Souris
Evaluation pharmacologique de molécules anti-virales et de vaccins pour le traitement de la Covid-19 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées par le SARS-CoV-2, 3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont soit maintenues immobiles quarante minutes dans une chambre de contention, le nez dans le flux d'air, soit anesthésiées pour une instillation nasale, puis reçoivent chaque jour pendant dix jours un composé ou un vaccin avant le prélèvement des organes. Le projet est vendu comme prestation de service : doses, voie d'administration et fréquence sont fixées avec le client, académique ou privé, ce qui empêche le porteur d'annoncer le nombre et la durée des interventions. Le virus se multiplie dans les poumons et provoque inflammation, lésions et difficultés respiratoires, et le porteur revendique un "besoin urgent d'études in vivo" pour "pérenniser la plateforme technologique".
Objectifs
Le SARS-CoV2 est le virus responsable de la maladie appelée COVID-19. Le manque d'antiviraux a révélé un besoin urgent d'études in vivo pertinentes afin d'évaluer de nouveaux vaccins et de nouvelles molécules potentiellement anti-SARS-CoV2. Différents modèles de souris dont un modèle de souris génétiquement modifiées pour être sensibles au virus SARS-CoV2 est décrit dans la littérature. Ces souris sont un outil de choix pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 et pour évaluer les vaccins et les produits thérapeutiques COVID-19. L’ambition de ce projet est de péréniser la plateforme technologique, à destination de futurs clients, académiques ou privés, où des souris sensibles au virus sont utilisées pour tester de nouveuax vaccins et de nouvelles molécules antivirales pour le traitement de la COVID-19. Pour comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus, il est en effet crucial à ce stade, d’utiliser un organisme vivant dans son ensemble. Différentes techniques in vitro ont déjà été utilisées en amont. Nous avons donc pour objectif de continuer à contribuer au développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est l'épidémie de Covid-19.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle souris pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 contribue à comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus. Ce modèle préclinique in vivo permet d’évaluer des vaccins et des produits thérapeutiques Covid19.
Procédures
Les animaux seront infectés 1) soit par voie aérosol, les animaux vigiles sont maintenus immobiles dans des chambres de contention avec le nez pointant vers le flux d’air (durée d’environ 40 minutes) 2) soit par voie nasale, les souris seront anesthésiées/analgésiées une fois (durée d’environ 1 minute). Les nouveaux vaccins et les nouvelles molécules potentiellement antivirales seront testés selon la voie d’injection définie en accord avec le client fournisseur. Les doses et la fréquence d’administration dépendent des composés et de l'étude. Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée. Pour des procédures dites « classiques », les animaux reçoivent une infection, une administration de molécules ou vaccins tous les jours pendant maximum 10 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
L’infection des souris peut se faire soit : - Par instillation intranasale, des nuisances modérées, (durée 1 minute), sont présentes au moment de l’anesthésie (préhension, contention piqûre). - Par nébulisation, les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres pendant 40 min et induit un stress modéré. La préhension et la contention afin de procéder aux diverses injections ou gavage engendre un stress modéré (durée 1 minute). La pesée des animaux (durée 1 minute) entraine un stress léger. Suite à l’infection des souris, le virus se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Les effets attendus sont : altération de l’état général et difficultés respiratoires. L’effet cumulatif de ces actes sur un même animal (infection, injections et développement de l’infection, pesée) entraine des nuisances sévères
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
L’amplitude de l'épidémie de Covid-19 ainsi que l'absence de traitement de référence rend urgente la découverte de nouveaux vaccins ou de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de l'étude de l’efficacité in vivo d’un composé sou d'un vaccin sur une infection, qui résulte non seulement de l’effet de ce composé sur le virus mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur cet agent pathogène. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances et de vaccins, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont incontournables. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre calculé de souris nécessaires sera au maximum de 3000 sur 5 ans. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules antivirales/vaccins à tester, doses différentes de la molécule antivirale/vaccins). Le nombre d'études variera en fonction de la demande des utilisateurs. Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre de souris requises pour une année.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée à la procédure expérimentale par l'utilisation d'anesthésique pendant l’infection, lors des différentes injections des traitements potentiels. Pour l’infection des souris par nébulisation les souris sont mises en place dans les tubes de contention par du personnel habitué à l’utilisation de l’appareil ce qui réduit le stress des animaux. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et des points limites précoces seront mis en place. Les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux d'infection au Sars-CoV-2 sont actuellement utilisés par la communauté scientifique : les primates non humains, les chats, les furets, les hamsters et les souris. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie. Des souris adultes si possible, âgées entre 5 à 10 semaines seront utilisées pour ce projet.
Etude par imagerie de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
138 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à six séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse et quinze tests comportementaux. 75 d'entre elles reçoivent un composé qui déclenche une épilepsie, les 63 autres formant le groupe témoin. Les crises attendues sont focales et non convulsives, les souris cessant leur activité en cours, et les tests mesurent l'activité motrice, la dépression et l'anxiété. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et corréler l'imagerie aux analyses immunohistochimiques.
Objectifs
L'épilepsie, une maladie neurologique fréquente touchant environ 1% de la population et générant 100 nouveaux cas annuels pour 100 000 habitants, demeure une condition potentiellement sérieuse dont les mécanismes moléculaires et cellulaires restent encore mal compris. De fait, les traitements médicamenteux actuels se limitent principalement à des approches symptomatiques. Notre démarche vise à approfondir notre compréhension de l'épilepsie tout en identifiant de nouvelles voies thérapeutiques potentielles, en mettant particulièrement l'accent sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires cérébraux. L’imagerie fonctionnelle se présente comme un outil puissant pour explorer in vivo divers mécanismes cérébraux. Ainsi, la tomographie par émission de positons (TEP), largement utilisée en médecine nucléaire, permet de suivre au cours du temps différents paramètres dans les différentes régions du cerveau. Dans le cas de l’épilepsie, la TEP est particulièrement intéressante pour observer : • Le métabolisme des cellules du cerveau, un indicateur de leur activité ; • La concentration en synapses, ces zones de transmission d’information entre neurones ; • L’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, la barrière naturelle qui protège le cerveau. Le choix du radiotraceur varie en fonction du paramètre que l’on souhaite suivre. L'objectif de ce travail consiste à appliquer cette méthode d'imagerie, déjà développée et appliquée dans notre laboratoire, y compris chez l'Homme, à un modèle rongeur d'épilepsie bien caractérisé. Cette approche permettra d'identifier les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie neurologique, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques. De plus, nous réaliserons des tests de comportement afin de corréler les données de l’imagerie à des symptômes cliniques. Les tests de comportement, tels que l'évaluation de l'anxiété, de la dépression et de l’activité motrice, sont essentiels pour comprendre les comorbidités neurocomportementales de l’épilepsie. Ils permettent de mesurer l'impact des crises sur le comportement et de développer des interventions thérapeutiques adaptées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à élucider les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans l'épilepsie, en établissant une corrélation entre ces dysfonctionnements et les comportements manifestés par les animaux. De plus, cette approche permettra d'identifier la méthode d'imagerie la plus pertinente pour une poursuite du développement chez l'homme. À terme, cette étude ouvrira la voie à l'exploration in vivo de ces mécanismes chez des patients atteints d'épilepsie, avec l'objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait ainsi contribuer à l'avancement des traitements et à l'amélioration de la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : - Administration (75 animaux, durée 25 minutes) d’un composé induisant une épilepsie pour le groupe épilepsie tandis que le groupe témoin (63 animaux, durée 25 minutes) ne recevra pas de composé induit une épilepsie. - Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, 6 imageries maximales par animal) - Injection d’un radiotraceur (1 minute) - Les rongeurs seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de mesurer 1) l'activité motrice (durée du test = 10 minutes, 15 tests comportementaux maximales par animal), 2) la dépression (test de 6 minutes) et 3) l’anxiété (test de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : - des crises épileptiques principalement focales et non convulsives (les souris cessent leur activité en cours) ; - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des analyses immunohistochimique permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans l’épilepsie et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Les études in vivo sont essentielles pour comprendre pleinement les mécanismes d’un dysfonctionnement cérébral. Les modèles animaux permettent d'observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Il n’existe pour l’instant pas de méthode alternative capable de faire ces observations.
