Souris
Circuits neuronaux des biais émotionnels dans un modèle murin de dépression.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chirurgie du cerveau sous anesthésie générale jusqu'à deux heures, deux interventions possibles par animal, implants portés jusqu'à deux mois, dix tests comportementaux à raison d'un par jour : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un phénotype qu'il qualifie de dit-dépressif et annonce une détresse "induite et attendue", tout en écrivant que les procédures du projet sont "relativement bien tolérées par les animaux". Les dix tests comportementaux ne sont pas nommés, alors qu'ils servent à mesurer l'approche et l'évitement de stimuli plaisants ou déplaisants. Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que des études histologiques sur leurs tissus sont prévues.
Objectifs
La dépression représente une cause majeure d’incapacité à l’échelle mondiale, affectant environ 300 millions de personnes dont 50% davantage de femmes. Or, la physiopathologie des troubles dépressifs est encore assez méconnue, tout comme les mécanismes par lesquels agissent les traitements antidépresseurs existants, dont l’efficacité est d’ailleurs limitée puisqu’environ un tiers des patients ne répondent pas aux thérapies classiques et plusieurs semaines sont nécessaires pour pouvoir observer ces effets. En outre, la dépression est accompagnée d’altérations sensorielles : les patients dépressifs percevraient les stimuli sensoriels comme étant moins plaisants, ou davantage déplaisants que des sujets sains. On parle ainsi d’un biais de valence négatif, qui est cependant peu considéré dans les critères diagnostiques. Or, ces biais émotionnels sont particulièrement intéressants à étudier d’un point de vue translationnel. D’une part, la réponse émotionnelle est assez facilement mesurable chez la souris, notamment à travers le comportement d’approche (stimuli plaisants) ou d’évitement (stimuli déplaisants), contrairement à d’autres symptômes plus classiques de la dépression comme l’humeur dépressive ou les idées suicidaires qui sont difficilement évaluables chez l’animal. D’autre part, ces biais perceptifs seraient rapidement restaurés après l’administration d’un traitement antidépresseur, c’est pourquoi la prise en compte de la réponse émotionnelle en clinique pourrait permettre de déterminer beaucoup plus rapidement si un patient répond efficacement ou non à la thérapie proposée et donc améliorer la prise en charge thérapeutique. Puisque l’amygdale basolatérale est une région du cerveau jouant un rôle majeur dans la régulation émotionnelle et l’attribution de la valence, et que l’activité de certaines voies neuronales de l’amygdale basolatérale serait modifiée dans des modèles de dépression, l’objectif de ce projet est ainsi (1) d’étudier la réponse émotionnelle dans des modèles de dépression de souris mâles et femelles en nous concentrant sur des stimuli olfactifs, (2) de comprendre quels circuits neuronaux sont impliqués dans ces biais émotionnels, et enfin (3) de chercher comment des traitements antidépresseurs à la fois classiques et innovants modulent l’état émotionnel ainsi que la réponse neuronale associée dans notre modèle murin de dépression.
Bénéfices attendus
En cherchant à comprendre quels sont les mécanismes sous-jacents au biais émotionnel négatif associé à un état dit-dépressif à l’échelle des circuits neuronaux, cette étude permettra d’améliorer notre connaissance et notre compréhension de la physiopathologie de la dépression. De plus, les diagnostics en psychiatrie reposent actuellement sur une approche catégorielle qui consiste à classer les patients selon la présence ou l’absence d’un certain nombre de symptômes discrets. Cependant, cette approche fait face à un nombre grandissant de limitations. En réponse à ces critiques, l’approche RDoC (Research Domain Criteria) propose de changer de paradigme diagnostique pour se fonder sur un continuum de symptômes et de biomarqueurs. De façon notable, les systèmes de valence positive et négative constituent deux des six domaines fonctionnels majeurs d’intérêt relevés par cette approche. Ainsi, en s’inscrivant dans cette approche alternative, notre étude des biais émotionnels négatifs dans une perspective translationnelle chez la souris pourrait non seulement permettre d’élucider de façon fondamentale certains mécanismes physiopathologiques de la maladie (bénéfices à court terme du projet), mais également d’ouvrir la voie au développement de nouveaux outils diagnostiques et de détection de réponse aux traitements antidépresseurs (bénéfices à long terme du projet). En particulier, la restauration de la réponse émotionnelle par un antidépresseur serait obtenue de façon très précoce après administration du traitement, bien avant des effets sur l’amélioration de l’humeur, c’est pourquoi ces biais sont particulièrement intéressants à étudier et pourquoi une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents serait cruciale d’un point de vue thérapeutique. Enfin, la dépression est une maladie qui touche 50% davantage de femmes que d’hommes. Toutefois, les mécanismes neuronaux à l’origine de cette différence sont encore largement méconnus. Ainsi, en comparant systématiquement des souris mâles et femelles tout au long de notre étude, nous pourrons également mettre en lumière l’existence ou non de mécanismes spécifiques au sexe à la fois dans l’installation du phénotype dit-dépressif et du biais de valence négatif, mais aussi dans l’efficacité de la réponse à un traitement antidépresseur.
Procédures
Dans ce projet, les souris pourront être soumises à différents types d’interventions : - Induction d’un phénotype dit-dépressif. Chaque souris ne pourra subir qu’une seule fois un des modèles de dépression. - Tests de comportement non-invasifs pour tester le phénotype dit-dépressif. Les souris devront réaliser au maximum 10 tests comportementaux différents (1 test/jour). - Administration chronique d’un antidépresseur (3 semaines), par voie orale ou par injection intrapéritonéale (1 injection tous les 3 jours) - Procédures chirurgicales sur le cerveau sous anesthésie générale. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris et chaque souris sera soumise à un maximum de deux interventions séparées par un minimum de 30 jours. - Ponction sanguine (environ 1 min par souris). Chaque animal subira un maximum de deux prélèvements sanguins, séparés au minimum de quatre semaines.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : 1) détresse induit et attendu pour les modèles de dépression. Cependant, notre stratégie expérimentale par rapport a des travaux précédents (durée réduite à 4 semaines de traitement, hébergement groupé) est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux et en réduisant la détresse et l’inconfort de l’animal. 2) les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours) liés à la chirurgie. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les souris. 3) La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (durée maximale de l’expérience : deux mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le phénotype dit-dépressif et les biais émotionnels. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal non-nécessaire à l’induction du modèle expérimental de dépression.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour comparer les groupes. De plus, nous nous attacherons à décrire au mieux le phénotype des animaux utilisés à l’aide d’une grande batterie de mesures comportementales et physiologiques. Cela nous permettra de réduire la variabilité intra-individuelle de chacun des tests, et ainsi de nécessiter d’un moins grand nombre d’individus pour évaluer l’effet de nos modèles et des traitements. Enfin, lorsque cela s’y prête, nous aurons recours à une étude longitudinale de l’état phénotypique et de la réponse neuronale des individus, ce qui nous permettra également d’augmenter notre puissance statistique et d’avoir besoin de moins d’animaux par groupe.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avec recours à : - un complément alimentaire hautement calorique (gel hydrique) - chauffage des cages - réhydratation sous cutanée - renforcement d’enrichissement des cages De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle animal est justifié par le fait que les circuits impliqués dans l’attribution de valence aux stimuli sensoriels sont très bien conservés entre l’homme et les rongeurs. Par conséquent notre travail permet de délimiter de nouvelles approches pour le diagnostic et les thérapeutiques des troubles de l’humeur chez l’homme tout en travaillant sur une espèce mammifère mais phylogénétiquement éloignée de l’homme. De plus, en dehors de l’induction du phénotype dit-dépressif souhaité pour l’étude, le type de procédures effectuées dans ce projet sont relativement bien tolérées par les animaux et des traitements anesthésiques et antidouleurs très efficaces existent pour cette espèce et seront appliqués pour ce projet. Nous utiliserons tout au long du projet des jeunes souris adultes, âgées de 8 semaines, car nous étudions des modèles de dépression chez le sujet adulte.
