Souris
Etude la dose léthale 50 en intra-veineuse d’une formulation innovante de mitotane
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
48 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection intraveineuse unique de cinq secondes d'une formulation de mitotane, l'effectif variant de 12 à 48 selon la réponse toxicologique observée, pour établir la dose qui tue la moitié des animaux. Le porteur annonce des troubles gastro-intestinaux fréquents, une surveillance matin, midi et soir pendant cinq jours, et la mise à mort de l'animal si l'analgésique morphinique ne suffit pas. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les modèles cellulaires ne permettant pas d'établir une dose léthale 50, et présente cette étape comme le passage obligé avant les premiers essais chez l'humain.
Objectifs
L’adénocarcinome corticosurrénalien est une maladie rare (0,5 à 2/million/an) aboutissant dans la majorité des cas au décès du patient. Cette pathologie peut survenir à tout âge, principalement chez l’adulte de plus de 50 ans et chez l’enfant de moins de 15 ans. Le but de cette étude, est de trouver une nouvelle formulation de Mitotane éfficace.
Bénéfices attendus
Obtenir des données sur la toxicité d’une formulation innovante, afin de finaliser les études précliniques et pouvoir passer aux études cliniques de niveau 1 chez l’Homme.
Procédures
Une injection "unique"en intra-veineux sera réalisé sur chaque animal, le premier jour, durée de l'injection :5 secondes
Impact sur les animaux
Troubles Gastro-intestinal fréquemement obervés
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce protocole seront euthanasiés, suivant les procédures décrites dans cette DAP.
Remplacement
Il est indispensable pour notre étude d’avoir recours à l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne permettent pas la réalisation d’un profil de DL 50 in vivo. Il est donc primordial avant de passer sur un modèle Humain de définir la DL 50 chez l’animal.
Réduction
Un faible nombre d’animaux sera utilisé, c'est à dire 12 souris au minimun et 48 au maximun, en fonction de la réponse toxicologique de chaque animal; selon les recommandations OECD 423 (ligne directrice de l'OECD), pour les essais de produits chimiques.
Raffinement
Les vistes de surveillance seront effectués , afin de vérifier l'atteinte des points limiets et ceux-ci, tous les matins, midis et soir, pendant les 5 journées du déroulement du protocole et en cas d'observation de souffrance de l'animal, un traitement analgésique à base de morphinique (Buprecare 0.1mL/Kg) sera effectué en IP sur chaque animal. Si le traitment antalgique n'est pas suffisant, il sera décidé de la mise à mort de l'animal (voir pragraphe sur la mise de mort de l'animal).
Choix des espèces
La souris est l’animal de référence pour les études de DL 50. Les animaux utilisés sont au stade adulte, la taille à cet âge permet une réalisation facile de l’administration par voie IV
Développement de nouveaux modèles murins de l’infection avec le virus Cedar provenant de chauves-souris Australiennes
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
L'infection se fait par deux gouttes de virus déposées dans les narines ou par injection dans l'abdomen, suivies de sept injections abdominales et de onze injections dans la veine de la queue, chaque geste sous anesthésie gazeuse. 318 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin du protocole parce qu'elles portent le virus, 198 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines sont des souriceaux de six à neuf jours, choisis parce que leur système immunitaire immature les rend plus sensibles à l'infection, l'objectif étant de construire un modèle murin du virus Cedar utilisable en animalerie ordinaire plutôt qu'en confinement de haute sécurité. Le porteur décrit ce virus comme dépourvu du gène de virulence et sans symptômes chez la souris, tout en annonçant prostration, tremblements, perte d'équilibre et paralysie possibles.
Objectifs
Certains virus de la famille des henipavirus représentent un risque important pour la santé humaine et sont classés dans la liste des virus prioritaires de l’Organisation Mondiale de la Santé. Deux henipavirus dangereux pour l’homme, les virus Nipah et Hendra, sont responsables d’infections du cerveau et des poumons fatales dans 75% des cas. Ces virus sont naturellement portés par une famille de chauves-souris frugivores, chez qui ils n’engendrent à priori pas de pathologie spécifique. Il n’existe à l’heure actuelle ni vaccin, ni traitement, ces virus sont donc classés de niveau 4, nécessitant leur manipulation dans un laboratoire de très haute sécurité (niveau 4 maximale). De ce fait, les recherches menées sur ces virus sont donc limitées et extrêmement onéreuses. En 2012, le virus Cedar a été identifié chez des chauves–souris frugivores d’Australie, les analyses ont montré l’appartenance de ce virus aux henipavirus mais l’absence d’un gène, responsables de la virulence, marque une différence importante avec Nipah et Hendra. Ce virus a démontré une réplication très limitée chez plusieurs espèces (cobayes, souris, hamster), associée à une absence de symptômes justifiant son utilisation dans des conditions de confinement moins élevées (niveau 2). Une très forte réponse immunitaire a été observée chez le hamster et la souris en réponse à l'infection et est responsable du contrôle de la réplication de ce virus et de l’absence de symptômes. Ce projet de recherche vise à comprendre la réponse immunitaire et son rôle dans le contrôle de l’infection par le virus Cedar. Les résultats obtenus par ce projet permettront de mieux comprendre les infections à henipavirus et développer un modèle animal pour tester de nouveaux traitements antiviraux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra tout d’abord de comprendre la réponse immunitaire, plus particulièrement le rôle des défenses antivirales et des cellules immunitaires, dans le contrôle de l‘infection par le virus Cedar. Les résultats obtenus dans ces souris, nous permettront de comparer la réponse immunitaire contrel le virus Cedar, à celle que nous avons caractérisé avec le virus Nipah par le passé . Nous pourrons ainsi mieux comprendre le contrôle de la réponse immunitaire car celui-ci fonctionne parfaitement chez le virus Nipah mais est absent chez le virus Cedar. De plus, ce projet permettra d’établir un modèle de souris plus facilement réalisable pour les henipavirus qui permettra de réaliser des essais de traitements dans des animaleries conventionnelles avant d'avoir recours à des animaleries de haute sécurité.
Procédures
Les animaux seront infectés par le dépot de 2 gouttes de virus sur les narines ou une injection dans l'abdomen. Les traitements se feront par des injections dans l'abdomen (7 injections ), et/ou dans la veine de la queue (11 injections). Dans tous les cas, les injections seront réaliseés sous anesthésie et ne dépasseont pas 20 secondes. Globalement, chacun des gestes sera réalisé sous anesthésie gazeuse (20 secondes) à l'exception de l'infection des souriceaux, un maximum de 12 anesthésies sera réalisé sur la durée du protocole.
Impact sur les animaux
Certains types de souris pourront être plus sensible au virus et pourront développer une maladie avec des symptomes tels que la perte d'équilibre. Les injections induiront une gêne mineure de très courte durée au niveau du site d'injection. Si l'infection se developpe activement, il sera possible d'observer une prostration, des tremblements, une perte d'équilibre voir une paralysie.
Devenir
Les animaux étant infectés par un virus, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Remplacement
L’obtention de données en culture de cellules, nous incite à mettre en place un étude chez la souris qui permettra de confirmer ou d’infirmer les hypothèses de recherche issues de ces données en culture de cellules. En effet, ces méthodes tendent à recréer artificiellement les interactions cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme mais ne permettent pas de se focaliser sur la réponse d’un organe et encore moins d’un organisme vivant entier (système immunitaire, flux sanguin). Ces tests ne permettent pas de répondre à des questions globales, tels que la dissémination dans l'organisme, la mise en place de la maladie ou bien encore les réponses immunitaires (anticorps,...). Ainsi l'étude de la réponse immunitaire mise en place suite à l’infection par un virus, ici Cedar passe obligatoirement par l'utilisation d'un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons 6 animaux par groupe (mâles et femelles) afin de garantir une fiabilité de nos résultats dans les courbes de survie et des groupes de 3 animaux pour les différents points (J3 et J6) pour comparer les différence de quantité de virus entre les âges. Nous réaliserons les expériences de façon séquentielle, tout d’abord une première expérience exploratoire en souris au systeme immunitaire peu efficace et si cette expérience ne donne pas de résultats exploitables (pas de réplication virale) alors l’ensemble du projet est arrêté. Les données récoltées seront analysées à l’aide de tests statistiques pour valider les résultats.
Raffinement
Le personnel participant à cette étude aura été formé en interne à l’observation des symtomes et à remplir une grille d'évaluation, des points limites d'expérimentation seront fixés et marqueront l'arret definitif du protocolepour les animaux concernés. Les animaux seront anesthésiés deux fois durant le protocole : une fois par anesthésie gazeuse pour l'inoculation virale et une fois toujours par anesthésie gazeuse pour l'euthanasie. Nous n’effectuerons pas d’identification invasive des animaux mais réaliserons un marquage non invasif d'identification. Afin de maintenir le statut sanitaire des animaux, ceux-ci seront manipulés sous hotte stérile lors des expérimentations et des changes et seront maintenus en portoir ventilé dans l'animalerie . Nous suivrons les animaux tous les jours afin de mesurer l'évolution de leurs états cliniques et si le cas le nécessite (augmentation du score clinique) nous effectuerons une deuxième visite journalière. Nous effectuerons l'ensemble des infections pour les animùaux adultes sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Nous cherchons ici à utiliser un modèle de petit mammifère bien caractérisé dont de nombreux outils d'étude sont disponibles afin de caractériser la maladie induite par le virus. L'existence de modèles de souris dont certains gène ne fonctionnent pas constitue un réel avantage pour la recherche scientifique en permettant une compréhension approfondie du rôle du système immunitaire. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 4 semaines dont le système immunitaire n’est pas complètement mature, afin de se mettre dans des conditions le plus favorables pour l’infection virale, qui nous permettra une mise en place d’un modèle de petit animal d’étude de la réplication virale. Dans certains cas nous utiliserons de jeunes souris de 6 à 9 jours car leurs systèmes immunitaires immatures les rendent plus sensibles à l'infection.
