Souris

384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les femelles gestantes opérées pour introduire des marqueurs fluorescents dans le cerveau de leurs fœtus, les nouveau-nés placés huit jours dans un air appauvri en oxygène. Environ 10 % des embryons ne survivent pas à l'intervention, une perte que le porteur dit difficile à distinguer d'une mortalité naturelle. Le manque d'oxygène provoque un retard de croissance et des lésions cérébrales, et le projet cherche à savoir si la L-Carnitine limite ces atteintes dans un modèle de grande prématurité. Les souriceaux sont tués pour prélèvements, les femelles qui n'ont pas été opérées pouvant être réutilisées comme allaitantes dans les expériences suivantes.

Objectifs

Quand un bébé naît très prématurément, ses poumons ne sont pas encore complètement formés, ce qui peut entraîner des périodes où il manque d’oxygène (appelées hypoxies). Ce manque d’oxygène perturbe le fonctionnement du cerveau, qui a du mal à produire l’énergie dont il a besoin, et peut provoquer des dommages dans le cerveau. Même si le cerveau des bébés a une meilleure capacité de réparation que celui des adultes, ces réparations ne sont pas toujours parfaites. Ainsi, les enfants nés très prématurément ont un risque plus élevé de développer des problèmes cognitifs (comme des difficultés d’apprentissage) à l’adolescence. Cela pourrait être dû à des connexions anormales entre les neurones. Des expériences chez la souris, dans un modèle qui reproduit la grande prématurité (avec un manque d’oxygène à la naissance), montrent que ce stress provoque un problème dans les "usines à énergie" des cellules, appelées mitochondries. Ce problème persiste même à l’âge adulte. Ce projet vise à tester si une molécule appelée « L-Carnitine », qui aide les mitochondries à mieux fonctionner, peut limiter ces problèmes cérébraux. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de grande prématurité et une méthode spéciale qui rend certains neurones fluorescents pour les étudier plus facilement. Nous voulons répondre à deux questions principales : 1) Est-ce que la L-Carnitine aide le cerveau à mieux se développer chez les bébés prématurés ? ; 2) Quel est le meilleur moment pour commencer ce traitement, et combien de temps doit-il durer pour être efficace ?

Bénéfices attendus

Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) puisqu’il vise à comprendre comment le manque d’oxygène affecte le développement du cerveau et à tester si un traitement protecteur pour les "usines à énergie" des cellules, appelées mitochondries, peut limiter ces effets à long terme.

Procédures

Une technique appelée électroporation sera utilisée chez des souris portantes pour introduire des protéines fluorescentes dans les cerveaux des fœtus, ce qui permettra d’observer les cellules cérébrales et leurs "usines à énergie" (mitochondries). Après la naissance, la moitié des souriceaux seront placés dans un environnement pauvre en oxygène pendant 8 jours afin de reproduire le manque d’oxygène associé à une naissance très prématurée. De la L-Carnitine, un traitement protecteur pour les "usines à énergie" des cellules, appelées mitochondries, sera donnée à tous les souriceaux dans l’eau de boisson à différents moments pour évaluer son efficacité à limiter les effets du manque d’oxygène sur le développement cortical et déterminer la durée optimale du traitement. Les souriceaux seront soumis à des tests pour évaluer leur comportement, puis leurs cerveaux seront analysés pour mesurer les effets de l’hypoxie et du traitement.

Impact sur les animaux

Pour les femelles, une chirurgie invasive permet d’introduire des marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries. Bien que rare, des difficultés lors de la mise bas ou des infections sont possibles, mais évitées grâce à des règles d’hygiène strictes. Pour les souriceaux, environ 10 % des embryons peuvent ne pas survivre à la procédure, bien qu’il soit difficile de distinguer cette perte d’une élimination naturelle. L’hypoxie (manque d’oxygène) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales, mais les souriceaux rattrapent leur croissance après et les lésions semblent réparées à l’échelle visible. Cependant, des troubles cérébraux subtils à long terme, comme des problèmes d’apprentissage ou de comportement, peuvent persister et sont détectables lors de tests spécifiques.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.

