Souris
Role de l’oxygène dans le processus de pathogénicité de Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage unique de Clostridioides difficile et une à deux injections intrapéritonéales, puis leurs selles sont recueillies chaque jour. Le porteur décrit des diarrhées de deux à trois jours et une perte de poids de 5 à 15 %, avec un retour au poids initial généralement observé trois jours après l'infection. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider in vivo ce que des tests in vitro ont déjà montré sur l'effet de l'oxygène sur la croissance de cette bactérie.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas des infections associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente» dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Il est donc urgent de mieux comprendre les différentes étapes de développement de la bactérie dans le tube digestif. Ces dommages intestinaux causés par C. difficile peuvent varier en fonction du niveau d'oxygène disponible dans le tube digestif. Dans ce projet, notre but est d’étudier l’influence de l’oxygène sur C. difficile et les troubles intestinaux induits par cette bactérie pathogène.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de pathogénicité de cette bactérie permettrait de développer et de proposer des stratégies thérapeutiques plus adaptées aux patients et limiter le risque de récidives et de dissémination de bactéries dans l'environnement.
Procédures
Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile (un gavage unique durant la procédure qui dure moins de 10 secondespar animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum) ce recueil dure moins d'une minute, sur la durée de l'essai.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile et 1 ou 2 injections intrapéritonéales (une automatique d’antibiotique et éventuellement une autre 2h avant l'euthanasie des souris prévue à J-7, J0 et J2). Cette 2ème injection intra-péritonéale est dépendante du kit commercial qui sera utilisé pour l'analyse des coupes histologiques. Dans la mesure du possible, nous privilégierons le protocole ne nécessitant pas cette injection. Les nuisances induites par ces injections sont qualifiées de légères. Suite à l’infection, le modèle peut induit des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui vairent entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection.
Devenir
Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro ont permis d'évaluer l'impact de l'oxygène sur la croissance de C. difficile. L'étape de vérification de ces résultats obtenus in vitro par un modèle in vivo est indispensable afin de tenir compte de l'environnement complexe du tube digestif et notamment le microbiote impliqué dans le taux d'oxygène présent. Le recours à l'animal est indispensable pour valider les résultats obtenus in vitro. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre maximun d'animaux utilisés au nombre de 384 , tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites définis éthiquement non acceptables.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Evaluation thérapeutique de virus oncolytiques seuls ou en combinaison avec une thérapie antitumorale dans des modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules tumorales, injectées jusqu'à trois fois d'un virus puis traitées cinq jours par semaine pendant trois semaines par une substance antitumorale, 7 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 848 d'entre elles et sévère pour 4 160. Le porteur décrit des ulcérations ou nécroses des tumeurs sur le flanc, des métastases pulmonaires entraînant des difficultés respiratoires et de l'ascite liée aux nodules abdominaux. Il s'agit d'évaluer des virus oncolytiques, seuls ou combinés à d'autres traitements, dans des modèles de greffe tumorale. Il affirme pourtant que seuls les virus ne risquant pas d'induire une souffrance seront testés, et prévoit de réutiliser jusqu'à 200 souris pour la formation de ses techniciens, les autres étant tuées.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer sur différents modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris l’activité antitumorale de nos virus candidats-médicaments seuls ou en combinaison avec des therapies antitumorales. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer la réplication du virus dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi de limiter sa toxicité. Avant d’être testés en modèles murins, les virus candidats ont été évalués sur des modèles alternatifs, notamment par culture cellulaire sur de nombreuses cellules tumorales établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales). Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif.
Bénéfices attendus
Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. A court terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 120 jours après l'administration du virus). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. Le développement de métastases pulmonaires peut entrainer une difficulté respiratoire. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans une grille de score.
Devenir
Les animaux supplémentaires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos techniciens en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation de maximum 200 animaux sur 5 ans pour la formation. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris inclues dans l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.
Réduction
La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux).
Raffinement
Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. De précédents dossiers déposés et apptouvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Seuls les virus ne risquant d'induire une souffrance chez l'animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton et tunnel de change) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. Les injections se feront sur animal vigile ou sous anesthésie et l'imagerie sur animal anesthésié. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Pour le prélèvement de sang terminal une anesthésie et une analgésie sont prévues. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.
Choix des espèces
Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 8 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).
Maintien d’une lignée murine exprimant dans les neurones inhibiteurs une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de l'oreille de dix secondes, une seule fois dans la vie de l'animal : c'est le seul acte technique infligé aux souris de ce projet. 470 souris vont pourtant être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère, et toutes seront tuées pour prélèvements. La souffrance tient à la lignée elle-même, maintenue par accouplements pour reproduire une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique. Un quart des souriceaux naissent avec un poids et une taille réduits et une force musculaire diminuée aux quatre membres, et la moitié d'entre eux meurent trois semaines après la naissance. Le porteur indique que ces symptômes ne sont pas encore complètement caractérisés et annonce des raffinements à évaluer au fur et à mesure, dont le nourrissage des souriceaux à la main.
Objectifs
Le gène qui nous intéresse est impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale. Ces maladies sont dites neurodégénératives, c’est à dire qu’elles sont caractérisées par une perte progressive des neurones, acteurs primordiaux des fonctions exercés par notre cerveau. Il existe une lignée de souris qui mime ces maladies en reproduisant la mutation du gène d’intérêt. Ces souris, comme les humains, présentent des défauts des neurones inhibiteurs. Ces neurones sont des cellules dont le rôle est de réduire (inhiber) l’activité des neurones environnants. Ils sont importants car ils contrôlent l’activité électrique du cerveau en l’empêchant d’être trop élevée. Actuellement, l'implication des neurones inhibiteurs dans le développement de ces maladies est trop peu comprise. Pour y remédier nous étudierons une lignée de souris dans laquelle le gène est muté spécifiquement dans les neurones inhibiteurs. Dans cette lignée, un quart des souris adultes présente des symptômes ressemblant à ceux observés chez les personnes atteintes de démence frontotemporale. En revanche, un quart des souriceaux a des symptômes qui ressemblent à ceux observés chez les personnes atteintes de sclérose latérale amyotrophique. Avec ce projet nous souhaitons maintenir cette lignée, c’est-à-dire réaliser des accouplements et nous occuper des petits qui naissent. Cela nous permettra de mieux caractériser et prendre en charge les symptômes des souriceaux. C’est particulièrement important puisqu’il n’existe toujours pas de traitement efficace contre la sclérose latérale amyotrophique. Cela est dû, notamment, à un manque de compréhension des mécanismes pathologiques. Ainsi, maintenir une lignée dont les souris présentent des symptômes similaires à ceux des humains nous permettra d’étudier les mécanismes impliqués.