Etude du rôle des lymphocytes T gamma delta dans la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour établir chez la souris ce que des études humaines ne font que suggérer, le rôle protecteur de certains lymphocytes T contre le cytomégalovirus, 568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées en fin d'expérience pour récupérer leurs lymphocytes. Elles reçoivent une à quatre infections virales dans le péritoine à raison d'une par semaine, certaines une injection de lymphocytes par voie intraveineuse, d'autres des anticorps, et cinq prélèvements de sang hebdomadaires sur 42 jours. Le porteur indique qu'après dix jours d'infection les souris peuvent présenter piloérection, dos arrondi, perte de poids et isolement, et qu'avec des souris immunodéficientes les points limites sont fixés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère de la mutation.
Objectifs
Notre projet a pour but une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre un herpès virus nommé Cytomégalovirus (CMV). Nous nous intéressons plus particulièrement au rôle de cellules immunitaires particulières ( lymphocytes T) dans ce contexte. Il comprend une étude chez la souris pour répondre à des questions innaccessibles chez l'Homme. L'étude chez la souris permet d'établir la preuve de l'implication de cellules ou facteurs immunitaires dans la protection antivirale en modélisant une thérapie cellulaire. le modèle murin d'infection par le MCMV est utilisé depuis 20 ans par notre équipe et bien maîtrisé.
Bénéfices attendus
L'objectif final est une prise en charge plus efficace des patients à risque (immunodéprimés), en évitant notamment l'utilisation de traitements anti-viraux à effets secondaires.
Procédures
Les animaux vigiles sont soumis à une ou 4 infections virales (1/semaine) en intrapéritonéal sur une durée de un mois. Un deuxième lot de souris sont anesthésiées et soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes à J0. Le lendement les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de virus. Les souris sont soumises à des prélèvements de sang une fois par semaine sous anesthésie courte pendant 42j (5 prélèvements). Un 3ème lot de souris reçoit deux injections intrapéritonéales (une de virus et une d'anticorps) à 24h ou 7 jours d'intervalle pendant 3 semaines.
Impact sur les animaux
Après 10 jours suite à l'infection à CMV, les souris peuvent montrer des signes de souffrance classique tels que la piloérection, le dos arrondi, perte de poids et isolement s'accompagnant d'une augmentation des transaminases hépatiques et de la charge virale.
Devenir
Les animaux sont tous infectés par du cytomégalovirus et sont donc mis à mort en fin d'expérience. Cette mise à mort est nécessaire pour récupérer les lymphocytes.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet. Le modèle murin de l'infection à CMV est largement utilisé car il récapitule ce qui est observé chez l'homme. L'utilisation de souris immunodéficientes permet de se rapprocher du contexte d'immunosuppression thérapeutique appliquée aux receveurs de greffes, et de tester l'impact d'une thérapie cellulaire par transfert adoptif. L'utilisation de souris et/ou l'injection d'anticorps permettent de conclure sur l'importance des facteurs étudiés dans la protection. Ces conclusions ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo qui ne permettent pas de modéliser la complexité d’un organisme pour l’étude du système immunitaire .
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé pour obtenir des résultats statistiques interprétables et les expériences seront répétées à deux reprises. Par souci de réduction nous utilisons dans nos expériences aussi bien des souris mâles que des souris femelles.
Raffinement
1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Du fait de l'utilisation de souris immunodéficientes, les points limites sont adaptés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère. Les conditions d'hébergement permettent d'éviter les contaminations par des pathogènes opportunistes (portoirs ventilés, filtration entré et sortie) Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les prises de sang sous mandibulaires, les injections intraveineuses et sous-cutanées sont réalisées sur des animaux anesthésiés afin de réduire inconfort et douleur.
Choix des espèces
Le modèle d'infection par le CMV chez la souris est très bien étudié. Nous utilisons des souris adultes, entre 8 et 12 semaines d'age. Les CMV murins et humains ont un même tropisme et la réponse immunitaire anti-CMV chez la souris est très proche de celle de l'Homme. Cependant le suivi de cette réponse chez les patients ne donne qu'une réponse partielle puisqu'il ne peut se faire qu'au niveau du compartiment sanguin. L'étude chez la souris permet une étude spatio-temporelle de la dissémination du virus et de la réponse immunitaire. Le rôle protecteur des cellules/facteurs que nous étudions est suggéré chez l'homme par des études corrélatives mais impossible à prouver. Le transfert adoptif de sous-populations de cellules immunitaires chez des souris immunodéficientes est le seul moyen de tester leur caractère protecteur. L'utilisation de souris invalidées pour un facteur mis en évidence en amont par des études in vitro chez l'Homme est indispensable pour étudier l'importance de ce facteur dans la protection. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro.
Evaluation de nouveaux candidats médicaments sur l’addiction et la pharmacodépendance
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1410
Cathéter veineux posé sous anesthésie jusqu'à une heure, deux injections par jour pendant environ un mois, séances de conditionnement de vingt minutes à deux heures par jour pendant jusqu'à quatre mois : 2 510 souris et rats vont être utilisés pour tester des candidats médicaments contre l'addiction. 1 910 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 600 d'un niveau léger, et 120 pourront être réutilisés après accord du vétérinaire, les autres étant tués lors d'un prélèvement terminal de sang ou de cerveau. Les tests comportementaux sont nommés, visites de compartiments et appuis sur leviers, et les animaux non-humains y sont rationnés en nourriture. Le porteur décrit les symptômes de sevrage attendus, hypothermie, tremblements, baisse d'activité, perte d'appétit pendant environ sept jours, et qualifie la restriction alimentaire de légère au motif qu'elle n'empêche pas la croissance pondérale.