Réduction
Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum), ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en ne compromettant pas une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergées par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, des bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Deux semaines d’acclimatation sont prévues après la livraison et avant de débuter le protocole. Un suivi régulier permettra de repérer une éventuelle souffrance animale et de prendre en charge l’animal concerné dans les plus brefs délais. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Des analgésiques seront également administrés avant et après la chirurgie. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections neurologique. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP ainsi qu’à l’étude comportementale. Plus particulièrement : - les rongeurs sont particulièrement appropriés pour ce type d'étude en raison de leur taille, de leur facilité d'hébergement et de manipulation ; - il existe de nombreux tests comportementaux standardisés chez les rongeurs pour mesurer les comportements dépressifs et anxieux. Ces tests permettent de corréler efficacement les données d'imagerie avec les symptômes cliniques observés dans l'épilepsie, offrant ainsi une compréhension plus complète des mécanismes physiopathologiques et des comorbidités comportementales associées à cette maladie. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).
Etude des mécanismes conduisant à l’élimination rapide des plaquettes transfusés lors d’un état réfractaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris sont saignées à l'aorte sous anesthésie générale puis tuées sans reprendre conscience, leurs plaquettes étant transfusées à 198 autres souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces dernières subissent cinq prélèvements à la queue étalés sur les deux heures qui suivent la transfusion, une partie recevant d'abord une injection par semaine pendant trois semaines pour provoquer une réaction immunitaire. Pour les donneuses, le porteur retient des mâles, à âge égal plus lourds que les femelles et donc porteurs d'un volume sanguin plus grand. Aucune n'est gardée en vie, le prélèvement étant terminal et les receveuses ne pouvant plus être réutilisées une fois leur système immunitaire stimulé.
Objectifs
.Les patients pris en charge dans le cadre d'une chimiothérapie myelosuppressive ont besoin d'un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Cependant, dans certains cas, les plaquettes transfusées sont très rapidement éliminées de la circulation sanguine du receveur et la transfusion se révèle inefficace sur un plan thérapeutique, c'est ce qu'on appelle un état réfractaire. Les mécanismes liés à cette élimination ne sont pas totalement compris et cette absence de connaissances représente donc un réel frein au développement de stratégies thérapeutiques. Les objectifs de ce projet sont donc de pouvoir étudier finement les mécanismes qui conduisent à l'élimination des plaquettes transfusées. Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de modéliser l'état réfractaire chez le rongeur afin de pouvoir disposer d'un modèle pré-clinique qui nous permettra de tester différentes stratégies thérapeutiques dans le cadre de la prise en charge des patients en état réfractaire.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients en état réfractaire repose actuellement sur la transfusion d'un produit plaquettaire dit "compatible" avec le receveru. C'est une solution qui n'est pas satisfaisante car elle ne peut pas être mise en place en cas d'urgence et requiert des ressources qui sont par définition limitées (le nombre de produit compatible par receveur est extrêmement restreint). Le bénéfice de ce projet à long terme pourra être une meilleure prise en charge des patients présentant un état réfractaire en utilisant des stratégies thérapeutiques efficaces pour amilorer l'efficacité transfusionnelle.
Procédures
Il n'y aura aucune procédure faite sur animaux vigiles, les animaux recevront une anesthésie . Il n'y a pas de procédures chirurgicales avec réveil, les animaux subiront sous anesthésie générale un prélèvement à l'aorte (souris donneuses de plaquettes) qui dure moins de 5 minutes. Les souris receveuses subiront (sous anesthésie) une transfusion de plaquettes sanguines avec ou non un traitement pharmacologique puis des prélèvements à la queue itératifs sur les 2h suivant la transfusion (prélèvements à 1', 5', 15', 30', 2h).
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, un stress lié aux manipulations est possible ainsi qu'un effet de l'anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Dans le cadre de la procédure liée à l'alloimmunisation, les injections répétées (une injection par semaine pendant 3 semaines consécutives) peut être associée à un risque de lésion au niveau du site d'injection. Il n'y a pas de nuisance attendue aux différents traitements reçus pour prévenir l'état réfractaire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures. Les animaux subissent en effet soit un prélèvement sanguin terminal ou des transfusions plaquettaires. Pour ces derniers, il n'est pas possible de les réutiliser dans d'autres expériences car il y a eu une stimulation du système immuniataire (production d'anticorps).
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est de comprendre les mécanismes d'action des anticorpsconduisant à l'élimination des plaquettes transfusées. Cette question ne peut être abordée qu'in vivo Cette question ne peut être abordée qu'in vivo puisque l’élimination des plaquettes se fait dans un système intégré (circulation sanguine, composés plasmatiques, macrophages tissulaires). Cependant, nous avons mis au point des tests d'activation plaquettaire en réponse aux anticorps in vitro. ces tests seront mis à profit pour déterminer les doses des différentes molécules candidates à administrer pour prévenir l'état réfractaire.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Si l’état réfractaire est totalement inhibé avec une des approches, les conditions où plusieurs approches sont combinées ne seront pas testées. Le critère recherché est le temps de circulation de plaquettes in vivo. Nous effectuons donc une comparaison des courbes d’élimination des plaquettes en fonction du temps dans les souris traitées versus les souris non traitées Les effectifs ont été calculés au plus juste en tenant compte de la variabilité déjà observée dans ce genre d'expériences. Afin de réduire au maximum le nombre de souris donneuses, nous privilégierons les souris donneuses mâles. A âge équivalent, elles ont un poids plus important que les souris femelles et donc un volume sanguin plus important, ainsi nous pouvons isoler une quantité suffisante de plaquettes sanguines en utilisant moins d’animaux.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Pour réduire le stress provoqué par la manipulation des animaux, ceux-ci auront une phase d’habituation à la contention et à la manipulation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par la mise en place de nourriture de type « pâté » 3 jours avant le début des expérimentations faisant intervenir une chirurgie • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation. • Par l’injection d’analgésique et d’antalgique avant chaque procédure chirurgicale • Par application d’ocrygel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signes de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure . Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés, notamment les modèles de transfusion. Puisque nous souhaitons mimer la différence d’haplotype entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire. De plus,le modèle d’allo-immunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les souris donneuses de plaquettes seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Les souris receveuses seront utilisées au stade adulte entre 7 et 20 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte et à une période où les souris n'ont pas un poids trop important qui nécessiterait d'injecter beaucoup plus de plaquettes et/ou des différentes molécules testées dans ce projet (nous utiliserons des souris dont le poids est compris entre 18 et 25g)
Activation synergique de récepteurs nucléaires par des contaminants alimentaires
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Gavées chaque jour pendant trois jours, ou nourries pendant quatre-vingt-dix jours avec des contaminants alimentaires, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements à la veine faciale sous anesthésie, sept prises de sang lors d'un test de tolérance au glucose et des pesées hebdomadaires, pour mesurer si perfluorés, phtalates, bisphénols et pesticides activent ensemble des récepteurs impliqués dans l'obésité. La plupart sont tuées par dislocation cervicale, une partie des femelles étant gardée pour l'entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires utilisée pour l'entraînement aux gestes techniques. Le porteur écrit n'attendre "pas de nuisances particulières", sans expliquer ce qui vaut à 256 d'entre elles un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
Les maladies métaboliques, telles que le diabète et l’obésité, sont en constante augmentation dans les pays industrialisés. L'origine de ces maladies est complexe et multifactorielle. Les causes premières d’apparition de ces troubles, lorsqu’ils ne sont pas d’origine génétique, sont liées à une alimentation riche en sucre et en gras et à un mode de vie sédentaire. L’exposition à certains produits chimiques, dits « obésogènes environnementaux » est également suspectée de jouer un rôle dans l’apparition et/ou l’évolution de ces maladies. Un certains nombre de senseurs appelés les récepteurs nucléaires jouent un rôle important dans la régulation de l'équilibre énergétique et pourraient être des médiateurs des effets de ces « obésogènes environnementaux » sur le développement de troubles métaboliques. Les contaminants étudiés sont les composés perfluorés, les phtalates, les bisphénols, les organoétains et les pesticides connus pour leur caractère obésogène et identifiés sur la base tests en laboratoire sans animaux, réalisé par un partenaire du projet. Ces composés seront administrés seuls puis en mélange par gavage oral à des souris exprimant ou non certains récepteurs nucléaires en aigu (3 jours) ou en chronique (90 jours). Des analyses sur les perturbations métaboliques induites par l’exposition à ces contaminants seront réalisées.
Bénéfices attendus
Ces données permettront d’évaluer l’impact d’expositions à des contaminants alimentaires sur l'activation des récepteurs nucléaires et sur les perturbations métaboliques qui en découlent. Les expositions aiguës permettront de mettre en évidence un éventuel effet combiné dans l'activation d'un récepteur nucléaire donné. Les expositions chroniques de 90 jours permettront de déterminer si les mêmes récepteurs sont activés de la même manière lors d'expositions à plus faibles doses sur des temps plus longs et de rechercher les différentes perturbations métaboliques qui peuvent en découler.
