Souris
Étude des mécanismes de modification de la réponse immunitaire par l’influence de cellules mémoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.
Bénéfices attendus
Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.
Procédures
Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).
Impact sur les animaux
Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées
Remplacement
Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.
Réduction
Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.
Raffinement
Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Rôle d’une protéine des vaisseaux sanguins dans une pathologie rénale, la glomérulonéphrite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Deux injections intraveineuses de sérum déclenchent une maladie rénale chez 480 souris, dont l'évolution est ensuite suivie pendant cinq à quatorze jours. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin pour analyser leurs reins. Une partie subit en plus une chirurgie de trente minutes pour une injection directe dans le rein, une autre reçoit un anticoagulant mélangé à sa nourriture, et le prélèvement final d'urine se fait par incision abdominale. Le porteur ramène l'œdème et la présence de protéines dans les urines à "une certaine gêne", et affirme que les conditions de la circulation sanguine ne peuvent pas être reproduites "en dehors d'un organisme complet".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de déterminer comment notre protéine d'interêt, qui bloque des enzymes dans les vaisseaux sanguins, joue un rôle dans le développement d'une maladie rénale, la glomérulonéphrite. Des résultats précédents indiquent que cette protéine pourrait être protectrice et limiter l'insuffisance rénale liée à cette maladie. Nous voulons déterminer son mécanisme d'action et quelles cellules de l'organisme produisant cette protéine sont importantes pour la régulation de la glomérulonéphrite. Nous souhaitons également tester la possibilité de bloquer le développement de la glomérulonéphrite en modulant l'expression de cet inhibiteur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de determiner si notre protéine d'interêt, qui bloque l'activité d'enzymes dans les vaisseaux, régule le développement de la glomérulonéphrite et pourrait représenter une nouvelle cible pour les maladies rénales. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre son rôle dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme et son mécanisme d'action, pour pouvoir cibler cette protéine au cours de la maladie afin d'améliorer la santé des patients.
Procédures
La glomerulonephrite sera induite par injection intraveineuse d'un serum (2 injections de 1min, 1 par jour pendant 2 jours) sous anesthésie et nous suivrons le développement de la maladie pendant 5 à 14 jours. Un groupe de souris aura auparavant une procédure chirurgicale de 30 minutes environ pour une injection dans le rein qui permet d'augmenter la production de notre protéine d'intêret. Pour savoir si le mécanisme d'action de notre protéine est lié à la coagulation, un autre groupe de souris aura un traitement anticoagulant ajouté à la nourriture. A la fin des procédures, un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie, ainsi qu'un prelevement d'urine directement dans la vessie après une petite incision abdominale, puis les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses pour déclencher la maladie rénale peuvent provoquer une petite gène de courte durée. La maladie rénale elle même est associée à la présence de protéines dans les urines et à un gonflement du ventre (oedème rénal) qui peut également provoquer une certaine gène. Certains animaux auront également une petite chirurgie qui peut engendrer un inconfort et une douleur modérée transitoire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir analyser les reins.
Remplacement
L'étude de la fonction de la protéine étudiée et l'étude des fonctions rénales nécessitent la présence des conditions caractéristiques de la circulation sanguine que l'on ne peut retrouver que dans un être vivant. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites en dehors d'un organisme complet.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique et celle d'une étude précédente. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés et la production de ces animaux est basée sur ce nombre. Nous prévoyons de faire les expérimentations en deux fois sur deux groupes de souris. Si le premier groupe montrait l'absence flagrante d'effet de notre protéine d'interêt, de l'injection dans le rein, ou du traitement anticoagulant, nous ne ferons pas de deuxième groupe.
Raffinement
Les souris ont à disposition des cotons et du papier kraft leur permettant d’exprimer un comportement naturel de mise en place d’un nid, ainsi que de batonnets de bois. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les injections est traitée préventivement par l'administration d'un antidouleur. La prise en charge d’une éventuelle douleur au cour de la procédure s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 2 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, le modèle de glomerulonephrite est bien établi chez la souris adulte. Les souris de 10-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interêt, avec de surcroit la disponibilité des lignées avec des déficits spécifiques de cette protéine. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit les processus pathologiques qui peuvent être favorisés par l'age.
Optimisation des stratégies de vaccination thérapeutique anti-tumorales par association à des traitements visant les vaisseaux sanguins chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
960 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Chacune peut recevoir dix-huit gavages en neuf jours, quatre injections intrapéritonéales, trois injections sous-cutanées, et pour certaines une incision cutanée permettant d'injecter des cellules tumorales dans le foie ou dans le rein, suivie d'une imagerie hebdomadaire sous anesthésie pendant quatre semaines. Le porteur indique que les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids, s'immobiliser ou s'isoler. Il affirme que le microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduit en dehors d'un organisme vivant, et fait de ces modèles un "prérequis nécessaire" avant tout essai clinique.
Objectifs
La vaccination thérapeutique demeure la seule immunothérapie capable d'induire une réponse immunitaire antitumorale spécifique. Cependant la vaccination thérapeutique lorsqu’elle est utilisée en monothérapie s’avère peu efficace. Lors de la progression du cancer, la tumeur développe de nombreux mécanismes d’échappement au système immunitaire tels que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins anormaux (appelée angiogenèse tumorale). Cette angiogenèse empêche l’arrivée des lymphocytes T au sein de la tumeur et favorise un environnement hostile au système immunitaire. Il peut donc être intéressant d’associer la vaccination thérapeutique à des traitements ciblant ces vaisseaux sanguins (appelés traitements antiangiogéniques) afin d’améliorer son efficacité. Des travaux ont montré une forte synergie d’action entre ces deux traitements, et cela, uniquement lorsque la vaccination est initiée à l’arrêt du traitement antiangiogénique. L’objectif de ce projet est à présent de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeux qui pourraient expliquer le bénéfice d’une combinaison administrée de façon séquentielle entre un traitement antiangiogénique et la vaccination thérapeutique. Les bénéfices possible d’une trithérapie en associant cette combinaison thérapeutique à d’autres immunothérapies seront également évalués. Ce projet apportera de meilleures connaissances sur la séquence d’administration de plusieurs traitements thérapeutiques et pourra aider aux développement de nouvelles combinaisons thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’impact des traitements antiangiogéniques lors d’une réponse vaccinale. Notre approche longitudinale nous permettra de déterminer la cinétique d’apparition des modifications angiogéniques et immunitaires associées à cette combinaison thérapeutique. Ces résultats pourraient orienter sur le choix des anti-angiogéniques à utiliser en combinaison dans les essais cliniques. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques telle que des combinaisons entre traitement antiangiogénique et vaccin en association à des immunothérapies.
Procédures
Injection par voie sous-cutanée de cellules ou produit : 3 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Gavage 2 fois par jour tous les jours pendant 9 jours, sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours); durée totale du geste 1-2 min. Chirurgie (incision cutanée latérale) : Injection de cellules tumorales dans le foie (1 fois) ou dans le rein (1fois) sur animaux sous anesthésie gazeuse ; durée du geste : 5 min. Imagerie : Injection en intra-péritonéale (i.p) du produit et Imagerie sous anesthésie gazeuse : 1fois/semaine, durée 30 min. Injection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Prélèvement de sang: 1 fois/souris sur souris anesthésiées ; durée du geste : 1-2 min. Chirurgie terminale sans réveil sur animaux sous anesthésie, durée 20 min.
Impact sur les animaux
L’injection par voie sous-cutanée cause un stress de courte durée et n’est pas connue pour engendrer des nuisances ou douleurs. Le gavage cause un stress et une gêne transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoires, risques d’infection et problème de cicatrisation. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 4 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes en vue de l’analyse de la réponse immunitaire et de l’angiogenèse
Remplacement
L’implication du système immunitaire dans la lutte anti-tumorale et le microenvironnement tumoral sont extrêmement complexes, et ne peuvent être reproduits en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à des modèles animaux qui développent des pathologies qui se rapprochent le plus physiologiquement possible de ceux retrouvés chez l’homme. Ces modèles sont fondamentaux pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements thérapeutiques. Ils sont un prérequis nécessaire avant le lancement d’essais cliniques chez l’homme.
