Souris

Greffées d'une tumeur sous la peau en état vigile, mesurées trois fois par semaine, traitées par injection dans la veine de la queue puis mises à mort quand la tumeur atteint 1 500 mm3 ou se nécrose, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est immunodéprimée pour éviter le rejet des cellules tumorales humaines. Le porteur affirme que les preuves d'efficacité hors organisme vivant ont déjà été obtenues et qu'aucune alternative ne peut se substituer à la souris, les candidats médicaments visant une cible commune à la souris et à l'être humain. 928 souris sont réutilisées dans une autre procédure, et celles qui n'entrent pas en protocole sont réformées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : # La Procédure-1 permettra mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s contrôle de référence sur les meilleurs modèles de procédure-1. # La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection souscutanée ainsi que lors (2) de l’injection par intraveineuse dans la veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger).Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souches consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte. # Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Les souris blanches sont retenues pour leur capacité à supporter des parasitémies de 50 à 60 % tout en affichant un tableau clinique facile à suivre. 114 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, infectées par une souche léthale de paludisme murin, avec un risque de mort que le porteur reconnaît en cas d'inefficacité du traitement. Chaque jour, elles reçoivent le candidat médicament par gavage ou par injection dans le ventre, sont maintenues contentionnées jusqu'à vingt minutes et subissent une piqûre à la queue pour un frottis, deux d'entre elles étant saignées à l'œil sous anesthésie. Toutes sont ensuite tuées après sédation, pour récupérer leurs organes et notamment le cerveau à l'état frais.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à confirmer ou non l'activité antipaludique d'un candidat dans un modèle de paludisme murin. Ce candidat antipaludique a déjà été testé sur des cultures cellulaires pour déterminer ses différentes caractéristiques biologiques. Il s'agit également de savoir si ce candidat antipaludique améliore l'activité d'un antipaludique déjà connu et servant de référence. La voie d'administration et la fréquence seront également testées afin d'analyser l'effet de la molécule sur la parasitémie. Ce projet est l'étape consécutive aux différents tests réalisés sans animaux tels que la sélection des composés les plus efficaces parmi les différentes molécules produites.

Bénéfices attendus

Le bénéfice espéré reste toujours le même : celui de trouver un nouveau candidat antipaludique ou une nouvelle famille chimique candidate à développer dans un contexte ou l'espèce pathogène responsable du paludisme développe de plus en plus vite des résistances au traitements actuels et devient également moins facile à détecter en raison de modifications génétiques, tout en se propageant dans des zones où il avait soit disparu soit n’existait pas.

Procédures

Les interventions de ce modèle sont les suivantes : l'infection des souris par l'injection au niveau du ventre d'une souche léthale de paludisme murin (1 fois, moins de 2 min). Le prélèvement de sang au niveau de l'oeil, sous anesthésie pour 2 souris (8 min en moyenne sous anesthésie un seul prélèvement). La manipulation et à la contention (inférieure à 20 min par souris par jour pendant 4 jours et 10 min par souris et par jour tous les jours à partir du 5ème jour), La prise de médicament sous contrainte (inférieur à 5 min, par souris par jour hors temps d'observation après la prise, pendant 4 jours), l'injection du médicament au niveau du ventre (3 minutes par souris par jour, pendant 4 jours). La piqure nécessaire à la réalisation de frottis une fois par jour au niveau de la veine de la queue (moins de 2 minutes, sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 4 jours puis tous les 2 jours après les 4 jours de traitement). Les injections au niveau de la peau, ou de l'abdomen pour les analgésies et anesthésies et enfin la pesée sur balance (moins de 2 minutes, sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 4 jours puis tous les 2 jours après les 4 jours de traitement)

Impact sur les animaux

Nous choisissons une combinaison entre la souris et le pathogène où l'infection se réalise à bas bruit et de façon continue. Les effets vont de la perte d’appétit entrainant une perte de poids et des phases de prostration transitoires. Les souris auront le dos rond et en fonction de la parasitémies l’apparition de poils hérissés. Les souris seront infectées par une souche léthale du paludisme murin, il y a donc un risque de mort en cas d'inefficacité du traitement. Il y a la réalisation de frottis par prélèvement d'une goutte de sang à la queue. Ce prélèvement n'est pas indolore mais équivaut au test de glycémie chez l'adulte diabétiques et il est réalisé sans contention pour la souris.

