Souris
Mise en place d’un modèle de cicatrisation cutanée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Deux plaies de pleine épaisseur dans le dos, sous anesthésie, pour caler la taille des lésions et la durée d'observation d'un projet ultérieur de pansement : 87 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est tondue et ses griffes arrière coupées avant l'intervention, puis ses pansements sont changés tous les trois jours, chaque fois sous anesthésie. Aucun pansement fonctionnalisé n'est testé ici, cette étape sert à préparer celle qui le fera. Le porteur affirme que les modèles de peau in vitro comportent "trop de lacunes" et qualifie le modèle animal d'"incontournable", puis annonce que les 87 souris seront gardées en vie et proposées à l'adoption.
Objectifs
Le projet présenté ici est une étude pilote qui a vocation à mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée. Il est le pré-requis d’une étude sur le développement d’un pansement pour la libération locale et prolongée d’agents pro-cicatrisants type vitamine E en utilisant des pansements fonctionnalisés avec des polymères thermo-répondants. En effet, la cicatrisation des plaies est un processus complexe visant à maintenir la fonction de barrière de la peau. Faute de cicatrisation suffisante, les plaies chroniques entraînent des infections persistantes et l'incapacité des cellules cutanées à se réparer, entraînant une gêne et une détresse importantes chez le patient. Dans notre projet l’idée est qu’après élimination des débris et tissus inertes, le pansement appliqué peut être exploité comme une plateforme pour délivrer des molécules bioactives afin de prévenir l'infection bactérienne et de favoriser la cicatrisation. Le projet a pour objectif de développer des revêtements de polyarginine thermorépondants pour la fonctionnalisation de pansement. Les revêtements développés posséderont trois propriétés : (i) bactéricide à la fois par contact grâce à la polyarginine, (ii) antioxydante et (iii) favorisant la cicatrisation par la libération d'un agent cicatrisant naturel.
Bénéfices attendus
Le projet présenté ici est un projet pilote pour le développement d’un dispositif médical favorisant la cicatrisation de plaies chroniques. L’étude pilote en elle-même doit permettre de mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée sur lésion de pleine épaisseur. Il permettra de déterminer avec précision la taille des lésions à réaliser ainsi que le temps d’observation. Ainsi nous pourrons raffiner au mieux nos expériences pour la validation de l’effet des recouvrements de surface en cours d’élaboration en assurant plus de reproductibilité.
Procédures
Tonte et coupe des ongles des pattes arrières sur animaux anesthésiés d'une durée de 10 minutes Réalisation de plaies cutanées et mise en place des pansements sous anesthésie d'une durée de 30 minutes Changement des pansements et observation des plaies sous anesthésie d'une durée de 10 minutes tous les trois jours.
Impact sur les animaux
Au cours de l’expérimentation deux plaies cutanées seront réalisées sur le dos de l’animal. La nuisance générée sera de deux ordres. Le premier est la douleur associée à la procédure chirurgicale. La seconde nuisance est l’application de pansement sur les plaies.
Devenir
Animaux gardés en vie et proposés à l'adoption.
Remplacement
Il existe des modèles de peau in vitro. Ces derniers sont plus ou moins complexes. Le plus simple est un modèle en deux couches, une couche épithéliale constituée à partir de kératinocytes et une couche mimant le tissu conjonctif sous jacent sous la forme d’une matrice (biologique ou synthétique) ensemencée avec des fibroblastes. Dans les modèles plus complexes, des cellules immunitaires sont ajoutées dans le succédané de tissu conjonctif. Certains modèles testent également l’incorporation de cellules endothéliales. Ces modèles sont intéressants mais ne permettent pas de recréer les différentes phases de la lésion cutanée et de sa cicatrisation : création d’un caillot sanguin, formation d’un tissu de granulation à partir du tissu conjonctif, ré-épithélialisation. Il manque également les éléments propres à la réaction immunitaire locale qui peut être pertubée par un matériau ou encore un élément essentiel qu’est le mouvement de la plaie. En effet les plaies cutanées par essence sont soumises à des contraintes mécaniques. Ceci doit être pris en compte dans l’évaluation de nos stratégies. En effet pour un pansement l’application de ce dernier sur la plaie est un facteur qui va modifier potentiellement la libération locale du principe actif. Les modèles in vitro comportent donc trop de lacunes qui ne leur permettent pas de représenter fidèlement la situation clinique à traiter et qui nous oblige donc a utiliser un modèle animal.Le modèle animale est également incontournable car les éléments qui seront testés après établissement de ce modèle sont de nouvelles molécules qui nécessiteront avant leur emplois chez l'homme un validation de leur sécurité et de leur efficacité.
Réduction
Il s'agit ici d'une étude pilote, nous allons donc réaliser une étude descriptive. Nous utilisons une approche incrémentale analysant un paramètre du modèle l'un après l'autre. Pour chaque paramètre, il y aura également une approche progressive permettant de limiter le nombre d'animaux lorsque la variable testée a atteint l'objectif. On travaillera donc avec des petits lots d'animaux (4 à 6).
Raffinement
Les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées en groupe. Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie locale sur le site de l’incision. L’analgésie post-opératoire sera réalisée pour assurer le bien-être des souris avec une surveillance journalière. La chirurgie sera privilégiée le matin. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, coton, tunnel…) afin de permettre la fabrication de nids. L'évaluation du bien-être des animaux se fera au cours d'évaluations journalières à partir d'un tableau de référence (en annexe).
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris car c’est un modèle de cicatrisation décrit dans la littérature qui permettra de diminuer le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. La cicatrisation chez le rongeur est légèrement différente du processus chez l’humain (Chez l’homme, il y a d’abord la ré-épithelialisation puis la granulation avant la contraction alors que chez les rongeurs le processus débute par la contraction, mais la stabilisation de la plaie permet d’éviter le phenomène de contraction. Les souris seront âgées de 10 semaines, il s’agira donc de jeunes adultes. A cet âge la capacité des animaux à supporter des chirurgies est optimale et le système immunitaire est pleinement mature.