Réduction
Certains paramètres expérimentaux ont déjà été déterminés par des études précédentes, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Un nombre d’animaux minimum pour constituer des groupes statistiquement significatifs a été déterminé. Ainsi pour les procédures n’impliquant pas de chirurgie, des groupes de 10 souris par point d’étude sont nécessaires. Pour les procédures impliquant de la chirurgie, des groupes de 12 souris par point d’étude sont nécessaires pour palier une éventuelle hétérogénéité de la réponse immunitaire après chirurgie et/ou d'éventuelles complications post-chirurgie. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les expérimentateurs effectuent un suivi bihebdomadaire des souris. Le vaccin et les différents traitements sont préparés dans des diluants compatibles pour des applications chez l’animal et ne sont pas connus pour être toxiques aux doses utilisées. Les prélèvements de sang et la chirurgie sont réalisés sur animaux sous anesthésie générale. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pré et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. L’alimentation des souris sera adaptée si besoin afin d’assurer leur hydratation et une prise alimentation: croquettes humidifiées, gel hydratant renouvelée 2 fois/semaine. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal idéal pour l’étude du système immunitaire au sein d’un organisme vivant. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car à cet âge là, le système immunitaire est entièrement développé et mature.
Développement de thérapies anti-cancéreuses CAR-Macrophages
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris immunodéficientes d'abord, puis des souris dont le système immunitaire a été remplacé par un système humain, reçoivent des tumeurs mammaires ou des tumeurs du cerveau. 280 souris au total vont être utilisées, 140 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 140 d'un niveau sévère. Une partie subit une chirurgie d'implantation dans un coussinet mammaire, l'autre une injection stéréotaxique dans le cerveau créant un gliome, avant de recevoir des macrophages génétiquement modifiés censés attaquer la tumeur. Le porteur décrit une échelle allant de la faiblesse de la queue à la paralysie complète et prévoit de tuer les animaux dès la paralysie des pattes arrière, les tumeurs étant ensuite prélevées pour analyse.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie pour le traitement des tumeurs solides, en utilisant des cellules immunitaires appelées macrophages. L’objectif est de surmonter les limitations actuelles des immunothérapies anticancéreuses, telles que la faible pénétration des cellules immunitaires dans la tumeur et l’immunosuppression induite par la tumeur elle-même. Les cancers sont souvent difficiles à traiter car les cellules cancéreuses peuvent échapper à l’attaque du système immunitaire. Ce projet propose d’utiliser des macrophages, un type de cellule immunitaire, qui seront modifiés pour mieux combattre les tumeurs. Ces macrophages modifiés seront capables de cibler et de détruire les cellules cancéreuses tout en résistant aux mécanismes de défense de la tumeur. Les macrophages seront modifiés pour exprimer un récepteur spécifique (CAR) qui leur permet de reconnaître et de cibler les cellules tumorales. Les macrophages seront reprogrammés pour adopter un comportement pro-inflammatoire, ce qui les rendra plus efficaces pour combattre les tumeurs et résistants à l’immunosuppression induite par les cellules tumorales. Nous nous appuyons sur nos travaux précédents qui ont démontré que l’inhibition des proprotéines convertases permettait de polariser les macrophages vers un profil pro-inflammatoire. Les souris seront utilisées pour tester cette nouvelle approche. Des souris immunodéficientes seront utilisées dans un premier temps, puis des souris avec un système immunitaire humanisé seront ensuite utilisées pour étudier les interactions entre les macrophages et les autres cellules immunitaires. Les souris recevront, sous anesthésie, des injections de cellules tumorales dans les régions mammaires et cérébrales afin de modéliser la croissance des tumeurs. La croissance des tumeurs sera suivie deux fois par semaine et tout signe de détresse ou de souffrance seront surveillés. Ensuite, nous allons introduire des macrophages modifiés, appelés macrophages CAR, qui sont conçus pour cibler spécifiquement les cellules tumorales et améliorer la réponse immunitaire grâce à leur reprogrammation pro-inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait représenter une avancée majeure dans le traitement des tumeurs solides, offrant une nouvelle option thérapeutique aux patients. En améliorant la capacité des macrophages à pénétrer les tumeurs et à rester actifs malgré l'environnement immunosuppresseur, cette recherche pourrait conduire à des traitements plus efficaces et moins invasifs.
Procédures
Les animaux de la procédure expérimentale 1 seront soumis à une seule chirurgie au niveau de la zone d'implantation tumorale (4° coussinet adipeux), cette chirurgie permettant l'implantation des cellules tumorales. Les animaux de la procédure expérimentale 2 seront soumis à une seule neurochirugie par voie stéréaotaxique au niveau de la zone d'implantation tumorale. Les macrophages modifiés seront injectés dans les souris pour cibler les tumeurs.
Impact sur les animaux
Les symptômes attendus sur les animaux sont les symptômes neurologiques qui ont été évalués avant par des scores neurologiques modifiés comme suit : grade 0, absence de symptômes; grade 1 (légers),faiblesse de la queue ou paralysie de la queue; grade 2 (modérés), paraparésie des pattes postérieures ou hémiparésie; grade 3 (sévères), paralysie des pattes postérieures ou hémiparalysie; et grade 4 (très sévères), paralysie complète (tétraplégie), stade moribond ou décès. Mais dans notre projet, tous les animaux seront euthanasiés dès l’apparition de symptômes de grade 3. Les animaux seront observés tous les jours pour l’apparition des symptômes. Les symptômes tels que la douleur et la détresse seront atténués par l’anesthésie et l’administration d’analgésiques. Pour les deux modèles (mammaires et cérébrales), tout signe de souffrance (prostration, isolement, perte de poids supérieure à 20% du poids corporel initial) sera scruté et fera l’objet d’un suivi scoré, tout animal présentant un de ces signes sera mis à mort. Les injections de macrophages peuvent induire des réactions inflammatoires locales au site d'injection et des effets systémiques modérées liés à l'activation immunitaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement pour détecter ces effets, et une euthanasie sera pratiquée dès l'apparition de symptômes sévères.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les souris seront soumises à une euthanasie, et des prélèvements des tumeurs mammaires et des gliomes seront ensuite réalisés pour des analyses par cytométrie en flux et immunofluorescence.
Remplacement
Avant d’envisager toute expérimentation in vivo, nous avons exploré les alternatives non animales disponibles et évalué leur pertinence par rapport aux objectifs du projet. L'efficacité des macrophages CAR a d'abord été testée in vitro sur des lignées cellulaires en 2D, puis ex vivo sur des modèles organoïdes 3D, reproduisant plus fidèlement l’environnement tumoral. Ces expériences ont permis de déterminer que la furine est l'enzyme la plus efficace pour réactiver les macrophages et ont optimisé le multiplicity of infection (MOI) nécessaire pour générer des macrophages CAR fonctionnels, capables de reconnaître et d’éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats valident la pertinence de poursuivre par des études in vivo, indispensables pour évaluer l’efficacité et la sécurité des macrophages CAR dans un microenvironnement tumoral complexe,et pour affiner le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Réduction
Au cours de la rédaction des protocoles in-vivo, une analyse biostatistique a été effectuée afin de définir le nombre idéal des animaux, qui sera utilisé en conjonction avec la crédibilité des résultats obtenus. Le nombre de souris sera réduit le plus possible afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs (lots de 10 animaux par condition). Le projet fait appel à différents modèles expérimentaux, dont des modèles cellulaires en trois dimensions qui ont permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. La validation de ces conditions expérimentales ne peut se faire qu’in vivo pour rendre compte de l’efficacité du traitement dans un système biologique complexe.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront optimisées pour minimiser le stress et la douleur. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et des analgésiques seront administrés pour gérer la douleur post-opératoire. Les animaux seront surveillés de près pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance, et des critères stricts d'euthanasie seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile. Les techniques et protocoles utilisés seront continuellement évalués et améliorés pour assurer le bien-être maximal des animaux. Les conditions de vie seront améliorées au maximum.