Objectifs
La pharmacodépendance (dépendance aux substances psychoactives) représente une préoccupation majeure de santé publique. La plupart du temps, les drogues provoquent dans un premier temps des sensations de plaisir qui induisent un désir de renouveler l’expérience et conduisent certains sujets à ne plus pouvoir contrôler leur consommation. La pharmacodépendance réfère à un comportement pathologique de consommation, ayant des conséquences physiologiques, psychologiques et/ou sociales néfastes pour la personne et son entourage. La pharmacodépendance représente un problème majeur de Santé publique également de par le nombre très élevé de patients atteints ; à titre indicatif, selon les chiffres de 2022 publiés par l'Observatoire français des drogues et des tendances addictives (OFDT), 25,5% des adultes fument tous les jours et 10% boivent quotidiennement de l’alcool. Toujours selon l'OFDT, concernant les médicaments psychotropes (anxiolytiques, antidépresseurs, hypnotiques), 21% de la population de plus de 15 ans a bénéficié d'un remboursement de psychotrope au moins une fois dans l'année en 2017 en France ; or, ces médicaments peuvent être associés à un risque de mésusage ou d'abus. Enfin, les drogues illégales sont également expérimentées ou consommées de manière abusive par des millions de personnes en France. Or, les conduites addictives ont de multiples conséquences sanitaires et sociales (maladies, handicaps, suicides, violence, isolement, précarité...) et entraînent une mortalité évitable. Tout ceci souligne l'importance, outre les campagnes de prévention, de développer des traitements permettant de réduire la dépendance aux drogues (licites, illicites ou médicamenteuses) ainsi que les symptômes liés à l'arrêt de leur consommation (sevrage). L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité anti abus/dependance de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la pharmacodépendance repose généralement sur l’association d’un traitement médicamenteux, d’un suivi psychologique et d’un accompagnement social, mais il n'existe actuellement pas de traitement efficcae à 100% contre les problématiques liées à l'addiction ou au sevrage de drogues. Les procédures décrites dans ce projet permettent d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues. Ces traitements seront évalués contre la dépendance induite par différentes drogues, en fonction de leurs spécificités et objectifs cliniques (par exemple contre la morphine ou le remifentanyl pour évaluer l'effet d'un traitement potentiel contre l'addiction aux opiacés/opioïdes, ou contre la nicotine pour évaluer l'effet de traitement anti-tabagisme...).
Procédures
Les substances à évaluer, les contrôles positifs et les contrôles négatifs sont administrées par bolus (environ 1 seconde) ou infusion intraveineuse d’une durée de quelques secondes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou semaines (minimum 1 injection à maximum 2 injections par jour pendant environ 1 mois), selon le traitement étudié. Les procédures peuvent également nécessiter une ’implantation sur animal vigile ou sous anesthésie (durée de quelques secondes à quelques minutes selon le site d’implantation) et/ou la pose d’un cathéter veineux ou d'un dispositif pour infusion lente sous anesthésie (durée maximum d'1 heure). Par ailleurs, des prélèvements de sang (durée de quelques secondes à 3 minutes) pourront être réalisés selon une fréquence déterminée dans la limite des considérations éthiques (de manière standard, un prélèvement par jour et pas plus de 10% du volume sanguin au cours de l’étude). Les phases de test comportemental surviennent le plus souvent quotidiennement durant toute la durée de la procédure et peuvent consister en une simple observation de l'animal sans manipulation ou en des phases de conditionnement et de tests (visites de compartiments ou appuis sur leviers) dans des dispositifs spécifiques (minimum de 20 minutes par jour pendant 10 jours à maximum 2 heures par jour pendant environ 4 mois, selon la procédure). De plus, pour certaines procédures, les animaux sont rationnés en nourriture pendant toute la durée de l’expérience soit environ 4 mois.
Impact sur les animaux
Les administrations, les phases chirurgicales (implantation sur animal vigile ou sous anesthésie) ou les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress ou une douleur légère. Dans le test de sevrage, l'animal peut ressentir des symptômes associés au sevrage pharmacologique (tels que l’hypothermie, des tremblements, une diminution de l’activité locomotrice, une perte d’appétit, etc…). Ces symptômes apparaissent généralement dans les 24 heures suivants l’arrêt du traitement et peuvent persister pendant toute la durée suivant la phase d'administration (en général 7 jours). Dans les autres tests, les animaux sont placés dans des dispositifs spécifiques (boites de conditionnement) pour une durée de 10-20 minutes à 2 heures, ce qui peut induire un stress lors de la première exposition du fait de la nouveauté de l'environnement (auquel les animaux s'habituent rapidement). Dans les procédures de conditionnement opérant, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire qui peut augmenter la sensation de faim, mais n'empêche pas leur croissance pondérale.
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Les animaux soumis à un prélèvement terminal seront ethanasiés car le prélèvement d'une grande quantité de sang ou d'organes vitaux (tel que le cerveau) affecte le maintien en vie dans de bonnes conditions.
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils nécessitent l'étude de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques, que ce soit dans la phase de consommation ou de sevrage de drogues) et permettent l’étude des potentiels effets secondaires. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites spécifiques aux procédures et clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour toute procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Aujourd'hui encore, Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer l'efficacité des nouveaux candidats médicaments sur l'addiction et la pharmacodépendance. En effet, les rongeurs présentent des mécanismes neurobiologiques similaires à ceux rencontrés chez l'Homme, et il a été démontré leur capacité à s'auto-administrer plusieurs drogues de classes différentes, parfois jusqu'à cumuler les 3 principaux critères diagnostiques du Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux (DSM) symptomatiques d'une recherche compulsive et d'une perte de contrôle sur la prise de drogue. Principalement rongeurs (rats, souris) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historique et à la littérature scientifique. Ceci afin d'étudier les traitements potentiels aussi bien chez le jeune que chez l'adulte.