Evaluation d’une combinaison entre une immunothérapie et un nouveau biomédicament dans le traitement des carcinomes à petites cellules du poumon dans un modèle souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Après des essais menés sur des souris privées de système immunitaire, 50 souris immunocompétentes reçoivent sous la peau des cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues chaque semaine dans un cône de contention en inox pour recevoir en intraveineuse un placebo, un anticorps médicamenteux, une immunothérapie ou les deux traitements associés. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'être humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé chez la souris lors des études précédentes, la gravité déclarée restant pourtant modérée. Toutes seront tuées pour peser les tumeurs, mesurer l'infiltration immunitaire et chercher la toxicité sur les organes, en vue d'un essai clinique de phase 1.
Objectifs
Le carcinome à petites cellules du poumon (SCLC), est la forme de cancer du poumon la plus aggressive, avec une survie à 5 ans de seulement 7% avec très peu d'options thérapeutiques actuellement disponibles. L'approbation de nouvelles immunothérapies en association avec un traitement de chimiothérapie conventionnel en première ligne a représenté une nouvelle étape thérapeutique en 2018 avec une diminution du risque de décès d'environ 30% grâce aux réponses prolongées. Cependant, la survie globale à 3 ans reste inférieure à 20 %, dus aux résistances innées et acquises, les options de traitement actuelles restent limitées. Dans ce contexte, notre projet a pour objectif d’utiliser un anticorps médicamenteux qui a montré in vitro son efficacité thérapeutique sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs mais également in vivo sur un modèle murin immunodéficient (sans système immunitaire fonctionnel). L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité du produit étudié seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle murin immunocompétent avant de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’humain.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est l’évaluation du nouveau anticorps médicamenteux Adcitmer utilisé seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle de souris immunocompétentes utilisant une lignée murine de carcinome à petites cellules du poumon. La validation de ce modèle nous permettra d’évaluer le bénéfice d’une bithérapie biomédicament/immunothérapie. L’objectif plus global etant donc d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de contribuer à la mise en place d’un essai clinique de phase 1.
Procédures
Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de SCLC (cancer à petites cellules du poumon) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés une fois par semaine en intraveineuse avec le placebo, le biomédicament Adcitmer, l'immunothérapie Avelumab ou la combinaison des deux traitements. Pour cela les souris seront placées dans un cône de contention le temps de l'application de la pommade anesthésiante et de l'injection en intraveineuse (5-10 minutes par intervention).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutanée et une contention hebdomadaire en cône de contention pour l'injection en intraveineuse. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intraveineux. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes.
Devenir
L'évaluation de la masse finale des tumeurs, de l'infiltration immunitaire des tumeurs et l'évalution de la toxicité sur les organes impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.
Remplacement
L’efficacité d'Adcitmer a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de SCLC humaines et sur la lignée murine KP11. L'obtention de données préliminaires in vitro sur ces différentes lignées a permis de limiter le nombre de doses testées dans la recherche d'optimisation des schémas thérapeutiques dans le modèle de xénogreffes de la lignée humaine de SCLC, en modèle souris immundéficient. Grâce à ces expériences préliminaires, nous proposons dans ce projet, d'évaluer la plus-value apportée par une combinaison biomédicament/immunothérapie en testant une dose optimale du biomédicament et non plusieurs.
Réduction
La détermination du nombre de groupes et la dose testée sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Pour les injections en intraveineuse, les souris seront maintenues dans un cône de contention en inox, pour leur générer moins de stress lors de cette manipulation, les souris seront habituées à cette contention 2 fois par semaine avant leur inclusion dans l’étude. De plus, une pommade anesthésiante sera appliquée avant chaque injection en intraveineuse, et une friandise sera donnée aux souris après. Pour limiter toute souffrance des animaux, une grille décisionnelle a été élaborée afin de monitorer l'état de santé des animaux, si l'un des critères de souffrance est atteint, la décision de sacrifier l'animal sera prise. De plus, afin de limiter les souffrances lors de l'euthanasie, un sédatif sera injectée en intrapéritonéal avant le sacrifice.
Choix des espèces
La génération d'une lignée carcinomateuse murine présentant l'ensemble des marqueurs caractérisant les lignées de SCLC humaines, nous permet d'utiliser un modèle de souris immunocompétente pour évaluer notre traitement. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.
Etude du rôle d’ASXL1 et ASXL2 dans la mégacaryopoïèse pathologique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un score de douleur relevé lors des examens cliniques déclenche la mise à mort des souris qui atteignent les points limites terminaux. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle osseuse et la rate. Elles reçoivent une alimentation modifiée qui invalide les gènes Asxl1 et Asxl2, subissent jusqu'à douze prises de sang sous anesthésie générale et une injection d'une molécule qui s'intègre dans leur ADN. Le projet, ouvert en 2016, est prolongé pour consolider des résultats déjà obtenus, et l'effectif de 220 animaux n'est appuyé que sur un renvoi aux études publiées.
Objectifs
La mégacaryopoïèse est le processus qui conduit à la formation des plaquettes. Elle a lieu dans la moelle et est régulée par de nombreux facteurs dont des facteurs de transcription et épigénétiques. Les facteurs épigénétiques permettent de modifier l’état de la chromatine (l’ADN) et ainsi d’influencer la transcription. Parmi ces facteurs, nous nous sommes intéressés aux protéines ASXL1 et ASXL2 qui sont mutées dans des maladies hématologiques. L’objectif global de notre projet est d’étudier leurs fonctions dans la mégacaryopoïèse. Nous avons pu démontrer que l’invalidation de ces gènes chez la souris conduit à des anomalies de la mégacaryopoïèse, avec le développement de macrothrombopénies (diminution du nombre de plaquettes dans le sang, associée à la présence de grosses plaquettes), une diminution des progéniteurs mégacaryocytaires dans la moelle osseuse, des anomalies structurales et du contenu en ADN des mégacaryocytes. Par ailleurs, les plaquettes générées sont moins efficaces et donc moins capables de jouer leur rôle dans l’hémostase. Ce projet a été initié en 2016 et nous demandons une nouvelle autorisation pour le finaliser : consolider nos résultats et ajouter de nouvelles expériences visant notamment à étudier le cycle cellulaire des progéniteurs mégacaryocytaires.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le rôle des protéines ASXL1 et ASXL2 dans la mégacaryopoïèse. Nous rechercherons en parallèle si ces facteurs épigénétiques sont altérés chez des patients atteints de thrombopénies et pourront ainsi associer la thrombopénie observée à une cause génétique.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - alimentation spécifique pour induire les pertes de fonction des gènes Asxl1 et Asxl2 - prise de sang bi-mensuelle ou mensuelle sous anesthésie gazeuse pour récupérer et étudier les plaquettes (n=6 à 12, durée 5 minutes, sous anesthésie générale)- injection unique d’une molécule qui s’intègre dans l’ADN des cellules en cycle pour les études de cycle cellulaire (durée 1 minute, sous anesthésie locale).