Choix des espèces
C’est une espèce classiquement utilisée en cancérologie dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. Des tests de macrophages CAR sur les modèles souris ont déjà été publiés précédemment. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 8 semaines. Pour les souris humanisées, nous utiliserons des souris âgées de 21 semaines (16 semaines après humanisation).
Étude préclinique des anticorps anti-PD1 sur les lymphomes T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 079 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Greffées avec des cellules tumorales prélevées sur des patients atteints d'un lymphome cutané, elles subissent une prise de sang par semaine sous anesthésie jusqu'à leur mort, une injection de cellules immunitaires humaines, puis un anticorps anti-PD1 chaque semaine pendant un mois. La mise à mort intervient quand la tumeur atteint le volume maximal toléré, ou six semaines après le traitement si la tumeur ne se développe pas. Le porteur écrit que la croissance tumorale "ne semble pas induire de souffrance pour l'animal" jusqu'à cette limite.
Objectifs
Les lymphomes T périphériques représentent un large groupe d’hémopathies malignes issus de lymphocytes mature T. Nous nous intéressons particulièrement au syndrome de Sézary, un lymphome T lymphome cutané rare, caractérisé par une prolifération maligne des lymphocytes T dans la peau. Il représente environ 3 % des lymphomes cutanés des cellules T. Cependant, le pronostic est généralement défavorable, avec un taux de survie moyen de 2 à 4 ans après le diagnostic. Des tests préliminaires in vitro ont démontré que des anticorps anti-PD1 sont capables de recruter les cellules immunitaires pour induire la mort des cellules tumorales. Cette preuve de concept in vitro nous a permis de conclure que l’anticorps anti-PD1 permet de détruire les cellules tumorales par un recrutement des cellules immunitaires. Pour passer en phase préclinique, nous devons tester cet anticorps anti-PD1 sur des souris. Nous utilisons un modèle de souris immunodéficientes, sans système immunitaires pour permettre la prise des greffes de tumeurs. Ensuite, nous allons injecter l’anticorps anti-PD1 et des cellules immunitaires humaines. Ce duo nous permettra de tuer les cellules immunitaires. Ce projet permettra de montrer l’efficacité de ce nouveau traitement contre les lymphomes T exprimant la cible PD1 et d’ainsi obtenir un traitement possible contre les lymphomes T.
Bénéfices attendus
Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes à cellules T dont le syndrome de Sézary. Les lymphomes à cellules T sont des maladies rares avec peu de traitements efficaces sur le marché. Ce projet nous permettra de démontrer la preuve de concept des anticorps thérapeutiques anti-PD1 sur un modèle de souris patient-derived-xenograft (PDX). Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Procédures
Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous ferons des prises de sang toutes les semaines sur des souris anesthésiées (conformément aux recommandations) pour réduire leur souffrance. Les souris auront des prélevments de sang jusqu'à la mort de la souris une fois par semaine. De plus, les souris subiront une injection de cellules immunitaires au dès qu'elles auront des cellules tumorales dans le sang. Elles seront alors traitées une fois par semaine par injection intraveineuse d'anti PD1 pendant 1 mois sur souris endormie. Ainsi une fois par semaine, pendant la phase traitement (1mois) , les souris seront anesthésiées et auront un prélevement de sang et un traitement anti-PD1 par semaine.
Impact sur les animaux
Nous allons injecter des cellules tumorales et des cellules immunitaires en intrapéritoénale sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provoquera une douleur modérée. Nous mettrons à mort les souris sous anesthésie.
Devenir
Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de souffrance pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.
Remplacement
Il a été démontré en culture cellulaire, que l’anticorps anti-PD1 pouvaient induire la mort de cellules tumorales en recrutant les cellules immunitaires. Nous devons donc maintenant tester cet anticorps dans notre modèle PDX in vivo. Cela nous permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de cet anticorps et sa capacité à induire une forte régression tumorale. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Réduction
Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet de l’anticorps anti-PD1. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests. De plus, nous voudrions tester cet anticorps anti-PD1 sur 7 modèles de PDX pour voir l’efficacité de ce traitement sur différents profils mutationnels de lymphome T.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur , perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation des PDX, les souris seront anesthésiées. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.
Génération de lignées transgéniques de Cryptosporidium spp. sur souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Gavées une fois avec du bicarbonate de sodium, puis une fois avec une solution de parasites, 320 souris immunodéprimées voient leurs selles récoltées jusqu'au terme de la procédure, déclarée d'un niveau de souffrance léger. Certaines développent une diarrhée, un amaigrissement, une déshydratation et de la fatigue, au point d'être tuées avant la fin prévue. Le porteur juge le cas peu fréquent, les parasites transgéniques étant selon lui difficiles à générer et produits en nombre insuffisant pour déclencher des symptômes marqués. Il justifie le recours aux souris par une seule phrase, l'absence d'"alternative crédible", et toutes sont tuées après récolte des oocystes du parasite modifié.
Objectifs
Cryptosporidium spp. est un parasite qui provoque des maladies diarrhéiques chez les humains et les animaux, en particulier chez les jeunes enfants et le bétail. Cette infection, appelée cryptosporidiose, est un gros problème de santé publique et animale parce qu’elle rend beaucoup de jeunes enfants malades et réduit la productivité des élevages, notamment des ruminants comme les vaches. Malheureusement, il n’existe actuellement ni traitement spécifique ni vaccin efficace contre cette maladie. Nous comprenons encore mal comment ce parasite fonctionne. De nombreuses protéines et parties de ce parasite ne sont pas bien étudiées, ce qui rend difficile la découverte de nouveaux traitements. Pour mieux comprendre ces protéines, les chercheurs essaient de modifier génétiquement le parasite en laboratoire. Cela permet de mieux comprendre où ces protéines se trouvent dans le parasite, comment elles interagissent avec d’autres molécules, et quel rôle elles jouent dans l’infection. Cependant, il est difficile de modifier génétiquement ce parasite parce que son cycle de vie est complexe. Une partie de ce cycle inclut une phase de reproduction sexuelle, qui est nécessaire pour intégrer les modifications génétiques. Malheureusement, les modèles de laboratoire actuels ne permettent pas à ce parasite de se reproduire sexuellement de manière efficace, ce qui complique la création de parasites génétiquement modifiés. Le projet en question vise à surmonter ces obstacles en créant des parasites transgéniques, c’est-à-dire des parasites dont les gènes ont été spécifiquement modifiés pour mieux comprendre le rôle des protéines qu’ils produisent. En identifiant les protéines essentielles à la survie et à la virulence du parasite, les chercheurs espèrent découvrir de nouvelles cibles pour des traitements ou des vaccins contre la cryptosporidiose, ce qui pourrait conduire à des stratégies de prévention et de traitement plus efficaces.
Bénéfices attendus
Beaucoup de choses restent a élucider concernant la biologie de Cryptosporidium spp., un parasite responsable de maladies graves. Ces questions concernent des aspects très basiques, comme le rôle de certaines parties du parasite, la façon dont il choisit ses hôtes qu’il s’agisse d’humains ou d’animaux), comment il parvient à entrer dans les cellules, et les effets à long terme de la maladie, notamment chez les enfants. On ne connaît pas non plus la fonction de la plupart des protéines que produit ce parasite. Étant donné que la cryptosporidiose touche à la fois les humains et les animaux, avec des conséquences importantes sur la santé et l’économie, et qu’il n’existe actuellement ni traitement ni vaccin efficace, il est essentiel de faire avancer la recherche sur ces sujets. Le but est de découvrir des cibles potentielles pour développer de nouveaux traitements ou vaccins. Ce projet vise donc à identifier des protéines et des mécanismes clés dans la biologie du parasite et dans le développement de la maladie, afin de trouver de bonnes cibles pour de futurs vaccins et traitements.