Bénéfices attendus
Nous voulons tirer profit de ce projet pour mieux comprendre, caractériser et prendre en charge les symptômes des souriceaux. A court terme, maintenir la lignée permettra d’étudier les mécanismes impliqués dans l’apparition des symptômes, qui ressemblent à ceux observés chez les personnes atteintes de sclérose latérale amyotrophique. A long terme, l’étude de ces souris permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans la pathologie et pourrait permettre d’identifier des pistes thérapeutiques chez l’humain.
Procédures
Un prélèvement de tissus (petit bout d’oreille pour le génotypage) sera réalisé sur animal vigile une seule fois dans la vie de l'animal et durant très peu de temps (10 secondes).
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement du bout d’oreille pour le génotypage, une légère et brève douleur pourra être ressentie par l’animal. Par ailleurs, dans cette lignée de souris, un quart des souriceaux présente un phénotype dommageable. Ils ont un poids et une taille inférieurs à ceux des souriceaux contrôles (c’est-à-dire n’ayant pas de phénotype dommageable). Ils ont également une force musculaire réduite au niveau de leurs quatre membres. Les premières caractérisations de la lignée montrent que ces souris ont de courtes et transitoires baisses d’activité. Enfin, la moitié de ces souriceaux mutés décèdent trois semaines après la naissance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Avec ce projet nous souhaitons maintenir une lignée de souris dont une partie des animaux présentent des symptômes suite à la mutation d’un gène d’intérêt dans les neurones inhibiteurs. Cela nous permettra d’étudier l’implication de la protéine mutée et des neurones inhibiteurs dans le développement post-natal et, plus précisément, d’étudier les conséquences moléculaires, cellulaires et comportementales de la mutation d’intérêt. Nous ne pouvons pas étudier cela avec des cultures cellulaires car elles ne reproduiraient pas la complexité comportementale nécessaire pour étudier, notamment, la croissance et la prise de poids. La modélisation informatique nécessiterait des données expérimentales encore manquantes et ne nous permet donc pas, pour le moment, de répondre à nos questions scientifiques. Sachant cela, l’utilisation d’un organisme entier est alors nécessaire. Cependant, nous ne pouvons pas étudier la mutation d’intérêt chez l’humain car il faudrait étudier des stades très précoces où les patients ne sont pas encore diagnostiqués tout en s’assurant que le gène est muté uniquement dans les neurones inhibiteurs (ce qui n’est possible qu’avec une étude post-mortem). Finalement, aucune alternative ne permettrait de répondre aux questions posées dans ce projet. C’est pourquoi un modèle animal est nécessaire afin de reproduire à la fois la complexité structurelle du système nerveux et la complexité comportementale.
Réduction
Tous les animaux ayant un phénotype dommageable et naissant dans le cadre de ce maintien de lignée seront inclus dans des groupes expérimentaux et seront comparés à des souris contrôles (c’est-à-dire n’ayant pas de phénotype dommageable). Nous veillerons alors à générer le minimum d'animaux nécessaires à la constitution de ces groupes tout en produisant des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Nous aurons 470 animaux inclus dans le projet. La taille des effectifs a été établie grâce à l’expertise développée dans notre laboratoire, et en fonction des besoins techniques. Une fois les données récoltées, des tests statistiques seront utilisés pour assurer une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon les normes en vigueur concernant la taille des cages, le nombre d’animaux par cage, la température ambiante et les cycles de lumière. Les cages seront enrichies d’un nid de coton et de bâtonnets à ronger. Sur conseils vétérinaires, nous ne mettrons pas de maison en carton afin de pouvoir suivre les animaux sans forcément avoir besoin d’ouvrir la cage. Les symptômes que pourraient développer les souris ne sont pas encore complètement caractérisés, c’est pourquoi les animaux seront étroitement surveillé par le personnel de soin animalier et les expérimentatrices. Plus précisément, nous ferons attention au poids, à l'apparence physique (état de la peau et de la fourrure, position du dos) et aux éventuels changements de comportement (mobilité, sociabilité, motricité, respiration, prise alimentaire). Des points limites ont été établis afin de soustraite les animaux à la souffrance. Par ailleurs, nous mettrons en place des raffinements au niveau de la prise alimentaire, dont nous évaluerons l’efficacité et la pertinence au fur et à mesure du maintien de la lignée. Cela pourra inclure, mais ne se limite pas à, l’ajout d’aliments solides et humides placés directement sur le sol des cages, le nourrissage des souriceaux à la main pour s’assurer de la quantité ingérée.
Choix des espèces
Ce projet sera mené avec des souris, qui sont encore aujourd’hui l’un des modèles animaux les plus pertinents dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques : 1/ Ce maintien de lignée permettra l’étude d’un modèle génétique de maladies neurodégénératives, ce qui nécessite des modifications génétiques très précises (mutation d’un gène d’intérêt uniquement dans les neurones inhibiteurs). Or la séquence de ce gène est bien conversée entre les humains et rongeurs. 2/ Avoir une lignée pure, dont certaines caractéristiques génétiques sont stables, homogènes et utilisées dans les laboratoires du monde entier, permet de pouvoir comparer et reproduire des résultats. 3/ Les rongeurs présentent à la fois une complexité structurelle du système nerveux et une complexité comportementale ce qui nous permettra de comparer nos résultats à ce qui est observé chez les humains. L’étude commencera à partir du jour de la naissance de l’animal jusqu’à l’âge adulte.