Remplacement

Les recherches menées dans ce projet s’appuient sur des modèles animaux pour mieux comprendre les conséquences du manque d’oxygène sur le cerveau. Les interactions complexes entre les cellules, l’inflammation et la réponse immunitaire ne peuvent pas être étudiées en laboratoire sans l’utilisation d’animaux. Les traitements testés ont d’abord été évalués sur des cellules isolées avant d’être appliqués à des organismes complets pour mieux comprendre leurs effets dans des conditions réelles.

Réduction

Pour limiter l’utilisation d’animaux, chaque cerveau est utilisé pour plusieurs analyses différentes, et des techniques innovantes permettent d’extraire un maximum d’informations. Les procédures chirurgicales respectent des normes strictes, avec des soins postopératoires attentifs pour minimiser le stress des animaux. Les mères et souriceaux bénéficient d’un suivi quotidien, et des pratiques comme l’alternance des femelles entre cages permettent de garantir une alimentation de qualité pour les petits tout en réduisant le stress.

Raffinement

Ce projet utilise des méthodes bien maîtrisées pour assurer le bien-être des animaux. Les opérations sont réalisées dans des conditions strictes d’hygiène, avec anesthésie et gestion de la douleur. Une attention particulière est portée à la récupération après les interventions et à la réduction du stress autour de la naissance, grâce à des aménagements qui encouragent les mères à préparer un nid confortable. Les souriceaux sont surveillés pour repérer rapidement tout signe d’inconfort. Les mères sont échangées entre les cages normoxiques et hypoxiques pour garantir une bonne production de lait et réduire leur stress.

Choix des espèces

Le cerveau de la souris est proche de celui de l’humain, tant dans sa structure que dans son fonctionnement, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les maladies du développement cérébral et le fonctionnement du cortex. Les techniques nécessaires pour ce projet sont bien maîtrisées sur cette espèce, garantissant la faisabilité de l’étude. Les souris femelles utilisées seront des adultes en bonne santé, âgées de 8 à 24 semaines. Leurs petits seront mis à mort à différents âges pour comprendre comment un manque d’oxygène peut affecter des étapes clés du développement des connexions dans le cerveau et si un traitement qui stimule l’énergie produit par les cellules peut limiter ces problèmes cérébraux.

Infectées par le virus de la grippe, gavées, anesthésiées à plusieurs reprises et saignées jusqu'à quatre fois, 3 322 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses. Le projet vise à mettre au point des films à dissoudre sous la langue, présentés comme une voie de vaccination moins effrayante que la piqûre pour les futurs patients humains. Le porteur annonce une inflammation locale des muqueuses de faible intensité et un inconfort au réveil. Il indique que des seuils d'intervention ont été définis pour limiter la douleur, sans préciser lesquels ni ce qu'ils déclenchent.

Objectifs

Ce projet a pour but de créer un nouveau type de vaccin qui permettrait une meilleure protection contre certaines maladies. Les vaccins classiques sont souvent injectés, mais ils ne fonctionnent pas toujours aussi bien que prévu, ce qui peut poser des problèmes, surtout pour les maladies pour lesquelles il n'existe pas de bon vaccin. Nous voulons développer des films buccaux, un peu comme des pastilles à dissoudre sous la langue. Ces films permettraient au corps de réagir plus efficacement aux infections, car ils agiraient directement dans la bouche, là où certains virus et bactéries pénètrent souvent. Cette méthode est moins effrayante qu'une piqûre et pourrait faciliter la vaccination pour beaucoup de gens. Pour fabriquer ces films, nous utilisons des matériaux sûrs pour le corps et respectueux de l'environnement. Nous avons aussi l’intention d’intégrer des nanoparticules, de toutes petites structures qui permettent de protéger les ingrédients du vaccin et de les libérer lentement dans le corps. Cela aide le système immunitaire à mieux reconnaître et combattre les maladies. Un autre aspect important de notre projet est de comprendre comment notre corps se souvient des infections passées. Pour cela, nous allons étudier des souris génétiquement modifiées qui nous permettront de comprendre comment leur système immunitaire se prépare à se défendre contre les maladies après avoir été vacciné. Nous commencerons par administrer des films au niveau de la bouche contenant un ingrédient modèle aux souris afin de tester notre méthode. Nous observerons ensuite comment les souris réagissent et si elles produisent des anticorps, qui sont comme des soldats prêts à défendre le corps contre les infections. En résumé, notre projet vise à rendre la vaccination plus efficace et plus accessible à tous, en utilisant une méthode simple qui pourrait mieux fonctionner contre certaines maladies.