Procédures
Les animaux serons gavés avec un petit volume, de bicarbonate de sodium une fois, puis une solution de parasites une fois. Le reste de la procédure consiste a récupérer les selles. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent développer de la diarrhée, avec amaigrissement, déshydratation et fatigue, pouvant mener à la nécessité de sacrifier l’animal avant la fin de la procédure. Néanmoins, il n’est pas attendu que ceci arrive dans une majorité de cas, les parasites transgéniques étant en général difficiles à générer et en un nombre insuffisant pour provoquer des symptômes importants.
Devenir
Animaux infectés avec des pathogènes animaux et humains transgéniques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative crédible a l’utilisation d’animaux pour la génération de Cryptosporidium transgénique en l’état actuel des connaissances.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu sur 5 ans correspond au minimum envisageable pour la génération d’un nombre suffisant de parasites transgéniques si le nombre de souches transgéniques générées est atteint.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies correspondant au standard recommandé pour l’espèce. La procédure en tant que telle n’a qu’un impacte très limité sur le confort des animaux pendant de courtes périodes.
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées sont les modèles les plus petits et les plus pratiques sur lesquels il a été possible de générer expérimentalement des souches de Cryptosporidium transgéniques à ce jour. Il n’existe par ailleurs pas d’alternative aux modèles animaux dans ce but. Pour la génération d’oocystes : les animaux seront utilisés à plus de 3 semaines d’age. Il n’a pas été démontré qu’un age était plus favorable à la génération d’oocystes qu’un autre, et lever toute limite d’âge permet de d’éviter d’avoir a sacrifier des animaux n’ayant pas généré de parasites transgéniques. Pour l’élevage : L’âge minimal pour l’accouplement est de 6 semaines pour les femelles et de 7 semaines pour les mâles. L’âge maximal suggéré avant le premier accouplement est de 10 semaines, dépassé cet âge la capacité reproductrice diminue. Les mâles seront utilisés jusqu’à l’âge de 7 mois, après quoi leur capacité reproductrice diminue. Les femelles seront retirées après 6 portées ou à l’âge de 8 mois (le 1er critère atteint) ou après une baisse significative de production.
Evaluation par imagerie de l’état de la barrière sang-cerveau après traitement par un anticorps chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Issues d'un élevage de souris génétiquement modifiées dont la totalité des naissances est utilisée, y compris celles qui ne portent pas la mutation et deviennent des témoins, 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 12 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Elles subissent une biopsie de la queue pour génotypage, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, jusqu'à trois injections intraveineuses et deux séances d'anesthésie gazeuse d'une heure. L'objet est de suivre par imagerie l'ouverture puis la refermeture de la barrière sang-cerveau provoquée par un anticorps. Le porteur affirme que la complexité de cette barrière ne peut pas être répliquée in vitro, sans dire ce qui a été tenté.
Objectifs
Le cerveau est un organe sensible aux contaminants chimiques ou biologiques éventuellement transportés par le sang. Afin de le protéger, les vaisseaux sanguins du cerveau sont plus imperméables que ceux du reste du corps et leur paroi forme une véritable barrière. D'un autre côté cette barrière représente un véritable obstacle à l'utilisation de médicaments pour traiter les maladies se développant dans le cerveau, comme les maladies neurodégénératives ou les cancers du cerveau. Certaines stratégies thérapeutiques, bien qu'efficaces pour les organes périphériques, échouent pour les maladies du cerveau car les médicaments ne peuvent atteindre leur cible intracérébrale. L'ouverture de la barrière sang-cerveau de manière ciblée, contrôlée et temporaire, pourrait ouvrir des perspectives énormes pour des maladies jusqu'ici incurables. Un anticorps thérapeutique a été développé récemment le permettant. Son développement nécessite cependant des méthodes précliniques pouvant être utilsées dans le futur chez les patients de manière à suivre précisément l'ouverture et la bonne refermeture de cette barrière. L'imagerie médicale non invasive permet ce suivi. Le but de ce projet est l’étude par imagerie médicale chez la souris de l’ouverture de la barrière sang-cerveau induite par un anticorps thérapeutique.
Bénéfices attendus
De nombreuses stratégies thérapeutiques efficaces sur cellules ex vivo ou in vivo sur les organes périphériques sont impossibles pour le traitement de maladies cérébrales, telle que alzeihmer ou les cancer du cerveau à cause de la barrière sang-cerveau. Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le fonctionnement de cette barrière, valideront la stratégie permettant de l'ouvrir temporairement et de façon contrôlée et permettrons la mise au point d'une méthode d'imagerie médicale pouvant être, en cas de succès, utilisée en clinique. Ce projet et ces études sur la barrière sang-cerveau pourront permettre à plus long terme de comprendre comment soigner des maladies cérébrales jusqu'ici incurables.
Procédures
Un premier groupe de souris subira : Anesthésie gazeuse (maximum 1h) 1X par animal, Injection intraveineuse anesthésié (
Impact sur les animaux
Au cours des injections, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort à cause de la manipulation, ainsi qu'une douleur légère et de courte durée lors des injections. Un stress léger et de courte durée peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale qui nécessitent manipulation et anesthésie. Les biopsies caudales pour génotypage, c'est à dire identification des animaux porteurs d'une mutation nécessaire à cette étude, entraînent une nuisance légère et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
La complexité de la barrière sang-cerveau et les effets globaux que son ouverture entraine ne peuvent pas être totalement répliqués in vitro. De plus, la procédure d'ouverture de la barrière sang-cerveau et les méthodes d'imagerie non invasive testées dans ce projet sont des méthodes thérapeutiques et d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été determinés et les resultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum, mais sera suffisant pour conclure de manière robuste au succès ou non de notre étude. En ce qui concerne les animaux transgéniques élevés, nous utiliserons tous les animaux de l'élevage car les souris ne portant pas la mutation d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs.
Raffinement
Pour le génotypage, c’est-à-dire l’identification, des souris génétiquement altérées modèles, nous utilisons une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les méthodes d'imagerie que utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Durant les anesthésies, les souris seront chauffées, leur rythme respiratoire surveillé et du gel oculaire leur sera appliqué pour éviter le déssèchement des yeux. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Cette étude de l'ouverture de la barrière sang-cerveau par imagerie médicale non invasive a pour but d'améliorer l'administration de médicament au cerveau. Cette barrière est contrôlée par les mêmes protéines chez l'homme et la souris. Par ailleurs il existe chez la souris des lignées transgéniques avec des mutations impliquées dans le contrôle de la barrière sang-cerveau permettant de mieux comprendre ce phénomène. Les souris transgéniques seront identifiées à 3 semaines. Pour les procédures expérimentales, des souris adultes seront utilisées.
Evaluation d’une thérapie génique dans un modèle murin du syndrome de Rett
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une souris dont l'état se dégrade est retirée du protocole et tuée avant le test. 216 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral par voie intraveineuse ou rétro-orbitale, puis passent trente-deux heures d'enregistrement de leur activité, deux sessions de rotarod, un test de barre crantée, un test de reconnaissance d'objet, et une injection d'agent convulsivant dont la latence et la sévérité des crises sont mesurées. Le porteur cherche à montrer qu'une thérapie génique corrige les signes du syndrome de Rett chez la souris, preuve de concept qu'il présente comme l'étape "indispensable" avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. La pathologie touche essentiellement les filles, rarement les garçons qui eux meurent d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par édition du génome pour corriger le gène muté responsable de la pathologie. Afin d'envisager cette approche thérapeutique, nous avons caractérisé au préalable trois modèles de souris portant des mutations dans ce gène, représentatives de la pathologie humaine, plus spécifiquement dans le domaine du comportement et de la cognition. Cette caractérisation et compréhension des modèles dans nos conditions nous a permis de sélectionner le modèle le plus pertinent pour évaluer une approche de thérapie génique. En parallèle, nous avons développé un vecteur viral AAV (Adeno-Associated Virus) pouvant être injecté par voie intraveineuse périphérique et capable de passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace afin de cibler les cellules portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie, et ainsi aboutir à leur correction par édition du génome.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept in vivo qu'une approche thérapeutique par thérapie génique permet de corriger les signes cliniques du syndrome de Rett dans un modèle murin, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de cette pathologie, contre laquelle il n'existe aucun traitement curatif à ce jour.