Rôle de la mort cellulaire programmée dans le développement des circuits corticaux normaux et pathologiques du cerveau de souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les animaux utilisés sont pour partie des embryons encore dans l'utérus, des souriceaux de cinq à dix jours et des femelles gestantes. 2 952 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 820 d'entre elles et modéré pour 132. Les femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter un produit dans le cerveau des embryons et de leur appliquer un courant électrique d'une seconde. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et analyses génétiques, y compris les mères, et le bénéfice avancé se limite à mieux connaître une population de neurones qui disparaît normalement au cours du développement.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement du cerveau. Nous voulons également explorer les conséquences de la survie anormale de ces cellules sur la formation du cerveau.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la génération et la mort de nos neurones d’intérêt et quel est leur rôle dans le développement du cerveau.
Procédures
Les souriceaux des lignées subiront une biopsie à la queue pendant une contention de quelques secondes. Les femelles gestantes subiront une injection intrapéritonéale et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes et l'application d'un courant électrique de 1 seconde. Des animaux subiront une chirurgie terminale sans réveil.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue provoque une douleur légère. Les injections peuvent induire une douleur légère et brève. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance qui est minorée ou évitée par le traitement analgésique. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Pour le maintient des lignées génétiquement modifiées, nous nous limiterons à la production des animaux nécéssaires en limitant les accouplements au maximum. Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par nos expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors de la chirurgie les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. Une administration d'analgésique ou la mise à mort de l'animal est envisagée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. En effet, seuls les mammifères présentent un cerveau organisé en 6 couches inversées. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire où interviennent les phénomènes étudiés.
Procédures terminales dans le cadre d’études caractérisant les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les maladies métaboliques et cardio-vasculaires.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
10 325 souris vont être utilisées, chacune pour un prélèvement de sang de dix à trente secondes ou une chirurgie de quinze minutes sans réveil. 1 460 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 8 865 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger, et toutes finissent tuées pour prélèvement d'organes. Ce projet ne produit aucune donnée propre, il déclare des mises à mort transférées depuis un autre établissement, celui-ci disposant des équipements d'analyse des tissus. Les bénéfices annoncés, de nouvelles perspectives de diagnostic et de traitement du diabète, de l'obésité et des troubles cardio-vasculaires, appartiennent aux projets d'origine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de décrire les procédures génériques terminales ayant lieu dans cet Etablissement Utilisateur (EU), afin de transférer la mise à mort des projets déjà déclarés dans l’EU d'origine dans le présent EU. Ce dernier bénéficie de divers équipements indispensables à l’analyse des tissus prélevés et la sécurité des utilisateurs face aux risques chimiques. Les analyses de sang, tissus et cellules issus des prélèvements terminaux répondent aux problématiques décrites dans les différentes saisines. Ces problématiques visent, de façon imbriquée ou non, à étudier le rôle du système lymphatique, vasculaire, hépatique et du tissu adipeux dans les pathologies métaboliques.
Bénéfices attendus
Les procédures terminales définies dans ce projet vont permettre, à l’échelle des tissus adipeux, lymphatique, vasculaire et hépatique, la caractérisation des mécanismes physiopathologiques à l’origine de maladies métaboliques et cardiovasculaires telles que diabète, obésité, hépatopathies métaboliques, troubles cardio-vasculaires… Ces pathologies ont une prévalence élevée dans la population mondiale et ces travaux permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives médicales en terme de diagnostic et traitement.
Procédures
Un prélèvement de sang unique peut être réalisé avant la mise à mort des animaux (10 à 30 secondes), sur animal vigile ou anesthésié. Ils peuvent également subir une chirurgie sans réveil d’une durée de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins sur animaux vigiles peuvent provoquer un léger stress et de l’inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélévements d'organes/tissus à la fin du projet.
Remplacement
La stratégie de remplacement est décrite dans chaque saisine rattachée à ce projet générique. Certains projets utilisent des analyses bioinformatiques pour remplacer l’utilisation des animaux. Des études in vitro sur lignées cellulaires sont également réalisées pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués et limiter l’utilisation des animaux. Cependant, ces approches ne suffisent pas à reproduire la complexité des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires des contextes physiologiques ou physiopathologiques étudiés, nécessitant l’utilisation d’animaux comme modèle intégré. Malgré les efforts pour promouvoir la substitution, la souris demeure un modèle essentiel en raison de sa physiologie proche de celle de l'Homme et de sa similitude génétique, permettant la reproduction moléculaire et phénotypique de nombreuses pathologies humaines.
Réduction
Les méthodes de réduction propres à ces projets sont décrites dans ceux-ci. De manière générale, des tests biostatistiques sont réalisés en amont pour limiter le nombre d’animaux en déterminant le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes. Pour ce faire ainsi que pour l’analyse des résultats, des tests statistiques sont utilisés. L’utilisation d’un même animal comme étant son propre contrôle est également un facteur de réduction fréquemment utilisé dans ces projets. Lors des mises à mort des animaux, les tissus n’étant pas d’intérêt peuvent aussi être récoltés pour les banques de données ou utilisation ultérieure.
Raffinement
Les animaux, gardés dans leur cage d’origine, sont transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Une période d’acclimation propre à chaque projet est définie en accord avec la SBEA (Structure du Bien-Etre Animal). Les animaux en attente/acclimatation sont dans une pièce attenante à la pièce d’expérimentation, contrôlée en lumière et température. Pour les prélèvements sanguins, les animaux peuvent être anesthésiés afin de réduire leur stress, et reçoivent un anesthésique local en cas de besoin. Pour les prélèvements sur animal vigile, les animaux sont laissés au maximum libres de leurs mouvements afin de minimiser le stress. La chirurgie est réalisée sur tapis chauffant, sous protocole anesthésique et analgésique optimisé afin d’éviter toute sensation de douleur jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les personnels sont parfaitement formés aux techniques de prélèvement (tissu et sang) et de perfusion qui, procédurées avec du matériel de chirurgie entretenu et désinfecté, permettent de limiter le stress et la douleur des animaux au maximum. Bien que toutes les procédures soient terminales, toutes les précautions sont prises pour que l’animal ait une bonne couverture analgésique afin de ne subir aucune douleur au cours des procédures.