Méthotrexate pour le traitement curatif de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Trois ponctions articulaires sous anesthésie provoquent chez 22 souris hémophiles une arthropathie du genou, avant qu'elles reçoivent par injection le traitement de référence, seul ou complété par du méthotrexate. Seize d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, six d'un niveau léger, et toutes sont tuées. Le porteur écrit pourtant que l'expérience de son groupe ne lui fait "attendre aucunes douleurs" après le réveil, et ne retient comme nuisances que la piqûre des injections et une toxicité du méthotrexate sur la moelle osseuse. La mise à mort est justifiée par la "nécessité" de prélever tout le sang, geste qu'il juge incompatible avec le maintien en vie de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. L’arthropathie hémophilique partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde. Comme dans le stade précoce de l’arthropathie hémophilique, chez les patients atteints de polyarthrite, il existe une inflammation articulaire. Le pilier du traitement de l'hémophilie est la substitution du facteur de coagulation manquant, cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire, alors que le méthotrexate utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde en première intention pourrait être efficace pour contrôler l’inflammation. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de la synovite comme traitement curatif chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la polyarthrite rhumatoïde. Lors d’un projet précédent, notre équipe a montré que le méthotrexate, comme traitement préventif administré avant les saignements articulaires, permet de réduire la synovite. Dans le cas de l’arthropathie, la première atteinte touche successivement la synoviale (membrane qui tapisse l’intérieure du genou), le cartilage et enfin l’os. Les premiers résultats nous montrent une diminution de la synoviale et du dépôt de fer sous forme d’hémosidérine. L’idée étant de proposer le méthotrexate comme traitement de manière temporaire et préventif à l’apparition d’une synovite L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité curative du méthotrexate pour traiter la synovite de l’arthropathie synoviale et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B.
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par concentré de facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique, médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montrent une efficacité suffisante du méthotrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Les souris seront séparées en 2 groupes pour comparer l'effet d'un adjuvent au traitement de référence dans la prise en charge de l'arthropathie hémophilique. Pour cela, les souris auront trois ponctions articulaires pour mimer la maladie et recevront soit le traitement de référence seul par injection ou le traitement de référence plus l'adjuvent par injection. Au terme de l'expérimentation, un prélèvement de sang total sera effectué. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une ponction articulaire : 2-3 min 2. Un prélèvement sanguin: 1 min 3. La mesure du genou siège d’arthropathie : 30 sec 4. Une injection (groupe 1) et deux injections (groupe 2) : 1-2 min 5. Un prélèvement sanguin et mise à mort : 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie et certains post mortem. Après le réveil suite à l’induction de l’arthropathie, l’expérience de notre groupe ne nous fait attendre aucunes douleurs. Les injections répétées des traitements peuvent provoquer une douleur légère (piqûre d’aiguille). Le traitement adjuvant peut avoir une toxicité au niveau de la moelle osseuse, sans incidence sur les plaquettes sanguines.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement tous le sang, non compatible avec le maintien en vie de l'animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures biologiques et histologiques de chaque souris sont comparées à son propre genou droit (genou contrôle) pour l‘étude de l’articulation.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie. Une possible gêne locomotrice peut être attendue, en cas d’apparition, de l’eau et de la nourriture seront mis à disposition dans la cage, au sol, pour éviter la station debout aux souris et le redressement sur les pattes arrière pour chercher leur nourriture. Afin d'éviter toute souffrance pour les animaux, nous appliquons les points limites strictes et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Approches thérapeutiques pour améliorer les capacités ventilatoires et locomotrices suite à un trauma cervical sur des modèles précliniques murins : combinaisons innovantes en neurostimulation
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 966
966 rats et 924 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant d'abord une contusion ou une laminectomie de la moelle épinière cervicale de moins de quarante minutes. La lésion paralyse d'un côté les pattes avant et arrière et coupe la conduction nerveuse vers l'hémidiaphragme correspondant, réduisant la capacité respiratoire de l'animal. Suivent, cinq fois par semaine pendant deux à trois semaines, des séances de stimulation musculaire de trente minutes sous anesthésie et de stimulation médullaire de dix minutes sur animal éveillé, plus des injections sous-cutanées et l'injection d'un matériau végétal dans la moelle. Tous sont tués pour analyses histologiques, le porteur situant son objectif au stade de la preuve de concept tout en écrivant que "trouver une solution est indispensable" pour les patients dépendants d'un respirateur.
Objectifs
Chaque année, près de 500 000 personnes dans le monde subissent des lésions de la moelle épinière, que ce soit à la suite d'un accident ou d'une autre cause. La plupart de ces blessures touchent la région cervicale, ce qui entraîne non seulement une paralysie des muscles, mais aussi une réduction importante de la capacité pulmonaire, ce qui peut entraîner des difficultés respiratoires graves. De nombreuses personnes tétraplégiques (paralysées des quatre membres) ont besoin d’une assistance respiratoire, parfois à vie, ce qui a un fort impact sur leur qualité de vie et sur la société en général. Nos recherches visent à trouver des solutions alternatives à l’utilisation permanente de la ventilation mécanique. Dans ce cadre, nous travaillons sur des stratégies de réparation des réseaux neuronaux et des fonctions musculaires, en combinant des approches de stimulation neuromusculaire et nerveuse et des agents pharmacologiques. Pour tester nos idées, nous utilisons des modèles animaux bien établis dans la recherche scientifique. L'objectif de notre projet est de combiner ces différentes techniques pour maximiser la réparation après une lésion de la moelle épinière. Nous utilisons principalement des souris et des rats pour nos expérimentations, car ce sont des modèles qui ont fait leurs preuves. Par exemple, nous provoquons une lésion de la moelle épinière au niveau du cou, ce qui entraîne une paralysie des muscles respiratoires et des membres d’un côté (atteinte unilatérale). Cependant, ces animaux gardent une certaine capacité à respirer et à bouger, car certains circuits nerveux restent intacts. Enfin, nous avons pour objectif de tester de nouvelles techniques de réparation en combinant la stimulation neuromusculaire et l’ingénierie tissulaire. Nous veillons à respecter les principes éthiques de la recherche, notamment la règle des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner l'utilisation des animaux dans les expériences
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est d’apporter des preuves de concept de la récupération de l’activité ventilatoire partielle ou totale après une lésion médullaire cervicale, et ce par la combinaison d’approches thérapeutiques. De plus, nous attendons un effet de ces thérapeutiques sur la récupération de l'utilisation de membres supérieurs par les memes phénomènes de neuroplasticité induit par nos approches. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Notre projet de recherche préclinique visera à démontrer qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Certains patients restent dépendants à vie d’un respirateur, les coupant d’une vie sociale et des centres de rééducation, et diminuant par conséquent leur espérance de vie. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie qui consiste en une contusion ou une laminectomie (durée inferieure à 40 min) réalisée sous anesthésie et analgésie. Il s’agit du modèle de référence pour simuler une lésion de la moelle épinière qui est l’objet du projet de recherche. Par la suite les animaux seront impliqués dans différents traitements seuls ou combinés tels que la stimulation des muscle (30 min, 5 fois par semaine pendant 2 à 3 semaines sous anesthésie), la stimulation de la moelle épinière (10 min, 5 fois par semaine pendant 2 à 3 semaines, animal vigile), l’agent pharmacologique par voie sous-cutanée (injection de quelques secondes, 5 fois par semaine pendant 2 semaines, animal vigile), ou encore de l’ingénierie tissulaire (une injection unique sous anesthésie et analgésie). Ce dernier consiste en une injection d’un matériau végétal visant la régénération de la moelle épinière. Tous les animaux seront également impliqués dans des tests fonctionnels (déplacements libres dans un cylindre ou un espace libre mais restreint, filmé pendant 5 à 10min, à raison d’une fois par semaine).
Impact sur les animaux
Les nuisances principales attendues sur les animaux sont celles induites par la chirurgie de lésion médullaire. Lors de l’anesthésie, il y a un risque d’hypothermie et de douleur au réveil. La lésion entraine également un inconfort dû à la perte sensori-motrice des pattes postérieures et antérieures correspondant au côté lésé, ainsi qu’une réduction de la capacité respiratoire liée à l’atteinte de la conduction nerveuse vers l’hémi diaphragme correspondant au côté lésé de la moelle épinière. Ces atteintes sont cependant unilatérales, de fait qu’elle permette à l’animal de se mouvoir, de se nourrir et de respirer mais cela peut entrainer un inconfort du fait de ne pas se mouvoir complètement librement. Une hypoventilation (diminution du volume respiratoire) est possible les premiers jours mais compensée par une augmentation de la fréquence respiratoire. Il peut aussi exister un risque de soif et de malnutrition si les animaux n’arrivent pas à se nourrir et boire suffisamment les jours après la chirurgie. Les injections par voie sous-cutanée sont faites sans anesthésie donc cela peut entrainer un stress au moment de la préhension. Lors des tests fonctionnels, les animaux pourront ressentir du stress lié à la découverte d’un nouvel environnement et à la limitation de leur liberté d’expression physique pour les tests en enceinte de taille restreinte. Enfin, les traitements n’entrainent pas d’effets secondaires connus mais ils peuvent engendrer un stress lors de la préhension et du positionnement dans un environnement limité (notamment pour s’assurer que l’animal est bien dans le champ de la stimulation par exemple).