Impact sur les animaux
Lors de nos précédentes expériences, nous n’avons pas constaté de nuisances spécifiques ou effets indésirables associés à la délétion des gènes étudiés. La macrothrombopénie observée n'est pas profonde et n'a donc pas de conséquence clinique. Les nuisances seront donc courtes et légères (légère douleur) et liées aux gavages, aux prises de sang (sous anesthésie générale) et à l'injection unique d'une molécule permettant l'étude du cycle cellulaire).
Devenir
A la fin de chaque procédure, il est prévu de prélever les organes où s’effectuent la production des cellules du sang (moelle osseuse, rate) afin d’étudier les cellules progénitrices des plaquettes, ce qui nécessite l’euthanasie des animaux.
Remplacement
Le processus de formation des plaquettes a lieu dans la moelle osseuse et est fortement influencé par l’environnement médullaire (autres cellules environnantes, architecture médullaire) qui est impossible à reproduire in vitro. Par conséquent, un modèle in vivo nous a semblé indispensable, afin de pouvoir étudier le rôle des facteurs épigénétiques dans ce processus. Par ailleurs, ce projet vise à finaliser les résultats obtenus lors d’une demande précédente, l’utilisation du même modèle est donc indispensable. Les approches in vitro ne permettent pas d’obtenir suffisamment de cellules pour les analyses de cycle, ni le maintien pendant plusieurs jours des cellules à l’état de cellules immatures. Enfin, la formation des plaquettes se fait sous l’action du flux sanguin, que nous n'avons pas dans nos systèmes de culture.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous étudions en parallèle les 4 groupes d’animaux d’intérêt (sauvage, délété pour Asxl1, délété pour Asxl2, délété pour Asxl1/Asxl2), afin de n’avoir qu’un seul groupe contrôle. L’étude des plaquettes sur les prélèvements sanguins sera couplée aux analyses médullaires afin de minimiser le nombre d’animaux. Le nombre nécessaire d’animaux a été estimé afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant, en accord avec les études publiées.
Raffinement
Les animaux sont observés tous les jours. Un score de douleur est établi en observant le comportement des animaux lors des examens cliniques. Les points limites en découlant et les mesures prévues seront strictement appliquées. Si un signe de douleur est observé, un analgésique pourra être administré et un enrichissement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage (point limite précoce non terminal). Si un amaigrissement est observé, un aliment adapté, plus riche et plus préhensile sera mis à disposition. En cas d’atteinte des points limites terminaux, les animaux seront euthanasiés. Les souris seront anesthésiées lors des différentes interventions procédurales (anesthésie locale ou générale dépendamment des actes).
Choix des espèces
Les modèles murins sont adéquats pour notre étude, car ils nous permettent d’explorer les différentes étapes de la mégacaryopoïèse, dans un modèle mammifère qui reflète en général ce qui se passe chez l’homme. Par ailleurs, les modèles animaux développés nous permettent d’invalider les gènes d’intérêt spécifiquement dans les cellules produisant les cellules du sang. L’invalidation de ces gènes dépend de l’expression d’une enzyme que nous pouvons induire par l’alimentation des souris. Etant donné que nous souhaitons étudier la mégacaryopoïèse adulte, nous induirons les délétions de ces gènes chez les souris autour de 2 mois et étudierons les souris à partir de 5 semaines après induction, soit à partir de l’âge de 3 mois (âge adulte).
Rôle des cellules immunitaires dans les traitements anti-cancéreux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et l'effet des traitements caractérisé, 836 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, puis jusqu'à neuf injections de vaccin, de traitement associé et d'immunothérapie étalées sur trois semaines. Les tumeurs implantées dans le poumon peuvent provoquer des difficultés respiratoires, des douleurs modérées et une perte d'appétit. Le porteur écrit ne pas pouvoir envisager le remplacement des animaux, tout en indiquant que l'intelligence artificielle permettrait d'étudier l'interaction entre cellules immunitaires et cellules tumorales et qu'elle n'est "pas actuellement utilisée".
Objectifs
Le pronostic global des patients atteints de cancer du poumon est mauvais, et dans ce contexte l’immunothérapie suscite un grand intérêt, néanmoins, bien que ces traitements aient permis d’améliorer la survie de certains patients, les taux de réponse restent limités. Nous avons identifié des lymphocytes infiltrant les tumeurs et appelées lymphocytes T résidents capables d’éliminer les cellules tumorales et associés à une meilleure survie des patients dans plusieurs pathologies cancéreuses. Ce projet permettra : 1) d’élucider le rôle des lymphocytes T résidant dans les tumeurs dans la réponse aux immunothérapies in vivo dans un modèle de souris, 2) de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les améliorer et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous utiliserons deux modèles de souris portant une pathologie cancéreuse, et des traitements anti-cancéreux in vivo. Jusqu’à ce jour, aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité du système immunitaire dans un environnement tumoral.