Choix des espèces
Avec une homologie génique dépassant 90% entre l'Homme et la souris, la plupart des gènes humains ont leurs homologues chez la souris, et les voies métaboliques sont largement conservées entre ces deux espèces. La souris représente ainsi un modèle expérimental particulièrement intéressant en tant qu'animal génétiquement modifié. De nombreux modèles murins, qu'ils soient porteurs ou non de mutations sur des gènes qui nous intéressent, offrent la possibilité d'étudier la physiopathologie de diverses maladies. Dans la littérature et/ou les études publiées par les différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques). Ce modèle intégré permet de rendre compte de la complexité des voies impliquées dans la physiologie et la physiopathologie, avec une transposabilité à l'Homme. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour les équipes de recherche. Les animaux sont utilisés pour les procédures terminales dès l’âge de 7 semaines, jusqu’à 24 mois (études de vieillissement).
Etude de l’implication des protéases à serine du microbiote intestinal dans l’induction et la progression des maladies inflammatoires digestives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour 240. Elles sont gavées chaque jour pendant quatorze jours, et une colite leur est provoquée chimiquement sans aucun anti-inflammatoire, l'inflammation étant l'objet même de l'étude. Il s'agit de vérifier si neuf enzymes du microbiote intestinal aggravent les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, hypothèse déjà testée in vitro sur les selles de patients. Le porteur conclut que le recours aux animaux non-humains est "indispensable", une approche in vitro excluant selon lui les interactions survenant chez l'hôte.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) constituent l’un des désordres les plus courants du tube digestif et représentent un véritable problème de santé publique. Leur incidence est en augmentation dans le monde entier. Ces maladies provoquent une inflammation continue du système digestif, associée à des douleurs abdominales récurrentes, fatigue, diarrhée et altèrent la qualité de vie des patients. Bien que les traitements actuels réduisent les symptômes de la maladie, aucun d’entre eux n’est curatif et tous présentent plusieurs limites liées à des problèmes d’intolérance, de perte de réponse et des effets secondaires souvent graves. D’autres voies thérapeutiques font donc l’objet de recherches. Plusieurs études ont démontré que l'activité des protéases à sérine augmente chez les patients et qu’elle participe à la dégradation de la paroi intestinale et au maintien de l'inflammation. Notre équipe a récemment démontré qu’en plus de l’hôte, le microbiote intestinal représente un véritable réservoir de protéases à sérine qui pourraient également contribuer à l’apparition de la maladie. Dans le cadre de ce projet, notre intérêt s'est porté sur le rôle des enzymes venant du microbiote intestinal dans l’initiation et la progression des MICI. L’analyse in silico du métagénome intestinal (génome du microbiote intestinal) a montré qu’il contient des gènes codant pour des protéases à serine, et que ces gènes sont sur-représentés dans le métagénome intestinal de patients souffrant de MICI. Les protéases bactériennes dont les gènes sont plus abondants chez les patients ont déjà fait l'objet d’analyse in vitro. Les résultats obtenus ont révélé que l’activité protéolytique de neuf protéases est détectable dans les fèces des patients et que ces activités augmentent significativement en cas d’inflammation digestive. Ces observations suggèrent que les protéases à sérine bactériennes auraient un effet pro-inflammatoire jusqu’à maintenant inexploré. Le but de ce projet est de valider, chez un modèle de souris le potentiel effet de neuf nouvelles protéases à sérine codées par le microbiote intestinal dans l’initiation et la progression des MICI. En fonction des résultats i) les mécanismes d’action de ces protéases dans la pathogénie seront proposés et ii) de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les protéases à serine bactérienne pourraient être adoptées pour traiter les MICI.
Bénéfices attendus
La compréhension du rôle des protéases à serine codées par le microbiote intestinal dans l’inflammation et leur mécanisme d’action pourrait permettre d’envisager à l’avenir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’inhibition de ces protéases.
Procédures
- Gavage des animaux vigiles (300 souris) tous les jours pendant 14 jours (J1 à J14). Les souris seront gavées le J14 matin après une mise à jeun de 4 heures. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Prélèvements fécaux (2 ou 3 fèces) pour les 300 souris tous les jours pendant 14 jours (J1 à J14) . Les fèces seront émis naturellement à l’occasion de la pesée des animaux et de l’examen clinique. La durée du geste pour est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Mise à jeun des 300 souris à J14 matin pendant 4 heures, Un prélèvement de sang sur les souris vigiles sera effectué à J14. La durée du geste pour la prise de sang est minimisée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris) afin de limiter au maximum le stress de l’animal. Un prélèvement de sang sera effectué à la fin de la procédure. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Comme une colite expérimentale sera induite, de la douleur est attendue. Aucun anti-inflammatoire n'est prévu, puisque l'inflammation sera l'objet de l'étude. Cependant, l’administration de DSS sera limitée à 7 jours.La souffrance et le stress liée à la manipulation sera (essentiellement lors du gavage (fausse route) et de la prise de sang (douleur), et de la pesée (léger stress).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes.