Bénéfices attendus

La plus part les vaccins utilisés chez l'homme à l'heure actuelle reposent sur une ou plusieurs injections dans le muscle ou sous la peau même lorsqu’il s’agit de protéger contre des maladies infectieuses transmises par les muqueuses (buccale par exemple). Or l’administration par ces voies d'injection n’est pas la voie efficace pour induire une réponse immunitaire au niveau des muqueuses. Ainis, une formulation vaccinale administrée au niveau de la bouche est un enjeu majeur dans le domaine. Notre projet propose de tester la voie buccale comme voie d’administration en recherchant une formulation permettant de garantir une réponse du corps efficace à long terme, sécuritaire, et contrôlée

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1- anesthésies (à 1 mois d'intervalle) ; 2- une injection de cellules immunitaires (une fois) ; 3- une injection de virus de la grippe (une fois) ; 4- un gavage intragastrique de molécule (2 fois à une semaine d'intervalle) ; 5- une anesthésie de moins d'une heure ; 6- des prélèvements sanguins après une anesthésie qui durera moins de 10 minutes 3 fois (procédure 2) ou 4 fois (procédure 3) à au moins 28 jours d’intervalle.

Impact sur les animaux

Les principaux risques identifiés dans le cadre de ce projet sont les suivants : • L’administration du vaccin sous la langue de nanoparticules pourrait provoquer une légère inflammation locale des muqueuses, mais cette réaction est généralement de faible intensité et temporaire (moins de 48 heures) ; • Un stress peut être causé par l'anesthésie qui est répétée 2 fois à 28 jours d’intervalle ; • L’animal peut ressentir un léger inconfort au réveil après un prélèvement sanguin ou l’administration du virus de la grippe sous anesthésie. • Une douleur peut survenir après l'injection des substances anesthésiques ou suite au gavage des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales pour des analyses biologiques.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode en laboratoire capable de remplacer l'expérimentation animale pour répondre aux questions de ce projet. La réponse vaccinale est un phénomène complexe qui ne peut pas être étudié de manière complète en dehors d'un organisme vivant. C'est pourquoi l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire avant de passer aux essais cliniques sur l'humain.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous réalisons d’abord des études préliminaires minutieuses qui nous aident à affiner les formulations dès le départ. Ainsi, nous minimisons les tests sur différentes formes de vaccins en utilisant un nombre limité de souris. Nous utilisons aussi des techniques d’imagerie non invasives, qui permettent de visualiser en temps réel la localisation et la durée d’expression des composants du vaccin dans le même animal. Ces méthodes fournissent des informations précieuses sans prélèvements supplémentaires et sans sacrifier davantage d'animaux. En parallèle, les souris modifiées génétiquement nous permettent de suivre l’activation des cellules immunitaires, notamment des cellules immunitaires mémoires, chez le même animal. Cela nous offre des données détaillées sur la réponse immunitaire tout en réduisant le nombre de souris nécessaires. Enfin, nous employons des outils mathématiques pour calculer précisément le nombre minimal d'animaux requis, optimisant ainsi chaque étape expérimentale tout en respectant des normes éthiques strictes. Grâce à cette approche, nous obtenons des résultats de haute qualité scientifique tout en limitant au maximum l'usage d'animaux.