Devenir

Conformément à l'Annexe IV de l'Arrêté du 1er février 2013 les souris seront toutes euthanasiées après sédation afin de récupérer tous les organes et notamment le cerveau dans un état frais et correct pour les lots expérimentaux.

Remplacement

Cette procédure permet de poursuivre nos travaux à la suite des différentes expériences déjà réalisés in vitro. En absence de système complet permettant de reproduire l'infection et le métabolisme des médicaments nous nous tournons vers le modèle animal. Les Organes sur puces et Organoïdes ne sont pas encore complets concernant les maladies infectieuses de façon générale et plus précisément dans le cas du paludisme, où toutes les formes et étapes du cycle ne sont pas reproduites ou assurées.

Réduction

Notre projet utilise le nombre minimal mais significativement déterminant pour conclure sur l'efficacité ou non de notre candidat. Notre demande est en revanche complété par une démarche de publication où l'expérience doit être reproduite 3 fois (triplicate) dans un Journal repondant au standart des recommandations ARRIVE. Mâles et femelles sont utilisées dans cette étude mais le sexe est pris en compte comme facteur non bloquant et il n'est donc pas nécessaire d'augmenter les effectifs.

Raffinement

Il s'agit d'un test d'efficacité antipaludique in vivo où seule compte l'activité antipaludique du médicament. L'ensemble des mesures permettant de raffiner les différentes procédures expérimentales seront prises. La nourriture et l'eau seront disposées à volonté, de la nourriture hydratée mais aussi des tétines plus longues seront mises à disposition lors des phases de prostration précédemment définies. L'utilisation de coussin chauffé est préconisée dans notre unité permettant de chauffer non seulement la cage investiguée mais aussi l'ensemble de l'armoire ventilée. En cas de douleur chez les animaux des analgésiques et des soins particuliers permettant d’atténuer la douleur seront mis en place. Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Ils bénéficieront d’une période de repos de 5 jours après livraison dans l’animalerie de l’établissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Les médicaments anti-douleur seront utilisés afin de limiter l'inconfort des souris suivant les différentes procédures. Systématiquement, nous utiliserons un analgésique si les sites d’injection deviennent sensibles pour les souris. Les sites d'injection sont sensibles quand la souris montre une agitation même après avoir été saisie pour l'injection au niveau du ventre, la peau s'est épaissie (car la souris s'est grattée). Enfin les injections au niveau de l'abdomen et les prélèvements au niveau de l'œil seront atténués par l'ajout d'analgésique et d'anesthésiant.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi car il est un support idéal pour l'infection par le parasite murin du paludisme. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris blanches pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 50 à 60%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Ce modèle existe depuis plus de 60 ans et il a permis la protection d'animaux sauvages, initialement capturés pour de la recherche antipaludique. Les souris blanches seront des animaux adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 9 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi à la maturité du système immunitaire.

Gavées ou injectées deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant un mois, puis rasées et épilées à la cire sous anesthésie, 148 souris porteuses de neurofibromes cutanés vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées pendant toute la durée du traitement, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress à gérer. Il écrit par ailleurs qu'aucune des procédures n'est douloureuse et que les tumeurs de son modèle sont plates, petites et indolores, tout en décrivant des irritations cutanées après l'épilation et des douleurs ponctuelles aux sites d'injection. Quatre des cinq composés testés l'ont déjà été sur le même modèle lors d'une étude précédente, et la peau du dos de chaque souris est prélevée après la mise à mort.