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'y a pas de modèle expérimental clinique autre que les sujets humains ou animaux pour étudier les réponses physiologiques intégrées. Ce projet a pour but de développer des preuves de concept de réparation d’une neuropathologie pour laquelle aucune thérapie n’est proposée aux patients. Nous ne serions pas en mesure d'effectuer les manipulations nécessaires chez l'homme (par exemple, une intervention pharmacologique dans les systèmes de neurotransmetteurs, des tests neurochimiques, des prélèvements de moëlle épinière), et nous devons donc recourir à l'expérimentation sur les espèces de mammifères non humains. Les connectivités neuronales de ces systèmes intégrés nécessaires pour mener "des études de modélisation" ne sont pas disponibles, ou encore, aucun comportement suite à un traitement innovant ne peut être prédit, et il n'existe actuellement aucun substitut à l'expérimentation animale. Les concepts qui ont guidé cette recherche sont nouveaux dans le domaine et, à ce titre, doivent être soigneusement étudiés dans des situations biologiquement significatives.
Réduction
Dans ce projet, le nombre total d’animaux impliqués sera de 1890. Les mêmes animaux sont utilisés pour diverses études (fonction, biochimie, anatomie). Nous analysons plusieurs paramètres sur un même animal, la localisation ou l'expression de certains antigènes en immunohistochimie. Les données sont comparées avec des tests statistiques adaptés et la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Il nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Toutes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie et analgésique. Les animaux auront bénéficié d’une acclimatation après réception pendant 1 à 2 semaines. Les animaux sont maintenus de 2 à 4 par cage après la chirurgie pour conserver les liens sociaux et hiérarchiques dans la cage. Ils sont regroupés au plus tard lendemain de la chirurgie pour limiter la période d’isolement. Ils sont réhydratés en post-opératoire avec une injection sous-cutanée de sérum physiologique et nous utilisation de plaques chauffantes au cours et après l’anesthésie, jusqu’à 2h après le réveil (période de surveillance post-chirurgicale). Un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (ajout de briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Nous réalisons un changement de la litière deux fois par semaine et une surveillance des animaux tous les jours (prise en compte du comportement et des expressions faciales des animaux), ainsi qu’un traitement si présence de plaies (pommade grasse si eczéma ou irritation...) Ces contrôles enregistrés et validés par la structure locale chargée du Bien Être des Animaux, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie. Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre structure locale chargée du Bien Être des Animaux et en interagissant avec le vétérinaire référant.
Choix des espèces
Rats et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche préclinique sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez la souris et le rat et de nombreux tests sensorimoteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion (notamment par immunomarquages). Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère, l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit en moyenne 20 à 30g et 250-300g, respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes.
Impacts mnésiques et cognitifs de l’invalidation d’un gène (PGBD5) jouant un rôle clé dans la mémoire dans les neurones hippocampiques de la souris adulte.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une chirurgie cérébrale de trente minutes sous anesthésie gazeuse est pratiquée sur 70 des 75 souris de ce projet, avec injection d'un plasmide dans l'hippocampe et risque d'hémorragie cérébrale. Toutes sont ensuite tuées par perfusion d'un fixateur sous anesthésie profonde, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart d'entre elles. L'objet déclaré est de mesurer les effets de l'extinction d'un gène de la mémoire chez la souris adulte, et le porteur écrit qu'il est "prématuré d'espérer des effets en santé humaine" puisque la fonction de ce gène reste inconnue chez l'adulte. Il annonce trois tests censés mesurer l'anxiété, l'exploration et la mémoire, d'environ cinq minutes chacun, sans dire lesquels.
Objectifs
La mémoire est une fonction essentielle à la santé mentale, car elle guide les comportements des animaux. La formation d’un souvenir repose sur des modifications synaptiques entre neurones, qui doivent être stabilisées et consolidées pour éviter au souvenir de s’estomper. Une hypothèse est que cette stabilisation résulte de l’expression de gènes, activés par des réarrangements non aléatoires du génome neuronal induits par une ou plusieurs recombinases encodées par différents gènes dont notre gène d'intérêt. Ce dernier est exprimé dans tous les neurones au cours du développement normal du cerveau des mammifères et chez l’adulte. Cette expression est particulièrement marquée dans les neurones pyramidaux et granulaires de l’hippocampe, une région clé pour la mémoire. L’inactivation de ce gène chez la souris entraîne des déficits comportementaux complexes, des troubles anxieux et d’apprentissage, des crises d’épilepsie, des déficits moteurs, ainsi que des anomalies structurelles significatives du cerveau, notamment au niveau de l’hippocampe. Toutefois, ces résultats proviennent de lignées de souris dans lesquelles le gène est inactivé au niveau germinal, ce qui ne permet pas de distinguer les conséquences de son absence au cours du développement, de celles observées à l’âge adulte. La question du rôle de ce gène dans le cerveau adulte et de son implication dans les fonctions mnésiques ne peut pas être résolue en utilisant les souris transgéniques traditionnelles car la délétion de gènes dans le cerveau est partielle et variable et que les mutants sont créés durant le développement et non à l’âge adulte. Nous proposons d’utiliser une technique récemment mise au point qui implique l’injection d’un plasmide dans la région cérébrale d’intérêt afin de supprimer l’expression du gène d'intérêt. Après injection du plasmide des expérimentations comportementales sont prévues afin d’estimer les déficits mnésiques et cognitifs associés à la diminution d’expression de ce gène. Après réalisation des tests chez les souris mâles et femelles, le site d’injection du plasmide sera vérifié. Cette approche devrait nous permettre de mener des recherches innovantes sur le déterminisme génétique des capacités mnésiques et cognitives chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de comprendre le rôle chez l’adulte mâle et chez l’adulte femelle d'un gène essentiel à la mise en place de la mémoire dans les capacités exploratrices, les fonctions cognitives et l’anxiété chez la souris. Ce travail est seulement possible chez des souris dont l’expression du gène n’a pas été perturbée au cours du développement. Les résultats acquis devraient constituer des recherches innovantes sur le déterminisme génétique des capacités mnésiques et cognitives chez la souris adulte. Il est pour l’instant prématuré d’espérer des effets en santé humaine puisque la fonction du gène est encore inconnue chez l’adulte d’où l’objet de cette étude
Procédures
Chirurgie cérébrale chez l'animal anesthésié par inhalation : environ 30 minutes par animal sur 70 animaux du projet. Perfusion d'un fixateur chez un animal en anesthésie profonde : environ 10 minutes par animal, tous les animaux du projet (n=75). Trois tests comportementaux afin de mesurer l'anxiété, les capacités exploratoires et la mémoire: chaque test dure environ 5 minutes par animal
Impact sur les animaux
Effets directs: toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle, ainsi qu'une douleur localisée en post-opératoire au niveau du site d'incision de la peau du crâne et du périoste cranien. Plus rarement, parmi les effets directs, il peut se produire une hémorragie cérébrale lors de l'injection dans le cerveau. Les effets indirects peuvent découler de la chirurgie (trouble comportemental, baisse d'activité locomotrice) et de la protéine induite par le plasmide (perte ou gain de poids). Les effets directs sont de courte durée (de quelques heures à quelques jours). Les effets indirects peuvent survenir après quelques heures mais se poursuivre sur plusieurs jours. Les nuisances associées avec les tests comportementaux consistent en un stress léger de courte durée.
Devenir
Le projet porte sur le cerveau et sur l'analyse anatomique et fonctionnelle d'un traitement in situ constitué par un transfectant et un plasmide. De ce fait, il est nécessaire d'euthanasier toutes les souris de ce projet en fin d'expérimentation afin de vérifier d'une part le taux d'expression du gène cible dans l'hippocampe et d'autre part, de confirmer la zone d'injection, de mesurer son étendue et de caractériser d'éventuelles lésions tissulaires.
Remplacement
Les fonctions cognitives et mnésiques étant des fonction intégrées (sous influence de facteurs environnementaux, sociaux et hormonaux endogènes) contrôlée par différentes régions cérébrales dont l’hippocampe, elle ne peut s'observer que sur un organisme vivant. Les expériences s'appuieront néanmoins sur nos données in vitro et sur celles de la littérature pour sélectionner la meilleure construction de nos plasmides, les critères expérimentaux seront aussi affinés pour réduire le nombre de tests et s’appuieront sur notre expérience antérieure avec la même approche technologique acquise chez le rat.
Réduction
Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure montrant que des résultats exploitables et statistiquement fiables peuvent être obtenus avec des groupes compris entre 8 et 10 animaux selon les données à collecter. La réalisation successive des expériences permet de réduire le nombre d’animaux dans la dernière expérience. La comparaison des données quantitatives entre animaux témoins et animaux traités sera réalisée avec un test statistique fiable dans la dernière expérience. La taille des lots a été déterminée en nous basant sur notre expérience antérieure où selon les données quantifiées, la variabilité inter-animale et le test statistique utilisé il faut au minimum 9 animaux/groupe. Nous avons ajouté 1 animal par lot afin de prévenir tout risque lié à la chirurgie.