Bénéfices attendus
Afin de comprendre pourquoi les taux de réponse à l’immunothérapie restent limités chez la majorité des patients atteints de cancer, notre objectif est de mieux comprendre le rôle d’une nouvelle classe de globules blancs, les lymphocytes T résidents, présents dans la tumeur. Grâce à des modèles in vivo, nous chercherons à comprendre quels sont les mécanismes permettant l’obtention de ces lymphocytes dans la tumeur. Notre but est de faire avancer les connaissances sur les causes de l’efficacité limitée du système immunitaire dans les tumeurs et ainsi contribuer à l’amélioration de la réponse aux immunothérapies et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Toutes les souris seront greffées avec une lignée cellulaire tumorale avec une seule injection (durée 1 minute, anesthésie locale). L'injection du vaccin sera répétée 2 fois tous les 7 jours pendant 20 jours (durée 1 minute, sous anesthésie locale). Le vaccin sera combiné à un autre traitement appliqué par injection répétée 3 fois tous les 4 jours pendant 20 jours (durée 1 minte, anesthésie locale). L’immunothérapie est une solution injectée 4 fois tous les 4 ou 5 jours pendant 16 à 22 jours (durée 1 minute, anesthésie locale).
Impact sur les animaux
Les injections causent un stress et douleur légère de courte durée. Les tumeurs greffées en sous-cutanée peuvent entraîner une gêne mécanique légère, une douleur modérée. Les tumeurs induisant un ou plusieurs foyers tumoraux dans le poumon, peuvent causer des problèmes respiratoires et des douleurs modérées. Parmi les nuisances possibles de ces tumeurs il y a aussi la perte d'appétit et de poids.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever certains organes pour caractériser l’effet des traitements, les effets anti-tumoraux et les cellules immunitaires.
Remplacement
L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique ou des anticorps thérapeutiques dans un contexte cancéreux relève d’une grande complexité où les modèles in vitro seuls n’apporteraient pas tous les éléments et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs. Nous ne pouvons pas envisager le remplacement des animaux pour nos études. Cependant nos hypothèses de travail se basent sur nos expériences in vitro avec des cellules humaines et sur la littérature. Certaines approches expérimentales in vitro pourront aussi être réalisés afin de confirmer une partie des résultats obtenus grâce aux expérimentations in vivo. Le nombre de souris pour cette étude a été calculé mathématiquement afin d'utiliser le plus petit nombre de souris tout en restant statistiquement significatif. L'intelligence artificielle pourrait permettre d'étudier l'interaction potentielle entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales mais n'est pas actuellement utilisée.
Réduction
Les expérimentations seront réalisées toutes les 6 semaines pour nous permettre d’analyser les résultats et de modifier le protocole suivant les résultats précédents obtenus in vivo. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience pour réduire le nombre d’expériences et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en tant que lot contrôle. Nous utiliserons le plus petit nombre de souris tout en respectant la validité statistique de l'étude. Afin de calculer à priori le nombre d’animaux pour répondre à nos hypothèses, un logiciel de statistique a été utilisé. Pour chaque procédure, le test statistique sera adapté et tiendra compte des résultats de nos expérimentations antérieures et de nos connaissances sur les modèles murins en cancérologie, ce qui nous permettra de réaliser des conditions de traitement cohérentes et ainsi réduire le nombre de groupes/animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront surveillées tous les deux jours puis tous les jours à partir de J8 pour les souris avec tumeurs pulmonaires et une grille de score sera réalisée. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le toilettage = grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. En cas de changement de comportement, de l’enrichissement sera ajouté dans la cage ou les souris seront séparées. Un examen clinique sera réalisé avec l'utilisation d'une grille de score et en cas de gênes ou douleur dues à la progression des tumeurs, en particulier les tumeurs pulmonaires, un anti-inflammatoire sera administré pour minimiser les douleurs et un aliment adapté sera donné. Un anti-inflammatoire sera administré pour les douleurs légères. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle in-vivo le plus adéquat pour l’étude des interactions entre le système immunitaire et le microenvironnement tumoral complexe. De plus, le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, et les modèles tumoraux sont les plus appropriés pour notre étude et comparables aux cancers humains. L’invalidation génétique de la molécule d'intérêt spécifiquement dans les lymphocytes T a été généré seulement dans cette espèce. Cependant, une étude sera réalisée en parallèle sur des échantillons tumoraux humains afin de renforcer les résultats obtenus dans le modèle murin. Les animaux, âgées de 5 à 8 semaines seront réceptionnées par l’animalerie et utilisés après une période d’acclimatation de 7 jours minimum. Les greffes de tumeurs seront réalisées sur des animaux âgés de 6 à 9 semaines afin d’obtenir une meilleure prise de greffe et avoir une grande quantité d’infiltrat lymphocytaires.
Modèles pathologiques induits chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 11100
Cochons d'Inde : 900
Hamsters dorés : 2100
Arthrose, encéphalomyélite auto-immune, cancer, diabète, inflammations, infections bactériennes et morsures de tiques : ces pathologies sont induites chez 28 200 rongeurs pour tester, à la demande de clients de l'industrie pharmaceutique, l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux. 14 100 souris, 11 100 rats, 2 100 hamsters dorés et 900 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue pour analyses. Le porteur indique que l'encéphalomyélite induite peut provoquer une paralysie progressive de la queue puis des membres, accompagnée d'allodynie et de douleurs persistantes, et que le modèle d'arthrose peut conduire à de l'automutilation. La surveillance annoncée repose sur des scores de paralysie, sur l'observation des pattes et sur une pesée bihebdomadaire, sans qu'aucun seuil déclenchant la mise à mort ne soit chiffré.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux tel que l’arthrose, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le cancer, le diabète, l’inflammation, l’infection parasitaire et bactérienne. Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de ces pathologies.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour le modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs administrations d’une substance, de 2 à 5 administrations. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’administration d’une première substance, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’administration d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle de cancer, les animaux vigiles ou anesthésiés reçoivent une administration d’une solution de cellules cancéreuses. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’infection bactérienne, les animaux reçoivent une solution bactérienne. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation aiguë, les animaux reçoivent une solution d’une substance au niveau de la patte. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation chronique, les animaux reçoivent une solution d’une substance. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle anti parasitaire des tiques sont déposées sur la peau des animaux. La durée du dépot des tiques sera de 5 minutes maximum. Une substance test sera inoculée en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement de chaque modèle. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Pour le modèle du diabète, les animaux reçoivent une administration d’une substance. Une chirurgie sous anesthésie générale et avec un protocole d’analgésie adapté pourra être réalisée si la substance test est administrée dans un organe cible, dans ce cas, la chirurgie sera de 1h30 maxium.