Remplacement
Préalablement aux essais sur les animaux, nos tests in vitro ont démontré que l’activité des protéases à serine codées par le microbiote intestinal augmente chez les sujets malades comparativement aux sujets sains. De plus, les analyses métagénomiques suggèrent que le déséquilibre de ces activités protéolytiques est associé à l’état de dysbiose observé chez les patients souffrant de MICI. Sur la base des tests préliminaires in vitro, nous avons sélectionné les neuf protéases les plus abondantes et les plus actives chez les patients atteints de MICI comparativement aux sujets sains. L’ensemble de ces tests préliminaires suggèrent que les protéases à sérine codées par le microbiote intestinale semblent avoir un effet pro-inflammatoire qui reste jusqu’à maintenant inexploré. Les mécanismes impliqués dans le développement des MICI mettent en jeu des interactions complexes entre l’hôte et le microbiote, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Ainsi, utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. Le recours aux animaux est alors indispensable.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été défini en se basant sur des études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin d’incorporer un nombre minimum d’animaux tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques significatifs.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 5 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée d'administration du produit chimique qui induit l’inflammation sera courte (7 jours) afin de révéler l’effet de la protéase sur l’inflammation tout en limitant au strict nécessaire le développement des lésions. Au cours de l’étude, les souris seront examinées individuellement de façon quotidienne ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’inflammation trop invalidante. Un léger stress est anticipé suite à la pesée des animaux. De plus, des points limites seront définis et un examen clinique individuel quotidien sera réalisé. Cela permettrait d'intervenir de façon appropriée si un problème survenait et de décider l’euthanasie des souris atteignant les points limites définis.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour étudier la physiologie intestinale ainsi que ses maladies. Ce modèle est facile à gérer (petite taille, très facile à manipuler et la maladie est facile à mettre en place). La colite expérimentale provoquée par le produit chimique utilisé dans ce projet chez la souris est un modèle reconnu des maladies inflammatoires chroniques intestinales humaines. Il reproduit plusieurs caractéristiques physiopathologiques de l’inflammation intestinale développée par l'être humain. Ainsi, ce modèle sera utilisé pour étudier l’impact des enzymes produites par le microbiote intestinal dans le contexte de MICI. Au commencement de l’expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-7 semaines), ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’être humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies inflammatoires de l'intestin.
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Prélever un fragment d'oreille, un bout de queue ou du sang pour lire le patrimoine génétique de chaque animal : la finalité de ce projet est l'intendance d'un élevage de lignées transgéniques. 88 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les prélèvements se font sur animal vigile, à l'emporte-pièce métallique pour l'oreille, en moins de trente secondes. Une partie des souris est tuée pour analyses post-mortem ou parce que son génotype ne présente pas d'intérêt, les autres restent en vie pour d'autres expériences ou comme géniteurs, et le porteur qualifie ces lignées de modèles "indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage .
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.
Manipulation de cellules immunitaires pour améliorer la réponse antitumorale et les immunothérapies par inhibiteurs de points de contrôle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 524 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc, puis viennent des injections dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant trois semaines, et pour un groupe une irradiation de sept minutes trente sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur écrit que les traitements ne provoquent pas d'effets indésirables, et indique par ailleurs que l'irradiation entraîne diarrhée et perte de poids pendant plusieurs semaines et qu'une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Aucun antalgique n'est prévu pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur s'appuyant sur des recommandations internationales en cancérologie expérimentale pour leur substituer un suivi rapproché et des points limites précoces.
Objectifs
Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.
Devenir
Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.
Réduction
Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.
Caractérisations de nouvelles molécules pour le traitement des troubles de l’usage des opiacés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rendues dépendantes aux opiacés par auto-administration puis observées en sevrage, 2 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Avant cela, chacune subit une biopsie de l'oreille sur animal vigile pour identification, une chirurgie d'une heure sous anesthésie, et jusqu'à quarante tests comportementaux de six minutes à une heure. Le porteur indique que les symptômes d'addiction et de sevrage entraînent une douleur qu'il qualifie de modérée, et que les souriceaux séparés de leur mère subissent un stress. Le traitement espéré en est au stade de la recherche de molécule, quand la dépendance, elle, est provoquée chez chacune des 2 120 souris.
Objectifs
Ce projet vise à tester des nouvelles molécules ciblant un récepteur spécifique dans le cerveau, GPR88, dans des modèles animaux de dépendance aux opioïdes. GPR88 est un récepteur dit orphelin, c'est à dire qui n'a pas de ligand endogène connu. Récemment, nous avons développé un modèle d'auto administration pour évaluer les effets de ces molécules sur les comportements liés à la dépendance aux drogues d’abus. Ainsi, nous souhaitons trouver une nouvelle molécule ciblant GPR88 pour diminuer les troubles liés à l'usage des drogues d’abus.
Bénéfices attendus
À l'issue de ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle de GPR88 dans les comportements de type addictif. Nous souhaitons identifier une molécule capable de réduire de manière significative les comportements addictifs. Les molécules ciblant GPR88 peuvent être bénéfiques pour plusieurs drogues d'abus telles que les opiacés, cocaïne, l'alcool et la nicotine. Ce programme de recherche permettera de découvrir un nouvel agent thérapeutique pour le traitement des troubles de l'usage de drogue d’abus.
Procédures
Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre l’identification des animaux transgéniques (30 secondes). Une chirurgie unique sur animaux anesthésiés, d’une durée de 1 heure maximum chacune. De un à 40 tests comportementaux de 6 minutes à une heures (avec un minimum de 24 heures entre chqaue test). Une injection sur animal vigile de molécules qui dure 30 secondes.
Impact sur les animaux
-Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, et une douleur légère due à la biopsie. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. -Chirurgie : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. -Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Une inflammation due aux injections répétées est possible.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de verifier l'emplacement des implants quand cela est nécéssaire et pour faire des analyses moléculaire sur les cerveaux.
Remplacement
"Remplacement" Ce projet consiste à valider et caractériser des agonistes de GPR88 dans le cadre de troubles de l'usage des opiacés. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.Les modèles cellulaires ne nous permettraient pas de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle (multiples structures cérébrales impliquées et réseaux neuronaux). L'addiction affectant en particulier les réseaux neuronaux, il est malheureusement jusqu'à présent impossible de modéliser l'addiction avec des modèles cellulaires et in silico.
Réduction
"Réduction" : Les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 12 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.
Raffinement
"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien). De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations en étant enveloppées dans du papier afin d’être branchées à la fibre optique. Enfin, elles seront branchées à la fibre laser et seront libre d’explorer leur cage, afin d’être habituées à la sensation.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome . De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, les souris MOR-Cre, agées de 8 semaines, permettront de cibler et manipuler spécifiquemenent les neurones aux opiacés. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.