Raffinement
Les souris seront hébergées par trois à quatre en présence d'objets en carton (maisons) et habituées à la manipulation. Les souris auront toujours un contact visuel et olfactif avec leurs congénères dans les conditions d’hébergement. Les souris seront anesthésiées par inhalation gazeuse lors des neurochirurgies et recevront un traitement antalgique en période peropératoire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pour conserver une bonne lubrification de l'oeil pendant la neurochirurgie. La température interne de l’animal sera également suivie pendant cette neurochirurgie. La molécule étudiée est une protéine endogène qui n'est pas connue pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux, de même l'absence de nocivité du transfectant a été établie. La surveillance post-opératoire s'appuiera sur l'observation quotidienne du comportement, de l'apparence physique et du poids corporel. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée tout au long de l'expérimentation ainsi qu'un suivi de poids hebdomadaire.
Choix des espèces
Nous utiliserons dans tout ce projet des souris adultes car c’est l'espèce chez lesquelles une modification génétique a été réalisée pour permettre l’expression d’une molécule fluorescente sous contrôle du promoteur du gène d'intérêt. L’expression de la molécule fluorescente permet donc de mimer celle du gène cible. Ces souris sont aussi communément utilisées pour réaliser des tests comportementaux pertinents concernant la cognition, l’anxiété et la mémoire. De plus, les approches de neurochirurgie sur cette souche murine sont réalisées en se basant sur un atlas de référence développé pour la souris adulte.
Etude des mécanismes de rejet inné après transplantation d’organe et tissue
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Prélèvement du cœur ou du rein sur les souris donneuses, puis greffe sur les receveuses au cours d'une opération de vingt à quatre-vingt-dix minutes selon l'organe, suivie de quatre injections de morphine et d'un suivi qui peut atteindre cent soixante-huit jours. 4 240 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les lignées d'élevage au phénotype dommageable subissent trois prélèvements sanguins par an au sinus rétro-orbitaire pendant cinq ans, et les receveuses de greffe d'îlots pancréatiques reçoivent d'abord une injection provoquant un diabète, puis deux contrôles de glycémie par semaine. Chaque chirurgie entraîne une gêne au réveil et une douleur malgré les analgésiques, et toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour que soient prélevés leur sang, leurs organes lymphoïdes et les greffons.
Objectifs
La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Ce processus permet de remplacer l’organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent. Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. L’identification et la compréhension des mécanismes du rejet inné permettraient de mieux évaluer et suivre les patients, tout en ouvrant la voie à de nouveaux traitements innovants. Les objectifs du projet sont : i) analyser les réponses de l’immunité innée du receveur contre le greffon; ii) tester des molécules susceptibles de freiner les lésions de rejet et d’augmenter la durée de vie des greffons ; iii) étudier comment l’interaction entre les cellules innées et les lymphocytes. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons diffèrents modèles de greffes pour explorer la contribution des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe chronique et aiguë. Le projet est structuré en 8 procédures, chaque modèle de greffe (moelle osseuse, greffe cardiaque, rénale, îlots) étant étudié avec deux objectifs : 1) caractériser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les monocytes et tester des molécules visant à réduire le risque de rejet ; 2) analyser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les cellules innés NK avec les lymphocytes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 4240 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'améliorer la compréhension du rôle du système immunitaire inné dans le rejet de greffe, ainsi que de ses interactions avec le système adaptatif. Cette meilleure connaissance pourra nous guider dans l'identification de traitements potentiels pour atténuer le rejet. L’effet thérapeutique de molécules candidates sera étudié, ce qui permettra de sélectionner et valider des candidats capables de moduler ces interactions, avec des études plus approfondies sur les mécanismes moléculaires in vitro.
Procédures
Elévages des souris du phénotype dommageable : prélèvement sanguin au sinus retro-orbital trois fois par an, maximum 5 secondes par prélèvement – durée 5 ans Souris receveuses des cellules moelle osseuse : Greffe des cellules moelle osseuse sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (opération 20 minutes) Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 15 minutes Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections 20 sec) – opération au niveau du cou (opération 60 minutes) Expérience de maximum 56 jours Souris donneuses de greffon rénale : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 20 minutes Souris receveuses de greffon rénale : greffe rénale sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections soucutanée 20 sec) – opération au niveau du ventre (opération 90 minutes) + + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – opération au niveau du ventre (total opération 20 minutes) Expérience de maximum 168 jours Souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 5 secondes). Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre de 5 secondes) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre de 20 secondes) – réalisée au niveau du rein via une incision sur le flanc latéral. (opération 20 minutes). Suivi de la glycémie par glucomètre (prélèvement sanguin de la queue deux fois par semaine, maximum 5 secondes par prélèvement). Expérience de maximum 56 jours
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cellules de moelle osseuse, cœur, rein et îlots pancréatiques sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 4 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur (malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour garantir des résultats pertinents, fixé à 8 animaux par groupe. Afin d’atteindre cet effectif malgré les taux de réussite variables des greffes rénales, des greffes d’îlots et de l’induction du diabète (80-90% et 70% respectivement), chaque groupe comprendra entre 10 et 14 individus au départ. Cette marge permet de s’assurer qu’au moins 8 animaux pourront être analysés par groupe. Au total, 4240 souris (Mus musculus) seront nécessaires pour ce projet. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique afin d’assurer la robustesse des analyses. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, chaque étape étant conduite uniquement après l’obtention et l’analyse complète des résultats de la procédure précédente. Si les résultats obtenus ne permettent pas de valider l’hypothèse testée, les étapes suivantes ne seront pas engagées. Cette approche garantit que la poursuite des expériences repose sur des résultats concluants, limitant ainsi la réalisation d’expériences non nécessaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce à un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque chirurgie seront définis pour assurer une prise en charge adaptée. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Un suivi rapproché sera effectué après chaque chirurgie, avec une surveillance accrue en fonction des signes cliniques observés. Pour limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées par un professionnel formé à la chirurgie sur rongeurs, avec du matériel stérile et sous conditions optimales. Après la chirurgie, les animaux seront placés en armoire chauffante pour favoriser leur réveil.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est un modèle idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées et de fonds génétiques variés pour simuler différents types de rejets, qu’ils soient allogéniques ou innés : 1. Souris receveuses et donneuses sans système adaptatif (immunité innée seule) pour étudier les monocytes : BRG (receveuses et donneuses contrôles), NSG (donneuses uniquement, SIRPA mismatch). 2. Souris receveuses sans système adaptatif pour l’étude des NK : Rag. 3. Souris donneuses de greffons pour l’études des NK: C57BL/6 (contrôle), B2MKO (absence de MHC-I, « missing-self »). 4. Pour les greffons exprimant l’antigène OVA : B6-OVA, B2MKO-OVA. 5. Pour les donneuses de cellules T spécifiques d’OVA : Rag OTII. Ces souches permettent une analyse précise des mécanismes de rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 12 mois en fin de procédure.
Etude exploratoire du rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Les souris qui atteignent les critères d'arrêt de la grille de score sont tuées immédiatement. 505 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un cocktail d'antibiotiques pendant quatorze jours, subissent une irradiation du bas du corps sous anesthésie, avalent sept jours durant un produit chimique dans leur eau de boisson qui provoque lésions intestinales, diarrhée, perte de poids et saignements anaux, ou sont infectées par gavage avec une bactérie intestinale. Le porteur indique que les doses ont été calibrées pour rester tolérables chez les souris témoins, admet que des signes cliniques plus importants ou plus précoces peuvent apparaître chez les souris mutantes privées des cellules étudiées, et range les retombées thérapeutiques au rang de perspectives.
Objectifs
Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules clefs du système immunitaire. Lors d’infections virales elles produisent en grandes quantités les interférons, des molécules essentielles pour bloquer la propagation du virus chez l’hôte infecté. Les pDC interviennent aussi dans d’autres fonctions physiologiques. Lorsque la peau est lésée, les pDC se localisent dans la lésion et promeuvent la réparation du tissu grâce à leur production d’interférons. Les pDC sont très nombreuses dans l’intestin. Chez l’individu sain les pDC de l’intestin seraient impliquées dans la tolérance aux aliments. La flore intestinale est essentielle pour le bon fonctionnement du système immunitaire, mais son impact sur les pDC de l’intestin a été peu étudié. Notre premier objectif est de déterminer si et comment les pDC intestinales sont affectées si on traite temporairement les souris avec une combinaison d’antibiotiques qui élimine la flore intestinale. Le rôle des pDC au cours des maladies inflammatoires de l’intestin est très controversé. Dans certains modèles de ces maladies elles seraient délétères en promouvant l’inflammation, alors que dans d’autres elles seraient bénéfiques en promouvant la réparation des tissus enflammés ou en limitant les infections intestinales. Notre hypothèse est que cette controverse ne dépend pas uniquement du modèle de maladie étudié, mais aussi de la spécificité du modèle murin utilisé pour étudier les pDC. Nous avons généré et validé un nouveau modèle murin permettant la perte sélective des pDC depuis la naissance sans affecter aucun autre type de cellule. Grâce à ces souris notre deuxième objectif est d’étudier le rôle des pDC intestinales dans trois modèles distincts de maladies inflammatoires de l’intestin. Dans ces modèles l’inflammation intestinale est obtenue suite à l’exposition de l’intestin 1) aux rayons X ou 2) à un produit chimique ou 3) à l’infection par un pathogène intestinal, le Citrobacter rodentium. Ces trois modèles induisent des lésions intestinales par des mécanismes différents. Il est donc possible que selon le modèle étudié la perte des pDC ait un impact différent et, par conséquent, soit associé à des fonctions bénéfiques ou délétères. Connaitre le rôle des pDC dans ces différents modèles de pathologie intestinale va ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients souffrant de maladies inflammatoires de l’intestin, pour lesquelles peu de traitements sont efficaces à ce jour.