Évaluation de l’efficacité de la buprénorphine par administration orale guidée par micropipette chez des souris C57BL/6 et des souris Balb/c : étude comparative de la pharmacocinétique par rapport à la technique d’administration par voie sous cutanée
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
132 souris BALB/c et C57BL/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour comparer deux façons d'administrer un analgésique. La moitié reçoit la buprénorphine en injection sous la peau, l'autre à la micropipette par la bouche, avec neuf microprélèvements de sang, quatre administrations et trois anesthésies à l'isoflurane. Le porteur présente la voie orale comme un progrès pour le bien-être des souris de laboratoire, susceptible de devenir une technique de référence, ce qui suppose d'en passer par ces 132 souris. 68 pourront être réutilisées si le microprélèvement suffit aux dosages, les autres seront tuées, les volumes de sang nécessaires étant alors incompatibles avec leur maintien en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’administration orale de buprénorphine, un analgésique (médicament utilisé pour diminuer la douleur) classiquement utilisé chez les animaux de laboratoire chez des souris par rapport à la voie sous-cutanée classiquement utilisée dans nos laboratoires, afin de réduire le stress associé aux injections sous-cutanées et de prolonger la durée d’analgésie par cette voie alternative d’administration. L’hypothèse, basée sur des études chez le rat, permettrait à cette voie d’administration d’offrir des concentrations dans le sang plus efficaces de buprénorphine par rapport à la voie sous-cutanée avec une réduction des manipulations. Des médias comme le Nutella® ou des gels médicamenteux ont également été testés pour l’ingestion volontaire de buprénorphine chez la souris, évitant le stress du gavage mais demandant de l’entrainement et l’isolement des animaux pendant la durée d’administration. Cette étude vise donc à tester des véhicules ne perturbant pas le métabolisme et d’utiliser l’administration guidée par micropipette afin de ne pas isoler les animaux pour leur faire ingérer la buprénorphine, de travailler en coopération avec eux et d'avoir une quantité fiable et définie de buprénorphine administrée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués pendant les 6 premières heures, puis à 12 h et 24 h, voire 36h et 48h pour tracer un profil de distribution sanguine de la buprénorphine qui nous permettra de savoir si la buprénorphine est suffisament présente dans le sang des souris pour apporter un effet analgésique optimal. Ce projet vise donc à optimiser la délivrance de l’analgésie tout en minimisant les manipulations invasives et en améliorant le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Un premier bénéfice attendu sera d'évaluer l'efficacité d'une méthode d'administration orale de buprénorphine via micropipette guidée (MDA) chez les souris BALB/c et C57BL/6. Cette approche non invasive offre une alternative aux injections sous-cutanées, connues pour provoquer du stress chez l’animal et pour avoir une durée d’efficacité assez brève dans cette espèce. L'habituation des souris à cette méthode permettra de valider la faisabilité et la reproductibilité de l'administration orale pour obtenir une analgésie efficace sur une période plus longue (au-delà des 4 à 6 heures actuellement observées avec les injections répétées en SC). La mise en place de prélèvements sanguins permettra de tracer un profil pharmacocinétique complet, validant ainsi les concentrations sériques optimales et efficaces telles que décrites dans la littérature. Ces données permettront d'ajuster les doses administrées et de prolonger l'effet analgésique. À plus long terme, les résultats de ce projet pourraient avoir des retombées significatives sur les pratiques courantes en recherche animale. La méthode d'administration MDA pourrait devenir une technique de référence, non seulement pour la buprénorphine, mais aussi pour d'autres analgésiques ou médicaments administrés de manière répétée par voie orale. Une technique d'administration fiable et efficace, permettant un effet prolongé sans nécessiter de manipulations fréquentes, améliorerait considérablement le bien-être des animaux, réduisant ainsi les biais expérimentaux associés au stress. En conclusion, ce projet a pour objectif immédiat d’améliorer l'administration d'analgésiques chez les souris, et à long terme, de fournir une méthode fiable et éthique d'administration non invasive, applicable à la recherche biomédicale et à la gestion de la douleur animale. Ces avancées bénéficieront aux scientifiques, aux animaux de laboratoire et à l’ensemble du domaine de la recherche, garantissant des conditions plus respectueuses du bien-être animal et des résultats plus fiables.
Procédures
Stress et douleur légères dûs à l'Injection sous-cutanée (15 secondes ; 1 fois) pour la moitié des animaux; Stress léger dû à l'administration médiée par micropipette (30 secondes ; 4 fois) pour la moitié des animaux; Stress et douleur légères dûs aux microprélèvements de sang (30 secondes ; 9 fois) pour la moitié des animaux; Stress léger dû à l'anesthésie générale à l'isoflurane (1 minutes ; 3 fois) pour la moitié des animaux
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sur les souris BALB/c et C57BL/6 peuvent être anticipés. Ces effets sont principalement liés à la procédure de l'anesthésie, aux prélèvements sanguins réguliers, et à la manipulation des animaux pour les diverses procédures expérimentales. L'anesthésie, nécessaire pour certains prélèvements sanguins est une source de stress pour les souris. Cependant, cette période de stress sera limitée à la durée de l'anesthésie et les souris devraient retrouver un comportement normal peu après leur réveil, généralement en quelques minutes. Les prélèvements sanguins par ponction de la veine de la queue, peuvent entraîner une douleur légère au site de ponction, ainsi qu'une gêne temporaire limitée étant donné l’utilisation d’un analgésique local. La douleur et la gêne devraient disparaître rapidement après l'intervention, et aucune conséquence à long terme n'est attendue. Même si l'administration de buprénorphine est réalisée par voie orale, limitant ainsi les injections stressantes, les manipulations nécessaires pour l'habituation à la méthode de micropipette (MDA) et les prélèvements peuvent générer du stress. Afin de minimiser ce stress, les manipulations seront réalisées avec précaution, en suivant des protocoles établis pour réduire au maximum l'impact sur les animaux. La durée des effets de stress devrait être limitée à la période de manipulation, avec un retour à un comportement normal dans les minutes qui suivent.
Devenir
En cas d'utilisation du microsampling pour le suivi de la buprénorphine dans le sang des souris, tous les animaux pourront être réutilisés. Si la technique du microsampling n'est pas utilisable car les volumes de sang obtenus seraient insuffisants pour effectuer les dosages, les souris seraient mises à mort à la fin de la procédure car les volumes de sang ne seraient pas compatibles avec leur maientien en vie. cette décision a été prise dans le but d'utiliser moins d'animaux. Dans ce cas, seuls les animaux utilisés dans la procédure de mise au point du dosage de la buprénorphine pourront être réutilisés, soit 4 animaux.
Remplacement
Les souris ne peuvent être remplacées dans ce projet, car l’objectif est de déterminer l’efficacité de l’administration orale de buprénorphine spécifiquement chez ces deux souches. Aucune méthode alternative in vitro ou sur un autre modèle animal ne permettrait de fournir des données équivalentes pour ces deux souches largement utilisées en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire, en se basant sur les recommandations issues de la littérature scientifique. Le calcul du nombre d'animaux tiendra compte de la variabilité génétique entre mâles et femelles, afin de permettre une analyse statistique tout en limitant l’utilisation excessive d'animaux. Le n a été calculé en se basant sur la littérature, grâce à un logiciel et est de 8 animaux par lot.
Raffinement
Des techniques de raffinement seront appliquées pour réduire la douleur et le stress infligés aux animaux. Le microsampling sera utilisé autant que possible pour minimiser les volumes sanguins prélevés, associé à un analgésique local lors des prélèvements. Cette approche évitera le prélèvement rétro-orbitaire plus invasif. De plus, l’utilisation de la méthode de micropipette guidée (MDA) pour l’administration orale de la buprénorphine limitera le recours au gavage, réduisant ainsi le stress et l'inconfort associés à cette méthode. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 2 animaux minimum dans des cages enrichis et seront visités quotidiennement afin de déceler au plus tôt toute forme de souffrance, de douleur ou d’angoisse si elles devaient apparaître. Enfin des points limites précoces et précis seront mis en place et vérifiés lors des expériences afin d'éviter toute forme de souffrance de douleur ou d'angoisse.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris dans ce projet car elles sont l'espèce la plus couramment utilisée en recherche. Il existe déjà une étude sur l’administration de buprénorphine par gavage oral chez le rat mais rien en ce qui concerne la souris avec la technique de MDA. Ce projet vise donc à combler ce manque de données et à mieux comprendre comment ces traitements fonctionnent spécifiquement chez les souris. De plus, l’utilisation de 2 souches distinctes et de 2 sexes différents permettra de les comparer et de déceler d’éventuelles différences intra spécifiques Les souris utilisées dans ce projet auront 8 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est considéré comme mature. C’est aussi l’âge de début de la plupart des projets de notre laboratoire.