Procédures
Pour les 3 expositions aiguës, les souris seront exposées à des contaminants par gavage quotidien (30 secondes) pendant 3 jours. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale (30 secondes). Pour l'exposition chronique, les souris seront exposées à des contaminants par l'alimentation pendant 90 jours. Elles seront pesées chaque semaine pendant toute la durée de l'expérimentation (ce qui correspond à environ 13 pesées de 30 secondes). Sept prélèvements d'une goutte de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au glucose, sous pommade anesthésique. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale. Ce prélèvement dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas de nuisances particulières chez les animaux exposés. Les expositions seront à des doses ne présentant pas de toxicité pour les animaux. Un stress peut être généré par la manipulation et la contention des souris.
Devenir
Les animaux ayant servi à l'expérimentation sont euthanasiés par dislocation cervicale au terme de l'expérimentation. Nous conserverons une partie des femelles pour l’entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires sera utilisée pour de la formation aux gestes techniques.
Remplacement
Les tests en laboratoire sans animaux, réalisés par une équipe partenaire permet une sélection de seulement 16 molécules ayant montré un potentiel synergique auxquelle s'ajouteront 4 molécules de référence. Cependant, seule une approche avec des organismes vivants entiers est capable d’évaluer les conséquences de l'activation synergique de récepteurs nucléaires et les dérégulations métaboliques qui en découlent.
Réduction
Chaque étape de protocole vise à sélectionner les molécules présentant un potentiel synergique élevé pour les étapes suivantes passant de 20 molécules avec 5 doses à 8 molécules avec une seule dose. Si aucune molécule ne synergise ou n'active un récepteur donné, aucune molécule ne sera sélectionnée pour ce récepteur, réduisant ainsi le nombre de lots prévu lors des procédures suivantes.
Raffinement
La mise en place de d'abris en inox permettra aux animaux de s'isoler au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront habitués à la préhension par les zootechniciens. Un analgésique local est prévu pour les prélèvements de sang pendant le test de tolérance au glucose. Une anesthésie générale est prévue pour les prélèvements de sang précédant la mise à mort. En cas d’atteinte d’un des points limites établis, l'animal sera retiré de l'étude, anesthésié et euthanasié si les lésions observées sont jugées irréversibles . Les animaux seront hébergés sans dépasser 6 adultes par cage conformément recommandations liées au bien-être animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons pour ce projet des souris d'une lignée particulièrement adaptée aux les études de perturbations métaboliques. Ce fond génétique nous permet d’utiliser des souris invalidées pour les récepteurs nucléaires d'interet, de manière à mieux évaluer leurs rôles dans les perturbations métaboliques induites par l’exposition aux contaminants alimentaires. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous nous intéressons à l'effet des contaminants sur le métabolisme de l'individu adulte.
Evaluation de l’efficacité de molécules pour lutter contre la toxi-infection provoquée par certaines Escherichia coli entérohémorragiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Insuffisance rénale, diarrhée, perte de poids, symptômes neurologiques pouvant aller jusqu'à la mort : les atteintes attendues servent à la fois de résultat expérimental et de critère de mise à mort anticipée. 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une instillation intra-rectale de shigatoxine ou de lysat bactérien sous anesthésie, puis jusqu'à sept prélèvements de sang à la mandibule. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable" pour observer à l'échelle d'un individu les répercussions de la toxine sur les différents organes.
Objectifs
Certaines souches d’Escherichia coli pathogènes, appelées EHEC (pour E. coli Entérohémorragique) sont responsables d’infection d'origine alimentaires graves, du fait de leur implantation dans le côlon des personnes infectées et de la production d’une toxine, la shigatoxine. Cette toxine est excrétée à la fois sous forme libre ou encapsulée dans des vésicules extracellulaires bactériennes. L’activité de la shigatoxine provoque la mort ces cellules hôtes ciblées, à savoir les cellules endothéliales au niveau du rein, du côlon et de l’encéphale, à l’origine de lésions sévères et potentiellement mortelles. Il est à noter que ces infections affectent majoritairement les jeunes enfants. Ces infections sont particulièrement difficiles à traiter car l'utilisation d'antibiotique est contre indiquée car elle entraine une lyse des bactéries et un choc endotoxique avec le relargage massif de la shigatoxine, à l’origine des formes graves de la maladie. Ainsi, il est nécessaire de (i) comprendre l’impact des modes de sécrétion des shigatoxines (libre ou encapsulée dans des vésicules extracellulaires) sur leur activité biologique, (ii) évaluer les médiateurs de la toxicité de la shigatoxine dans les cellules endothéliales et (iii) développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour lutter contre les effets cellulaires de ces toxines. Les objectifs de ce projet sont donc d'évaluer l’importance des vésicules bactériennes contenant des shigatoxines dans la pathogénie des EHEC et d’évaluer l'efficacité d’une nouvelle molécule contre l'effet des shigatoxines en absence ou en présence de vésicules bactériennes.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des vésicules extracellulaires dans l’aggravation des infections par des EHEC et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. De plus, les infections par les EHEC sont difficiles à traiter même une fois l'agent infectieux identifié. En effet, le traitement par des antibiotiques entraine un relargage massif des toxines (choc endotoxique) avec une aggravation de l'état de santé du patient. Le traitement antibiotique est donc déconseillé conduisant à une impasse thérapeutique. L'administration de molécules pharmacologiques capables d’inhiber l’activité de la toxine, qui pourrait donc représenter une approche thérapeutique bénéfique en combinaison de traitement par les antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une instillation intra-rectale sous anesthésie fixe (injection intra-péritonéale qui prendra quelques minutes) ou gazeuse une seule fois au début de la procédure (durée totale de quelques minutes). Tous les animaux seront soumis à des prélèvements de sang à la mandibule 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse, soit 7 prélèvements maximum (durée totale du prélèvement de 1 minute). Pour les animaux qui seront inclus dans l’étude de test du traitement inhibiteur recevront deux injections sous-cutanées à 10h d’intervalle. L’injection prendra quelques minutes. Tous les animaux recevront une injection intra-péritonéale de réaliser un prélèvement à la veine cave.
Impact sur les animaux
L'administration de lysat bactérien ou de shigatoxine par voie intra-rectale contenant la shigatoxine reproduit la physiopathologie observée chez l'homme. En effet, la shigatoxine est sécrété par la bactérie dans l’intestin et les cellules qui y sont réceptives sont présente dans la partie la plus distale de celui-ci. L’instillation intra-rectale permet donc d’avoir une dose connue directement en contact avec les cellules cibles. Ces lésions pourraient entrainent une défaillance des fonctions vitales de l'animal, et notamment une insuffisance rénale, de la diarrhée, une perte de poids, des symptômes neurologiques, une dégradation de l’état général pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal. C'est pourquoi des points limites seront définis et évalués à partir du suivi clinique des animaux (réalisé 2 fois par jour et des pesées des animaux (réalisée 3 fois par semaine). Ils serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des vésicules extracellulaires bactériennes et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer les lésions éventuelles.
Remplacement
Des modèles cellulaires ont permis de mettre en évidence le mode d’action de la shigatoxine sous forme libre et encapsuler dans des vésicules extracellulaires bactériennes et de valider l’efficacité des molécules que l’on souhaite utiliser contre la shigatoxine. Cependant, le recours à l’animal est irremplaçable car aucun autre modèle ne permet d’évaluer, au niveau d’un individu, les répercussions de la shigatoxine au niveau global avec les conséquences sur les différents organes et les répercussions cliniques.
Réduction
Des expériences préalablement réalisées avec ce modèle permettent d'estimer de manière optimale le nombre d'animaux requis. L’innocuité et la dose de la molécule à tester a déjà été validée. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Plusieurs paramètres seront analysés et suivis dans le temps sur le même animal tout au long de l’expérimentation et après le sacrifice notamment grâce à des analyses histologiques.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages avec une taille et un environnement convenant aux respects des besoins des souris. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des enrichissements seront fournis pour permettre aux souris d’exprimer les comportements propres à son espèce. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour l’ensemble des procédures, l’état clinique sera suivi deux fois par jour selon la grille présenté en annexe. La mesure du poids sera effectuée 3 fois par semaine. Cette surveillance servira d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer des points limites. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Lors des instillations transrectales une anesthésie gazeuse ou fixe sera mis en place pour la contention pendant et de la lidocaïne sera ajouté en local pour augmenter l’analgésie. Lors des prélèvements sanguins, une contention chimique sera effectuée pour augmenter le confort de l’expérimentateur et de la souris. Les injections sous-cutanées seront réalisées avec les souris tenues par la peau du cou et l’injection effectuée dans le pli ainsi formé. Au moment de la mise à mort des animaux, les animaux recevront une injection d’un mélange anesthésique suivie d’une prise de sang à la veine cave, suivie d'une dislocation des vertèbres cervicales. L’animal subissant une chirurgie ante mortem, une analgésie supplémentaire sera ajoutée en local pour l’incision de la paroi abdominale. Tous les prélèvements seront réalisés par une personne correctement formée et ayant l’habitude de ce type de prélèvement.