Procédures
Injection par voie intraveineuse caudale AMENDEMENT: par voie rétro-orbitale (durée 2-3 minutes) ; activité circadienne pour suivre l'activité locomotrice, ainsi que la consommation en eau et en nourriture durant un cycle complet jour-nuit (durée 32h); test de coordination (rotarod) (2 sessions de 15 minutes); barre crantée: test proprioceptif dépendant de la coordination motrice et de la fonction vestibulaire (10 minutes); test de reconnaissance d'un nouvel objet pour évaluer la cognition (30 minutes); test de susceptibilité aux crises épileptiques (durée du test: 20 minutes), après injection par voie intrapéritonéale d'un agent convulsivant( durée d'injection: 5 sec); le suivi du poids des animaux (1X/semaine, à partir de 3 semaines jusqu'en fin d'étude à 7 semaines d'âge).
Impact sur les animaux
La mutation dans le gène responsable de la pathologie induit une mortalité précoce des animaux, avec une médiane de survie de 9 semaines chez les males porteurs de la mutation. Ceux-ci peuvent notamment présenter les symptomes suivants à 6-8 semaines d'âge: hypoactivité, diminution du poids, diminution de la température corporelle, déficit dans la coordination motrice, démarche anormale, déficits cognitifs, et susceptibilité accrue aux crises épileptiques. Les femelles qui portent la mutation ne manifestent des défauts que vers l'âge de 9 mois (déficits moteurs, faible capacité à construire des nids) et peuvent survivre au-delà de l'âge de 1 an. Dans le cadre de notre projet, les femelles seront euthanasiées avant l'âge de 9 mois où commencent à apparaitre les symptomes. Au cours du test de sensibilité aux crises épileptiques par injection d'un agent pro-convulsivant, des crises convulsives peuvent survenir à différents degrés de sévérité; la durée, la latence et la sévérité sont enregistrées. Des effets indésirables sont également liés à l'injection de vecteurs AAV par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences, avant l'apparition du phénotype dommageable.
Remplacement
L'objectif de cette étude est d'évaluer une approche thérapeutique dans un modèle de souris portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett, représentative de la clinique humaine. Il s'agit en particulier d'étudier la correction des phénotypes comportementaux, de déficit intellectuel et de susceptibilité aux crises épileptiques. Des études in vitro ont été réalisées au préalable afin d'évaluer cette approche dans des modèles de cellules neuronales en culture, ainsi que dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes de patients et dans des organoides cérébraux, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser la correction des symptômes de la maladie de Rett, et ainsi de valider l'effet thérapeutique par la correction du gène, étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 60 mâles portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett représentative de la clinique humaine: 30 seront traités par injection d'un vecteur viral permettant de corriger le gène muté pour évaluer l'approche thérapeutique, 30 ne seront pas traités. Ce nombre de souris tient compte d'une probabilité de perte des animaux au cours de l'étude en raison de la mortalité précoce associée à la mutation, tout en permettant d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin d’améliorer leurs conditions de vie, elles seront ainsi stabulées dans des conditions optimales pour l’espèce : en groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de "nestlets" ou de maisonnettes en carton. Pour pallier au risque de diminution de la température corporelle, nous augmenterons le nombre de "nestlets"dans les cages. En cas de difficultés motrices, de la nourriture en gel sera ajoutée dans les cages. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Les manipulations et gestes brusques seront limités pour éviter de déclencher des crises d'épilpesie. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal. Le type de croisement choisi pour monter les cohortes expérimentales (femelles hétérozygotes X mâles qui ne portent pas la mutation) permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer les cohortes et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs, ceux-ci développant des symptômes pathologiques à 6-8 semaines, avec une survie limitée à environ 9-10 semaines. Les femelles hétérozygotes ne présentent, quant à elles, des symptômes qu'à partir de l'âge de 9 mois; elles seront euthanasiées avant cet âge afin de ne pas maintenir des animaux avec un potentiel phénotype dommageable.
Choix des espèces
Le modèle souris portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie permet de reproduire les symptômes de la maladie de Rett observés en clinique humaine. Il permettra ainsi d'évaluer un traitement par thérapie génique et de suivre la correction des phénotypes. Les études précédentes nous ont permis de définir un âge maximum de 8 semaines pour réaliser les tests comportementaux, avant que les animaux n'expriment un phénotype dommageable entrainant leur mort. Par ailleurs, nous savons qu'il faut un délai de 3-4 semaines entre l'injection des vecteurs AAV et une expression efficace des transgènes. Nous utiliserons ainsi des animaux âgés de 3 semaines pour réaliser les injections par voie intraveineuse du vecteur AAV, suivi de l'évaluation de la correction du phénotype à l'aide de tests comportementaux et de cognition à 6-7 semaines d'âge (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptômes du syndrome de Rett).
Rôle des protéines de la membrane basale et des récepteurs transmembranaires dans le développement et la maturation de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent jusqu'à dix administrations par gavage ou par piqûre au cours de leurs quatre premières semaines de vie, avant d'être tués à des âges échelonnés de deux à vingt-huit jours. 3 155 souris vont être utilisées, 2 995 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 160 d'un niveau sévère. Le porteur qualifie chacun des produits administrés de "non toxique et non irritant" et ramène la nuisance à "une gêne d'une courte durée", tout en attendant diarrhées, déshydratation et variations de poids. Une partie des animaux appartient à une lignée qui développe une dystrophie musculaire congénitale et perd l'usage des pattes arrière, et toutes sont tuées pour analyses post-mortem.
Objectifs
L’intestin est composé de plusieurs couches : l’épithélium, la membrane basale et le tissu conjonctif. L'épithélium est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile qui se trouve à l’intérieur de l’intestin. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets, tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité de l’organe, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en une semaine (ce qui en fait l’organe le plus régénératif du corps). L'épithélium recouvre des protubérances en forme de doigts qui s'étendent à l’intérieur de l’intestin (appelées villosités) et des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif (appelées cryptes). Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire (avant la naissance), les principaux changements morphologiques, tels que l'invagination des cryptes ou le début de la migration cellulaire, ne se produisent qu'au cours de la période postnatale (après la naissance), de même que la maturation des cellules épithéliales, qui est cruciale pour la capacité à digérer des aliments solides après le sevrage. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM) par l'intermédiaire de récepteurs spéciaux (intégrines). Celle-ci est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un soutien structurel à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient leur orientation. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme et change au cours de la vie et également lors de la survenue de maladies. Le rôle joué par la composition de la BM dans le comportement et la maturation des cellules épithéliales reste inexploré. Dans ce projet, nous visons à évaluer comment certaines des protéines qui composent la membrane basale, et les récepteurs que les cellules utilisent pour se fixer à celle-ci, influencent le comportement et la maturation des cellules au cours du développement.
Bénéfices attendus
Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.