Impact sur les animaux
Le modèle d'arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations à plus ou moins long terme. Les effets liés au développement du modèle peuvent aboutir à une baisse d'activité ainsi qu'un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, ...). Ces effets peuvent apparaître à partir du 21ème jour. Le modèle d'encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres à plus ou moins long terme. Cette paralysie peut s'accompagner d'une allodynie et/ou d'une douleur plus ou moins persistante au niveau des memebres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaître le 10ème jour avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Le modèle de développement de cancer peut provoquer des douleurs liées à l'apparition des masses tumorales. Les premiers signes cliniques peuvent survenir dès l'apparition visible de ces masses. Les animaux peuvent avoir des difficultés pour se déplacer. Le modèle d'infection bactérienne peut générer différents signes cliniques liés à l'infection. Ces signes cliniques peuvent être une perte de poids, des poils hérissés, une prostration de l'animal. Le modèle de diabète peut générer différents signes cliniques tels qu'une augmentation de la consommation d'eau, une augmentation des mictions, une déshydratation, une perte de poids et une distension abdominale. Les modèles d'inflammations aiguës et chroniques peuvent engendrer de la douleur au niveau du site de l'inflammation, des rougeurs, de la fièvre ainsi qu'une perte des fonctions physiques normales. Le modèle d'infection parasitaire peut engendrer de la douleur liés aux morsures de tiques, ainsi qu'une inflammation cutanée de lazone mordue, une faiblesse générale, de la fièvre ainsi qu'un manque d'apetit. Les effets liés à ces modèles peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d'activité, baisse de la prise alimentaire) et physique (perte de poids, abscence de réflexes, immobilité). Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l'abscence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Dans le cas de développement de cancer, il s’agit de l’apparition de tumeurs solides visibles ou sanguines (leucémie). Dans le cas d’activité antibactériennes, il s’agit d’une infection qui peut engendrer de la fièvre, une prostration de l’animal et des poils hérissés. Dans le cas du diabète il s’agit d’une perte de poids, une augmentation de la prise d’eau et des mictions, et d’une augmentation de la glycémie. Dans le cas d’inflammations aiguës et chroniques, il s’agit de rougeur et/ou de fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Dans le cas d’infection parasitaire, il s’agit de morsures de tiques entraînant des rougeurs, de la fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel. Il y aura environ 55 études par année (toutes procédures confondues).
Raffinement
De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Pour le modèle de cancer, les tumeurs sont mesurées afin de suivre leurs évolutions. Pour le modèle de diabète, la glycémie est analysée régulièrement afin de suivre l’évolution du diabète. Pour le modèle antiparasitaire, le nombre et le poids des tiques détachés des animaux sont comptés. Pour le modèle d’inflammation aiguë, l’inflammation au niveau de la patte est mesurée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Pour la procédure d'arthrose, le choix du modèle dépend du volume et du mode d'administration. Pour la procédure d’encéphalomyélite auto-immune, le choix du modèle est la souris car uniquement celui-ci fonctionne sur ce modèle. Pour le modèle de cancer, le choix dépend du modèle de tumeur et du mode et du volume d'administration. Pour le modèle d'infection bactérienne, le choix dépend de l'agent pathogène. Pour le modèle de diabète le choix du modèle dépend de l'historique de la substance à tester et du volume d'administration. Pour le modèle d'inflammation aigüe, chronique et d'infection parasitaire le choix du modèle est fait selon le volume d'administration de la substance à tester. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Test de toxicité et d’efficacité d’un composé X anti-obésité en développement
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Douze mesures de température par sonde rectale et dix injections intrapéritonéales dans une procédure, vingt-deux injections et vingt-deux pesées dans l'autre. 90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses par onze semaines d'un régime dont 60 % des calories viennent des graisses, elles sont hébergées seules et passent deux sessions de 48 heures en mesure de dépenses énergétiques. Le porteur relève que leur obésité réduit leur capacité de mouvement et que le jeûne de quatre heures imposé avant les prises de sang provoque une sensation de faim. L'étude teste la toxicité et l'efficacité d'un candidat médicament pour le compte d'un client, et se limite aux mâles pour ne pas doubler les effectifs.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester sa potentielle toxicité et son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses. Le projet devra permettre de montrer l'innocuité et l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Procédure 1 : Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (8 mesures au cours de la procédure 1; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de placébo, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (10 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (1 mesure; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesures de température corporelle par sonde rectale (12 mesures; durée de la mesure : 1 minute); 5) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement de sang et d'organes (durée: 10 minutes). Procédure 2 : Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (22 mesures au cours de la procédure 1; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (22 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 48h); 5) Anesthésie générale avant euthanasie (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Les nombres de 8 animaux par groupe pour la procédure 1 et de 10 animaux par groupe pour la procédure 2 ont été rationalisés à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais un contact visuel et olfactif entre congénères sera maintenu. Par ailleurs, une attention particulière sera maintenue sur l'enrichissement des cages qui sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur, avec une rotation de leur présence dans la cage (a minima 2 matériels d'enrichissement présents dans la cage) afin de conserver un effet de nouveauté. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée (2 visites par jour) et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 17 semaines (20 à 22 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 11 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Chocs septiques stériles et modèles d’exploration rapide de l’inflammation aigue systémique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1230
Le laboratoire provoque une inflammation générale par injection de lipopolysaccharide, pour qualifier ses lots de réactifs biologiques et évaluer des composés en développement. 1 230 rats et 1 230 souris vont être utilisés, tous mis à mort à l'issue, dont 2 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent l'agent inflammatoire à l'état vigile, puis le composé à tester en quelques secondes ou sur plusieurs minutes, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie. Le porteur juge le recours à l'animal vivant "incontournable" à ce stade préclinique. Il s'attend, dans les cas extrêmes, à des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, ces signes constituant eux-mêmes les points limites qui déclenchent l'arrêt anticipé.