Raffinement

Tout au long de l'étude, les souris sont surveillées de près pour repérer rapidement tout signe anormal. Après l'immunisation, une surveillance rapprochée est mise en place pendant 24 à 48 heures pour détecter d’éventuels effets secondaires, comme des réactions inflammatoires dues à l'injection. Des seuils d’intervention ont été définis pour limiter la douleur au maximum, assurant ainsi le bien-être des animaux pendant toute la durée de l'étude.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris pour notre projet de vaccination orale en raison de leur proximité biologique avec les humains, ce qui permet de mieux interpréter les résultats pour d’éventuelles applications humaines. De plus, de nombreuses études sur la vaccination des souris contre le virus de la grippe existent déjà, ce qui nous permet de comparer nos résultats à ceux d’autres laboratoires. Nous avons également accès à des modèles de souris génétiquement modifiées qui nous permettent d’analyser en détail les cellules immunitaires B mémoire, essentielles pour évaluer la réponse vaccinale. Les souris seront principalement utilisées à l’âge adulte car leur système immunitaire est alors pleinement développé. Cela garantit des observations précises et pertinentes pour évaluer la réponse immunitaire au vaccin.

Pour sélectionner des candidats vaccins à ARN messager contre les allergies, une société privée va utiliser 1 120 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit trois injections dans le muscle de la patte arrière, puis des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, cinq en trois mois pour 700 d'entre elles, quatorze en un an pour 180 autres. Les atteintes annoncées vont de l'œdème au site d'injection à une douleur musculaire que l'animal signale en se mordant, jusqu'aux douleurs oculaires, œil rouge ou opaque et sécrétions lacrymales. Une grille de points limites est prévue, et les souris qui en atteignent un seuil critique sont mises à mort.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie. Les cytokines sont des protéines sécrétées par les cellules, leur permettant de communiquer entre elles, et pouvant stimuler le système immunitaire. Dans notre étude nous travaillons sur les cytokines IL4 et IL13. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement d'immunothérapies contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s) après administration d’un vaccin. Ce dernier se présente sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm) encapsulé dans des particules lipidiques leur permettant d'entrer dans les cellules. Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin est évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de neutraliser les effets de la cytokine. Dans nos précédentes études, nous avons démontré que le vaccin murin induit une réponse immunitaire neutralisante contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s). Nous avons également démontré que le vaccin humain induit une réponse immunitaire chez des souris humanisées. Ces souris expriment les cytokines humaines IL4 et IL13 ainsi que le récepteur humain IL4Rα. Dans cette nouvelle étude, nous avons 3 objectifs : - Optimiser la réponse immunitaire induite par le vaccin ARN humain en testant différentes doses de vaccins - Evaluer la réponse immunitaire induite par différentes construction de vaccins ARNm humains encapsulées dans différentes particules lipidiques sur du court terme et du long terme. -Evaluer l'effet des vaccins sur les taux de cytokines dans le sang. Pour cela, nous utiliserons les souris exprimant les cytokines humaines IL4 et IL13 ainsi que le récepteur IL4Rα.

Bénéfices attendus

Il permettra de sélectionner les meilleurs candidats vaccins ainsi que la meilleure formulation de particules lipidiques, ainsi que la dose adéquate. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -1060 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (50 à 100 μl). Elles recevront 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28. Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins ARN étaient nécessaires. De plus, des études préliminaires ont montré que chez les souris exprimant les cytokines et le récepteur humains 3 à 4 injections étaient nécessaires pour obtenir une réponse immunitaire efficace. 2)Prèlévements sanguins : Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. Parmis ces 1060 souris : - 700 subiront 5 prélèvements de 150uL chacun sur 3 mois (jour -7, jour 26, jour 38, jour 58, jour 99). - 180 souris subiront 14 prélèvements de 150uL sur 1 an ( A jour -7, jour 26, jour 38, jour 58, jour 99 et une fois par mois jusqu'à 12 mois). - 180 souris subiront 9 prélèvements de 70uL de sang sur 3 mois. ( pré-injection, à jour 1, jour 7, jour 8, jour 28, jour 29, jour 38, jour 58, jour 99).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Nos études nécessitant le prélèvement des organes des souris afin d'approfondir la caractérisation de notre produit, l'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c'est à dire de 7 à 9 semaines, soit environ 20-25 g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

Greffées d'une tumeur par injection de cellules cancéreuses, puis traitées par de nouvelles injections, 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse tous les trois jours, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. L'objectif est de tester si des inhibiteurs de tyrosine kinase, déjà autorisés chez des patients, ralentissent la croissance tumorale une fois combinés à une chimiothérapie ou à une immunothérapie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de passer par un modèle vivant, aucune méthode ne permettant selon lui de reconstituer un système immunitaire in vitro.