Gestion de la production de lignées de souris transgéniques immunodéficientes à des fins de recherche sur le système immunitaire dans la lutte contre le cancer
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
490 souris seront tuées parce qu'elles n'exprimeront pas les caractéristiques recherchées, dix autres parce qu'elles auront développé des abcès. Sur les 1 125 souris que cet élevage fera naître en cinq ans, 500 seront ainsi mises à mort et 625 gardées en vie, 160 comme reproductrices, 330 pour la gestion des lignées et 135 pour des expériences. Chaque animal subit un unique prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse à l'âge de deux mois pour vérifier son génotype, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur dimensionne cette production à partir d'un historique d'élevage, pour des lignées de souris immunodéficientes destinées à des travaux sur les lymphocytes T dans les tumeurs.
Objectifs
Dans le cadre des approches développées par notre équipe pour comprendre la biologie des lymphocytes T et identifier des facteurs qui bloquent l'activité des cellules T dans un environnement immunosuppresseur in vivo, nous utilisons un ensemble de 3 lignées de souris génétiquement modifiées dont certaines trangéniques pour le récepteur T c'est à dire capable de reconnaître un antigène et un seul. La biologie des lymphocytes T est très étudiée dans la lutte contre le cancer mais trouve bien d'autres applications.
Bénéfices attendus
Les outils de la génomique permettent aujourd'hui de caractériser les gènes améliorant la persistance des cellules T dans des environnements tumoraux et de là, identifier les facteurs qui bloquent l'activité des lymphocytes T infiltrant les tumeurs. La connaissance des résultats provenant des projets utilisant les modèles animaux objets de cette DAP permettra de mieux comprendre la biologie des cellules T et de développer de nouveaux outils à visée thérapeutique dans la lutte contre le cancer.
Procédures
Les animaux subiront un seul prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse. Cette intervention ne dure que 3-4 minutes maximum par animal.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de sang pratiqué sous anesthésie pour l'identification phénotypique des animaux peut provoquer une douleur légère au réveil et le cas échéant un hématome qui ne dureront pas. Concernant le phénotype immunodéficient des animaux, ceux-ci jouissent d'un environnement exempt de pathogène qui fait que le phénotype délétaire ne s'exprime pas ou très peu. En effet, nos études ont montré que moins de 2% des animaux immunodéficients pouvaient développer des abcès à Staphylocoque doré ; un agent bactérien que nous savons à portage humain au sein de nos installations.
Devenir
Sur les 1125 animaux à produire durant toute la durée du projet (5 ans) et à partir des données historiques cumulées, on peut estimer que : 490 animaux n'exprimeront pas un phénotype avec les caractères d'intérêt et seront donc mis à mort, 135 animaux seront utilisés pour les projets scientifiques expérimentaux, 10 animaux seront suceptibles de développer des abcès et seront mis à mort pour cette raison, 160 animaux seront utilisés comme reproducteurs et mis en accouplement, 330 animaux seront conservés pour la gestion des lignées. Au final, 500 animaux seront mis à mort et 625 seront gardés en vie.
Remplacement
Les projets scientifiques qui peuvent être réalisés avec ces élevages s'inscrivent trypiquement dans des études de réponse immunitaire nécessitant un animal entier et immunodéprimé tels que les modèles animaux objets de cette demande. Ceci n'enlève rien au fait que des études in vitro et in silico sont réalisées préalablement aux études vivo dans le cadre de l'évaluation de molécules candidates d'intérêt bio- ou immunothérapeutiques dans la lutte contre le cancer.
Réduction
Afin d'adapter la production aux besoins expérimentaux des projets scientifiques qui pourront être réalisés avec ces élevages de manière à obtenir le juste nécessaire d'animaux d'étude, le nombre d'accouplements nécessaires et les besoins en reproducteurs ont été dimensionnés à partir d'un historique de données d'élevage cumulé depuis plusieurs années. Ces données sont recueillies chaque année par les états membres dans le cadre d'enquêtes statistiques européennes.
Raffinement
Le prélèvement de sang effectué pour permettre l'identification phénotypique des animaux est pratiqué sous anesthésie une seule fois à l'âge de 2 mois. Il s'agit d'un petit volume de sang qui est prélevé avec anticoagulant. Pour les animaux présentant un statut immunologique déficient de part leurs caractéristiques génétiques, une surveillance particulière a été mise en place pour surveiller l'apparition éventuelle d'infections sous forme d'abscès mais les conditions sanitaires exemptes de pathogène rendent l'apparition de ces abscès très occasionnelle et jamais avant l'âge de 3 mois.
Choix des espèces
La très bonne connaissance du génome de la souris et la maitrise des outils de la transgénèse ont permis d'établir ces souris immunodéprimées pour étudier les lymphocytes T dans un contexte tumoral. Ajoutée à l'expertise mondialement reconnue de notre Laboratoire spécialisé dans l'immunologie des tumeurs et l'immunothérapie, cette espèce constitue un modèle de choix pour nos recherches et leurs applications précliniques. Si les animaux d'étude peuvent être utilisés à des âges différents selon les projets scientifiques, entre 3-4 semaines d'âge post-natal et 25 semaines, les animaux sont prélevés à des fins d'identification génétique à l'âge de 2 mois et l'apparition d'abcès chez quelques très rares animaux de part leur statut immunologique déficient n'intervient pas avant 3 mois.
Effets de l’activité physique sur les déficits sociaux induits par l’isolement social et un régime obésogène péri-adolescent chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Environ la moitié est hébergée seule dès le sevrage, à trois semaines, et pour le reste de sa vie, soit une quinzaine de semaines, avec un régime obésogène pendant douze à seize semaines, jusqu'à trois prélèvements de sang à la veine faciale et pour certaines une chirurgie du crâne d'une heure. Elles passent cinq tests, anxiété, reconnaissance d'objets, reconnaissance sociale, et transmission sociale de la préférence alimentaire précédée de seize heures sans nourriture. Le porteur qualifie ces tests de peu stressants au motif qu'ils font appel à des comportements naturels, et affirme qu'il est "primordial" de comprendre pourquoi la mise à l'écart aggrave les troubles de mémoire des adolescents en surpoids.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d’approfondir notre compréhension des effets de l’hébergement en cage individuelle et de la consommation d'une nourriture obésogène pendant l'adolescence sur les fonctions hippocampiques et la mémoire chez la souris. Nous étudierons plus précisément différents types de mémoire dont la mémoire sociale chez la souris et les effets de l’activité physique volontaire dans ces contextes. Nous étudierons en particulier les mécanismes neurobiologiques sous-tendant ces fonctions cognitives (notamment l'implication de l'ocytocine et des endocannabinoides) et nous ciblerons une structure cérébrale connue pour son rôle dans différents types de mémoire, l'hippocampe. Il est aujourd’hui nécessaire d’évaluer l’influence de ces différents facteurs aussi bien chez les mâles que chez les souris femelles car nous ne savons pas si les individus des deux sexes se comportent de la même manière en impliquant les mêmes structures cérébrales.