Impact du neurodéveloppement dans l’évolution des ataxies spinocérébelleuses de type 3 sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 867 souris pour treize animaux par génotype, par sexe et par stade de développement, en deux répétitions : c'est le compte annoncé sur cinq ans pour comparer le développement du cerveau de souris porteuses du gène humain de l'ataxie spinocérébelleuse de type 3. Les procédures déclarées se limitent à un prélèvement au bout de la queue et relèvent d'un niveau de souffrance léger, l'atteinte venant de la mutation elle-même, qui provoque des troubles moteurs à partir de 90 semaines. Les souris mutées sont tuées après douze mois pour que ces effets n'apparaissent pas, les reproductrices dès que leur fécondité baisse, et les petits sans intérêt génotypique sont proposés à d'autres équipes ou tués dès réception du génotype. Pour une maladie qui touche 1 à 9 personnes sur 100 000, les cibles thérapeutiques annoncées restent une perspective à long terme.
Objectifs
L’ataxie spino-cérébelleuse de type 3 (SCA3) est une maladie neurodégénérative héréditaire faisant partie du groupe des ataxies spino-cérébelleuses. Elle a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle provoque notamment des contractions musculaires involontaires et des troubles cognitifs. Cette maladie est causée par une anomalie génétique. Même si cette maladie se manifeste à l’âge adulte, la protéine mutée est exprimée dès le stade embryonnaire, ce qui pose la question de l’aspect neurodéveloppementale dans cette maladie. Peu d’études se sont intéressées aux phases de développement dans cette maladie cependant certaines études ont montré des modifications pertinentes dans le modèle murin de celle-ci. De plus la protéine en question a de nombreux rôles importants, elle est notamment impliquée dans la réparation de l’ADN. Ainsi, comprendre son rôle dans le développement du cerveau est crucial pour comprendre cette pathologie, ce qui aiderait à développer des nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet sera de suivre le développement du cerveau chez les animaux portant le gène humain normal et le gène humain anormal afin de les comparer. Pour cela, nous allons élever nos animaux modèle de la pathologie et nous réaliserons des analyses histologiques et de biologie moléculaire à différents stades de développement. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’ataxie spinocérébelleuse est de 1 à 9 personnes sur 100000. Elle a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle provoque notamment une dystonie et des troubles cognitifs. Cette étude permettra de mieux comprendre l’effet de cette mutation sur le développement du cerveau et les potentiels mécanismes compensatoires. Cela permettra de mettre en évidence des marqueurs spécifiques, permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades précoces. De plus, elle vise à long terme à identifier des cibles thérapeutiques afin de corriger les symptômes associés à la maladie.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles pour déterminer la présence de la mutation (moins d’une minute par animal, réalisé 1 fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux peut générer une légère douleur chez l’animal. Les manipulations et contention des animaux peuvent être source de stress. La modification génétique apportée par les animaux provoquera des troubles moteurs significatifs à partir de l'âge de 90 semaines et commencera par une présence non significative de symptômes vers l'âge de 12 mois (45 semaines).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à différents âges afin de récupérer des tissus post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques. Les animaux reproducteurs seront euthanasiés pour conserver des capacités de reproduction optimales. Les petits ne présentant pas d’intérêt génotypique seront soit proposés à d’autres équipes de recherche si cela est possible ou seront euthanasiés à la réception du génotype.
Remplacement
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. L’étude de l’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Il n’existe pas d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux et permettant d'étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation d’animaux pour trois raisons majeures : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement puisqu'ils adoptent un comportement migratoire dans le cerveau et un comportement de croissance une fois mis en culture ; la mise en place des couches du cortex, ainsi que les connexions neuronales qui y sont formées, ne peuvent être reproduits en culture cellulaire. Ainsi les modèles de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisés. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. La variabilité interindividuelle peut être élevée, nous avons donc défini qu’il sera nécessaire de tester 13 souris par génotype et par sexe (en deux réplicas) pour chaque stade de développement du cerveau. Ainsi, pour l’ensemble de l’analyse neurodéveloppementale nous estimons que nous utiliserons 1867 souris maximum au cours des 5 années du projet.
Raffinement
Les cages sont maintenues en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau (biberon). La nourriture est adaptée au stade physiologique. Les conditions de luminosité, température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum et couple en trio). Afin de récupérer des embryons à des stades précis nous réaliserons des accouplements contrôlés d’une nuit, ce qui pourra nécessiter de laisser un mâle hébergé seul pendant cette nuit. Toutes les cages sont enrichies d’un nid et de stick en bois. Les cages d’accouplements bénéficient également d’une maison et/ou de papier kraft et d’une alimentation adaptée. Dans le cadre du maintien courant de la lignée les souris seront observées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Conformément au bien-être des animaux, une femelle n'aura pas plus de 6 portées. Les mâles mutants ne seront pas accouplés au-delà de l'âge de 8 mois, afin de maintenir une capacité de reproduction optimale basée sur l'expérience de l'équipe. Dans le cadre de la maintenance de la lignée, les accouplements sont effectués avec des femelles sans mutation provenant d'un fournisseur, afin d'éviter toute dérive génétique susceptible d'aggraver le phénotype nuisible. Les animaux mutés seront euthanasiés après l'âge de 12 mois pour s'assurer que les effets néfastes de la mutation ne sont pas atteints. Les animaux seront également particulièrement surveillés à l'approche de l'âge de 12 mois, afin de détecter d'éventuels signes précoces de souffrance dus à la mutation. Une attention particulière sera accordée aux difficultés locomotrices et à la prostration, qui sont deux signes caractéristiques de la souffrance liée à la mutation. Des points limites ont été établis et seront respectés pour éviter toute souffrance aux animaux. Un protocole d'analgésie sera utilisé pour assurer une euthanasie sans douleur de certaines souris.
Choix des espèces
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Notre choix se porte sur la souris car les techniques de transgénèses sont bien maitrisées chez cette espèce, ce qui permet de créer une lignée d’intérêt qui permet de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet est de suivre le développement du cerveau aux âges suivants : · Stade embryonnaire, donc femelle gestante : pour suivre la mise en place des couches du cortex · Jour post-natal 0, 4, 7 et 15 : Il s’agit de stade critiques pour la maturation du cerveau. · Jour post natal 21,30 : à ce stade on estime que le cortex et le cervelet sont matures. Enfin nous utiliserons des souris adultes à 3 mois pour considérer des effets de la maladie sur un cerveau adulte.
Étude du rôle de la réponse immunitaire dans un modèle ectopique de cholangiocarcinome murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Choisies parce que l'établissement en héberge déjà et que son personnel en maîtrise les techniques, 7 488 souris vont être utilisées dans ce projet sur le cholangiocarcinome, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et jusqu'à vingt-cinq injections, 360 subissent une immunisation en trois temps destinée à provoquer une cholangite, 384 un traitement par l'alimentation pendant 82 jours, et toutes jusqu'à trois prélèvements de sang. Le porteur cite parmi les effets attendus la cachexie, des saignements au site tumoral, des hématomes, des infections aux sites d'injection et, rarement, un arrêt cardiorespiratoire sous anesthésie. Toutes seront tuées pour prélever des tissus qui seront aussi partagés avec des collaborateurs, et aucune médication supplémentaire ne leur sera donnée pendant les expériences, le porteur indiquant que les effets secondaires pourraient interférer avec les résultats.