Choix des espèces
La diversité des modèles utilisés dans les infections à Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) des invertébrés comme Caenorhabditis elegans a fourni à la communauté scientifique un grand nombre de modèles animaux permettant d’étudier les différents aspects de l’infection humaine. Néanmoins, les modèles mammifères et parmi eux, le modèle souris est le plus représentatif de la pathophysiologie observée durant une infection. L’utilisation de souris présentant une mutation pour une kinase nous permettra d’évaluer la contribution de cette kinase sur la médiation des effets des shigatoxines notamment dans les cellules endothéliales car ce sont elles qui sont le plus sensible à la toxine. Souris âgées de 6 semaines. L’utilisation de jeunes souris se justifie par le fait que dans un contexte clinique, les personnes les plus sensibles chez lesquelles le développement d’un syndrome hémolytique et urémique (SHU) est le plus fréquent suite à une infection par des EHEC sont les jeunes enfants.
Utilisation de nanoparticules comme vecteur d’antigènes dans un modèle de vaccination par voie intra nasal chez la souris contre des maladies infectieuses
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Vaccinées trois fois par voie nasale ou sous la peau, puis saignées chaque semaine jusqu'à la fin de l'étude, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées pour récupérer leur sang et leurs organes. Les vaccins testés visent des maladies infectieuses animales, avec pour horizon une mise sur le marché. Le porteur écrit par ailleurs que ces vaccins ont déjà été testés sur plus de 600 animaux dans le monde sans provoquer d'effets secondaires.
Objectifs
L'objectif est de tester des vaccins chez la souris en laboratoire est d'évaluer leur sécurité et leur efficacité avant une mise sur le marché. Les souris, en tant que modèles biologiques, permettent d'étudier la réponse immunitaire, les effets secondaires potentiels et la capacité du vaccin à protéger contre des infections spécifiques. Ces tests précliniques sont essentiels pour identifier les doses optimales et s'assurer que le vaccin est sûr et prometteur.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu des tests de vaccins chez la souris est de garantir que le vaccin induit une réponse immunitaire protectrice tout en étant bien toléré. Cela permet d'identifier les formulations prometteuses, réduisant ainsi le risque d'effets secondaires graves. En optimisant la sécurité et l'efficacité du vaccin à cette étape, on accélère le développement de traitements fiables contre des maladies, ce qui peut potentiellement sauver des animaux et prévenir des épidémies.
Procédures
Après leur arrivée et une période d’acclimatation de sept jours en zone d’hébergement, les souris seront manipulées tous les deux jours pendant deux semaines par l’expérimentateur. Cette étape permettra de réduire leur stress et de les habituer à la présence humaine avant le début des procédures. Ce projet comporte plusieurs étapes : Les souris recevront trois doses de vaccin, administrées soit par injection sous la peau, soit par instillation nasale. Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude.
Impact sur les animaux
Les procédures prévues pourraient être une source de stress pour les animaux en raison des manipulations nécessaires. Pour limiter ce stress, les souris seront habituées à être manipulées avant le début des expériences. Les seules douleurs prévues concernent une prise de sang au niveau de la queue, avec l’application d’un anesthésiant local pour limiter l’inconfort, ainsi que l’injection du vaccin sous la peau. Ces souris seront surveillées de près pour s’assurer qu’elles ne ressentent pas de gêne. Pour les souris recevant le vaccin par le nez, une attention particulière sera portée afin d’éviter tout risque de fausse route. La vaccination se fera en douceur, goutte à goutte, avec un très petit volume de liquide. Après l’administration, nous vérifierons qu’elles respirent normalement. Les vaccins utilisés ont déjà été testés sur plus de 600 animaux dans le monde sans provoquer d’effets secondaires. Ils sont fabriqués sur place à partir de composants inactivés et testés en laboratoire pour garantir leur sécurité et leur efficacité.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. En effet, la récupération d’échantillons (sang, organes) est essentielle pour déterminer l’efficacité de nos thérapies.
Remplacement
Notre protocole respecte le principe de remplacement en intégrant des méthodes alternatives lorsque cela est possible, afin de réduire l'utilisation des souris. Avant de recourir aux animaux, nous avons exploré des approches in vitro et des modèles informatiques pour simuler certaines étapes expérimentales, notamment des cultures cellulaires et des modélisations biologiques, qui permettent d’obtenir des informations préliminaires et d’affiner les hypothèses. Cependant, l’utilisation des souris reste nécessaire pour obtenir des données in vivo indispensables à la compréhension des processus biologiques complexes qui ne peuvent pas être reproduits complètement par d'autres méthodes. Ce recours aux animaux n'intervient qu'en dernier ressort, après avoir épuisé toutes les solutions de remplacement non animales possibles.
Réduction
Notre protocole respecte pleinement le principe de réduction en optimisant le nombre de souris utilisées pour atteindre des résultats scientifiques robustes et statistiquement valides. Le calcul de la taille de l’échantillon a été effectué avec soin afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des données significatives, tout en évitant une sous-utilisation ou une surutilisation d’animaux. De plus, nous avons intégré des techniques non invasives et longitudinales, comme des mesures répétées sur le même individu (prélèvements sanguins), pour maximiser l'information obtenue à partir de chaque animal. Ces méthodes permettent de réduire le nombre total de souris tout en garantissant l’acquisition de données complètes et fiables.
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour assurer le bien-être des animaux et réduire au maximum leur stress et leur inconfort. Nos efforts ne se limitent pas à leurs conditions de vie, mais portent aussi sur la façon dont nous réalisons les expériences pour qu’elles soient le moins contraignantes possible. Avant toute intervention, les souris auront une période d’adaptation de sept jours à leur nouvel environnement. Elles seront aussi habituées progressivement à être manipulées par les chercheurs, ce qui les aidera à être plus à l’aise. Nous vérifierons leur état de santé chaque jour en surveillant leur poids, leur alimentation et leur comportement. Si nous détectons le moindre signe d’inconfort, des mesures adaptées seront prises immédiatement pour éviter toute souffrance inutile. Pour réduire la douleur pendant les procédures, nous utiliserons des solutions adaptées : un anesthésiant local avant les prises de sang, un gaz anesthésiant pour certaines interventions, et une surveillance attentive après la vaccination. Enfin, nous veillerons à ce que les souris aient un environnement enrichi avec des éléments adaptés à leurs besoins naturels. Cela leur permettra d’exprimer des comportements normaux et contribuera à leur bien-être général, tout en garantissant des résultats scientifiques plus fiables.
Choix des espèces
Bien que les études in vitro préalables nous aient apporté beaucoup d’informations, les résultats ont besoin d’être confirmés in vivo car un système biologique complexe est nécessaire afin de développer des modèles physiologiques pertinents en regard de nos hypothèses. Nous nous sommes concentrés sur le modèle murin qui a l’avantage de présenter des similitudes avec le modèle humain et pour lequel nous disposons d’un large panel d’outils moléculaires pour son étude. Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire. De plus, il s’agit du modèle le plus utilisé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux des résultats. L'utilisation de souris âgées de 7 semaines dans les expérimentations scientifiques est justifiée par le fait qu'à cet âge, elles sont considérées comme adultes jeunes, ayant atteint leur pleine maturité physique et physiologique. Cela permet d'obtenir des résultats plus fiables et représentatifs des mécanismes biologiques adultes, tout en évitant les variations dues aux processus de croissance ou de vieillissement. De plus, ces souris présentent généralement une santé robuste, facilitant l'homogénéité des groupes expérimentaux et réduisant les biais liés à des facteurs extrinsèques.
Suivi de la progression tumorale et de la formation des métastases par imagerie intravitale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
537 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie de deux heures, après une greffe de cellules tumorales et parfois une chirurgie de trente minutes. 54 sont opérées et tuées avant tout réveil, 246 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 237 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur décrit une progression tumorale accompagnée de prostration, d'amaigrissement, d'anémie et de difficultés respiratoires, et signale que la pose d'une fenêtre optique peut provoquer une infection locale. Les animaux porteurs de cette fenêtre sont isolés pour la préserver, sans que le nombre d'individus concernés par chacune des procédures décrites soit précisé.