Procédures
Une première cohorte d’animaux sera divisée en 5 groupes à des stades précoces du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 4 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 2 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un cinquième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis Une seconde cohorte d’animaux sera divisée en 4 groupes à des stades avancés du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 8 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 2 temps différents - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous utiliserons plusieurs modèles de souris dont la lignée Lama2-dyw (perte de la protéine Lama2 dans la membrane basale). Un modèle inductible qui limiterait la mutation au système gastro-intestinal n’existe pas actuellement. Les animaux Lama2-dyw développent une dystrophie musculaire congénitale lors des premières semaines après la naissance. L’espérance de vie pour ce modèle est de 8 à 14 semaines, ici nous l’utiliserons seulement jusqu’à 4 semaines maximum. Jusqu’à cet âge, les animaux sont attendus plus petits que les animaux témoins (qui ne développent pas la maladie) mais ne subissent aucune perte de poids. Ils peuvent montrer des difficultés à se mouvoir dû à une faiblesse musculaire au niveau des membres postérieurs. Lorsque c’est possible, nous utiliserons un modèle de souris inductible où la mutation peut être limitée au système gastro-intestinal. Dans ce cas là, les animaux vont recevoir différents traitements (produits non toxiques et non irritants) par gavage orale ou par une piqûre. Les nuisances attendues sont donc une gêne d’une courte durée au point d’injection ou dans la gorge. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphe, neurones, muscles, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L’objectif principal de ce projet étant d’identifier la régulation de la membrane basale (BM) sur l’homéostasie et le développement de l’intestin, la réduction au système in vitro seulement pourrait nous empêcher d’identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l’intestin. L’objectif du projet est d’identifier le rôle des protéines dans la régulation de la BM et de déterminer comment la BM est impliquée dans les problèmes digestifs (maladie ou cancer). Cependant, le rôle de la BM dans l’intestin pourrait être secondaire à son effet sur le système musculaire ou sur le système neuronal. Nous aurions besoin d’un modèle murin pour identifier les différents composants affectés par l’absence de protéines, et comment ces autres systèmes affectent le petit intestin. Nous utiliserons des organoïdes et des explants de tissus en supplément, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n’existe aucun moyen de reproduire la membrane basale (sa composition et sa structure) in vitro, mais seulement certains de ses composants de base (en fonction de notre protéine d’intérêt elle est ou non présentes dans la culture in vitro). Pour l’utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d’organoïdes provenant des mêmes souris d’intérêts et contrôles pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour diminuer le nombre d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l’échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée aux caractéristiques similaires. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d’animaux de tous les génotypes d’intérêts. Plusieurs types d’analyses seront effectués sur la même souris. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les femelles gestantes seront séparées 2 à 3 jours avant la mise à bas pour le bon déroulement de la procédure Pour réduire et limiter le stress, aucun changement de cage ne sera effectué pendant la première semaine suivant la naissance. De plus, la mère sera manipulée avant les jeunes, afin d’incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon de la part de la mère. La bonne manipulation des jeunes par la mère sera vérifiée. Pour les animaux développant la dystrophie, ils seront monitorés tous les jours (week-end compris) et auront à disposition de la nourriture et de l’eau accessible directement au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire. L’espérance de vie des animaux atteints de cette maladie est de 8 à 14 semaines, ici nous les utiliseront maximum à 4 semaines (P28) donc nous n’effectuerons pas de sevrage (normalement à P21) afin de faciliter le développement jusqu’à la mise à mort. Pour tous les animaux, une grille de score est établie pour évaluer l’état des animaux de façon objective.
Choix des espèces
Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen approprié reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l’Homme, tant au niveau génétique qu’au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l’organe, font qu’il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l’Homme. Enfin, la disponibilité d’une variété d’outils génétiques, ainsi qu’un assemblage complet et annoté du génome, de même qu’une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet et même le seul modèle animal disponible puisqu’il n’existe pas encore d’autres modèles utilisables pour cette étude. Nous utiliserons des souris âgées de P2, P7, P14, P21 et P28 (P = jour après naissance) pour évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement de l'intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change radicalement, et nous testerons l'implication de la membrane basale dans la régulation de ces changements. De plus, nous utiliserons des stades précoces du développement pour déterminer le rôle de la protéine durant l’embryogénèse à E13,5, E15,5 et E18,5 (E = jour après fécondation) en utilisant des souris adultes gestantes. Enfin nous utiliserons des souris adultes pour étudier le rôle de nos protéines d’intérêts, soit entre 8 et 16 semaines pour avoir un système gastrointestinal mature.
Techniques d’imageries expérimentales non invasives chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 200
Jusqu'à quatre-vingt-dix administrations de traitement en trois mois, neuf séances d'imagerie de quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie et douze prélèvements sanguins par animal : 3 600 souris et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever sang, tumeur et organes. Certains reçoivent une greffe tumorale, et les séances d'imagerie peuvent être précédées d'une mise à jeun de quinze heures. Le laboratoire vend ces prestations d'imagerie et de radiothérapie interne à des équipes extérieures, en mettant en avant des équipements "équivalents voire supérieurs" à ceux de l'imagerie humaine. Une partie des souris est immunodéprimée pour faciliter la prise des greffes de tumeurs humaines, d'autres sont génétiquement modifiées pour développer les pathologies étudiées.
Objectifs
Le laboratoire prend en charge des projets scientifiques en proposant plusieurs techniques d’imageries expérimentales chez l’animal de laboratoire, avec des performances technologiques équivalentes voire supérieures à celles des équipements correspondants pour l’imagerie humaine. Des agents de contraste ou des radiotraceurs sont utilisables pour chacune des modalités, et se caractérisent notamment par leur capacité à marquer les espaces vasculaires et interstitiels, ou des évènements moléculaires et cellulaires spécifiques de pathologies (cancéreuses, cardiovasculaires, rénales, métaboliques, neurologiques). L’imagerie anatomique de scanner par rayons-X est en général choisie pour sa grande résolution spatiale. Elle apporte des informations structurelles dans les pathologies affectant le squelette. En effet, elle est largement utilisée pour étudier la structure et la densité osseuse chez les rongeurs. L’imagerie nucléaire permet-elle de l’imagerie fonctionnelle moléculaire et cellulaire et présente la sensibilité la plus importante pour détecter des tissus dont les caractéristiques métaboliques ou biologiques sont anormales. Elle permet de mesurer l’activité métabolique ou moléculaire d'un organe ou d’un tissu grâce à un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Cette approche d’imagerie est non invasive. Le laboratoire propose également la réalisation d’études théranostiques, c’est-à-dire de diagnostic couplé à la thérapie. En effet, une thérapie spécifique peut être envisagée de type chimiothérapie, immunothérapie, hormonothérapie ou bien encore le radiotraceur peut être thérapeutique (thérapie innovante appelée : radiothérapie interne vectorisée). Les études d’imageries pourront permettre de suivre l’efficacité de ces traitements. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir prendre en charge des études nécessitant de l’imagerie anatomique ou nucléaire, couplée ou non à de la thérapie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont a) de réaliser des études d'imageries innovantes et non invasives permettant d'utiliser moins d'animaux pour obtenir des résultats fiables b) d'utiliser ces résultats chez l'Homme pour proposer des thérapies classiques adaptées ou des thérapies très innovantes comme la radiothérapie ciblée qui détruit précisément les cellules malades tout en limitant les effets sur les tissus sains.
Procédures
Les animaux pourront avoir une greffe tumorale (sous anesthésie, 1 fois, 10 minutes). Les animaux seront suivis par imagerie non invasive (sous anesthésie, 3 fois par semaine maximum et au total 9 imageries possible sur tout le protocole, 90 minutes maximum). Ces imageries pourront être précédées d'une mise à jeun de 15h maximum. Ils pourront également suivre une thérapie (animal vigile ou anesthésié suivant la voie de thérapie, 90 fois maximum pendant 3 mois pour certaines administrations, quelques minutes, 24 fois maximum pour d'autres) avec un suivi par prélèvement sanguin (animal vigile, 12 fois maximum pendant 3 mois, quelques minutes). En fin d'étude un dernier prélèvement de sang sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer un phénotype dommageable pouvant entrainer une sensibilité accrue aux infections, ou des douleurs modérées ou une réduction de la mobilité. Les animaux seront soumis à des anesthésies (greffe, imageries) qui pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Ils pourront également ressentier de la douleur modérée et une perte légère de mobilité suite à la croissance des tumeurs greffées. L'administration des traitements pourront induire un stress aux animaux. Les injections intrapéritonéales et intramusculaires pourront induire une douleur légère au point d'injection. Les injections intraveineuse pourront induire une douleur légère au point d'injection et une irritation de la queue. Les administrations par voie orale pourront induire une irritation de l'oesophage et une fausse route dans de rares cas. Les traitements pourraient induire une perte de poids avec une altération de l'état général des animaux. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et un hématome dans de rares cas.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements pour analyse (sang, tumeur, organes).
Remplacement
Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.