Objectifs
Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5/100.000 habitants en Occident. Il présente un des pronostics les plus sombres avec une survie à 5 ans inférieure à 20 pour cent, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet a pour objectifs de mieux caractériser les cellules et facteurs immunitaires impliqués dans l’immunosurveillance du cholangiocarcinome et de développer des traitements capables de la stimuler.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera des acteurs/facteurs clés de l’immunosurveillance du cholongiocarcinome qui pourront servir de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, il proposera des stratégies vaccinales pour la thérapie et la prophylaxie du cholongiocarcinome, non disponibles à ce jour en clinique.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une seule injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes/animal). Toutes les souris seront soumises à des injections intra-péritonéales, intramusculaires, ou intraveineuses (pour un maximum total de 25). La cholongite sera induite chez 360 animaux, par une immunisation en 3 étapes (Jour 0 : 1 injection intra-péritonéale et 1 injection intraveineuse; Jour 14 : 1 injection intra-péritonéale et 1 injection intraveineuse; Jour 28 : 1 injection intra-péritonéale). Les injections intra-péritonéales et intraveineuses n’excèderont pas 1 minute et seront réalisées sur animal vigile. Les injections intramusculaires seront réalisées sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes/animal). 384 animaux recevront un traitement via l’alimentation (pour une durée de 82 jours). Tous les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 3 prélèvements sanguins (durée d’environ 2 minutes). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des épisodes de contention des animaux vigiles qui peuvent entrainer un stress chez l’animal. Les traitements et les régimes spéciaux peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et les sites d’injections et prélèvements peuvent s’infecter. Les prélèvements sanguins peuvent induire des hématomes. L’anesthésie peut induire une hypothermie ou, en cas rare, un arrêt cardiorespiratoire. La croissance tumorale peut induire une gêne chez l’animal ainsi que une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie, apparition de saignements au site tumoral).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin d'obtenir plusieurs tissus qui seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues ex vivo et in vivo. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique du système immunitaire.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 7488 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets immunologiques dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, etc). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie gazeuse des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats. Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Étude du système immunitaire dans un modèle d’allergie cutanée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Le ventre rasé et badigeonné d'un produit allergisant et irritant sur animal vigile, puis les oreilles traitées sous une anesthésie profonde d'environ quarante minutes, 1 470 souris vont être utilisées dans un modèle d'eczéma de contact. 1 380 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 90 d'un niveau léger, et toutes seront tuées pour prélever oreilles, ganglions, rate et sang. S'y ajoutent jusqu'à quinze applications cutanées, des mesures d'oreille cinq fois par semaine sous anesthésie gazeuse, sept injections dans l'abdomen et une injection dans le sinus de l'œil. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui perturberait la réponse étudiée, et prévoit de tuer immédiatement les souris qui se grattent trop, sans préciser combien d'entre elles seront gardées jusqu'à six mois après l'induction de l'allergie.
Objectifs
Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires (appelées Trm), ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus a été mise en évidence. Ces cellules particulières patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes permettant aux Trm de s’établir et de persister à très long terme dans la peau. Deux stratégies seront utilisées pour moduler ces mécanismes dans un modèle d’eczéma de contact allergique : 1. l’application cutanée de molécules modulant le cycle de vie des Trm, 2. l’utilisation de souris portant des Trm génétiquement modifiés. Cette étude vise également à mieux comprendre le devenir des Trm dans l'organisme grâce à l'utilisation de souris portant des Trm fluorescents permettant de les localiser dans l'organisme. Puisqu’il a été montré que les Trm sont impliqués dans la récidive et la sévérité de l’eczéma, nous espérons que mieux connaitre ces cellules nous permettra à terme de développer de nouvelles solutions thérapeutiques permettant de les éliminer et donc de traiter cette pathologie à sa source. En effet, les traitements actuels préconisés dans ces eczémas (notamment les dermocorticoïdes (anti-inflammatoires)), bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permettent pas d’empêcher les récidives de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension du cycle de vie des Trm. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les Trm pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas.
Procédures
Dans la plupart des procédures, les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les mêmes animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie profonde (durée de l'anesthésie : environ 40 minutes), induite après injection d'un produit anesthésiant (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans la plupart des procédures, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines. Ces mesures seront effectuées sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans certaines procédures, les animaux recevront une application cutanée au niveau des oreilles (15 applications maximum - durée de la procédure d'application : 30 secondes), sur une durée maximale de 5 semaines. Ce traitement sera réalisé sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans certaines procédures, les animaux seront pesés 2 fois (durée de la pesée : 30 secondes). Dans la plupart des procédures, les animaux recevront des injections à l'abdomen (7 injections maximum) . Ce traitement sera réalisé sur animal vigile (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans l'une des procédures, les animaux recevront une injection dans le sinus de l'oeil (durée de l'injection : 30 secondes). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes). Dans cette procédure, les animaux seront également soumis à un prélèvement sanguin (durée du prélevement : 30 secondes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur au point d’injection lors des injections intra-péritonéales et intraveineuses ; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou l'application d'un produit par voie épicutanée ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang et les injections intraveineuses ; iv) une légère inflammation au niveau de l'oeil suite à l'injection intra-veineuse ; v) une légère inflammation (pouvant induire un grattage léger) au niveau des oreilles ou du ventre, après application du produit allergisant.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.
Remplacement
Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. En effet, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal et recirculent ensuite progressivement dans l'organisme.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe expérimental et 5 animaux par groupe contrôle est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. Par exemple, certaines procédures ne seront réalisées qu'en cas de succès d'autres procédures.
Raffinement
Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés (anesthésie générale ou locale) pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes et en raison de l’existence d’une grande variété de lignées transgéniques. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Idéalement, nous utiliserons des animaux adultes de 6 à 12 semaines: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature au moment de l’induction de la réponse immunitaire. Toutefois, des animaux d’un âge maximum de 1 an au moment du début des procédures pourront être utilisés (en particulier lorsqu’il s’agit des lignées d’animaux transgéniques), afin d’utiliser au mieux les animaux disponibles. En effet, selon nos expériences antérieures, les cellules étudiées dans ce projet ont un comportement similaire chez des souris d’1 an et chez des animaux plus jeunes. Dans certaines procédures, une partie des animaux seront gardés jusqu’à 6 mois après induction de la réponse allergique.
Décontamination de lignées de souris par transfert d’embryons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
90 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 60 d'entre elles reçoivent deux injections d'hormones pour produire davantage d'embryons, et 40 seront tuées pour récupérer ces embryons. 30 autres subissent une chirurgie de réimplantation d'une quinzaine de minutes, avec une agrafe dans le dos, puis seront tuées après la naissance des petits, tandis que 20 femelles sans bouchon vaginal repartent en zone d'élevage. Le porteur annonce comme bénéfice une amélioration des conditions d'hébergement des lignées et écrit qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation d'animal" puisque le projet consiste précisément à décontaminer des lignées de souris.
