisable), les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 3 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal. Le nombre maximum de prélèvements sanguins sera de 1 par semaine.

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent (1) la surcharge pondérale des animaux, (2) la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, (3) l’administration répétée des molécules-clients à tester. La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra générer un stress chez l’animal, ainsi qu’une douleur au point de piqure.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portat sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimental). Le nombre de rats et de souris nécessaire a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Chaque fois que cela sera nécessaire, une analgésie et/ou une anesthésie seront administrées aux animaux. Leur environnement sera enrichi de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole, afin de leur permettre de se distraire et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être, un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

Trois lignées de souris, dont une modifiée pour ne plus produire le sucre alpha-Gal, et des lapins blancs de Nouvelle-Zélande retenus parce qu'ils fournissent de gros volumes de sang : 300 souris et 9 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les souris portent sur le dos une capsule contenant des tiques qui se nourrissent sur elles, ce qui impose un hébergement individuel puisqu'elles arrachent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques. Les lapins reçoivent deux immunisations, puis un prélèvement dans la veine de l'oreille et enfin un prélèvement intracardiaque sous anesthésie. Toutes et tous sont tués pour récupérer sang et organes, alors que le calcul de puissance annonçait 33 souris par groupe et que le porteur en retient cinq.

Objectifs

Objectif 1 : Infection des souris pour obtenir des tiques infectées par Borrelia spp. La maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia spp., est une maladie transmise aux animaux et aux humains qui est en pleine expansion, notamment en Europe, où son incidence a considérablement augmenté ces dernières années, en particulier en France. Comprendre comment les tiques, principaux transmetteurs de cette maladie, sont infectées et comment la bactérie se transmet des animaux ou des humains aux tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention. En infectant des souris avec Borrelia spp., ce projet cherche à générer des tiques infectées de manière contrôlée, afin de mieux comprendre le cycle de transmission et d’examiner les interactions animaux/humains-Borrelia et les tiques. Cette connaissance est cruciale pour identifier de nouvelles cibles permettant d'interrompre la transmission de Borrelia spp. Objectif 2 : Induction d'anticorps spécifiques contre le sucre α-Gal pour protéger contre l'infection par Borrelia spp.Des études antérieures ont démontré que les anticorps contre le sucre α-Gal, générés naturellement en réponse à certains stimuli, peuvent offrir une protection contre divers pathogènes, y compris ceux qui exposent ce sucre à leur surface, comme Borrelia spp. La vaccination avec le sucre ou avec des variantes de la bactérie E. coli qui ne causent pas de maladies et exprimant ce sucre pourrait induire la production de ces anticorps protecteurs. L'objectif de cette partie du projet est de tester cette approche innovante. Si elle s'avère efficace, elle pourrait ouvrir une nouvelle voie pour la prévention de la maladie de Lyme, représentant ainsi une avancée majeure, car aucun vaccin n’est actuellement disponible pour les animaux ou les humains. Objectif 3 : vaccination des lapins pour des études in vitro. Les lapins seront utilisés pour produire des volumes importants de sérum riche en anticorps contre α-Gal et contre E. coli, ce qui est crucial pour les expérimentations complémentaires. Ce sérum permettra de tester en laboratoire, à plus grande échelle, l'efficacité des anticorps produits par les vaccins expérimentaux, garantissant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande précision dans les résultats. L’utilisation des lapins, qui permettent de récolter un plus grand volume de sérum que les souris, réduit le nombre total d’animaux nécessaires et améliore la qualité des études futures.