Réduction
Ce projet nécessitera 3600 souris et 200 rats maximum sur les 5 ans d'autorisation. Ce nombre permettra de pouvoir conclure sur l'interêt d'un radiotraceur ou d'un traitement dans une certaine pathologie grâce à une bonne puissance statistique. Le nombre d'animaux a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.
Raffinement
Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes, ou batonnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettront de suivre le bien-être de l’animal. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse pour les actes techniques ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car les greffes de tumeurs humaines sont facilitées et validées sur ces animaux. Nous utiliserons également des souris avec un système immunitaire actif pour les greffes de tumeurs murines. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés suceptibles de développer certaines pathologies afin de les étudier grâce à l'imagerie. Nous utiliserons des rats pour réaliser des tests d'imagerie de radiotraceurs et ou produits de contraste sur des plus gros rongeurs. Les rats seront utilisés à l'âge de 12 semaines au stade de jeunes adultes et jusqu'à 17 semaines de vie maximum. Les souris seront utlisées à l'âge de 4 à 5 semaines au stade de jeunes adultes ou entre 1 et 3 mois de vie suivant le développement du phénotype le cas échéant. Le stade jeune adulte pour les rongeurs facilite la prise des greffes. Pour les lignées transgéniques, l'âge sera justifié par le développement du phénotype (entre 1 et 3 mois).
Atténuation du déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer par l’exercice physique : corrélats biologiques chez la souris modèle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, 900 souris porteuses d'une mutation qui reproduit la maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une chirurgie cérébrale d'une heure pour marquer les nouveaux neurones, d'autres un gavage suivi de quatre prélèvements espacés d'une heure, dont le porteur reconnaît que la douleur dure quelques jours jusqu'à cicatrisation. L'objet est de comparer l'effet d'un accès volontaire à une roue d'exercice selon qu'il commence à l'adolescence ou à l'apparition des troubles de mémoire. Les roues sont retirées la journée, et les trois tests comportementaux censés mesurer la mémoire ne sont pas nommés.
Objectifs
Le projet vise à étudier si l'exercice physique volontaire, pratiqué avant ou après le développement post-natal du cerveau, c’est à dire pendant ou après l’adolescence, déclenche des mécanismes biologiques différents et responsables d’effets bénéfiques sur le cerveau. Des données cliniques et épidémiologiques montrent que l'activité physique est une stratégie efficace pour promouvoir le vieillissement en bonne santé et ralentir le déclin de mémoire lié à certaines maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer (MA). L'exercice, tant chez les animaux que chez les humains, est une composante accessible de l’hygiène de vie. Il favorise un état anti-inflammatoire, améliore la fonction antioxydante et stimule la plasticité du cerveau. De plus, des facteurs sanguins sécrétés après l'exercice contribuent à son action neuroprotectrice : une étude a montré que le transfert de sang d'une souris active à une souris sédentaire imite les effets de l'exercice au niveau du cerveau, soulignant son effet systémique. Le microbiote intestinal, modifié par l'exercice, pourrait également jouer un rôle crucial dans la promotion de la santé. Comprendre quand et comment l'exercice retarde l'apparition de la MA est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Nous faisons l’hypothèse que la période de la vie durant laquelle l'activité physique est pratiquée a une influence sur les bénéfices engendrés pour prévenir ou ralentir le déclin de mémoire. Des données de la littérature suggèrent que comparé à l'exercice à l'âge adulte, l'exercice à l'adolescence affecte différemment les processus de mémoire et la plasticité du cerveau chez les rats adultes. Ainsi, nous examinerons d’abord si une activité physique volontaire à l'adolescence ou au début de l'âge adulte entraîne un effet optimal sur le ralentissement du déclin de mémoire dans le modèle murin de la MA, à l’aide de tests comportementaux. Ensuite, nous explorerons les changements biologiques (centraux et périphériques) induits par l'exercice, susceptibles d’engendrer des effets différents sur la mémoire, à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à fournir des perspectives complètes sur l’impact de l'exercice physique dans la maladie d'Alzheimer (MA) en utilisant un modèle murin. En comparant l’impact de l’activité physique initiée pendant l'adolescence ou au début des symptômes de la MA sur la mémoire, nous déterminerons la période de vie pendant laquelle l’activité sportive a un effet optimal. Les investigations moléculaires rechercheront des changements dans certains mécanismes cérébraux décisifs pour les processus de mémoire, qui sont affectés dans la MA et qui pourraient être rétablis par l’exercice physique. L’étude de marqueurs périphériques circulants permettra d’identifier des mécanismes spécifiques activés par l'exercice ayant pour effet de protéger le cerveau. L’analyse des changements du microbiote permettra d’établir des profils de présence et/ou absence de certains marqueurs (changement dans la proportion de bactéries, changement dans la perméabilité intestinale …) en fonction des différents groupes. Finalement, cette recherche vise à approfondir notre compréhension du décours et des mécanismes induits par l'exercice physique et permettant d’améliorer la résistance du cerveau malgré la MA, ce qui pourrait éclairer de futures stratégies thérapeutiques.
Procédures
Certains animaux auront un gavage oral qui dure 30 secondes. Ces mêmes animaux auront 4 prélèvements espacés de 1h chacun. Pour certains animaux, 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets. Pour limiter ce stress, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs expérimentaux. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Pour certains animaux, une injection sera réalisée par jour, pendant 4 jours consécutifs. La prise en contention et l’injection sont susceptibles de causer un stress léger, ainsi qu’une douleur légère qui dure environ 2 minutes. Finalement, certains animaux seront soumis à une chirurgie permettant de marquer des nouveaux neurones. Chaque chirurgie durera 1h maximum.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables peuvent être dus à l’activité physique qui peut induire une légère perte du poids. Aussi, la prise en contention des animaux est susceptible de causer un stress léger. Certains animaux recevront une substance par gavage oral. Cette procédure représente une nuisance légère pour l’animal en raison de l’insertion d'une sonde dans l'œsophage. Ces mêmes animaux, auront des prélèvements qui peuvent induire une douleur légère. Ces prélèvements sont répétés 4 fois, avec un intervalle de 1h entre chaque. La douleur due aux prélèvements dure quelques jours jusqu’à cicatrisation de la plaie. Ceci représente une nuisance modérée car les prélèvements sont réalisés juste après le gavage. Certains animaux seront évalués dans des tests comportementaux. Ceux-ci ne provoquent qu’un stress léger ou modéré pour les animaux. De plus, pour quelques animaux, des injections sont susceptibles de causer une légère douleur. Ceci représente une nuisance légère. D’autres souris seront soumises à une chirurgie. Des effets indésirables de cette procédure peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire ou une perte de poids. De plus, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant quelques jours. Ceci représente une nuisance modérée.
Devenir
A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses histologiques quantitatives.