Bénéfices attendus
Le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin vise principalement à bloquer les molécules promouvant l’inflammation. Ces molécules sont surtout produites par les cellules du système immunitaire. Cependant, ces mêmes traitements affectent aussi l’efficacité des réponses du système immunitaire face à des pathogènes, rendant les patients plus susceptibles aux infections microbiennes. De plus, certaines cohortes de patients souffrant de MICI sont résistantes à ces traitements, soulignant ainsi la nécessité de trouver d’autres stratégies thérapeutiques plus adaptées. Nos études peuvent ouvrir de nouvelles perspectives de traitements pour promouvoir la guérison et/ou atténuer les symptomes associés au MICI en stimulant ou en inhibant les fonctions des pDC.
Procédures
Traitement antibiotique dans l’eau de boisson modifiant la flore intestinale pendant 14 jours. Irradiation pendant 10 minutes de la partie inférieure du corps sur animaux sous anesthesie générale. L'injection de l'anesthésie est effectuée une fois par voie intrapéritonéale et dure 20 secondes. Une partie des animaux (30) recevront vigiles une seule fois par injection intrapéritonéale un composé, ceci 4 heures avant la mise à mort 4 jours après irradiation. L'injection intrapéritonéale dure 20 secondes. Administration d’un composé dans l’eau de boisson sur animaux vigiles pendant 7 jours. Administration d’une souche bacterienne par gavage unique sur animaux vigiles. Le gavage dure 20 secondes. Gavage unique sur animaux vigiles avec un composé permettant d’étudier la permeabilité intestinale. Le gavage dure 20 secondes. Prélevement de sang sur souris sous anesthesie générale 2 heures après gavage. Le prélèvement de sang est effectué une seule fois et dure 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le traitement d’une durée maximale de 2 semaines par cocktail d’antibiotique est généralement bien toléré. Le traitement antibiotique peut impacter la motilité intestinale et provoquer constipation ou diarrhée. Les trois modèles de maladies inflammatoires de l’intestin présentés dans ce projet ont déjà été mis au point dans une équipe de notre institut, ce qui nous permettra de bien maitriser le suivi des souris traitées et limiter le nombre de souris requis pour les mises au point des protocoles. L’exposition aux radiations ionisantes sera restreinte à la partie inférieure du corps avec un dosage qui n'induit pas de perte de poids, de colite ou de diarrhée dans les souris contrôle C57BL/6. Cependant, il est possible que des signes cliniques puissent apparaître dans les souris mutantes. Le traitement avec le DSS induit des lésions et une inflammation de l’intestin, accompagnée d'une perte de poids et de diarrhée pendant une durée de 7 jours. Cela peut induire aussi des saignements et des lésions au niveau anal. La dose de DSS utilisée sera calibrée pour induire une colite modérée chez les souris C57BL/6. Cependant, il est possible que des signes cliniques plus importants ou plus précoces puissent apparaître dans les souris mutantes. En ce qui concerne l’infection par Citrobacter Rodentium, les souris C57BL/6 sont naturellement résistantes à l'infection, donc elles tolèrent l'infection et récuperent en 2-3 semaines sans signes cliniques évidents. La souche de C. rodentium et la dose d’inoculum ont été choisies sur la base de la literature comme étant bien tolerées chez les souris C57BL/6. Cependant, des signes cliniques peuvent apparaître dans les souris mutantes.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement organe et/ou analyse.
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire et de la réparation tissulaire au cours d’une inflammation produite in vivo. La complexité des nombreuses interactions cellulaires impliquées dans le processus inflammatoire et dans la réparation tissulaire associées aux MICI justifie l’utilisation de modèles d’études in vivo. De plus, la flore intestinale a été montrée comme capable de réguler les fonctions de nombreux organes de l’hôte et leur intercommunication. L’intégration d’un système vivant et complet est donc indispensable pour reproduire l’ensemble de ces processus dans leur complexité.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum. Nous utiliserons des souris de fond génétique pur, C57BL/6, ce qui nous permet de limiter la taille des groupes expérimentaux à 5 souris par souche et par condition, en raison d’une variabilité inter-individuelle moindre par rapport aux animaux de fond génétique mixte. Ces nombres ont déjà été validés dans d’une autre équipe de notre institut, qui maitrise les procédures incluses dans ce projet, comme suffisantes pour effectuer des analyses statistiques fiables dans les procédures utilisées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Chaque animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Le poids, l’apparence (en particulier du pelage), l’activité, la mobilité des animaux, la consistance des selles avec éventuel saignement et éventuellement la température corporelle seront suivis quotidiennement au début de chaque traitement. Dans le cas d’affaiblissement des souris de la nourriture sous forme de gélée sera mise à l’intérieur de la cage afin d’en faciliter l’accès et la surveillance sera renforcée à deux fois par jour. Les points limites et des grilles de score ont été définis dans chaque procédure. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et mettre en place le plus précocément les mesures pour les réduire les nuisances et la souffrance des animaux. Les animaux atteignant les critères d’arrêt seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Etude de PIEZO1 dans le métabolisme du fer et dans la xérocytose héréditaire.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Le seul acte déclaré sur les 90 souris de ce projet est leur mise à mort, sous anesthésie et sans reprise de conscience, suivie du prélèvement de leurs organes et de leur sang. Elles portent une mutation reproduisant la xérocytose héréditaire, une anémie rare accompagnée d'une surcharge en fer, et sont utilisées à l'âge de deux mois. Le porteur décrit longuement les organoïdes intestinaux cultivés à partir de leurs cellules souches comme un moyen de réduire le recours aux animaux non-humains, avant de conclure que la souris reste "indispensable" et "sans solution alternative" pour prélever le sang et les organes. Le choix de l'espèce est justifié par la connaissance du génome murin, par le volume de sang obtenu et par le fait que ces souris développent la surcharge en fer avec l'âge.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de comprendre comment une protéine membranaire et qui permet l’entrée de cations, influence le métabolisme du fer. Plus particulièrement, nous nous intéressons à l’effet de certaines mutations de cette protéine conduisant à une surcharge en fer excessive chez des patients atteint d’une forme rare d’anémie : la xérocytose héréditaire (XH). Nous cherchons à comprendre les mécanismes par lesquels cette protéine interfère dans l’absorption intestinale du fer et/ou dans l’acquisition du fer par les cellules érythroïdes (les cellules formant les globules rouges).
Bénéfices attendus
Ce projet est essentiel pour mieux comprendre la xérocytose héréditaire (XH), une maladie rare encore peu étudiée. Plus particulièrement, nous cherchons à identifier les mécanismes conduisant à une surcharge en fer excessive et toxique chez les patients atteints de cette pathologie. Forte d’une étroite collaboration avec des équipes de recherche travaillant sur d’autres complications de la xérocytose héréditaire, cette étude fera progresser la compréhension de la maladie et sera bénéfique pour les cliniciens, médecins, chercheurs et surtout pour les patients. A long terme, comprendre comment fonctionne la xérocytose héréditaire permettra d’envisager des solutions thérapeutiques ciblées pour les patients. Concernant la surcharge en fer, les connaissances acquises au cours du projet pourront être appliquées à la prise en charge des patients grâce à des molécules-médicaments qui ciblent le fer pour l’éliminer. Une première étape clef du projet est la conception d’organoïdes intestinaux (des mini-intestins cultivés en laboratoire à partir de cellules souches de souris). Il sera envisageable de concevoir des organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules de patients, avec leur accord, dans une démarche de médecine personnalisée pour tester des molécules thérapeutiques. L’intérêt de ce modèle unique est d’étudier directement les mutations génétiques spécifiques de chaque patient et l’efficacité des traitements contre la surcharge en fer de façon individuelle. Enfin, l’intérêt de la communauté scientifique autour de la protéine mutée dans la xérocytose héréditaire ne cesse de croître depuis sa récente découverte en raison de son implication dans de nombreux processus biologiques. C’est pourquoi, notre projet avec l’étude approfondie du rôle de cette protéine dans le métabolisme du fer, son rôle dans l’absorption intestinale et au niveau des globules rouges, représente une avancée fondamentale applicable à d’autres maladies et concepts. Ce projet s’inscrit donc dans un domaine de recherche en pleine expansion et à fort potentiel thérapeutique.
Procédures
Au cours de ce projet, 90 souris seront mises à mort à la fin du protocole selon une méthode réglementaire avec une couverture anesthésique et analgésique afin de permettre à l’animal de ne jamais souffrir en s’appuyant sur une grille de suivi et avec l’aide d’un personnel formé et compétent. Avant tout acte sur l’animal, l’absence de réflexe sera vérifiée par plusieurs méthodes. Après la mise à mort, des prélèvements de plusieurs organes et de sang seront réalisés.
Impact sur les animaux
Au cours de leur élevage, les souris seront suivis par le personnel de la zootechnie, l’équipe de recherche et le service du bien-être animal. Les interventions prévues dans ce projet peuvent entrainer un stress léger ou de la douleur liés à l’anesthésie qui se fait par une piqûre. L’anesthésie profonde de l’animal sera vérifiée avant tout acte invasif.
Devenir
Le projet nécessite 90 souris au total et les interventions sont de catégorie « sans réveil ». Tous les animaux utilisés pour les expériences sont mis à mort de manière éthique afin de récupérer les organes et le sang pour répondre aux questions scientifiques posées.