Objectifs
Cette technique de décontamination, permet à des lignées hébergées en animalerie conventionnelle (zone exempt de pathogènes responsables de maladie qui peut se transmettre de l'animal à l'homme ou de l'homme à l'animal) d'être transférées en animalerie protégée EOPS (zone exempte d'organismes pathogènes spécifiques) et donc d'être étudiées au niveau immunitaire sans interférence des stimulis du milieu environnant. Tous les éléments entrant en contact avec les animaux sont ainsi contrôlés: air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie. Les lignées ainsi décontaminées sont ensuite récupérées par les chercheurs afin de poursuivre leurs études phénotypiques dans le cadre de leurs projets. La décontamination de lignées se fait par transfert d'embryons et est basée sur le principe que l'embryon est protégé par sa membrane pellucide de tout contaminant présent chez la mère. Les lavages successifs des embryons permettent d'éliminer tout contaminant éventuellement présent autour de l'embryon lors de sa collecte.
Bénéfices attendus
La décontamination de lignées de souris par transfert d'embryons permet de modifier le statut sanitaire des lignées et donc leurs conditions d'hébergement, qui sont ainsi améliorées, sans perdre le génotype des animaux. Des souris hébergées dans des conditions d'animalerie conventionnelle sont exposées en permanence à des stimulations de leur système immunitaire par l'environnement (air, litière, nourriture, eau de boisson, personnes fréquentant l'animalerie). Ces stimulations ont forcément un impact sur les réponses immunitaires des animaux. Les études scientifiques qui portent sur des modèles de souris et qui s'intéressent à l'effet de mutation génétique sur les réponses immunes doivent s'affranchir des stimulations non contrôlées des animaux par leur environnement. La décontamination de ces lignées permet leur hébergement en animalerie protégée dans des conditions extrêmement contrôlées (air filtré, eau de boisson filtrée, nourriture irradiée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes en contact avec les animaux).
Procédures
Au cours de ce projet, les différents femelles utilisées seront soumises à: - 2 injections intrapéritonéales lors du parcours de superovulation pour les 60 femelles fertiles des lignées à décontaminer - 1 chirurgie de réimplantion d'embryons lors du transfert d'embryon d'une durée de 15 minutes maximum et 3 administrations sous-cutanées sous anesthésie gazeuse pour les 30 femelles pseudo-gestantes.
Impact sur les animaux
La piqûre d'aiguille pour l'injection des hormones aux femelles recevant le protocole de superovulation entraine une douleur légère et de courte durée et un stress physique de courte duré. La piqûre d'aiguille pour l'injection de la buprénorphine aux femelles recevant les embryons entraine une douleur légère et de courte durée et stress physique de courte duré. L'intervention chirurgicale des femelles recevant les embryons entraine un stress physique ainsi qu'une gêne liée à la présence de l'agrafe sur le dos.
Devenir
A la fin de la procédure "Superovulation et prélèvement d'embryon": 20 animaux seront replacés en zone d'élevage (20 femelles des lignées à décontaminer non bouchées). Au cours de ce projet, 70 animaux seront euthanasiés (40 femelles fertiles des lignées à décontaminer seront euthanasiées pour recupérer les embryons + 30 femelles réimplantées aprés naissance des petits)
Remplacement
Ce projet consiste à décontaminer des lignées de souris. Il n'est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animal. La décontamination des lignées intervient dans le contexte de recherches fondamentales visant à comprendre, dans sa globalité et sa complexité, le contrôle de la réponse immune et les lymphoproliférations. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas pour l'étude des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. La décontamination des lignées permet de contrôler l'impact du milieu environnant sur les animaux et limiter les stimulations du système immunitaire car tous les éléments entrant en contact avec les souris sont contrôlées (air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litère autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie).
Réduction
Les femelles utilisées pour la production d'embryons vont recevoir un traitement hormonal afin d'augmenter le nombre d'embryons récoltés, ceci permet de limiter le nombre de femelles utilisés. Le nombre de 6 femelles par expérimentation de décontamination a été determiné en prenant en compte les expérimentations passées. Ce nombre permet d'avoir un nombre suffisant de femelles bouchées et par conséquent un nombre suffisant d'embryons nous permettant d'avoir des résultats dès la première expérimentation. Les femelles ne présentant pas de bouchon vaginal seront remises dans leur zone d'hebergement afin d'être utilisées pour d'autres expérimentations du laboratoire.
Raffinement
Les animaux bénéficient d'enrichissement dans les cages conformes aux recomandations de la structure bien être de l'établissement. Le personnel est formé à l'expérimentation (manipulation, injection) ainsi qu'à la chirurgie sur le petit animal et maintien ses compétences au cours du temps. Ainsi, toutes les précautions sont prises pour induire un minimum de douleur chez l'animal. La surveillance des animaux en expérimentation est renforcée les jours suivants afin de s'assurer du bien être animal. Un protocole de gestion de la douleur est établi et mis en place dès que le score de douleur établi lors des surveillances quotidiennes le prévoit. Aprés la chirurgie, des croquettes humides sont placés dns la cage afin que l'animal puisse avoir accés à l'eau et à la nourriture le temps de recouvrer une mobilité normal (moins de 24h).
Choix des espèces
L'utilisation des souris est justifiée dans les projets du laboratoire les utilisant et faisant l'objet d'autres demandes d'autorisation de projets. De fait, le présent projet visant à décontaminer des lignées de souris pour les soumettre à un environnement microbien plus strict ne peut se faire que sur l'espèce Mus musculus. Les animaux seront utilisés entre 2 et 12 mois qui correspond, chez la souris, à l'âge correct à optimal de fertilité. De plus, à cet âge, les femelles receveuses d'embryon supportent bien la chirurgie.
Etude de la diffusion de nouveaux antibiotiques au niveau du système nerveux central (SNC) en présence d’inhibiteurs des transporteurs
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Mesurer combien de nouveaux antibiotiques passent dans le liquide cérébro-spinal, en vue d'ouvrir la voie à un essai clinique : 848 souris femelles vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour analyser leur cerveau. Elles reçoivent dans le ventre un lipopolysaccharide destiné à mimer une inflammation infectieuse, puis un inhibiteur de transporteurs, puis l'antibiotique. Le crâne est rasé et la peau incisée sur un centimètre pour ponctionner cinq microlitres de liquide cérébro-spinal, avant un prélèvement de sang à la veine de la queue. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et décrit un effectif calculé "au plus juste", qui comprend 10 % de souris supplémentaires prévues en cas de mortalité.
Objectifs
Les infections bactériennes au niveau cérébral sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance des bactéries, les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, plusieurs molécules sont recommandées dans les infections cérébrales cependant ces antibiotiques peuvent présenter des effets indésirables sévères et générer des résistances bactériennes. De nouveaux antibiotiques, actifs sur les bactéries résistantes, possèdent de plus longues durées d'action et moins d'effets indésirables. Cependant, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion au niveau cérébral. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral. Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système cérébral de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
La possibilité d’usage de ces nouveaux antibiotiques pour lutter contre les infections cérébrales par des bactéries résistantes est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système cérébral de la souris pourront ouvrir les portes à un essai clinique chez l’Homme.