Bénéfices attendus
Etant donné la forte hausse de l’obésité juvénile dans les sociétés industrialisées, il s'avère primordial de mieux comprendre pourquoi la consommation d’une alimentation obésogène à l’adolescence entraîne des perturbations de mémoire à l’âge adulte et si l'ostracisation (mise à l'écart, l'isolement social) dont sont victimes les enfants/adolescents en surpoids est un facteur aggravant. En effet, avoir une vue d’ensemble des modifications physiologiques et neurologiques que cette alimentation et que l'isolement social entraînent permettra à terme de mieux encadrer les jeunes sujets en surpoids ou obèses afin de limiter les conséquences délétères sur les fonctions cognitives. Le cerveau étant vulnérable au cours de l’adolescence, tout changement environnemental comme une consommation obésogène excessive ou l’hébergement en cage individuelle est particulièrement susceptible d’altérer la maturation et par conséquent, le bon fonctionnement cognitif. Cette étude permettra en outre de souligner l’enfance et l’adolescence comme périodes clés et critiques du développement cérébral, et de fournir des données pour les campagnes de prévention de l’obésité juvénile. Notre étude permettra aussi de mieux comprendre l'importance de l'exercice dans le comportement social, notamment chez la souris et son lien avec l'alimentation, équilibrée ou non et d'approfondir nos connaissances par des approches pharmacologiques sur l'activité d'une sous-région de l'hippocampe. Par ailleurs, les relations sociales faisant intervenir différents systèmes neurobiologiques, il est important d’évaluer l’influence potentiellement différentielle du type d'hébergement, de l’alimentation obésogène et de l’activité physique chez les deux sexes.
Procédures
Chaque animal sera soumis à maximum trois prélèvements sanguins à la veine faciale et certains animaux seront également soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une heure max sous anesthésie générale. La composition corporelle des animaux sera analysée par résonance magnétique nucléaire (2 minutes) au cours de l’étude (3 fois à environ 6 semaines d’intervalle). Les injections péritonéales (3 injections maximum de 15 secondes) ou focales (3 injections maximum de 2 minutes) se feront au cours de 5 tests comportementaux qui évaluent leur niveau d'anxiété (5 minutes) et différents types de mémoire (trois sessions de 10 minutes pour la reconnaissance sociale et la reconnaissance d'objets) et la qualité de leurs interactions sociales (transmission sociale de la préférence alimentaire: 16h max de privation alimentaire suivie de 30 minutes d'interaction sociale suivies de 2h de suivi de consommation alimentaire). Le test de reconnaissance sociale ou d'objets pourra être répété une fois avec un délai différent si nécessaire. De plus, environ la moitié des animaux sera hébergée en cage individuelle pour modéliser un isolement physique des congénères de leur arrivée à 3 semaines d'âge jusqu'à la fin de leur vie (environ 15 semaines d'expérimentation) .
Impact sur les animaux
Le régime obésogène donné pendant 12 à 16 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme c’est le cas dans nos études précédentes. L'hébergement en cage individuelle peut certes engendrer des effets néfastes sur les comportements mais c’est justement pour mettre en évidence l’accentuation éventuelle des dérèglements neurobiologiques et comportementaux engendrés par cette situation particulière que nous voulons travailler exceptionnellement dans ces conditions. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période péri-chirurgicale; même si les souris présentent un comportement normal à leur réveil, elles bénéficieront d'au moins 5 jours de "repos" avant les tests comportementaux. Ces derniers génèrent très peu de stress car ils font appel à des situations adaptées à leur comportement naturel et la restriction alimentaire utilisée dans un des tests (transmission sociale de la préférence alimentaire) est limitée à 16h maximum. Les injections (péritonéale ou intracérébrale) peuvent induire un stress qui sera limité par une maitrise des manipulations par les expérimentateurs. Les prélèvements sanguins seront aussi effectués par des expérimentateurs expérimentés afin de limiter le stress de cette manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car leur cerveau ou certaines structures cérébrales doivent être récupérés pour analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène, à un hébergement en cage individuelle et à l’activité physique. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. Cependant, si certains tests peuvent influencer le comportement ultérieur des animaux, des groupes différents seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables (tests paramétriques), 2260 souris seront nécessaires afin de mener à bien le projet. Cela correspond à une durée de 5 ans.
Raffinement
Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective (sauf les souris hébergées en cage individuelle pour modéliser l’isolement social) avec un environnement ayant un enrichissement minimal (igloo ou roue d’activité) dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être, il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post- opératoire pour limiter la douleur.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. Nous avons particulièrement choisi la souris car les effets de notre régime sont bien caractérisés dans cette espèce. De plus, notre approche pharmacologique pourra éventuellement être complétée/ ultérieurement en utilisant des souris transgéniques existantes. Nous utiliserons un premier lot de souris maintenues en cage collective (2 à 6 par cage) dès le sevrage ainsi qu’un second lot de souris maintenues en cage individuelle. Les souris seront exposées au régime obésogène ou contrôle, avec ou non accès à une roue d'activité, dès le sevrage (3 semaines) et ce pendant 12 à 16 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Après 12 semaines de régime obésogène, les souris seront intégrées dans les différentes procédures expérimentales. Les animaux soumis à un aliment contrôle seront également testés à l'âge adulte afin de garantir la comparatibilité des résultats.