Objectifs
Le projet a pour objectifs de mettre au point des méthodes d'imagerie permettant de caractériser différentes étapes de la progression tumorale et de la formation de métastases. Les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules normales présentes au sein des organes métastatiques demeurent mal connus et ce projet permettre de mieux les décrire en les observant en temps réel par microscopie dans l'animal anésthésié. Cette approche est extrèmement puissante car elle permet de visualiser in situ des étapes critiques du cancer.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'acroitre les connaissances fondamentales sur la formation des métastases. À terme, ceci permettra d'améliorer le diagnostique et les thérapies anti-tumorales. On comprend encore mal comment les cellules tumorales interagissent avec les cellules non-tumorales, en particulier les cellules immunitaires. Pourtant ces données sont essentielles à la compréhension de leur rôle pro-métastatique, à la mise en place d’études fonctionnelles cohérentes et au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Notre projet devrait permettre de d’obtenir ces données qualitatives et quantitatives fondamentales et de les corréler à la progression métastatique. .
Procédures
Certains animaux subiront un prélèvement à l'oreille pour génotypage (sur animal vigil, durée 10 secondes). Les animaux subiront une injection de cellules tumorales (sur animal vigil ou sous anesthésie, durée 30 secondes à 3 minutes). Ensuite certains subiront une chirurgie sous anésthésie (30 minutes). Tous les animaux suivront une à 5 séances d'imagerie sous anésthésie (jusqu'à 2 heures par séance). Certains animaux subiront 2 prélèvements sanguins (sur animal vigil ou sous anesthésie, durée 30 secondes), ainsi qu' un traitement chimio thérapeutique (5 injections, durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
La progression tumorale et métastatique peut s’accompagner d’inflammation, de prostration, d'amaigrissement, perte de poids, pelage dégradé, anémie et de difficultés respiratoires.Une partie des animaux seront soumis, sous anesthésie, à des injections de cellules tumorales (intraveineuse ou sous-cutané) pouvant entrainer une inflammation au point d'injection. La pause d’une fenêtre optique peut également conduire à une inflammation voir à une infection localisée. Tous ces aspects sont considérés dans l’établissement des points limites. Les anésthésies répétées peuvent entrainer un stress sur l'animal. Dans cette procédure, les animaux doivent être isolés pour garantir l'intégrité des fenêtres d'imagerie ce qui peut entrainer un stress supplémentaire. Le prélèvement à l'oreille pour génotypage entraine une douleur légère et passagère.
Devenir
Mise à mort de l'animal afin de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses.
Remplacement
Notre projet a jusqu'ici principalement eu recours à des approches in vitro (cultures cellulaires en 2D et 3D) et in vivo chez le poisson zèbre (embryon de moins de 5 jours post-fécondation). Ces approches présentent des limitations, notamment de ne pas prendre en compte toutes les composants cellulaires formant l’eco-système tumoral. Nous souhaitons maintenant valider ces résultats in vivo, dans un environnement complexe impossible à reproduire en intégralité, étape indispensable pour prouver la véracité des mécanismes observés. Nos solides travaux passés nous permettent néanmoins de concentrer nos efforts sur un petit nombre d'expérience pivot. Par ailleurs, nous allons tirer profit d'une approche ex vivo qui consiste à maintenir des tranches de poumons en culture in vitro pendant deux semaines afin de suivre l'invasion métastatique. Cette méthode de suivi longitudinal fournit de nombreuses informations et permet donc de remplacer un certain nombre d'expériences
Réduction
L'imagerie sous-cutanée et après la pause d'une fenêtre abdominale sont compatibles avec un suivi longitudinal des animaux ce qui nous permet d'en réduire le nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Toutes les chirurgies seront réalisées sur animal anesthésié et sous analgésie avec adjonction de gel oculaire pour prévenir des dommages ophtalmiques aux animaux. Une partie des injections sera réalisé sous anesthésie et toutes les séances d’imagerie sous anesthésie. A chaque fois les animaux sont manipulés sur tapis chauffant et mis sous lampe chauffant pour les réveils de chirurgie. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. En cas de douleur, les symptômes seront traités par analgésie. Les souris seront hébergées en groupe de maximum 5 par cage avec accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Les cages seront enrichies avec des dômes de carton et l'ajout de bâtonnets en ouate. L'enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés. Les animaux seront hébergés au minimum 2 semaines avant le début de l’expérimentation pour permettre leur l’adaptation à l’animalerie. Les animaux sont surveillés fréquemment, voir quotidiennement pour les animaux immunodéprimés.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’avoir des organes métastatiques (ganglions lympathiques, poumons, foie) identiques à ceux impliqués dans la pathologie humaine. La matrice extracellulaire qui nous intéresse particulièrement est également très proche. Au cours des dernières années, nous avons mis au point des outils et protocoles nous permettant de suivre par bioluminescence la progression in vivo de manière longitudinale et non invasive et par imagerie ex vivo l'invasion métastatique sur coupes de poumons. Les animaux qui seront utilisés sont des adultes pour mimer les pathologies cancéreuses rencontrées dans l’espèce humaine.
Nouveaux traitements pour faciliter l’abstinence aux opiacés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour extraire leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de douze à vingt-six injections ou gavages et développent des symptômes de dépendance aux opiacés et de sevrage. L'objet est d'identifier des traitements facilitant l'abstinence et limitant les troubles de l'humeur qui accompagnent la dépendance. Le porteur annonce quatre tests comportementaux, d'une durée de six à quarante-cinq minutes, sans préciser lesquels.
Objectifs
Les troubles de consommations aux opiacés sont en forte augmentations ces dernières années et ont des conséquences dévastatrices. Ce projet de recherche vise à identifier de nouveaux traitement pouvant limiter le développement des troubles de l’humeur (en particulier dépression) qui se développent lors de la mise en place d’une dépendance aux opiacés. Les opiacés agissent sur le « système opioïde » dans le cerveau. En conditions normales, ce système neuromodulateur régule la douleur, les processus de récompense, les réponses émotionnelles et les réponses au stress. L’exposition aux opiacés altère le fonctionnement de ce système, ce qui conduit aux troubles du comportement et de l'humeur. L’objectif de ce projet consiste à comprendre le développement de ces pathologies, en identifiant des traitements pouvant faciliter l'abstinence aux opiacés, en utilisant des modèles murins. Ce projet sera conduit en respectant la règle des 3R (remplacer –réduire –raffiner) visant à remplacer ou réduirechaque fois que possible le nombre d’animaux, ainsi qu’à optimiser les procédures pour minimiser l’inconfort des animaux tout en permettant d’étudier l’effet de l’exposition aux opiacés sur l’état émotionnel des animaux au long court (4 semaines).
Bénéfices attendus
Nous espérons trouver des nouveaux traitements pour faciliter l'abstinence aux opiacés et ainsi limiter les symptômes de désespoir et ainsi éviter la rechute ou re-consommation de substance pouvant mener à la mort par overdose des personnes avec des troubles de consommation.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des injections ou des gavages (de 12 à 26) et à des tests comportementaux (4). La durée d'une injection ou d'un gavage est de 30 secondes et un test comportemental dure de 6 minutes à 45 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Les injections répétées pourront également un stress modéré.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d'extraire le cerveau pour des analyses moléculaire.
Remplacement
"Remplacement" : Pour résoudre ce projet, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux, notamment avec les réseaux complexes de structures interconnectées dans le système nerveux central chez l’Homme. Les modèles cellulaires ne nous permettraient pas de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle (multiples structures cérébrales impliquées). Il en va de même pour les effets moléculaires des opiacés, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.
Réduction
"Réduction" : Les animaux utilisés étant de même parenté sanguine permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 15 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif. De plus, chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.
Raffinement
"Raffiner" : Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, des papiers absorbants et un dôme pour faire un nid. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations . Les sites d'injections seront alternés (gauche/droite) et des aiguilles à usage unique seront utilisées. Les souris seront laissées un minimum deux semaines d’acclimatation dans leur arrivée dans la zone d’expérimentation. En cas de bagarre importante les animaux seront séparés.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome. Les souris sont un modèle privilégié pour la recherche biomédicale et sont désormais utilisées comme modèles standard pour l'étude de la fonction neuronale et des réponses comportementales associées en conservant une complexité structurelle et intégrative intacte du système nerveux. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés. Les souris seront adultes, car l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures et adultes.