Objectifs
Les phénomènes inflammatoires sont des réactions normales des organismes mis en action en réponse à une agression tels que les traumas qui induisent des lésions, ou plus généralement consécutive à une infection par un hôte étranger. Au cours des maladies chroniques hépatiques telles que la cirrhose, des phénomènes inflammatoires peuvent être induits par un franchissement de la barrière intestinale à la perméabilité dégradée par de microorganismes issu du microbiote. L’inflammation présente donc un intérêt dans nos travaux. Par ailleurs, des modèles expérimentaux basés sur le pouvoir d’activation de l’inflammation de certains composants de la paroi de bactérie (LPS ou Lipopolysaccharide) sont très amplement utilisés au laboratoire pour l’étude de l’inflammation et des évaluations de propriétés pharmacologiques sur la voie de l’inflammation de composé en développement. Ce projet propose donc des procédures simplifiées de mise en œuvre de modèles inflammation systémique chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
L’utilisation de bio réactifs au cours de procédures longues, complexes et qui engagent un nombre significatif d’animaux comporte un part de risque d’échec. Il peut s'agir par exemple d'une induction trop faible en raison d'animaux qui ne réagissent pas correctement au stimulus ou au contraire qui montrent une réaction exhacerbée qui produit des pertes d’animaux. La qualification préalable des lots de bioréactifs nécessite l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux et permet à terme de réaliser des expériences en limitant les risques d’échec Cela contribue donc à la réalisation d’expérimentation plus fiables et reproductibles, et qui nécessitent moins de répétitions.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales pour la réalisation de la phase d’induction du processus inflammatoires, les animaux à l'état vigiles subiront l'action de l'agent d'induction de l'inflammation. Pour la réalisation de l’évaluation des propriétés des composés à tester, nous pourrons traiter les animaux dans un état vigile, soit de manière aigue dite " en bolus", et dans cette situation l'administration ne dire que quelques secondes ( 5 à 10 secondes), soit de manière lente et sur une plus longue durée ( plusieurs minutes ) Ils seront anesthésiés et subiront un prélèvement sanguin terminal puis seront mis à mort sans réveil.
Impact sur les animaux
Dans ce type de procédure, on s’attend à observer dans les cas extrêmes des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, mais ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé.
Devenir
Les analyses biochimiques réalisées pour les mesures de niveaux de cytokines sont rélaisées sur des prélèvements terminaux. Les animaux sont mis à mort en vue de recueil de leurs organes pour l'exploration de l'expression des proteines de la phase aigue de l'inflammation notamment d'origine hépatique.
Remplacement
Disposer d’un modèle animal translationnel qui puisse permettre d’évaluer les effets de composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre cette maladie. Nous disposons de modèles in vitro qui permettent d’évaluer les propriétés anti inflammatoires de composés, cette démarche est préalable à tout expérimentation chez l’animal L’utilisation de ces méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s s’impose. Cependant, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs, et d'activer toutes les voies de signalisation qui constituent les caractéristiques de ce modèle est incontournable. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
Dans certains cas, il est possible de profiter d’animaux engagés dans d’autres procédures expérimentales, et n’ayant subi aucune administration (groupe contrôle) pour pratiquer des prélèvements d’échantillons biologiques. La contrainte est de synchroniser les évènements. La réduction du nombre d'animaux engagés dans l'expérimentation consiste en premiers lieux d'estimer correctement le nombre des animaux nécessaires.. Cette estimation est faite à priori sur la base de données expérimantales déjà connues (étude pilote) ou sur la base de données publiées dans la literature. La détermination de la taille des effectifs est basée sur la connaissance de la variabilité d'un paramètre prioritaire étudié, , et sur le niveau de signification attendu (généralement p=0.05 ce qui signifie que nous admettrons que 5% des effets observés peuvent être dus au hasard). Enfin, nous accordons aussi l’importance à la puissance statistique, généralement entre 80 et 90%, ce paramètre exprime la probabilité de détecter un effet s’il existe. Plus la puissance sera élevée, et plus le nombre d’animaux devra être important. L’effectif théorique est donc calculé à partir de ces paramètres statistiques, il permet à l’expérimentateur d’ajuster son effectif en fonction de l’importance du paramètre qu’il étudie.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant leur période d’acclimatation ou d’hébergement dans l’animalerie. L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rongeurs. Au cours de la phase aigue de l'expérience, des critères cliniques observables définissent des points limites très spécifiques au modèle, ils sont prédictifs de l'issue de l'expérience et de l'atteinte proche d'un seuil de douleur à ne pas dépasser. Ils sont appliqués pour mettre un terme rapide à l'expérience et limiter ainsi les souffrances des animaux.
Choix des espèces
Nos travaux de recherche (développement de modèles d’évaluation de propriétés thérapeutiques de médicaments, protocoles de pharmacologie etc ) sont réalisés chez les rongeurs (rat et souris). Ces espèces sont largement employées dans notre domaine d’étude qui concerne les troubles métaboliques car elles sont bonnes répondeuses à des stimuli et à des actions pharmacologiques. La nécessité d’avoir accès à des échantillons biologiques frais de ces mêmes espèces est donc évidente. Les animaux utilisés seront des anaimaux adultes agés de 8 à 10 semaines. Il est important que les animaux soient matures du point de vue immulogique.
Evaluation de la contribution de vésicules bactériennes dans l’induction d’un sepsis (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection de vésicules bactériennes de quelques secondes, puis selon les cas une prise de sang sous anesthésie, une injection de colorant suivie de la mise à mort trente minutes plus tard, ou une injection d'agonistes plaquettaires suivie de la mise à mort trois minutes plus tard. 1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 920 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à comprendre comment ces vésicules déclenchent un sepsis et la formation de microthrombi qui bloquent la circulation dans les petits vaisseaux. Le porteur annonce une perte de poids et une perte de vitalité, puis écrit que les souris "récupèrent et vont mieux", alors que chaque procédure se termine par leur mise à mort.