Remplacement
Des lignées cellulaires intestinales sont utilisées pour des analyses préliminaires. Elles permettent en effet d’étudier dans un premier temps l’effet de la protéine d’intérêt sur le transport du fer grâce à une molécule qui reproduit la mutation de la protéine comme dans la xérocytose héréditaire (XH). Cependant, ce modèle a des limites non négligeables pour des analyses plus poussées. Il s’agit d’un seul type de cellules qui ne reproduit pas la complexité du tissu intestinal (plusieurs types de cellules différentes et en tridimension). De plus, la protéine étudiée est exprimée dans plusieurs types cellulaires. Les interactions cellules/cellules entre différents types cellulaires pourraient jouer un rôle clef dans la régulation du transport du fer, qui ne peut pas être étudié avec la lignée cellulaire. Pour pallier ces limites, nous proposons des organoïdes intestinaux (des mini-intestins produits à partir de cellules souches de souris). Ce modèle, reproductible, fiable et plus proche de la physiologie intestinale, réduit le recours aux animaux : une souris permet d’obtenir des dizaines d’organoïdes utilisables sur une longue période. Ces « mini-organes » permettent d’étudier des mécanismes complexes (architecture et fonctions de l’organe d’origine) et ainsi d’analyser l’effet des mutations de la protéine sur le transport du fer, l’architecture de l’organe et les dialogues entre les différentes cellules. Parallèlement, une lignée cellulaire qui reproduit les cellules à l'origine des globules rouges servira aux analyses préliminaires de l’acquisition du fer avec une molécule mimant la mutation de la protéine étudiée. Cependant, des cellules issues directement de souris porteuses de la mutation de la xérocytose héréditaire sont un modèle plus fidèle à la maladie. Ce modèle va approfondir l’étude des mécanismes de régulation d’acquisition du fer de façon plus fidèle à ce qu’on observe chez les patients atteints de xérocytose héréditaire. Enfin, malgré ces solutions de remplacement, le modèle de souris reste indispensable et sans solution alternative pour le prélèvement de sang et d’organes afin d’établir le profil pathologique des souris et le métabolisme du fer. En combinant les approches in vitro et in vivo, nous comprendrons mieux les dysfonctionnements du métabolisme du fer liés à la mutation de la protéine et la physiopathologique de la XH.
Réduction
Une réflexion a été menée en prenant en compte les outils technologiques qui peuvent être mis en place au sein du laboratoire et en s’appuyant sur des outils statistiques fiables dans la conception des procédures du projet dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque intervention. Tout d’abord, la lignée de souris exprimant la mutation de la xérocytose héréditaire existe déjà. La réception d’une première cohorte de souris se suivra d’une attention toute particulière à la gestion de l’élevage. L’accent sera mis sur le dialogue entre les concepteurs, applicateurs, et membres de l’établissement d’accueil des animaux pour bien réfléchir aux groupes de souris mis en accouplement. Cela permettra de mieux contrôler les génotypes des souris et réduire le nombre de naissances. De plus, les procédures expérimentales se feront étape par étape afin de vérifier que les résultats obtenus sont en accord avec nos hypothèses de recherche. Plus particulièrement, nous nous attendons à des différences de données en fonction du sexe des souris. Si aucune différence entre mâles et femelles n’est observée, un seul groupe mixte au lieu de deux groupes sera étudié. Enfin, la mise en place des organoïdes permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la caractérisation des mécanismes d’absorption intestinale du fer. Il s’agit d’un modèle in vitro qui reproduit fidèlement l’architecture de l’intestin, avec la présence de nombreux types cellulaires et qui est fidèle à la fonction biologique de l’organe d’origine. Ce modèle tridimensionnel permet des tests fonctionnels et de nombreuses analyses sans recourir à un nouvel animal pour chaque expérimentation. La réflexion concernant les tests statistiques appliqués permet de limiter le nombre d’animaux mis à mort tout en garantissant des résultats pertinents pour notre étude.
Raffinement
Le modèle de souris n’a pas été associé à la douleur ou à la souffrance dans l’équipe collaboratrice ayant créé la lignée. Néanmoins, nous nous assurerons que les animaux bénéficient d’une bonne qualité de vie au cours de leur élevage et de leur utilisation. Pour cela, un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé et compétents en contact direct les uns avec les autres. Ce suivi permettra de vérifier le comportement des animaux et de l’absence de signes de souffrance. En cas de doute, les avis du vétérinaire et du service du bien-être animal seront sollicités pour mettre en place les soins adéquats. L’hébergement des souris respectera leurs besoins sociaux. Dans la mesure du possible, les groupes de souris destinés aux différentes procédures seront formés à l’avance et hébergés ensemble en amont des procédures. Cela permettra de limiter un stress lié à la découverte de nouveaux congénères juste avant l’expérimentation, réduisant ainsi les biais causés par le stress de l’animal. De même, en amont des procédures expérimentales, des visites des applicateurs seront anticipées pour familiariser les animaux à leur présence et à la manipulation, diminuant ainsi le stress de l’animal le jour de l’expérimentation. Dans leur cage, le milieu d’hébergement sera enrichi (coton de nidification, dôme…) et les animaux recevront une alimentation standard et de l’eau en libre accès. Dans le cas des procédures sans réveil, l’animal sera sous analgésiant et sous anesthésiant. La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée par différentes méthodes. La qualité de l’anesthésie sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure.
Choix des espèces
Le modèle murin a été conçu grâce à la connaissance approfondie du génome de la souris, permettant de reproduire la mutation la plus récurrente de la xérocytose héréditaire (XH). Ainsi, ce modèle présente une grande proximité avec la maladie humaine. Le modèle permet d’obtenir un volume de sang suffisamment important pour l’analyse complète du bilan sanguin, du bilan du fer dans le sang et la récupération des cellules permettant de produire les globules rouges. De plus, la conception d’organoïdes intestinaux, qui réduit considérablement le nombre d’animaux nécessaires au projet, est une technique bien maîtrisée chez la souris. La XH est une pathologie évolutive où certaines complications, dont la surcharge en fer, deviennent plus sévères avec l’âge. Dans un modèle de souris portant la mutation de la protéine comme chez l’Homme, il a été montré que les souris développent une surcharge en fer avec l’âge avec une augmentation du fer dans le sang et dans les tissus ainsi qu’une diminution du taux de l’hormone régulant le fer. Dans notre équipe, des données préliminaires chez des souris âgées de 2 à 3 mois montrent également une surcharge en fer. Cependant, à cet âge, nos données indiquent que la surcharge en fer est uniquement d’origine tissulaire. Il semble donc qu’un mécanisme progressif engendre un changement dans le métabolisme du fer avec l’âge. De plus, nous ne retrouvons pas la diminution de l’hormone du fer chez nos souris jeunes contrairement à ce qui a été observé chez des souris âgées (> 1 an). Il semble donc très important de caractériser les mécanismes conduisant à l’aggravation de la surcharge en fer à un âge précoce grâce au modèle. C’est pourquoi, nous proposons de réaliser nos procédures expérimentales à l’âge de 2 mois.
Evaluation de molécules sur des modèles murins de cancers de la peau humains pour une meilleure prise en charge thérapeutique de patients en échec de traitement.
- Recherche appliquée
- Cancers
Tuées au plus tard six semaines après la greffe pour que la tumeur soit récupérée et analysée, 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de mélanome humain prélevé sur biopsie leur est implanté sous la peau du cou au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes. Une partie d'entre elles reçoit ensuite, huit semaines durant, une injection abdominale quotidienne ou un gavage quotidien cinq jours sur sept, avec irritation possible du tube digestif. La croissance de la tumeur peut provoquer ulcération, changement de respiration, agressivité et mobilité réduite, et la souris est alors tuée dès que le seuil de la grille de score est atteint, seuil que le porteur présente comme une mesure de bien-être.
Objectifs
Le mélanome est un cancer de la peau ayant un mauvais pronostic et une incidence croissante, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. De nouvelles thérapies ont permis d’améliorer la prise en charge du mélanome lorsque celui-ci s’est propagé dans d’autres organes, cependant l’inefficacité des molécules thérapeutiques courantes et la toxicité sont des phénomènes très fréquents qui limitent grandement leur bénéfice clinique. Ainsi, l’identification de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces reste un enjeu considérable. Notre projet permettra tout d’abord d’avoir à disposition du matériel biologique en quantité suffisante pour réaliser des tests de molécules thérapeutiques sur des prélèvements de tissus dérivés de biopsie de peau de patients atteints de mélanome. Il permettra également de tester de nouvelles combinaisons de thérapie anti-cancer de la peau dans ce modèle de souris.
Bénéfices attendus
L’inefficacité des molécules thérapeutiques courantes est un phénomène très fréquent chez les patients traités par des thérapies ciblées, notamment dans les cancers de la peau et plus spécifiquement dans le mélanome. La découverte de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces patients sont des enjeux considérables de nos jours. A terme, ce projet va nous permettre de guider la décision thérapeutique chez les patients atteints de mélanome en échec de traitement.