Creation et caractérisation de la lignée PKD2L1KO*SOD1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent deux modifications génétiques combinées, dont celle qui reproduit chez elles la sclérose latérale amyotrophique. 3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 724 d'entre elles et sévère pour 1 056. 1 056 animaux nagent jusqu'à trois fois trente secondes dans un couloir d'eau tous les quinze jours et subissent deux fois par semaine un test de force d'agrippement, à mesure que leurs membres postérieurs s'affaiblissent. Le porteur écarte les modèles invertébrés au motif qu'ils n'ont pas de moelle épinière organisée, et prévoit des tétines de biberon allongées pour les animaux qui n'atteignent plus leur eau.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie qui entraîne une dégradation progressive des neurones moteurs – les cellules chargées de transmettre la commande motrice produite par le cerveau vers les muscles –. En général, cette maladie est fatale dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic. Malgré la création de plusieurs modèles animaux, aucune cause précise de cette perte des neurones n’a encore été trouvée. Des recherches récentes ont permis d’identifier un type unique de neurones situés autour du canal central de la moelle épinière, appelés neurones de contact avec le liquide cérébrospinal. Ces neurones ont une structure particulière, avec une extension qui atteint directement le liquide. Leur rôle reste encore largement inconnu, mais on sait que dans le cas de la maladie de Charcot, la composition du liquide cérébrospinal devient toxique. Il semblerait que les neurones autour du canal central soient capables de détecter les changements de composition du liquide cérébrospinal grâce à une protéine spécifique. Notre projet vise à étudier l’implication de cette protéine dans la maladie de Charcot en utilisant entre autres des souris dont le gène codant pour cette protéine a été invalidé.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’étudier le rôle des neurones présents autour du canal central de la moelle épinière et l’implication des facteurs qu’ils libèrent dans le développement de la maladie de Charcot. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la vie des patients.
Procédures
1056 animaux seront soumis à des mesures de vitesse de nage dans un couloir de nage (maximum 30 secondes dans l’eau trois fois avec un temps de pause de 2 min entre chaque test) tous les 15 jours à compter de leur 2 mois. 1056 animaux seront soumis à des tests de force d’agrippement (maximum 3 minutes 30), deux fois par semaine à partir de deux mois postnataux. Afin de déterminer le génotype des animaux, une biopsie de 1mm, pouvant entrainer une douleur légère, sera réalisée en quelques secondes durant les 15 premiers jours postnataux au niveau de la queue des animaux.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices des membres antérieurs mais surtout postérieurs. Les animaux seront aussi soumis à un stress modéré lié aux tests de comportements.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment prédictive qui permettrait de se passer de l’utilisation d’animaux pour étudier la maladie de Charcot. La SLA est une maladie neurodégérative multifactorielle d’étiologie complexe avec des formes génétiques et sporadiques. L’absence de moelle épinière organisée chez les invertébrés ne permet pas d’utiliser ces modèles animaux lorsqu’on s’intéresse aux processus de dégénérescence des neurones spinaux .
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, nous ferons des études comportementales et des analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par l’expérience que nous avons acquise au laboratoire qui travaille depuis de nombreuses années sur ce modèle animal dans lequel il y a une variabilité interindividuelle importante quant à l’évolution des processus neurodégénératifs.
Raffinement
Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Des dispositifs adaptés aux besoins des animaux commençant à présenter des faiblesses motrices seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité. Les mâles étant agressifs entre eux, leur nombre est limité à 4 dans une cage de taille moyenne et à 6 dans une grande cage. De l’enrichissement sera aussi ajouté pour permettre un maximum de cachettes (maison en carton, tunnel, sizzlenest). Les intervenants sont formés aux points limites de la maladie et interviennent dès que cela est nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix de la sclérose latérale amyotrophique aujourd’hui dans la communauté scientifique. Il existe des modèles d’invertébrés de la sclérose latérale amyotrophique mais l’absence de moelle épinière organisée ne permet pas du tout les mêmes études surtout lorsqu’on s’intéresse, comme ici, à des neurones hyperspécialisés et à leur rôle chez le mammifère qui est vraisemblablement extrêmement différent de celui qu’ils ont chez les invertébrés. Les tests comportementaux commenceront 60 jours après la naissance, bien avant l’apparition des premiers symptômes moteurs afin d’avoir une période contrôle avant la dégradation progressive des différents paramètres moteurs analysés
Etude des changements de l’immunité innée liés à l’âge dans le contexte des tumeurs pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injection de cellules tumorales au premier jour, puis deux fois par semaine une injection de marqueur et une imagerie du corps entier sous anesthésie, pendant quatre semaines au plus : 894 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs pulmonaires qui se développent peuvent occasionner une gêne respiratoire. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem, l'objet étant de comprendre comment des macrophages vieillissants favorisent le cancer du poumon chez les personnes âgées. Le calcul annoncé, vingt-quatre souris par condition et cinq génotypes comparés, laisse de côté les trente souris consacrées au seul choix de la lignée de cellules tumorales.
Objectifs
Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il est particulièrement fréquent chez les personnes âgées : 50 % des cas sont diagnostiqués chez des patients de plus de 70 ans. Nous souhaitons donc étudier le développement du cancer du poumon dans le contexte du vieillissement. Les macrophages sont un type de cellules du système immunitaire inné, ce qui signifie qu'ils peuvent réagir rapidement et immédiatement à des menaces telles que l'invasion d'agents pathogènes. Il est également connu que les macrophages se trouvent souvent à proximité de tumeurs en développement. Récemment, des chercheurs ont découvert que dans le cancer du poumon, les macrophages sénescents s'accumulent et favorisent la croissance de la tumeur et la progression de la maladie. La sénescence est un état souvent observé dans les cellules des personnes et animaux âgées. Les cellules sénescentes cessent de se diviser, accumulent des dommages et changent de morphologie et de fonctionnalité. On ne sait toutefois pas comment ces macrophages "âgés" contribuent au développement des tumeurs pulmonaires. Pour répondre à cette question, nous utiliserons différents modèles génétiques de souris qui provoquent un vieillissement accéléré spécifiquement dans les macrophages pulmonaires, mais pas dans les autres cellules du tissu. Nous étudierons le développement de tumeurs chez ces souris et les caractéristiques différentielles des macrophages jeunes et vieux dans ce contexte. Globalement, ce projet vise à découvrir comment les changements liés à l'âge dans le système immunitaire inné contribuent au développement de tumeurs pulmonaires, ce qui ouvrira la voie à de futurs traitements anticancéreux potentiels adaptés aux personnes âgées.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon est responsable de la plupart des décès liés aux tumeurs dans le monde. L'âge élevé est l'un des principaux facteurs de risque de son développement et de sa progression, 50 % des cas étant diagnostiqués chez des patients âgés de plus de 70 ans. On sait que les macrophages pulmonaires sénescents, qui s'accumulent au cours du vieillissement de l'organisme, jouent un rôle pro-tumorigène dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules, le type de cancer du poumon le plus courant. Mais jusqu'à présent, on ne comprend pas comment ils contribuent au développement de la tumeur. Dans ce projet, nous visons à identifier les caractéristiques des macrophages sénescents qui favorisent la croissance des tumeurs pulmonaires. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les organismes âgés sont plus enclins à développer des tumeurs pulmonaires et quel rôle le système immunitaire inné joue dans ce processus. À long terme, ce projet permettra d'accroître nos connaissances sur la manière de prévenir la progression du cancer dans des conditions de vieillissement du système immunitaire et de développer des options de traitement immunothérapeutique spécifiquement adaptées aux personnes âgées. Étant donné que les macrophages sont des cellules résidentes dans tous les tissus et que le vieillissement est un facteur de risque pour de nombreuses maladies, nous nous attendons à ce que ce travail ait un large impact et soit pertinent au-delà du cancer du poumon.
Procédures
Chaque animal recevra une injection de cellules tumorales au début de l'expérience (durée du geste : environ 10 secondes). À partir du troisième jour après l'injection, la taille de la tumeur sera contrôlée deux fois par semaine, ce qui nécessite l'injection d'un produit de marquage (durée du geste : inf à 10 sec) et la réalisation d'une imagerie non invasive du corps entier sous anesthésie (durée de l’anesthésie :10 minutes). La durée maximale de l'expérience est de 4 semaines.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse de cellules tumorales et l'injection de produits de marquage pour l’imagerie peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d'injection. Les animaux auxquels on a injecté des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires qui pourront occasionner une gêne respiratoire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Nous nous intéressons à la réponse systémique du système immunitaire au développement de tumeurs pulmonaires. Cette réaction ne peut être étudiée que dans un organisme entier, avec une circulation lymphatique et sanguine intacte, une hématopoïèse active (formation de nouvelles cellules immunitaires par la moelle osseuse) et des poumons fonctionnels. l De nombreuses méthodes requises pour le projet proposé ainsi que des modèles génétiquement modifiés pour nos protéines d'intérêts ne sont disponibles et établis que chez la souris.. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis dans la littérature, ce qui fait de la souris un organisme modèle approprié. Dans la mesure du possible, nous utiliserons des alternatives in vitro à l'expérimentation animale, telles que la co-culture de macrophages et de cellules tumorales. Nous disposons déjà de premiers résultats utilisant ce système in vitro (sphéroïdes, formés à partir de la co-culture de cellules tumorales et de macrophages), qui renforcent nos hypothèses. Cependant, ce système est trop simplifié pour comprendre pleinement les adaptations que les macrophages du poumon et d'autres composants du système immunitaire subissent in vivo en réponse au développement de tumeurs. En outre, nous prévoyons de remplacer la microscopie in vivo par des approches d'imagerie ex vivo, qui réduisent le nombre de procédures sur les animaux vivants, mais qui nécessitent toujours l'induction et la surveillance de tumeurs in vivo.L'expérimentation animale ne peut donc pas être entièrement remplacée par des alternatives in vitro.