Objectifs
Notre objectif est de comprendre comment les vésicules bactériennes contribuent à la physiopathologie au sepsis (mise en place et aggravation). Nous nous intéressons en particulier à l’activation des plaquettes sanguines et la formation de microthrombi qui bloquent la circulation sanguine dans les petits vaisseaux entrainant la dysfonction des organes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des vésicules bactériennes dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure induisant une infection par injection de vésicules bactériennes (1 seule injection par souris de quelques secondes) dans le premier établissements utilisateur. Une seule prise de sang sera réalisée sur les souris anesthésiées (d’une durée environ de 2 min) (second établissements utilisateur). Suite à cette prise de sang unique, les animaux seront euthanasiés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue, injection d'une durée de 2-3 minutes) de colorant sera réalisée sur les souris anesthésiées, suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection (second établissements utilisateur). Pour l'évaluation du thromboembolisme, 1 injection d'un mélange d'agonistes plaquettaire sera réalisé en intra-veineux (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 3 min apres l'injection (premier établissements utilisateur).
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés de ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Lors de l’infection par les vésicules bactériennes, il peut y avoir dans un premier temps, une atteinte de l’état général, puis les souris récupèrent et vont mieux. Les effets indésirables attendus sont une perte de poids et une perte de vitalité.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et l’inflammation, l’hémostase, la perméabilité endothéliale ou la formation de thrombi seront analysés. .
Remplacement
Des résultats obtenus in vitro montrent que les vésicules bactériennes impactent l’activation plaquettaire et la formation du thrombus. Pour la suite de notre étude, le recours au modèle murin est irremplaçable pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Réduction du nombre d'animaux : plusieurs résultats obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Suite à l'infection, nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes. Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 10 souris si besoin. Une approche statistique sera utilisée pour vérifier les différences obtenues entre groupes.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par jour par les zootechniciens (matin) et l’expérimentateur (midi et soir) tout au long de la procédure. Les points limites seront basés sur la perte de poids et sur l’examen visuel des signes suivant : léthargie, inconscience, difficultés respiratoires (respiration rapide). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus décrit pour l’étude du sepsis. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. De plus, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées (pas de phénotype dommageable). Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, Système cardiovasculaire mature).
Elaboration d’un modèle murin de dégénérescence cérébelleuse EU2 sur 2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
Une chirurgie de quarante-cinq minutes pour injecter un vecteur inflammatoire dans le cervelet à travers un orifice d'un millimètre percé dans le crâne, puis chaque semaine une implantation de cellules tumorales et un mélange vaccinal, cinq injections abdominales d'immunosuppresseur, et des tests de motricité et d'équilibre deux fois par semaine pendant huit semaines. 92 souris vont être utilisées, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 12 opérées sous anesthésie sans reprise de conscience. La dernière intervention prélève le liquide céphalorachidien à la base du cervelet, puis le sang, puis fixe le cerveau par voie cardiaque, sans réveil. Toutes sont tuées, et le porteur prévoit en plus de mettre à mort des souris surnuméraires n'ayant subi aucune manipulation, pour entraîner les chirurgiens.
Objectifs
Le projet porte sur une maladie neurologique rare, qui touche principalement des femmes âgées souffrant d’un cancer du sein ou gynécologique. Cette maladie résulte d'une attaque du système immunitaire contre les neurones du cervelet, provoquant des pertes de motricité et d’équilibre et conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de la destruction de la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. Actuellement, les mécanismes responsables de cette maladie sont mal compris. Le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patientes et du stade déjà avancé de la maladie au moment de sa prise en charge à l’hôpital. Ce modèle permettra des analyses approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.
Procédures
Au sein de l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection d’un vecteur inflammatoire dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien -Une implantation de cellules tumorales et une injection de mélange vaccinal sont effectuées sous anesthésie en sous-cutané (2-3min) une fois par semaine sur une période de 3 et 2 semaines respectivement. -Cinq injections abdominales d’une molécule immunosuppressive sont faites à 3 jours d’intervalle sur une période de 2 semaines. -Des tests de motricité est d’équilibre réalisés 2 fois par semaine pendant 8 semaines Au sein de l’EU2 : -Une chirurgie terminale sous anesthésie et sans réveil pour procéder au prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) à la base du cervelet suivi d’un prélèvement de sang retro-orbitaire (environ 20min), puis l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral (environ 15min).
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un stress modéré dû aux manipulations répétées et à la contention. -Suite aux injections, il est possible que la tumeur se nécrose, que les animaux perdent du poids, ou réduisent leur mobilité. -Des douleurs peuvent survenir après l’intervention chirurgicale sous anesthésie, ainsi que du stress postopératoire lié à la récupération physique, aux besoins nutritionnels ou aux soins de la plaie après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale dans le but de collecter les échantillons de sang, liquide céphalo-rachidien et cerveau nécessaires aux analyses
Remplacement
La Dégénérescence cérébelleuse à anticorps Yo (DCP-Yo) est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et son origine reste mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patientes (liquide céphalorachidien, tumeurs) sont réduites de par la rareté de la maladie. L’analyse post-mortem du cerveau n’a fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie avec une mort neuronale qui résulte probablement d’une attaque immunitaire. Notre objectif est de pouvoir accéder aux mécanismes initiateurs de la maladie depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs car aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler tous ces éléments in vitro. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.