Procédures
La mise en place de ces différents modèles consiste dans un premier temps à implanter un bout de tumeur de peau humaine sous la peau au niveau du cou de la souris. Cette chirurgie se fait sous anesthésie générale et dure environ 30 à 40 minutes. Les souris sont ensuite surveillées sur une cage maintenue à 37°C jusqu’à leur réveil (15 minutes). Une injection sous la peau du flanc d’un anti-douleur sera réalisée afin de limiter la douleur de la souris pendant 72h post-opératoire. Les souris seront euthanasiées au bout de 6 semaines maximum afin de récupérer la tumeur. Pour l’autre partie du projet, nous testerons in vivo (sur un animal vivant entier) la meilleure réponse à une combinaison observée ex vivo (sur des fragments de tumeurs). Pour cela des souris ayant subi les mêmes interventions que décrites précédemment recevront une injection quotidienne (5 jours par semaine) dans l’abdomen ou un gavage une fois par jour (à l’aide d’une sonde de gavage) d’un ou plusieurs inhibiteurs de protéines impliquées dans le développement du mélanome (durée : 30s, sur souris éveillées) pendant 8 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Suite à la croissance des tumeurs et/ou au développement de métastases, une perte de poids peut être observée. Un développement trop important de la tumeur peut également induire une ulcération, un changement de la respiration ou encore une agressivité. Une réouverture de la zone d’implantation de la tumeur ainsi qu’une infection, inflammation ou irritation peuvent être observées. Les souris peuvent présenter une mobilité réduite si la tumeur atteint une taille trop importante. Enfin, la thérapie médicamenteuse peut se révéler légèrement toxique, ce qui se manifestera par une perte de poids principalement ou un gonflement de l’abdomen. Certains traitements étant administrés par gavage (1 fois par jour, 5 jours/7), une irritation du tube digestif est possible.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de collecter la tumeur qui sera analysée et conservée afin de caractériser au niveau cellulaire l’effet de la thérapie
Remplacement
Nous réalisons au maximum des expériences en utilisant des fragments de tumeurs in vitro (sans utilisation d’animaux) qui permettent de déterminer les meilleures combinaisons thérapeutiques. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles animaux vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de nos résultats in vitro sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. De plus, les cellules cancéreuses dont le nombre a été augmenté dans la première partie du projet sont utilisées pour trouver in vitro (sans utilisation d'animaux) les traitements les plus efficaces, permettant ainsi de réduire le nombre de groupes de souris utilisées dans la seconde étape du projet.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte la taille de la tumeur, l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. La tumeur sera mesurée deux fois par semaine afin d’anticiper une potentielle souffrance. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée, perte de poids importante) et de tumeur d’une taille importante (définie dans la grille de score) avec ou sans ulcération, la souris sera immédiatement euthanasiée selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de tumeurs humaines sur des souris sont bien décrits dans la littérature scientifique et sont pertinents pour l’étude de l’effet de thérapies sur la croissance de ces tumeurs humaines. Le mélanome étant un cancer qui se développe chez l’adulte, ainsi des souris adultes âgées de 5 semaines, âge permettant une prise de greffe efficace seront utilisées dans ce projet.
Travaux pratiques sur le modèle « souris »
- Formation professionnelle
Pour former des techniciens à la pratique des injections et des prélèvements, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes les administrations et les prises de sang se font sur animaux éveillés, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse et orale, jusqu'à vingt administrations et cinq prélèvements par souris sur l'année scolaire. Les gestes sont réalisés par des élèves en apprentissage, ce que le porteur reconnaît comme source de douleurs éventuelles, avec risque d'hématome au point de ponction. Trente souris au maximum, les plus âgées, sont tuées pour des dissections de BTS, les autres restant à l'animalerie pédagogique pour les exercices d'observation et de manipulation avant d'être proposées à l'adoption à neuf mois.
Objectifs
Ce projet consiste à former des personnes travaillant au sein d’établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques en tant qu’applicateur de procédures expérimentales sur l’espèce souris. Le but est d’acquérir les techniques de manipulations classiques pour réaliser des administrations et des prélèvements en évitant toute souffrance pour l’animal et en garantissant la sécurité de l’opérateur et de l’animal. En parallèle, avec l’utilisation de l’animalerie pédagogique, les apprenants avec encadrement sont initiés aux différentes techniques de base en matière d’hébergement, élevage , techniques d’anesthésie, soins pré/post opératoires et observations des animaux dans le respect du bien être animal.
Bénéfices attendus
Ces travaux pratiques font partie intégrante de la formation des techniciens applicateur de procédures utilisant des animaux à des fins scientifiques. L’obtention de leur diplôme ou habilitation leur donne la possibilité de travailler dans le cadre de projets scientifiques sur animaux vivants et permet aux employeurs de bénéficier de techniciens compétents techniquement et opérationnels réglementairement dès leur entrée dans l’entreprise. La méthode d’apprentissage basée sur les règles du bien être animal, permet d’acquérir les bons gestes afin de garantir sécurité et respect éthique de l’animal. L’animalerie pédagogique permet aux apprenants d’acquérir d’autres notions importantes tel que le maintien des ces animaux en milieu confiné, l’observation quotidienne, l’élevage, l’hygiène et la prophylaxie. L’acquisition des ces compétences théoriques et pratiques démontre l’importance d’avoir des animaux hébergés dans de bonnes conditions et une approche des règles du bien être animal facilite leur manipulation. Les entreprises sont à la recherche de personnel formé et autonome rapidement. Notre établissement est très réputé dans la formation de techniciens applicateurs grâce à l'expertise technique de formateurs reconnus depuis de nombreuses années et un outil pédagogique tel que l’animalerie complètement rénovée cette année.
Procédures
Toutes les administrations et prélèvements sont réalisées sur animaux vigiles. Les différentes voies d'administrations sont la voie sous cutanée, intra péritonéale, intra musculaire, intra veineuse et orale. L'animal est soumis à 2 administrations maximum par semaine et la durée d'administration est inférieure à 1 minute. Le nombre d'administrations pour un animal est inférieur à 20. Les prélèvements sanguins sont effectués à la veine caudale ou sub mandibulaire 1 fois par semaine maximum. La durée de prélèvement est inférieure à 1 minute. Le nombre de prélèvements pour un animal est inférieur à 5.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces séances de travaux pratiques sont faiblement invasives. Les nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation et aux douleurs éventuelles associées aux injections effectuées par des étudiants en apprentissage. La prise de sang peut également engendrer un hématome au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux sont conservés à l'issue de cette procédure sauf 30 animaux maximum (les plus âgés) utilisés dans le cadre du programme de BTS pour des dissections. Le reste des animaux est maintenu dans l'animalerie et sert aux apprenants pour l'acquisitions de compétences comme l'observation, l'entretien, ou la manipulation. Ces animaux sont proposés à l'adoption à l'âge de 9 mois.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau applicateur), il est nécessaire que les personnes pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives pour les maîtriser au mieux et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations sans animal ou avec « peluche »). La réalisation d’interventions directes sur l’animal, avec encadrement professionnel, est incontournable et reste l’objectif principal de ces formations professionnelles. Le but étant de permettre aux futurs applicateurs d’acquérir les bons gestes en évitant stress et souffrance aux animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des personnes (voir annexe 3). Ce calcul est fonction du nombre de sesssions réalisées pendant une semaine en tenant compte du nombre maximum d'apprenants. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont aussi utilisés pour des travaux pratiques hors projet comme le sexage, la préhension, les contentions,les activités zootechniques. Cette double utilisation permet de réduire le nombre d'animaux. Le nombre de souris utilisées au maximum sur 1 semaine est de 280 soit 56 cages. Cependant afin de réduire le nombre d'animaux utilisés tout en maintenant des phases de repos nécessaires au bien être de nos souris, les sessions de travaux pratiques sont réparties tout au long de la semaine en alternant travaux pratiques "projet" avec des travaux pratiques "hors projet". La souris est utilisée 1 fois par jour ouvré au maximum avec 2 administrations différentes par semaine ou 1 prélèvement sanguin par semaine. Cette organisation nous permet de diminuer le nombre de souris à 200 par an soit une diminution de 30%. Ce nombre sera adapté chaque année scolaire en fonction du nombre d'apprenants. Les sessions de formation courtes "applicateurs" sont placées lors des congés scolaires afin d'utiliser les mêmes animaux.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés en groupe socialement harmonieux de 4 ou 5 animaux par cage. Les animaux bénéficient d’un programme d’enrichissement alternatif et évolutif (Exemple: couche épaisse de copeaux au dessus des micro plaquettes, des tunnels et des bâtons à ronger). Tous les animaux sont entraînés en début d’année scolaire par les apprenants en classe de terminale bac pro TEA lors des premières séances de travaux pratiques. Les classes de seconde ou les premières années de BPTAUE débutent par l'habituation puis la préhension au contact applicateur/animal. Une attention particulière est portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. Les élèves peuvent également proposer des mesures de raffinement observées pendant leur période de stage en entreprise comme une nouvelle technique de contention. Après chaque procédure d'administration ou de prélèvement, les apprenants effectuent un acte de renforcement positif (récompense alimentaire, caressing). Tous les animaux sont suivis avant, pendant et après les manipulations avec mise en place d'un suivi clinique avec points limites et utilisation d'analgésiques le cas échéant
Choix des espèces
La souris est une espèce nécessaire à l’apprentissage du futur technicien applicateur de procédures expérimentales sur animaux. Cette espèce est la plus utilisée en recherche (1ère au classement en 2022 avec environ 60 %). Les souris sont âgés au minimum de 4 semaines en début de projet et seront mis en réforme à 9 mois d’âge pour une adoption éventuelle. Cette période correspond globalement à une année scolaire permettant au apprenants de manipuler des animaux tout juste sevrés et des animaux plus vieux et donc plus gros en fin de cycle. L’âge de réforme et la proposition à l’adoption se fait en fin d’année scolaire généralement. Avec des animaux de 9 mois, l’espérance de vie pour les adoptants reste intéressante.