Réduction
Nous avons déterminé, sur la base d'expériences déjà réalisées avec des tests statistiques, que nous avons besoin de 24 souris par condition expérimentale. Nous les répartirons en 3 groupes d'expériences indépendantes de 8 animaux chacune afin d'obtenir des résultats aussi robustes que possible. Nous étudierons 5 génotypes différents ainsi que des souris non modifiées génétiquement, y compris des contrôles correspondants pour chacune de ces conditions. Nous aurons besoin de 3 séries d'expériences pour l'analyse des tissus post-mortem. De plus, nous devons tester trois lignées différentes de cellules tumorales pour trouver celle qui donne le meilleur résultat expérimental. Cela nécessite 30 souris. Pour réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous employons un plan d'étude longitudinal basé sur l'imagerie par bioluminescence pour mesurer la croissance tumorale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Pour l'analyse post-mortem, le tissu pulmonaire sera réparti entre plusieurs méthodes d'analyse afin de permettre une utilisation optimale de chaque animal impliqué dans l'expérimentation animale.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. La lignée cellulaire tumorale qu’on utilisera permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence (mesure non invasive, faite deux fois par semaine, pendant maximum 4 semaines). Nous pèserons également les souris deux fois par semaine pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction d’une grille de score adaptée à notre projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.
Choix des espèces
Les souris sont le modèle de choix pour les expériences dans le domaine de l'immunologie des tumeurs. Cette recherche nécessite un contexte génétique bien défini et des modèles génétiquement modifiés, qui ne sont disponibles que chez cette espèce. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis. Tous ces éléments font de la souris le seul organisme modèle approprié pour notre projet. Des souris adultes seront utilisées pour toutes les expériences, ce qui est nécessaire pour étudier un système immunitaire mature. Comme nous étudions les effets du vieillissement sur le développement des tumeurs, nous utiliserons des souris dont l'âge se situe entre 8 semaines (jeunes adultes) et 24 mois (adultes âgés).
Travaux pratiques : « Formation à l’expérimentation animale niveau praticien chez le rat et la souris»
- Enseignement supérieur
Rats : 285
Déjà utilisés dans une précédente séance de travaux pratiques, 370 souris et 285 rats vont servir à deux séances supplémentaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent de l'eau par sonde gastrique et du sérum physiologique par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale, à raison de deux gestes par animal espacés d'une semaine. Aucune connaissance n'est produite ici, il s'agit de former des étudiants de deuxième année aux gestes techniques et de valider leur aptitude pratique. Une troisième réutilisation étant exclue, les 655 animaux sont tués à la fin des travaux pratiques.
Objectifs
Cette formation s'adresse aux étudiants de deuxième année après le baccalauréat, destinés à la profession de technicien ou assistant-ingénieur de laboratoire. Dans une structure de recherche publique ou privée, ils peuvent donc être amenés à travailler sur des animaux vivants. Par conséquent, ces étudiants doivent être formés aux techniques utilisées en expérimentation animale et obtenir un diplôme d’expérimentation animale de niveau praticien. Depuis plus de 25 ans, notre établissement propose une formation d’habilitation animale de niveau praticien, intégrée à la formation initiale. Ce projet a pour objectif de former ces étudiants aux techniques peu invasives et d’évaluer leurs aptitudes pratiques. Ces deux objectifs sont déjà intégrés dans l'autorisation à délivrer la formation à l'expérimentation animale niveau praticien en cours dans l'établissement.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de notre formation à l’expérimentation animale, il est nécessaire de former nos étudiants à des gestes techniques couramment utilisés dans les structures utilisant des animaux de laboratoires, mais également de renforcer leurs compétences en contention des animaux. En parallèle lors de cette formation nous inssistons particulièrement sur le respect des règles de bien-être animal lors du travail avec des animaux de laboratoire. Un personnel formé travaillera dans le respect de l’animal. Nous savons que les étudiants issus de notre formation sont capables d’intégrer un projet sur le rongeur et d’y être rapidement autonomes et efficaces (stage ou apprentissage dans la suite de leur formation, emploi en fin de formation…).
Procédures
Certains rats recevront une administration d'eau par voie orale (durée 0,5-1 min) et une injection de sérum physiologique par voie intrapéritonéale la semaine suivante (durée 0,5-1 min); les autres rats recevront une injection de sérum physiologique par voie intramusculaire dans chaque cuisse (0,5 min/injection) deux fois, à une semaine d'intervalle. Certaines souris recevront une injection de sérum physiologique par voie intraveineuse (durée 0,5-1 min) et une injection de sérum physiologique par voie sous cutanée (durée 0,5-1 min) la semaine suivante; les autres souris recevront une injection de sérum physiologique par voie sous cutanée (durée 0,5-1 min) et une injection de sérum physiologique par voie intrapéritonéale la semaine suivante (durée 0,5-1 min).
Impact sur les animaux
Seul du sérum physiologique ou seule de l'eau est administré aux animaux. Les contentions génèrent du stress chez l’animal et les injections provoquent une légère douleur lors de l’introduction de l’aiguille. L'insertion de la sonde dans la gorge de l'animal provoque un inconfort lors de l'administration par voie orale.
Devenir
Les animaux seront utilisés lors de deux séances de travaux pratiques (apprentissage et évaluation), mais ils auront préalablement déjà été utilisés dans une autre séance de travaux pratiques (TP) avec d'autres procédures. Ainsi il n'est pas possible de pouvoir réutiliser ces animaux dans une troisième procédure et les animaux seront mis à mort à la fin de ces travaux pratiques.
Remplacement
Notre établissement est détenteur d’une autorisation à délivrer une formation à l’expérimentation animale niveau praticien spécialité rongeurs et ce depuis plus de 25 ans. Dans ce cadre, il est nécessaire que nos étudiants soient familiarisés avec ces techniques d’administration de produits chez le rat et la souris. De plus, les compétences pratiques des étudiants sur ces espèces doivent obligatoirement être validées lors d’une épreuve pratique pour pouvoir attribuer cette autorisation. Ce projet, dont nous demandons ici le renouvellement, fait partie de l'autorisation à délivrer l'expérimentation animale délivrée par la Commission Nationale pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Il n’est donc pas possible dans ce cadre de remplacer l’utilisation d’animaux par des méthodes alternatives.