Objectifs

Les inhibiteurs d'enzymes oncogènes ont été approuvés pour le traitement de routine des patients atteints de cancer. Ils agissent sur la croissance de cellules cancéreuses. Cependant, cette fonction a récemment été remise en question par des découvertes montrant les effets immunostimulateurs directs de ces inhibiteurs a été démontré que certains de ces médicaments sont dotés de la capacité d'induire la mort cellulaire immunogène dans les cellules cancéreuses, stimulant ainsi les cellules cancéreuses à émettre des signaux qui les rendent détectables par le système immunitaire. De plus, nous avons fourni des preuves précliniques solides selon lesquelles les inhibiteurs induisant la mort cellulaire immunogène peuvent être avantageusement combinés avec une chimiothérapie et une immunothérapie standard, pour traiter le cancer du poumon non à petites cellules. En outre, il a été identifié un certain nombre d'inhibiteurs comme de puissants amplificateurs de la présentation croisée par certaines cellules. Plus globalement, nous disposons donc de preuves solides selon lesquelles certains inhibiteurs ont la capacité d'agir comme inducteurs de la mort cellulaire immunogène sur les cancers et que d'autres inhibiteurs peuvent stimuler la présentation croisée par certaines cellules agissant ainsi, aussi, comme des activateurs de la mort cellulaire immunogène. Il est indispensable de tester davantage ces médicaments seuls ou en combinaison avec une chimiothérapie et/ou une immunothérapie standard dans des modèles précliniques variés pour permettre la traduction des présents résultats en traitements concrets pour les patients.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à une diminution de la croissance tumorale après traitement avec les inhibiteurs testés en association aux traitements conventionnels anti-tumoraux comparée aux traitements conventionnels seuls. Cela permettra de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux aux patients par la suite.

Procédures

Les souris recevront une à deux injections de cellules tumorales (durée 2min) puis des traitements par injection (maximum 3 injections, durée moins d’une minute) pour certaines. Ces interventions seront faites sur anuimaux vigiles avec anesthésie locale. Elles seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse 2 à 3 fois par semaine (tous les trois jours). Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal. Les croisances tumorales peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Les traitements peuvent entraîner une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids chez la souris

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Les inhibiteurs de la tyrosine kinase agissent in vitro en inducteur de la mort cellulaire immunogène sur des cellules cancéreuses (in vitro). Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est indispensable d’utiliser un modèle reproduisant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Des analyses statistiques seront faites sur les résultats obtenus sur les animaux et leurs organes.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de différents éléments. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes). Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - La souris est un animal très utilisé en oncologie préclinique, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Six séances d'électrostimulation et sept mesures de force, chacune sous anesthésie générale, après quatre jours d'injections consécutives : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du tissu musculaire. Le porteur annonce qu'aucun analgésique ne sera administré avant les mesures de force, au motif que les données antérieures ont été obtenues sans analgésie. Il attribue la gravité modérée au cumul des actes et du vieillissement. Les souris sont utilisées à deux âges, entre 8 et 12 semaines et entre 24 et 28 mois, ce second groupe étant maintenu en vie plus de deux ans pour que le vieillissement produise ses effets.

Objectifs

Le muscle possède une remarquable capacité d'adaptation pour maintenir sa masse et sa fonction tout au long de la vie. L'augmentation de l'activité contractile va accélérer l'ajout de nouveaux noyaux aux myofibres, dérivés des cellules souches du muscle. Ce processus est appelé « accrétion myonucléaire ». L'induction de l'accrétion myonucléaire par la stimulation électrique neuromusculaire et l'analyse de l'impact sur le codage des protéines des noyaux résidents et nouvellement acquis chez les animaux jeunes et âgés apporteront une nouvelle compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation d’adaptation du muscle tout au long de la vie.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans le maintien et d’adaptationde la masse et du fonctionnement des muscles tout au long de la vie est fondamental pour la prise en charge des pathologies associées à la fonte musculaire et au dysfonctionnement des cellules souches (vieillissement, cancer, sepsis, insuffisance cardiaque).