Objectifs

La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 million des personnes dans le monde. Elle se caractérise par l'apparition de tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés et dont le nombre peux atteindre des milliers. Ces tumeurs, en plus d’être esthétiquement dommageables, peuvent causer des démangeaisons et des douleurs impactant sévèrement sur la qualité de vie du patient. Nous avons conçu le modèle murin de NF1 (Nf1-KO) qui recapitule le développement des NFc. Ce modèle est utilisé pour décoder les mécanismes qui gouvernent le développement des NFc et pour l’élaboration des pharmacothérapies pour leur traitement. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité de 5 composés à prévenir ou faire régresser les NFc dans ce modèle. 4 d’entre elles ont déjà été testé lors de l’étude précédente au moyen du même modèle. Les nouveaux essais avec des molécules utilisées précédemment visent à renforcer les résultats précédents, décoder leurs mécanismes d’action sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et d’évaluer leur efficacité pour prévenir le développement des NFc. L’efficacité du nouveau composé sera testée en utilisant le protocole curatif pour faire régresser les NFc déjà présents et matures. Les 4 procédures respectent des règles éthiques strictes pour garantir le bien-être des animaux, et l'étude a été validée par des comités scientifique de pilotage de ces projets.

Bénéfices attendus

Aujourd'hui, il n'existe aucun traitement efficace pour prévenir ou faire régresser ces tumeurs chez les patients NF1. La seule option consiste en leur exérèse chirurgicale, procédure utilisée quand le nombre des NFc est réduit. Ce projet vise à (i) évaluer l’efficacité de nouveaux composés, puis de comparer les résultats avec ceux obtenus avec d’autres molécules, (ii) décoder leur mécanismes d’action sur des cellules tumorales et leur environnement, (iii) identifier des éventuels effets indésirables et (iv) explorer les synergies entre les composées dans des cas d’utilisation des combinaisons des composés.

Procédures

Nous allons administrer des molécules en intrapéritonéales ou par gavage deux fois par jour sur 5 jours, pendant un mois. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux. Il faut environ 1 min de contention par animal pour réaliser les administrations. Le rasage, épilation et la prise de photo de la peau du dos des souris se feront sous anesthésie générale pour une durée inférieur à 5 min par souris. Cette étape sera réalisée deux fois (avant et après le traitement), afin de pouvoir évaluer l’efficacité des molécules.

Impact sur les animaux

Les NFc présents dans notre modèle murin sont indolores, plates et de petite taille. Les travaux récents révèlent que chez les patients NF1, les NFc sont moins sensibles aux stimuli thermiques et mécaniques que la région adjacente dépourvu des tumeurs. Nous n’avons observé aucun phénotype dommageable chez des souris mutantes avant l’âge de 1 an. Malgré, l’aspect asymptomatique nous sommes à l’écoute du bien-être animal. Toutefois, des nuisances liées au stress des manipulations, aux contentions répétées des souris, à l’anesthésie générale sont également à prendre en compte. De plus certains des animaux seront traités par injection pendant 28 jours qui peut induire une douleur légère ponctuelle et locale au site d'injection. L’épilation à la cire avant et après le traitement (28 jours d'intervalles) peut également induire une légère irritation de la peau pendant quelques minutes et enfin, lorsque les souris seront gardées isolées durant la durée du traitement la gestion du stress est à prévoir.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des molécules à faire régresser la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Tous les précédents essais pharmacologiques ont été réalisé avec le même modèle animal et en utilisant la même procédure expérimentale nous permettant de comparer l’efficacité des composés entre eux.

Réduction

L’expertise acquise lors de précédents études nous ont permis d’optimiser et standardiser la procédure de traitement, de suivi et d’analyse post mortem des animaux réduisant ainsi considérablement le nombre d'animaux.

Raffinement

Aucune des procédures utilisées pour l’administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors des épilations à la cire, les souris seront anesthésiées, rasées, épilées à l'aide de petites bandes de cire froide, puis de la vaseline sera appliquée sur la zone épilée pour réduire les irritations et rougeurs. Contrairement aux patients NF1, les souris Nf1- KO développent des NFc dont l’aspect est plat et la taille est réduite sans phénotype dommageable. Lors de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’une crème ophtalmique afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Le personnel de l’animalerie a mis en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Lors des précédentes études nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Néanmoins, les souris sont surveillées en se basant sur une grille d’évaluation du bien-être animal, avec l’utilisation de point limite, nous permettant en cas de signe persistant de plus de 24h de décider de l’arrêt du traitement avec la mise à mort des animaux. Enfin le personnel de l’animalerie nous informe quotidiennement et lors de leur visite les weekends de l’état de santé des souris.