Rôle des astrocytes dans les interactions sociales en physiologie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une craniotomie, l'injection d'un virus dans le cerveau et deux heures trente de chirurgie pour poser un dispositif d'imagerie attendent une partie des 2 210 souris de ce projet, toutes tuées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent des injections abdominales trois à cinq jours de suite, puis des tests d'anxiété et de locomotion, de mémoire sur trois jours, de préférence sociale, de sociabilité face à une femelle puis à un mâle, et de dominance dans un tunnel traversé cinq fois par jour. L'objet déclaré est le rôle des astrocytes et de l'ocytocine dans les interactions sociales, avec pour horizon lointain des traitements de l'autisme. Le porteur indique que le dispositif d'imagerie pèse 2 grammes, soit environ 10 % du poids d'une souris, et que les tests comportementaux pourraient augmenter l'anxiété des animaux dont il mesure précisément la sociabilité.
Objectifs
Les astrocytes sont des cellules du cerveau qui jouent un rôle important en aidant les neurones à communiquer efficacement. Cette communication est essentielle pour les pensées, les émotions et les comportements. Ce projet vise à mieux comprendre comment ces cellules influencent les interactions sociales, en étudiant l’effet de l’ocytocine, une hormone qui favorise les liens sociaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines molécules et signaux dans le cerveau, en particulier ceux liés à l’ocytocine et au calcium, influencent les interactions sociales. À long terme, cette recherche pourrait conduire à de nouveaux traitements pour des troubles comme l’autisme, en agissant sur ces signaux pour améliorer la sociabilité.
Procédures
Injection dans la cavite abdominale (environ 5 minutes, une fois par jours 3 à 5 jours de suite par souris) Injection intracerebrale (environ 30 minutes, une seule fois par souris) Chirurgie pour utiliser le dispositif (environ 2h30, une fois par souris) Tests comportement anxiété/locomotion (10 min, une fois par souris) Test comportement mémoire (10 min le premier jour, 20 min le deuxième jour, 10 min le troisième jour, une seul fois par souris), Test de préférence sociale (3 x 10 minutes, une fois par souris), Test comportement de sociabilité directe (10 minute le premier jour face à une femelle, 10 minutes le deuxième jour face à un male), Test de dominance (la souris traverse le tunnel 5x pendant 3 jours pendant l'entrainement puis test pendant 10 minutes maximum)
Impact sur les animaux
L’injection dans la cavité abdominale peut induire une douleur et un stress légers à la piqure et une irritation abdominale en lien avec le produit injecté. La craniotomie réalisée pour l'injection de virus et/ou l'implantation peut générer des douleurs. Le dispositif utilisé pour l'imagerie pèse 2g ce qui représente environ 10% du poids de la souris et pourrait causer des nuisances. Les tests comportementaux réalisés pourraient induire une augmentation de l'anxiété.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études en histologie ou biochimie.
Remplacement
Le but majeur du projet est d'étudier le rôle des interactions neurogliales dans les interactions sociales, qui nécessité une approche in vivo sur modèle animal. Il n'existe pas encore de modèles mathématique ou in silico alternatifs permettant l'étude de comportements. De plus, les interactions sociales sont des processus multidimensionnels qui ne peuvent pas être récapitulée sur des lignée cellulaires humaines ou animales ou tout autre modele in vitro, cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons le même animal lorsque cela est possible pour analyser les effets au niveau de nos deux régions d'intérêts. Nous estimons qu’une quinzaine de souris est nécessaire lors des expériences de test comportementaux pour obtenir des résultats suffisamment fiables pouvant être testés à l’aide d’un test statistiques. Cependant, compte tenu de possibles aléas liés à l’injection du virus , nous ajoutons 5 souris supplémentaires soit un maximum de 20 groupes par groupe testé. Pour les expériences de séquençage et de caractérisation microscopique et biochimique, une quinzaine de souris est nécessaire pour être testés à l’aide d’un test statistiques.
Raffinement
Les animaux ayant reçus un acte chirurgical seront placés sous surveillance jusqu’au réveil des animaux. Puis, les animaux sont replacés dans leur cage d’origine (avec leur congénères) et seront sous une surveillance renforcée. Les points limites sont définis par des changements dans l'aspect physique/comportement ou si des blessures sont constatées. Les animaux seront euthanasiés si leur bien-être est compromis. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant les 5 jours qui suivent la chirurgie. De plus, nous utiliserons la grille d'évaluation du bien-être animal validée par le comité éthique pour suivre quotidiennement les animaux. En cas de douleurs ou de souffrances observés à la suite des chirurgies, nous injecterons un antalgique en sous-cutanée. Avant le premier test de comportement, nous procéderons à une habituation des souris à l'expérimentateur en réalisant une habituation pendant 3 jours consécutifs. Pour les tests d'imagerie endoscopique, les animaux seront habitué pendant 5 jours consécutifs à porter le miniscope sur leur tête pendant 10 minutes.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui et toutes les lignées transgéniques utilisées ici se basent sur cette espèce. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, ce modèle permet d’étudier les interactions neurones-astrocytes in vivo dans des aspects comportementaux complexes. Dans le but d’étudier les propriétés neuronales et astrocytaires et leurs interactions, les expériences seront réalisées chez la souris adulte (2-5 mois). Contrairement aux jeunes souris en phase de croissance ou aux souris âgées, les adultes ont une certaine stabilité hormonale et comportementale, ce qui peut réduire la variabilité expérimentale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées chez des souris âgées de 1 à 5 mois et les études de comportements seront réalisées au moins 3 semaines après injections stéréotaxiques.
Étude sur la caractérisation des miRNA circulants associés à l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Génétiquement hémophiles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ponction du genou droit sous anesthésie pour provoquer un saignement articulaire, geste douloureux qui peut entraîner boiterie et gêne locomotrice. L'objectif déclaré est de repérer dans le sang des micro-ARN servant de marqueurs précoces de la dégradation du cartilage et de l'os, deux de ces marqueurs ayant déjà été validés chez des patients hémophiles. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement aux malades humains, ne saigne jamais spontanément et ne saigne que si on la blesse, et justifie la mise à mort par la "nécessité" de prélever tout le sang de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques où la forme sévère est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. Actuellement, le diagnostic d’une dégradation du cartilage et de l’os se fait par l’examen clinique, la radiographie, l’échographie et l’IRM. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de détecter à un stade assez précoce de l’arthropathie. Les biomarqueurs représentent des candidats pour le diagnostic précoce. Les micro-ARN circulants sont présents dans de nombreux fluides, notamment le sang. Ils sont stables et résistants aux analyses et représentent déjà de bons candidats comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic d’autres pathologies comme la polyarthrite rhumatoïde. Il existe des similitudes physiopathologiques commune entre la polyarthrite rhumatoïde et l’arthropathie hémophilique dont l’inflammation articulaire et la destruction du cartilage et de l’os. En amont, une étude clinique précoce réalisée par notre équipe a identifié et validé deux micro-ARN circulants comme biomarqueurs de l’arthropathie hémophilique chez les patients hémophiles ayant des lésions avancées d’arthropathie. Nous cherchons à identifier des marqueurs globaux de l’atteinte du cartilage et de l’os pour à terme proposer la détection de certains biomarqueurs permettant le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade le plus précoce. Nous avons fait l’hypothèse que l’identification de biomarqueurs précoce de l’arthropathie hémophilique permettrait la mise en place d’un nouvel outil de diagnostics simple et rapide, réalisé lors de bilan sanguin. L’objectif de ce projet est d’identifier des biomarqueurs pour un diagnostic précoce de l’arthropathie hémophilique. Afin de détecter le plus tôt possible la mise en place d’une synovite et ainsi bloquer l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B sévères et à terme chez les patients.
Bénéfices attendus
La comparaison entre les différents stades d’atteinte de l’arthropathie nous permet de cibler les microARN d’intérêts pour le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade précoce. La conservation inter-espèce de ces biomarqueurs nous permet également de proposer une étude clinique afin d’évaluer l’efficacité des micro-ARN comme outil de diagnostic clinique chez l’Homme.
Procédures
Les souris subissent une ponction du genou droit sous antalgie et anesthésie générale (2-3 minutes) pour simuler l’arthropathie hémophilique et l’évaluation de l’atteinte ostéochondrale. Le dernier jour, les souris sont mises à mort sous antalgie et anesthésie générale par prélèvement sanguin (5 minutes).
Impact sur les animaux
Le phénotype des animaux comporte une vulnérabilité du point de vue de la coagulation, avec risque de saignement prolongé en cas de blessure mais pas de saignement spontané comme dans la forme humaine de la maladie Les ponctions du genou engendrent une douleur. L’arthropathie induite par la ponction peut occasionner une gène locomotrice, une démarche anormale ou boiterie ainsi qu’une légère douleur lors des déplacements et redressements de l’animal sur ses pattes arrières.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement tout le sang, non compatible avec le maintien en vie de l'animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Dans cette étude, chaque souris constitue son propre contrôle pour les mesures biologiques et histologiques, réduisant le nombre de souris et participant à la robustesse de l’étude d’un point de vue statistique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal dont l'application des points limites stricts et spécifiques du projet. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. En cas d’apparition de problème locomoteur (boiterie ou difficulté à la station debout), de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage sont mis à disposition dans la cage. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.