Procédures

Les souris sont soumises à des injections (4 jours consécutifs). Ensuite, les souris sont soumises à un protocole d'exercices d'électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum, 6 séances maximum) et à une mesure de force (sous anesthésie générale, durée 5 minutes maximum, 7 mesures maximum).

Impact sur les animaux

Des nuisances "Modérées" sont attendues du fait d’un cumul d’actes (vieillissement, injection, électrostimulation, anesthésies) qui peut induire un stress et douleur de courte durée chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice par stimulations électriques musculaires qui est impossible à reproduire in vitro. Enfin, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental peu invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice par stimulations électriques musculaires et de mesurer la force musculaire de manière simultanée sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. De plus, nous utilisons le muscle contrôle non-stimulé comme contrôle, divisant par 2 le nombre d’animaux utilisés dans notre étude.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés (e.g., administration du traitement dans l'eau potable au lieu de manipulations et d'injections répétées ; stimulation musculaire à l'aide d'un protocole court et non dommageable d'une semaine au lieu de protocoles induisant des dommages). La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Nous n'administrerons pas d'analgésique avant a mesure de la force musculaire, car ce projet complète un ensemble de données obtenues précédemment sans analgésie. En revanche, la douleur, qui survient par exemple lors du vieillissement des animaux, est traitée par la buprénorphine. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’entretien du muscle ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines, et a 24-28 mois d'âge.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois administrations de molécules fluorescentes dans la veine de la queue ou sous la nuque, subit jusqu'à quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie sous anesthésie générale, avant une dernière injection au moment de sa mise à mort. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée sans délai. Le projet sert à mettre au point les vecteurs d'une société privée qui répond à ce qu'elle décrit comme une "demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique".

Objectifs

A l'heure actuelle, beaucoup de besoins médicaux restent malheureusement insatisfaits, sans aucun traitement curatif ou palliatif, et peuvent devenir de véritables enjeux de santé publique dans le futur. Il existe ainsi une demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique pour l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules, permettant des approches ciblées. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à identifier des récepteurs exprimé sur les cellules que l'on veut cibler et de développer des molécules capables de les reconnaitre et s'y fixer. Nous pourrons ensuite conjuguer des médicaments sur nos molécules afin de les faire passer les barrières physiologiques naturelles et atteindre plus efficacement les tissus cibles. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces car ils n'atteignent pas de manière spécifiques les tissus voulus. Cette demande de projet a pour objectif le développement et l’amélioration de nos molécules pour faciliter le passage des médicaments à travers les membranes cellulaires. Le fait d'accrocher nos molécules à des proteines fluorescentes permet de suivre leur localisation.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nos molécules permet d'obtenir une localisation plus spécifique et d'éviter des effets sur les tissus non voulu et cela constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont les suivantes : -L’administration de nos molécules se fera sur animaux éveillés en une dose ou plusierus doses répétées (maximum x3). Ces dernières se feront : - Au niveau de la veine de la queue pour l'animal vigil en contention, geste rapide (≤ 2min). - Ou au niveau de la nuque pour les sous-cutanées, animal vigile, libre sans contention ; geste rapide (≤ 2min). L'injection intrapéritonéale (1 fois lors de la mise à mort des individus) -Les prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux vigiles : au maximum 4 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7 jours et ≤20% sur 14 jours. Pour chaque imagerie la souris est anesthésiée. Il y aura à minima 1 imagerie et cela peut aller jusqu'à 7 imageries. L'imagerie prend quelques minutes (entre 2 et 5min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : - La contention des animaux dans le cas des administrations intraveineuses et sous-cutanées. - Les différentes administrations réalisées : intraveineuses ou sous-cutanées et intrapéritonéales (lors de la mise à mort des individus). - Les prélèvements sanguins intermédiaires

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de caractériser ex vivo la biodistribution mais aussi l'efficacité selon le type de molécule couplée.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités, mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 10 études par an, nous aurons besoin de 40 animaux par an (n mixte=4 *10), soit un total de 200 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les imageries se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal tout en ayant un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale par injection de morphinique. Le bien être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, ou morceau de bois afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dit « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 17-28g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).