Etude des bases neurobiologiques de la résilience/vulnérabilité au stress prénatal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Immobilisées 45 minutes trois fois par jour pendant sept jours au cours de leur gestation, des souris femelles transmettent un stress prénatal à leur descendance. 498 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les petits devenus adultes sont hébergés seuls deux à quatre semaines, reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours et passent jusqu'à six tests de trente minutes par jour, le porteur annonçant des tests de réactivité au stress sans préciser lesquels, pour séparer les individus résilients de ceux qui développent un profil comportemental anormal. 54 souris seront réutilisées dans d'autres procédures, les autres tuées pour prélever des structures de leur cerveau.
Objectifs
Le stress prénatal, subi lors du développement foetal, est associé à un risque accru de développer des troubles psychiatriques tout au long de la vie. En particulier, il a été montré dans un modèle de rongeur que le stress prénatal induit chez les individus adultes des déficits de mémoire semblables à ceux observés dans le trouble de stress post-traumatique, mais uniquement chez certains individus. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de démêler les mécanismes responsables des différences interindividuelles dans les réponses à l’exposition au stress prénatal, en se concentrant sur le développement du trouble de stress post-traumatique chez la souris. Notre objectif sera ici d'étudier les différences d'activité d'une région spécifique du cerveau, l'hippocampe, entre les animaux résilients, qui ne développent pas de troubles comportementaux, et les animaux vulnérables qui développent un profil comportemental anormal.
Bénéfices attendus
Le trouble de stress post-traumatique est une pathologie liée au stress, aux conséquences dévastatrices, qui se développe à la suite d'un événement traumatique vécu comme une menace d'agression physique ou de mort. La victime manifeste une réaction de peur intense et un profond sentiment d'impuissance. La prévalence à vie du trouble de stress post-traumatique est d'environ 6 à 8 % dans la population générale, mais 20 à 30 % des individus ayant vécu des événements traumatisants graves (par exemple, des combats militaires, des attaques terroristes, des viols) développent cette pathologie, qui peut persister plusieurs années après le traumatisme. On estime que 7,7 millions de citoyens européens sont sévèrement touchés par ce trouble, avec un coût annuel de 9 milliards d'euros. Les traitements actuels, principalement symptomatiques, sont efficaces pour moins de la moitié des patients et sont souvent associés à des effets secondaires ainsi qu’à des symptômes résiduels. Cette pathologie constitue donc un défi médical majeur. L'une des pistes pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques consiste à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la vulnérabilité accrue des 30 % d'individus exposés à un traumatisme qui développent des symptômes de stress post-traumatique, ainsi que la résilience des 70 % restants qui ne manifestent pas ces symptômes. Notre projet contribuera non seulement à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour élaborer de nouveaux traitements, mais aussi à envisager des biomarqueurs prédictifs de la maladie. Il contribuera à l'enrichissement des neurosciences translationnelles, ainsi qu'à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à favoriser une gestion efficace du stress.
Procédures
Hébergement en cage individuelle pour une durée de 2 à 4 semaines. Injections (1/jour pendant 5 jour au maximum; chaque intervention (préhension de l’animal, injection et retour de l’animal dans sa cage) dure en moyenne 40 sec )). Tests comportementaux permettant de mesurer la réactivité au stress des animaux (6 test de 30min max par jour). Sessions de stress de contention de 45 min 3x/jour pendant 7 jours. Une session de stress de contention de 30min.
Impact sur les animaux
1-hébergement individuel (nuisance légère). 2-Tests comportements de courte durée pouvant induire un stress modéré . 3- Douleur légère de courte durée pour les injections d’un produit mimant un état physiologique de stress (nuisance modérée). 4- Pour une partie des animaux , développement des symptômes associés au trouble de stress post-traumatique (troubles de mémoire, anxiété, hypervigilance, qui feront l’objet d’une analyse approfondie. (nuisance modérée).
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de structures cerebrales en vue de réaliser les analayses du projet.
Remplacement
Nous souhaitons identifier les mécanismes associés à la résilience ou à la vulnérabilité à développer un trouble de stress post-traumatique après exposition à un stress prénatal. Par essence, l’expression de cette vulnérabilité ou résilience ne peut s’observer qu’au travers de comportements, nécessitant donc une l’étude d’individus intègres. Il n'est pas possible à l'heure actuelle d'envisager le remplacement de ce modèle par des approches in vitro ou in silico.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir la robustesse et la fiabilité des analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, une expérience pilote utilisant un petit nombre d'animaux sera réalisée en vue de déterminer la souche la plus adéquate pour le reste des expériences. De plus, pour le projet, les frères et sœurs d’une même portée seront répartis entre différents lots, permettant ainsi de mener plusieurs expériences en parallèle.
Raffinement
Dès leur arrivée les souris sont hébergées en cages transparentes munies d’enrichissement (carrés de coton et copaux larges permettant l'élaboration d'un nid additionné de tunnels si nécessaire). Hors périodes de stress les souris seront observées quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect du pelage) et une pesée hebdomadaire sera réalisée. Durant les sessions de stress prénatal, les souris sont observées et manipulées 3 fois par jour. Dès qu’un animal présentera un signe de mal-être, il sera soigné par un responsable du bien-être animal et/ou la vétérinaire. S’il ne présente aucun signe d’amélioration dans les 3 jours suivant, il sera mis à mort.
Choix des espèces
L'activité de l'hippocampe, qui est notre région candidate pour expliquer les facteurs de résilience/vulnérabilité au stress prénatal, a été étudiée principalement chez le rongeur. De plus, le modèle utilisé dans ce projet est la souris car 1) ce projet fait suite à des premières études réalisées chez la souris; 2) il s'insère dans un projet plus général faisant appel à des lignées transgéniques développées chez la souris. Les animaux seront utilisés : -A l'âge de 7 semaines pour les femelles en reproduction car il s'agit de l'âge optimal pour la reproduction. -A l’âge adulte (11-12 semaines) pour les animaux expérimentaux puisque notre modèle a pour objectif d'étudier les conséquences du stress prénatal sur la vulnérabilité ou la résilience à développer un trouble de stress post-traumatique.