Choix des espèces

Nous avons conçu un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 qui recapitule le développement des NFc. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier ces tumeurs et de réaliser des tests pharmacologiques. Pour ce projet nous utiliserons deux stades de développement des NFc en utilisant d'une part des males âgés d’un mois et demi (P45) pour les traitements préventifs correspondant à la phase de croissance et d'autre part en utilisant des mâles âgés 6 mois pour les traitements curatifs correspondant à la phase de stabilisation des NFc.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la patte arrière droite ou par voie intraveineuse, d'autres reçoivent chaque semaine pendant dix semaines une injection d'une molécule qui déclenche un cancer du poumon, puis viennent les chimiothérapies et la mise à mort échelonnée un, trois, cinq, sept et dix jours après traitement. Le porteur reconnaît que la tumeur à la patte peut réduire la mobilité au point de gêner l'accès à la nourriture, et que des nécroses tumorales peuvent apparaître avec la douleur qui les accompagne. Il écrit néanmoins qu'aucune douleur n'est attendue des gestes eux-mêmes, puisque les injections se font sous anesthésie gazeuse.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Il a été montré que l’efficacité du cisplatine dans le cancer du poumon non à petites cellules chez la souris est dépendante d’un certain type de cellules immunitaires, les cellules lymphoïdes innées 3, recrutés rapidement dans la tumeur après traitement. Malheureusement, le cisplatine est assez mal toléré par les patients. Ainsi le premier objectif de ce projet est de rechercher d’autres chimiothérapies qui pourraient également induire le recrutement des cellules lymphoïdes innées 3 dans la tumeur. Dans une étude préliminaire, nous avons testé deux autres chimiothérapies et avons pu observer un effet potentiellement similaire au cisplatine sur la croissance tumorale. Nous chercherons donc à savoir si ces deux chimiothérapies induisent également le recrutement des cellules lymphoïdes innées 3 dans le cancer du poumon mais aussi dans d’autres types de cancers (pancréatique et colorectal). Le but du deuxième objectif est de caractériser les cellules lymphoïdes innées 3 dans un cancer du poumon orthotopique chez la souris de façon à être au plus proche de ce qui se passe chez l’homme.

Bénéfices attendus

Comme dit précédemment, le cancer est un problème de santé public majeur. Il est donc nécessaire de trouver des traitements qui sont bien supportés par le patient. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients et confirmer que ce traitement pourrait être utilisé chez des patients. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Les animaux sont injectés en sous-cutané dans la patte inférieure droite sous anesthésie gazeuse avec les cellules tumorales (5 minutes pour l’anesthésie et 30 secondes pour l’injection). Les animaux reçoivent les cellules tumorales du cancer du poumon non à petites cellules murin en intra-veineuse sous anesthésie gazeuse (5 minutes pour l’anesthésie et 1 minute pour l’injection). Pour l’injection de la molécule chimique conduisant à un modèle de cancer du poumon semblable à ce qui peut se développer chez l’humain, les souris vont recevoir une injection en IP une fois par semaine, pendant 10 semaines. La durée de l’injection est d’environ 30 secondes. Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes). 1,3,5,7 et 10jours après le traitement par chimiothérapie, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort). Par la suite, les tumeurs, les poumons, ganglions drainants et rates sont récupérés (2 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales au niveau patte inférieur droite pourrait entrainer une diminution de la mobilité des souris. Cette diminution de mobilité pourrait diminuer la capacité des souris à se nourrir. L’injection des cellules tumorales se fait en sous-cutanée. De ce fait, nous pourrions observer des nécroses au niveau de la tumeur conduisant à une douleur chez l’animal. L’injection des deux modèles orthotopiques du cancer du poumon peut conduire à une difficulté respiratoire. Les animaux recevant ce modèle tumoral seront étroitement surveillés. Les chimiothérapies utilisées peuvent entrainer une perte de poids chez les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons, tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 3 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections sous-cutanées (cellules tumorales), intra-péritonéales (traitements) et intra-veineuse (cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