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris recevront deux injections sous-cutanées et un maximum de trois prélèvements sanguins ; ces prélèvement dureront 10 minutes, anesthésie comprise.. Les lapins seront immunisés par voie souscutanée avec des variantes d'E. coli qui ne causent pas de maladies ou avec le sucre α-Gal, avec deux injections. Les jours 0 et 14 après la première vaccination, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; le prélèvement durera 8 minutes, anesthésie comprise. Le jour 30 après la vaccination de rappel, un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'alimentation des tiques pourrait provoquer un inconfort modéré chez les animaux, et ceux-ci pourraient également ressentir un léger inconfort en raison de la pose de la capsule sur leur dos. Aucune souffrance particulière n'est attendue en raison de l'infection, car les souris sont les transmetteurs naturels de Borrelia et ne présentent pas de symptômes. La pose des capsules a été optimisée pour minimiser l'inconfort tout en maximisant les résultats expérimentaux. Cependant, l'expérience sera interrompue en cas d'événements indésirables tels que : (i) un choc anaphylactique dû aux piqûres de tiques ou à l'infection bactérienne ; (ii) une réaction cutanée généralisée affectant les voies respiratoires ou gastro-intestinales après l'immunisation ; (iii) des blessures auto-infligées par les animaux tentant de retirer la capsule ; (iv) des signes graves après l'exposition aux micro-organismes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et, si nécessaire, l'expérience sera arrêtée. Les critères d'évaluation incluent une échelle de 3 niveaux, et tout animal atteignant un score de 3 sera mis à mort : (1) infecté sans signe visible ; (2) poils hérissés, activité réduite, légère posture voûtée ; (3) posture voûtée, difficulté à maintenir la position, prostration, respiration superficielle ; (4) décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec E. coli ou α-gal-BSA afin d'évaluer les effets protecteurs des anticorps anti-α-Gal contre Borrelia spp., ainsi que la survie des tiques et l'acquisition de Borrelia spp. par ces dernières. Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne, ce qui empêche d'analyser adéquatement les effets protecteurs et la colonisation de Borrelia spp. chez les tiques. Pour obtenir un plus grand volume de sérum destiné à des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation supplémentaire de souris. L'immunisation des lapins permettra d'obtenir du sérum anti-α-Gal ou anti-E. coli, offrant un meilleur contrôle sur la qualité, la spécificité et l'affinité des anticorps, ce qui garantit la cohérence et la reproductibilité des expériences. De plus, elle permettra la production d'anticorps à plus grande échelle, répondant ainsi aux besoins expérimentaux spécifiques.

Réduction

Nous utiliserons 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux sera calculé pour être le minimum requis afin d'obtenir les tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Pour développer un test de puissance statistique robuste permettant d’analyser la relation entre les anticorps anti-alpha-gal et la protection, nous avons fixé le niveau de confiance à 5%, en nous basant sur les données publiées disponibles. Nous avons ciblé une puissance statistique de 0,8, en supposant un effet de taille modérée, ce qui indiquait un besoin de 33 souris par groupe pour un test ANOVA. En appliquant le principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), nous avons réduit la taille de l’échantillon à 5 souris par groupe afin de minimiser l'utilisation des animaux tout en maintenant des résultats significatifs.Chaque souris peut nourrir jusqu'à 100 larves ou 30 nymphes. Comme les larves sont plus petites et nécessitent moins de ressources que les nymphes, il est possible d'utiliser 100 larves et 20 nymphes par souris, sans affecter leur santé, tout en garantissant un nombre suffisant de larves et de nymphes infectées pour mener à bien les études expérimentales. Environ 30 % des tiques se détacheront sans avoir pris un repas complet ou mourront, ce qui nous permettra d'obtenir 70 larves ou 20 nymphes gorgées par souris. Parmi les 350 larves obtenues, 200 seront élevées jusqu'au stade de nymphe pour obtenir des nymphes infectées par Borrelia, utilisées dans des études in vitro. Les 150 larves restantes seront réparties de la manière suivante : 75 pour la quantification de Borrelia et 75 pour les études d'immunité des tiques, en lien avec l'immunisation des souris et l'infection. Pour les 100 nymphes, 50 seront dédiées à chaque type d'étude similaire. Par conséquent, il faut prévoir 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux a été calculé pour être le minimum nécessaire à l’obtention des tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Les souris seront gardées un maximum de 6 jours, temps nécessaire pour que les nymphes complètent leur repas. Nous avons également calculé le nombre minimal de lapins requis pour obtenir le volume de sérum nécessaire à nos futures expérimentations in vivo.