Réduction
Rats : Lors de la séance d'apprentissage, pour la voie intramusculaire (IM), un rat sera utilisé pour deux étudiants (une injection dans chaque cuisse) et chaque étudiant utilisera également un rat pour réaliser la voie orale (VO) lors de cette séance d’apprentissage. Quatre animaux supplémentaires seront prévus, dont deux serviront pour la démonstration des gestes techniques par l'enseignant. Les animaux seront réutilisés pour la séance d'évaluation : le rat ayant reçu la VO recevra une injection intrapéritonéale (IP) lors de l’évaluation pratique, l’IM sera réalisée sur le même rat dans les mêmes conditions. Ainsi, 35 rats seront nécessaires pour la VO et l'IP et 18 rats pour l'IM pour 35 étudiants, plus 4 animaux, soit 57 animaux pour 35 étudiants maximum par an et 285 rats pour 5 ans. Souris : deux souris par étudiant seront nécessaires pour la séance d'apprentissage, une pour la voie intraveineuse (IV) et une pour la voie sous-cutanée (SC). Les souris seront réutilisées pour la séance d'évaluation, la semaine suivante: celles ayant servi pour l’IV recevront une SC et les souris ayant reçu la SC recevront une IP. De plus, 2 souris surnuméraires seront prévues en cas de problème pour chaque procédure (animal malade ou stressé avant le TP par exemple), dont l'une servira pour la démonstration des gestes techniques par l'enseignant. Ainsi 74 souris seront nécessaires pour 35 étudiants maximum par an et 370 souris pour 5 ans. Ce chiffre sera bien évidemment indexé sur le nombre réel d'étudiants inscrits dans la formation. Nous souhaitons que tous ces animaux soient réutilisés depuis des protocoles de TP de pharmacologie ou de physiologie peu invasifs réalisés précédemment dans notre établissement, afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Afin de garantir une formation efficace de nos étudiants il n'est pas possible de diminuer plus le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement comprenant au moins 2 éléments (rat: tunnel en plastique noir, bâtonnet en bois, noix à ronger; souris: tunnel/maison en plastique, morceaux de boîte à oeufs, lanières de papier kraft servant à la création de nids par les animaux) et en groupes socialement harmonieux dans des cages appropriées à l’espèce et en nombre adapté. Afin de limiter le stress des animaux lors des manipulations, les animaux seront habitués à la préhension/contention pendant la semaine précédant le début des TP. Cette habituation se fera via un système de récompense (pop corn, gâteau sec, vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt séché…). Préalablement aux séances, une observation clinique des animaux permettra d’exclure du TP tout animal stressé ou malade (poils hérissés, prostration …). Les TP seront réalisés avec de petits groupes d’étudiants. Les étudiants seront incités à ne pas faire trop de bruit pour ne pas effrayer les animaux. Un soin particulier sera apporté à la démonstration du respect des règles de bien être animal lors de chaque TP, afin que les étudiants soient parfaitement formés à l’éthique en expérimentation animale. Par ailleurs les plus gros rats (280 à 380 g) seront préférentiellement utilisés pour l’administration par voie IM, leur masse musculaire plus importante diminuant l’inconfort des animaux. Les animaux seront récompensés après chaque manipulation (pesée, contention, administration de produit). De plus, les souris auront été habituées par notre personnel à être prises en préhension dans le creux de la main et non par la queue afin de diminuer leur stress.
Choix des espèces
Notre établissement est habilité à délivrer une formation à l’expérimentation animale niveau praticien, spécialité rongeurs. En effet, les souris et les rats constituent les espèces les plus fréquemment ultilisées à des fins scientifiques en France et également en Europe, pays où nos étudiants peuvent poursuivre leur carrière professionnelle. Ainsi, les rats et les souris sont des modèles de choix pour ces travaux pratiques destinés à former aux techniques d’administration et de prélèvement les plus courantes chez les rongeurs. Rats : Les manipulations se feront sur des rats adultes (plus de 7 semaines) correspondant au stade d’utilisation classique de ces animaux pour ce type de formation. En général, le poids des rats variera de 200 à 380 g en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les plus gros rats (280 à 380 g) seront préférentiellement utilisés pour l’administration par voie IM, leur masse musculaire plus importante diminuant l’inconfort des animaux. De plus, cette pratique étant réalisée par 2 étudiants, la maîtrise de la seule contention par l’étudiant d’un rat d’environ 380 g est ainsi facilitée. Souris : les manipulations auront lieu sur des souris adultes, pesant entre 25 et 50 grammes. Ce poids correspond au poids des souris classiquement utilisées en expérimentation et permet une manipulation aisée pour les étudiants, diminuant ainsi le stress des animaux.
Etude du rôle des récepteurs CB1 dans la mémoire de peur pathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cinq semaines avant le premier test, 57 % des animaux subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes destinée à permettre l'enregistrement de leur activité neuronale. 1 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de provoquer une mémoire de peur pathologique, analogue à celle des états de stress post-traumatique, puis de mesurer le rôle des récepteurs cannabinoïdes de type 1 dans son acquisition. Le porteur retient la souris parce que le modèle d'altération de la mémoire traumatique a été établi chez elle et que le matériel comportemental est dimensionné pour cette espèce.
Objectifs
Les états de stress post-traumatiques (EPST) ont une prévalence importante dans le monde et sont extrêmement invalidant pour les patients en souffrant. Une des caractéristiques majeures de ces troubles correspond à une altération qualitative de la mémoire associant (i) une hypermnésie émotionnelle, i.e. intrusion des souvenirs traumatiques dans un contexte ordinaire et sûr de la vie quotidienne, et (ii) une amnésie contextuelle, i.e. impossibilité du patient à précisément décrire le contexte péri-traumatique. De plus, les stratégies thérapeutiques pour ces troubles ne sont que très limitées avec un fort taux de rechute, cela étant en grande partie dû à une grande méconnaissance des mécanismes neurobiologiques sous-jacent. Le système endocannabinoïde, et plus particulièrement les récepteurs cannabinoïdes de type 1 , sont un des systèmes majeurs régulant les comportements de stress. L’objectif de ce projet est de caractériser l’implication des récepteurs CB1 dans l’acquisition et l’expression de cette mémoire, ce qui pourrait permettre de proposer un potentiel mécanisme neurobiologique sous-tendant ces pathologies, ainsi qu’une éventuelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Par la caractérisation d’un mécanisme neurobiologique sous tendant la mémoire traumatique, ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1.
Procédures
Les animaux de ce projet seront tous soumis à un test de mémoire d'une durée comprise entre 2.5 et 6min par jour sur 4 jours, ainsi qu’à des injections (1 ou 2 selon le groupe expérimental, réalisées au jour 2 du test de mémoire). Parmi l’ensemble des animaux du projet, 57% subiront en plus au préalable (minimum 5 semaines avant le test comportemental) une intervention chirurgicale d’environ 30 à 45 minutes sous anesthésie avec pré, péri- et post médication permettant de minimiser le stress et la douleur qui permettra l’étude de l’activité neuronale.
Impact sur les animaux
Notre étude repose sur l’utilisation d’un test de mémoire associé à des injections permettant d’étudier le développement d’une forme de mémoire émotionnelle ce qui peut générer un stress temporaire chez l’animal. Aussi, l’étude de l’activité neuronales requiert une intervention chirurgicale préalable pouvant engendrer de la douleur et du stress, qui seront pris en charge par l’utilisation de médication avant, pendant et après l’acte chirurgical associées à un suivi méticuleux de la récupération post-opératoire. Ces nuisances entrainent une classe de sévérité « modérée ».
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue du protocole comportemental afin d’éviter tout stress/souffrance supplémentaire. Les animaux ayant subit une intervention chirurgicale seront mis à mort à l’issue de la procédure comportementales afin de s’assurer de la réussite de la chirurgie et d’étudier l’activité du cerveau.
Remplacement
L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par (i) l’absence de modèle in vitro permettant l’étude des processus de mémorisation et (ii) la nécessité de manipuler l’expression et/ou l’activité des récepteurs CB1 lors de ces processus. L’organisation du système nerveux des souris est suffisamment proche de l’espèce humaine pour pouvoir raisonnablement extrapoler les observations faites sur ces animaux.
Réduction
Le nombre de souris se justifie de par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux pour permettre des analyses statistiques concluantes. Un nombre inférieur pourrait impliquer une réplication de l’expérience ce qui induit l’utilisation d’un nombre encore plus important d’animaux.
Raffinement
Toutes les souris du projet seront hébergées dans une animalerie agréée disposant d’une régulation de température, d’hygrométrie et du cycle jour/nuit (12h/12h). Les animaux seront tous hébergés collectivement avec du matériel de nidification adapté au nombre d’animaux, ainsi que de l’eau de boisson et de la nourriture ad libitum. Les cages seront changées une fois par semaine tout en maintenant le plus possible le matériel de nidification lors du changement afin de conserver l’empreinte olfactive et ainsi diminuer le stress. Toutes les souris seront quotidiennement observées permettant ainsi de détecter précocement tout changement. Si besoin, l’animal sera soigné et/ou surveillé, avec consultation du vétérinaire. Pour les animaux subissant une intervention chirurgicale, le stress et la douleur potentielle seront pris en charge par la mise en place de pré-, péri- et post-médication adaptée associées à un suivi méticuleux de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce animale est la souris adulte. Cela se justifie par sa proximité phylogénétique avec l’Homme et la présence de comportement similaires notamment concernant les processus de mémoire, d’intérêt pour le présent projet. En effet, la plupart des études sur les mécanismes de la mémoire émotionnelle ont été obtenu chez cette espèce. De plus l’utilisation de souris permet l’étude au niveau (sub)cellulaire via des techniques histologiques. Enfin le modèle central à ce projet, i.e. l’altération qualitative de la mémoire de type EPST, a été établi chez la souris. Aussi, l’ensemble du matériel comportemental utilisé est dimensionné pour cette espèce. Les souris utilisées seront toutes à l’âge adultes (8-16 semaines) le modèle ayant été validé à ces âges. De plus, l’expression et la distribution des récepteurs CB1 varie au cours du développement ce qui pourrait altérer les conclusions du présent projet.