Remplacement
Le projet a pour but d’évaluer, in vivo, l’impact de la période de la vie de l’animal (à l’adolescence ou au début des symptômes mnésiques à l’âge adulte) où l’exercice physique ralenti de façon optimale le déclin de mémoire associé à la MA. Un aspect important de ce projet est donc de pouvoir mesurer les capacités mnésiques des souris après l’exercice physique. Pour cela, un modèle animal est indispensable. De plus, nous allons étudier l’impact de l’activité sportive sur la physiologie de l’animal au niveau central (cerveau) et périphérique (sang, intestin…) où un dialogue et des interactions complexes se produisent entre le cerveau et les organes, des processus qui ne sont pas modélisables à ce jour.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n= 15) a été déterminé sur la base de nos études antérieures chez ce modèle murin et à l’aide de la littérature correspondante. Ce nombre est réduit au minimum pour permettre d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses statistiques nécessaires aux comparaisons intergroupes (8 groupes) et intra-groupes (comparaison des prélèvements à différents moments de la vie de l’animal). Ce nombre prend également en compte l’éventualité certains animaux ne montreront pas d’exercice physique volontaire en présence de la roue et seront donc retirés de l’étude. Ce nombre prend aussi en compte l’existence d’une variabilité inter-individuelle dans les études comportementales. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux seront testés dans plusieurs tests comportementaux et nous utiliserons les mêmes animaux pour les études comportementales et post-mortem.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 4 ou par 2 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu’une buchette pour l’enrichissement. Les roues d’exercice seront retirées pendant la période d’inactivité (la journée) pour encourager le repos des animaux. Pour limiter le stress lié au déplacement des souris vers de nouvelles pièces et à la mise en contact avec de nouveaux objets lors des tests comportementaux, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Une attention particulière sera portée aux souris pendant les périodes d’exercice physique où le poids sera surveillé 1 fois par semaine et comparé au poids de référence avant le début de l’activité sportive. De plus, les animaux seront suivis quotidiennement par des personnes formées au soin. Les critères évalués sont l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration), le comportement (posture, locomotion, réaction à la manipulation, isolement) et le poids (pesée une fois par semaine). Pendant les chirurgies, les animaux seront placés sur une couverture chauffante permettant de contrôler leur température corporelle. Un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil complet (déplacements spontanés dans la cage, prise d'eau et de nourriture) et 6 heures plus tard. Après l’opération, l’animal sera isolé dans une cage propre contenant du papier ; il sera maintenu au chaud en prêtant une attention particulière à son hydratation et son état sera contrôlé. Les souris recevront une injection d'anti-inflammatoire après la chirurgie et le lendemain pour éviter les éventuelles douleurs post-opératoires. La cicatrisation de la plaie sera également contrôlée dans les jours suivant la chirurgie.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utiliserons une lignée de souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée est l'un des modèles précliniques de MA les plus étudiés, en raison de l’évolution progressive de la pathologie, qui ressemble à ce qui est observé chez les patients atteints de MA. Les souris de cette lignée développent avec l’âge des plaques amyloïdes, comme chez le patient. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice physique à diverses périodes de la vie, sur le déclin de mémoire lié à l’âge dans la MA. Les animaux les plus jeunes inclus dans le projet auront 28 jours (P28) (soit plusieurs jours après le sevrage) et les animaux les plus vieux auront 10 mois (adulte). Nous allons évaluer l’impact de l’exercice physique sur le déclin de mémoire lié à la MA en fonction la période de vie à laquelle l’exercice est pratiqué : pendant le développement post-natal (P28) ou au début des symptômes cognitifs (à 6 mois). Ceci explique que des animaux jeunes mais sevrés (P28) soient nécessaires.
Elevage de souris modèles de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) de phénotype dommageable pour l’étude de l’implication des cellules microgliales/macrophages dans cette maladie.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Maintenir une lignée de souris qui perdent leur force musculaire puis se paralysent vers 165 jours de vie, pour approvisionner d'autres protocoles : 2 164 souris vont être utilisées, 2 044 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 120 d'un niveau sévère. L'acte déclaré se limite à une biopsie de la queue de deux minutes sur animal vigile, pour le génotypage. La sévérité tient au phénotype lui-même, qui touche la moitié des 2 160 souriceaux issus des accouplements prévus sur cinq ans. Les souris porteuses du génotype recherché passent en "utilisation continue" dans d'autres projets, les autres sont tuées, anciens reproducteurs compris.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave, caractérisée par la mort des motoneurones entrainant une paralysie et le décès des patients en 2 à 5 ans. Les cellules microgliales, macrophages du système nerveux central (SNC) sont activées au cours de différentes maladies neurodégénératives incluant la SLA. Ces cellules sont capables de sécréter des facteurs trophiques ou toxiques pour les motoneurones. La modulation de l’activité des cellules microgliales et des macrophages dans la SLA a montré des bénéfices et l’étude de ces mécanismes doit être poursuivie. Le modèle SLA de souris transgéniques à phénotype dommageable, permet d’étudier les phénomènes complexes liés aux cellules microgliales et macrophages et leurs interactions avec les motoneurones. L’utilisation de ce modèle animal est donc indispensable. Ce projet a pour but de maintenir cette lignée de souris transgéniques afin de fournir une quantité suffisante d’animaux pour étudier les rôles des cellules microgliales et macrophages dans la SLA.
Bénéfices attendus
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative actuellement incurable entrainant une paralysie progressive et la mort des patients en moyenne en 2 à 5 ans. La SLA touche 8000 personnes en France avec une prévalence de 4/100000 personnes. L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie dans un modèle de souris de SLA, en ciblant les macrophages, cellules immunitaires des tissus par différentes stratégies. Un bénéfice du remplacement des macrophages des souris SLA par des macrophages moins toxiques a été montré dans ce modèle. L’utilisation de molécules pharmacologiques pour moduler la réponse toxique des macrophages ou cibler des gènes spécifiques dans les macrophages pourrait donc être bénéfique et transférable en clinique. Notre hypothèse de cibler les macrophages permettrait de ralentir la progression de la maladie chez les souris SLA. Le modèle de souris utilisé est un modèle qui reproduit de façon relativement fidèle, les différents stades de la sclérose latérale amyotrophique chez l’homme. C'est donc un modèle très utile pour tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques et étudier les mécanismes cellulaires complexes qui conduisent à la dégénérescence des neurones moteurs.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (animal vigil, 2 minutes). Dans de rare cas, un reprélèvement à la queue pourra être réalisé (animal vigil, 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris auront : 1) Un prélèvements pour génotypage : biopsie caudale. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors de ces biospies. Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation. 2) Un phénotype dommageable entrainant la perte de force musculaire et la paralysie progressive de l'animal vers 165 jours de vie.
Devenir
Les animaux avec un génotype d'intérêt seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère. Les animaux passant dans les projets de recherche autorisés seront alors en utilisation continue. Les autres animaux sans génotype d'intérêt qui n'auront pas pu être utilisés dans d'autres projets seront euthanasiés par une méthode réglementaire adaptée à l'âge des animaux ainsi que les anciens reproducteurs. Les accouplements sont réalisés pour produire au maximum des animaux d'intérêt.
Remplacement
Nous avons déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester avant de passer à l’expérimentation sur le modèle de souris. Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles nos projets nécessitent l’utilisation de souris à phénotype dommageable modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).
Réduction
Nous utiliserons, dans ce projet, un nombre minimal d’accouplements pour pouvoir (i) obtenir ce nombre minimal d’animaux pour les projets associés et (ii) conserver les lignées qui ne se reproduisent que pendant un temps limité soit 120 mâles pour les 5 ans. Ces accouplements donnerons naissances à 2160 souriceaux pour le génotype invasif dont 50 pourcents qui seront à phénotype dommageable. Ainsi 2164 animaux seront utilisés pour ce projet (4 mâles fondateurs et 2160 descendants). Le nombre d'accouplements lancés est systématiquement revu en fonction du nombre d'animaux déclarés dans les projets de recherche. Les animaux sans génotype d'intérêt seront réutilisés en priorité (contrôles négatifs de nos études ou projets d'autres équipes de recherche ou projet de tutorat). Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien-être animal (SBEA). Ce projet étant un projet d'élevage, il n'y aura pas de tests statistiques réalisés. Les tests seront réalisés dans le cadre des projets expérimentaux autorisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés conformément à la réglementation avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour nuit 12h 12h, avec au maximum 5 animaux par cages. Chaque cage contient au moins deux éléments d'enrichissement : nid en carton et bâton à ronger. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Dès les premiers signes de paralysie, les mâles seront placés en cage avec litière de cellulose et des croquettes seront disposées au fond de la cage. Des points limites clairs sont mis en place pour limiter la souffrance des animaux. Les animaux sont vérifiés quotidiennement.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons, mouches, vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat. C’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Tous les souriceaux, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés entre l’âge de 15 jours et 3 semaines. Les souris mâles positives pour le gène d'intérêt sont utilisées au stade adulte (entre 50 et 130 jours pour la reproduction durant leur période de fertilité maximale). Les femelles positives entreront dans une procédure expérimentale entre leur 28eme et leur 50eme jour de vie car les souris sont sevrées à 28jours de vie au plus tard et doivent entrer en procédure avant 50 jours de vie (moment du début du suivi du développement de la maladie (stade présymptomatique).