Réduction
Pour évaluer la motricité des animaux et analyser les tissus cérébraux, il est nécessaire d'effectuer une analyse statistique. Le nombre d'animaux requis a été déterminé à l'aide d'un logiciel spécialisé, et c'est l'examen des neurones dans les tissus qui demande le plus d'animaux. Nous avons prévu d'utiliser un total de 20 animaux pour la première expérience de modélisation (10 dans le groupe test et 10 dans le groupe témoin) afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. Si les résultats de cette première phase ne sont pas concluants, nous n'utiliserons pas les 60 souris supplémentaires prévues dans le projet. Cet effort permet de minimiser l'usage des animaux tout en garantissant des résultats scientifiquement fiables.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, chaque souris est familiarisée avec l'expérimentateur pendant 5 minutes par jour, durant une semaine avant le début des expériences. Une évaluation régulière de leur bien-être sera réalisée à l’aide d’un système de suivi qui prend en compte plusieurs critères, notamment leur poids, leur mobilité, et leur comportement général. Cela permettra d’anticiper d’éventuelles complications et d’adopter rapidement des mesures correctives. Des animaux surnuméraires n’ayant subi aucune manipulation expérimentale, seront mis à mort et utilisés pour l’entraînement aux techniques chirurgicales. Avant les chirurgies les griffes des souris seront raccourcies afin de prévenir les infections liées aux grattages. Une injection d’antidouleur sera administrée avant la chirurgie et les jours suivants avec un suivi rigoureux et si besoin l’application d’un antiseptique local jusqu’à cicatrisation complète. Des anti-inflammatoires seront également prévus en cas de signes d’inflammation. Après l’intervention, des soins post-opératoires spécifiques seront appliqués : -les souris seront placées au chaud en cage individuelle pendant au moins 1 heure pour un réveil optimal. -De la nourriture humidifiée est fournie pendant 2 jours pour optimiser la prise alimentaire et l’hydratation. -Un matériel de nidification neuf sera mis à disposition pour préserver leur comportement naturel. Avant les tests comportementaux, une phase d’habituation de quatre jours sera mise en place. Elle inclura des récompenses alimentaires pour réduire le stress. Les dispositifs utilisés seront nettoyés entre chaque session afin d’éviter la persistance d’odeurs pouvant perturber les animaux. Lors du transport des souris d’un établissement à un autre, leur répartition par cage sera respectée, et le matériel de nidification sera enrichi. À leur arrivée, elles seront hébergées dans des cages ventilées pendant un maximum d’une demi-journée, dans des conditions strictement contrôlées (température, ventilation) et avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang seront effectués sous anesthésie après injection d’un antidouleur. Ce protocole d’anesthésie et d’analgésie sera mis au point au préalable et optimisé le cas échéant. Si nécessaire, un relaxant musculaire sera administré pour faciliter l’intervention. Une anesthésie profonde sera maintenue jusqu’à la mise à mort.
Choix des espèces
La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.
Caractérisation de proteines d’intérêt dans le développement embryonnaire tardif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Au sevrage, chaque souris subit l'ablation de 1 à 2 mm de queue pour son génotypage, puis certaines reçoivent une injection rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse ou trois injections intrapéritonéales en trois jours. 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier deux protéines dont la délétion provoque des troubles cardiovasculaires chez l'embryon. Le porteur annonce une étude du développement à 13, 15 et 18 jours après fécondation, sans nommer les substances injectées ni dire comment les embryons sont obtenus sur les femelles gestantes. Toutes les souris sont mises à mort pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Étudier le développement embryonnaire est un enjeu scientifique majeur tant pour prévenir les pathologies congénitales que pour comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans la différentiation et la construction des tissus biologiques. Les cardiopathies congénitales sont estimées responsables d’environ 35% des morts infantiles, cependant leurs causes précises restent à élucider. Il a été observé que la délétion génétique de deux protéines d’intérêt a pour conséquences des complications cardio-vasculaires chez l'embryon. L’objectif de ce projet est donc de découvrir le rôle essentiel de ces protéines d’intérêt dans le développement de l’embryon afin de mieux comprendre la survenue de maladies congénitales et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier directement le rôle encore trop peu connu de 2 protéines d’intérêt dans l’organogenèse tardive chez l’embryon de souris et ainsi de nouvelles perspectives dans la compréhension de la survenue des maladies cardiaques congénitales.
Procédures
Certaines souris seront soumises à des injections par intra veineuse sous anesthésie gazeuse (une seule injection de quelques secondes) ainsi qu'à des injections intra péritonéales (une par jour pendant 3 jours). Tous les animaux subiront un prélèvement de queue (1 à 2 mm) lors du sevrage pour génotypage.
Impact sur les animaux
Toutes les souris subiront un prélèvement de biopsie de queue (1-2 mm), pouvant également occasionner une douleur et un stress de courte durée, afin de les génotyper. Certaines souris subiront également une injection en intra péritonéal par jour pendant 3 jours ou une injection retro orbitale sous anesthésie gazeuse pouvant générer du stress ainsi qu’une douleur légère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyses complémentaires.
Remplacement
L’objet de cette étude est de comprendre l’implication de protéines d’intérêt dans le développement du système cardiovasculaire étant un système physiologique complexe. Par conséquent, les études de culture cellulaire ou d’organoïdes sont insuffisantes pour reproduire la complexité des interactions physiologiques entre nos organes d’intérêt.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les effectifs des groupes ont été élaboré afin d’avoir le nombre minimum d’animaux tout en produisant des résultats scientifiques statistiquement interprétables et pertinents.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, les expérimentations se dérouleront avec une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie et le porteur du projet. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec contrôle de la température ainsi que de l’hydrométrie. Des points limites ont été établis dans ce projet entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Afin d’appréhender le rôle de protéines d’intérêt dans le développement cardiovasculaire il nous ait essentiel d’avoir un modèle in vivo qui récapitule cette complexité physiologique et dont il est possible de réaliser des manipulations génétiques afin d’isoler l’implication de certains compartiments physiologiques dans notre phénotype. Le modèle murin est aujourd’hui le modèle animal dont le génome et les manipulations génétiques sont les plus accessibles, efficaces et documentés dans la communauté scientifique. C’est donc le modèle le plus adapté à notre étude. Les souris seront étudiées à 13 jours post-fécondation (E13), E15 et E18 étant trois stade couvrant la fin de gestation chez la souris.
Caractérisation de modèles d’AVC ischémique chez la souris et investigation du rôle des récepteurs GPVI et GPIbα plaquettaires dans la recanalisation (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Privées d'un récepteur plaquettaire, du fibrinogène ou de la fibrine, ou porteuses de récepteurs humains, les souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, dont certaines seront créées pour l'étude. 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le volet EU1 d'un projet partagé entre deux établissements. Anesthésiées, elles reçoivent des injections ou des perfusions de trente minutes et subissent une chirurgie de deux heures au plus qui provoque un AVC, puis sont transportées vers le laboratoire de l'IRM. Pendant 72 heures, elles peuvent présenter une activité réduite, voire une prostration. Toutes sont tuées après une laparotomie et une perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour l'analyse histologique de l'AVC.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.
Choix des espèces
Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.