Caler les conditions d'injection d'une molécule anti-complément avant un futur protocole d'efficacité: 24 souris vont être utilisées pour cette mise au point, toutes tuées au dixième jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant neuf jours, chacune reçoit une injection quotidienne de complément humain dans le péritoine, trois injections d'anticorps prélevés sur des malades, trois injections sous-cutanées de l'inhibiteur testé et quatre microprélèvements de sang sous anesthésie. Le modèle repose sur une myopathie nécrosante auto-immune déclenchée chez la souris, et le porteur écrit pourtant n'attendre aucune nuisance des molécules, seulement l'inconfort des contentions, des injections et des prélèvements. Aucun résultat thérapeutique n'est attendu de ces 24 souris, dont le rôle se limite à un dosage préalable ouvrant sur un autre protocole.

Objectifs

Notre laboratoire a établi un modèle de myopathies nécrosantes auto-immunes par injection à des souris d'anticorps purifiés de malade et de complément humain. Ce modèle nous a permis de mettre en évidence le rôle pathogène de ces anticorps et du système du complément. Nous avons démontré par le passé l'efficacité préventive d'une molécule empêchant le système du complément de déclencher la maladie (Anti-C5, ou Zilucoplan) dans ce modèle murin. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle molécule inhibitrice du complément dans ce modèle (Anti-C2). L’étude des animaux se fera par une analyse sanguine pour doser la molécule thérapeutique anti-C2 et le complément humain injecté.

Bénéfices attendus

Ce protocole permettra de déterminer les conditions d'injection d'un nouvel inhibiteur spécifique du fragment C2 du complément humain et d'appliquer ces conditions dans un futur protocole qui visera à démontrer son efficacité thérapeutique dans notre modèle murin de myopathie nécrosante autoimmune ouvrant ainsi la porte à un éventuel essai clinique chez les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 microprélèvements de sang de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, en intrapéritonéal, durant 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des IgG en intrapéritonéal, 3 fois par souris , sur une période de 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection de l'anti-C2 en sous-cutanée., 3 fois par souris , sur une période de 9 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Cependant, des nuisances pourront être observées chez l'animal lors desphases de contention, des injections ou des prélèvements de sang prévus dans la procédure.

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable des molécules ne sont attendues. Cependant, des nuisances pourront être observées chez l'animal lors des phases de contention, des injections ou des prélèvements de sang prévus dans la procédure.

Devenir

Les animaux ayant reçus des injections ne pourront être réutilisés dans un autre protocole. Tous les animau seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de molécules inhibitrices du complément dans une perspective future d’approche à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expérimentaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris et injection du Zilucoplan, inhibiteur du C5. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique de puissance pour déterminer les effectifs exacts nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures, ainsi que de la variabilité des réponses immunologiques (réponse primaire notamment) observées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose (cello dome) et des fibres de coton (Nestlets). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux seront euthanasiés par surdose de CO2 sous anesthésie générale à l'isoflurane en fin de procédure (Jour 10). En cas de douleur, du méloxicam sera administré par voie sous cutanée à la dose de 1mg/kg. Un examen visuel sera pratiqué quotidiennement par deux observateurs indépendants et permettra d’évaluer une éventuelle souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort (réduction de l'activité, dos vouté, poils ébouriffés,difficultés respiratoires, vocalisation, perte d’appétit…) seront mis à mort de manière éthique par surdose de CO2 sous anesthésie générale à l'isoflurane à 2.5% en air grâce à un matériel dédié (Tem Sega, Necrobox et MiniHub) et dans un lieu isolé des locaux d’hébergement.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.