Raffinement

Souris : Les souris seront hébergées en groupes de 5 dans leurs conditions habituelles, avec un enrichissement nécessaire à leur bien-être (carrés de coton, maison en plastique). Elles seront surveillées quotidiennement pour détecter tout signe de malaise ou de symptôme. L’application des capsules contenant les tiques sur le dos des souris se fera sous anesthésie pour minimiser le stress et l'inconfort associés à cette manipulation. Une fois les capsules fixées, les souris seront placées dans des cages individuelles, car elles ont tendance à retirer les capsules des autres et à consommer les tiques. Malgré cet isolement, elles continueront de bénéficier des mêmes conditions d'enrichissement (carré de coton, maison en plastique), et, pour pallier leur isolement, des enrichissements supplémentaires, tels que des bâtonnets à ronger, seront ajoutés. Des points limites stricts seront appliqués pour identifier rapidement toute détérioration de leur état de santé, et les souris présentant des signes de douleur ou de détresse inhabituels seront retirées de l'expérimentation et recevront des soins appropriés. Lapins : À leur arrivée, les lapins seront logés dans des cages équipées de plateformes de repos et d’enrichissements spécifiques à leur bien-être, comme des balles, des branches en bois à ronger et des végétaux. Ils seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation pour garantir leur santé et leur confort. Étant sensibles aux manipulations, les lapins seront régulièrement contrôlés et manipulés par le personnel soignant et les expérimentateurs afin de les habituer à la présence humaine et aux différentes interventions. Avant les prélèvements sanguins, les lapins seront familiarisés avec les expérimentateurs pour réduire leur stress, et des techniques de contention douce seront appliquées pendant les prélèvements. L'anesthésie sera utilisée si nécessaire pour toute intervention susceptible de causer de la douleur ou un inconfort important. Des points limites spécifiques seront appliqués pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Si un lapin montre des signes d'inconfort significatif, il sera retiré de l’étude et recevra des soins adaptés

Choix des espèces

On utilisera trois variantes de souris et une de lapins : Souris très sensibles aux germes, comme la bactérie Borrelia spp, transmise par les tiques. Elles sont donc utilisées pour produire des tiques infectées par cette bactérie. Souris génétiquement modifiées pour qu'elles ne puissent pas produire le sucre α-Gal, mais elles peuvent créer des anticorps spécifiques contre celui-ci. Elles sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Souris non modifiées génétiquement. Elles sont utilisées comme groupe de contrôle pour comparer les résultats avec ceux des autres souris et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Lapins blancs de Nouvelle-Zélande : Ils sont utilisés car ce sont les meilleurs animaux pour prélever de grandes quantités de sang en une seule expérience, permettant d'obtenir suffisamment d'anticorps contre l'α-Gal pour les recherches. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge, et les lapins entre 4 et 5 semaines. Avant de commencer les expériences, une semaine d'adaptation sera accordée aux animaux pour qu'ils s'habituent à leur environnement.

3 800 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune pouvant recevoir des injections tous les deux jours et jusqu'à sept prélèvements sanguins hebdomadaires. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après un dernier prélèvement de sang. Il s'agit de valider chez l'animal vivant des anticorps couplés à un agent cytotoxique contre le cancer du pancréas, après des essais en éprouvette jugés concluants. Le porteur présente cette étape comme le préalable à des essais sur "des animaux de plus grande taille", eux-mêmes préalables aux phases cliniques.

Objectifs

Malgré de récentes avancées pour le traitement du cancer, il reste encore de nombreux besoins médicaux non couverts, notamment dans le cancer du pancréas. Nous avons développé de nouvelles approches thérapeutiques (notamment des Anticorps couplés à un cytotoxique (ADC)) dans le traitement du cancer. Suite à des études in-vitro concluantes, nous devons montrer l’efficacité in-vivo pour validation préclinique, sur plusieurs modèles de cancer. L’objectif est de valider in vivo l’efficacité du traitement, déterminer les concentrations, fréquences et modes d’injection avant de les réaliser sur des animaux de plus grande taille. Une comparaison sera réalisée avec une molécule de référence qui peut être un traitement par chimiothérapie ou un ADC de référence déjà sur le marché.

Bénéfices attendus

A l’issue du projet, il sera établi si l’anticorps et ses variants ADC ont bien la capacité d’inhiber la croissance tumorale. La dose efficace pourra être établie. Ces résultats pourront déboucher sur une étude sur de plus grands animaux en vue de la préparation des phases cliniques. Le bénéfice à long terme est la mise au point d’un nouveau traitement d’immunothérapie pour les cancers.

Procédures

- Injections (environ 2 secondes), tous les deux jours aux maximums, sur souris vigile. - Injections (environ 2 secondes), tous les trois jours aux maximums, sur souris vigile. - injection ( environ 5 secondes), sous anesthésie générale. - Prélèvements sanguins sous anesthésie, , toutes les semaines,e sept prélèvements au maximum. - Prélèvements sanguins, 2 prélèvements en 24h, sous anesthésie générale à l’isoflurane. Prélèvement de sang sous anesthésie générale, avant la mise à mort. Mesure des volumes tumoraux

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires, mais nous serons vigilants aux éventuelles détresses respiratoires. Les injections des molécules et les randomisations peuvent créer du stress chez les animaux. Les injections répétées peuvent éventuellement créer une petite irritation ou inflammation aux sites d’injections. Les traitements pourront éventuellement entrainer une perte de poids. Nous attendons à une possible gêne de la motricité à cause de la croissance tumorale, Nous ne nous attendons pas à une toxicité des molécules testées, mais comme il s’agit de molécules expérimentales nous seront vigilants sur ce point. Les souris immunodéficientes peuvent développer plus facilement des infections.

Devenir

La croissance tumorale, ainsi que le prélèvement de sang final justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est disponible pour tester l’effet des anticorps thérapeutiques sur un système mammifère vivant entier. Les modèles in vitro disponibles de types sphéroïdes ou organoïdes ne permettent pas de modéliser de façon suffisamment précise la pharmacocinétiques et pharmacodynamique des produits. L’utilisation de souris est donc nécessaire afin d’évaluer la pertinence pré-clinique des traitements antitumoraux.

Réduction

Une première validation de l’efficacité du traitement a été réalisée in vitro avec la détermination des indices d’efficacités qui sont compatibles avec les exigences attendues d’un traitement ADC. Cela réduit le nombre de conditions à tester pour la détermination de la quantité de produit à injecter. Les études pilotes (qui utilisent peu d’animaux, inclues la présente demande d’expérimentation) permettront de calibrer au plus juste le nombre de souris pour les études antitumorales tout en permettant une exploitation des résultats. Comme indiqué précédemment, pour chaque molécule testée, si les effets mesurés sont fiables d’un point de vue statistique au deuxième essai, nous n’en feront pas un troisième, ce qui permettra de limiter d’au moins 30% le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

La croissance tumorale sera mesurée trois fois (en fonction de la croissance tumorale) par semaine pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessive. Les animaux seront anesthésiés lors des prélèvements de sang et lors de l’injection des cellules tumorales. Les animaux auront un enrichissement dans les cages sous forme de tunnels et pourront avoir un complément alimentaire gélifié si nécessaire. Des point limites seront mis en place, suffisamment précoce pour limiter la douleur sans remerttre en cause les résultats du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris immunodéficientes. Ce modèle permet la greffe de cellules tumorales humaines et le test des ADC. L’évolution de la croissance tumorale est ensuite évaluée en fonction des différents traitements testés. Les souris auront entre 6 et 9 semaines pour avoir un système immunitaire adulte et pouvoir répondre correctement aux traitements