Procédures
Nous administrerons aux souris, par voie intra-péritonéale en 10 à 15 secondes : des antibiotiques, du lipo-poly-saccharide (afin de mimer une inflammation liée à une infection), ainsi que des molécules inhibitrices des transporteurs de médicaments afin d’explorer les mécanismes de passage des antibiotiques au niveau cérébral. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Cérébro-Spinal (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le liquide cérébro-spinal puis le sang seront prélevés. Pour prélever le liquide cérébro-spinal, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement d'un anesthésiant 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection d'antalgique 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipo-poly-saccharide par voie injectable en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 30 minutes après l’administration de lipo-poly-saccahride et 2 heures après l'administration de la molécule inhibitrice.
Impact sur les animaux
Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (cerveau).
Remplacement
L'utilisation des animaux est indispensable en raison des nombreux mécanismes impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte le devenir du médicament dans l'organisme ou des effets comme l'inflammation. Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système cérébral de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre minimum de points de dosage des médicaments (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le liquide cérébro spinal. Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point de dosage est nécessaire. Des analyses statistiques des résultats sont réalisées. Le nombre de 848 souris nécessaires au total (8 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.
Raffinement
Les prélèvements du liquide cérébro spinal (5µl) et du sang (200µl) se font sous anesthésie. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le liquide cérébro spinal, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale par voie injectable 10min avant prélèvement du liquide cérébro spinal. L'inflammation systémique est induite par l'administration de lipopolysaccharide, et les souris recevront un traitement antidouleur par voie injectable 30 minutes avant l’injection du lipopolysaccharide. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du lipopolysaccharide. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%
Choix des espèces
Pour cette étude seront utilisés des souris. La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaire pour pouvoir étudier les concentrations des médicaments dans le sang et le liquide cérébro spinal.
Etude du microenvironnement immunitaire des tumeurs épithéliales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système urogénital
Endormies au masque, implantées une fois avec des cellules tumorales sous la peau, dans le péritoine ou dans la bouche, puis attrapées trois fois par semaine pour le suivi, 2 520 souris vont être utilisées dans ce projet sur le microenvironnement immunitaire des tumeurs. Suivent douze injections de substrat pour l'imagerie par bioluminescence, trois injections d'immunothérapie et deux administrations nasales d'un vaccin expérimental. 1 376 souris relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 144 d'un niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever les tumeurs et un grand nombre d'organes associés, le porteur indiquant que 70 % des expériences s'arrêtent au dixième jour, avant les premiers signes de douleur.
Objectifs
Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes liés aux cellules immunitaires se trouvant à l’intérieur des tumeurs et en particulier aux lymphocytes qui sont les cellules immunitaires tueuses de tumeurs. A l'intérieur des tumeurs, la capacité tueuse des lymphocytes est inhibée par l'expression de molécules, appelées "checkpoints", à la surface des lymphocytes. Nous cherchons à comprendre les mécanismes menant à l'expression des "checkpoints" sur les lymphocytes. Nous cherchons à tester dans nos modèles précliniques l’efficacité de traitements bloqueurs de chekpoints (dont certains sont déjà utilisés en clinique) ainsi que d’un vaccin anti-cancer et comprendre ce que leur utilisation déclenche dans l’organisme. Nous planifions d’utiliser des modèles précliniques tumoraux permettant d’étudier 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d'oncologie préclinique), 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopique (c’est-à-dire dans l’organe duquel les cellules tumorales sont issues, comme par exemple intra-oral pour les tumeurs de cancers oraux).
Bénéfices attendus
En utilisant ces modèles précliniques de cancer, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires caractéristiques des lymphocytes "tueurs de tumeurs". Nous comprendrons comment les tumeurs contournent leur activité cytotoxique en induisant l'expression des checkpoints. Pour cela, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans leur organe d'origine. D'où l'utilisation des modèles d'implantations orhtotopiques, qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d'origine. Ainsi, en ciblant, de façon appropriée à chaque type tumoral, les checkpoints exprimés par les lymphocytes, et en développant des vaccins permettant d'activer ces mêmes lymphocytes, nous pourrons proposer une amélioration des stratégies thérapeutiques déjà en place. Cela pourrait permettre, à terme, de faire évoluer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancers oraux, du col de l'utérus, des ovaires.
Procédures
Les animaux sont soumis: 1) à des procédures d'implantations de cellules tumorales (implantation sous-cutanée (SC), implantation orthotopique intra-péritonéale (IP), implantation intra-orale (IO), 2) à des procédures d'injection intra-péritonéale de composants de type: anesthésiant, substrat de l'enzyme exprimée par les cellules tumorales, immunothérapies (anticorps inhibiteurs de checkpoints), et 3) à une procédure d'administration intra-nasale de vaccin - Les procédures d’implantation de cellules tumorales ne seront effectuées qu'1 seule fois par animal, chacune dure environ 5 min par animal. - Les procédures d’ injection d'anesthésiant IP seront effectuées 2 fois par animal (1 fois à l'implantation du cancer), elles durent 2 min par animal. L’injection de substrat sera effectuée 12 fois par animal (à chaque mesure lors du suivi par caméra bioluminescente), sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal. 2): l'immunothérapie sera injectée 3 fois par animal, elle dure 2 min par animal. – L’administration du vaccin sera effectuée 2 fois par animal, sur animal anesthésié, elle prendra 5 min par animal.
Impact sur les animaux
L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés juste après l'euthanasie.
Remplacement
Notre étude vise à explorer les mécanismes immunitaires dans les tumeurs épithéliales de plusieurs origines afin de développer des immunothérapies (anticorps et vaccin) et de comprendre la résistance des tumeurs aux immunothérapies actuelles. Le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi-cellulaire d'une tumeur avec son microenvironnement. Nous ne pouvons pas in vitro (ni dans des organoïdes, ni dans une flasque de culture in vitro) reconstituer un microenvironnement complet autour des cellules tumorales, qui contiendrait un réseau complexe multicellulaire et reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature actuelle concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer à 2, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous désignons également nos manips afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le groupe témoin sera utilisé pour comparaison avec plusieurs lots d’animaux afin de diminuer l’utilisation inutile d’animaux.
Raffinement
Pour optimiser le raffinement, notre long recul (>18ans) sur ces modèles permettra un suivi et une évaluation au plus juste de l’inconfort et de l’éventuelle apparition de souffrance. En effet, 70% des expériences seront arrêtées à J10, bien avant les 1ers signes de douleur. Dans les 30% d’expériences de suivi longitudinal, aucune nécessité de maintenir les animaux en souffrance, ainsi les animaux seront euthanasiés avant d’atteindre le point limite. Les procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés à l’expérimentation animale et au bien-être animal. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie, pour éviter le stress et la douleur. La préhension des animaux se fera en dirigeant doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de la poser sur une grille et d’effectuer la contention. Puis une fois endormis, les animaux seront posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Du gel oculaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs : les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien réveillés afin d’éviter une baisse de température liée à la ventilation dans les cages. Egalement en post-opératoire, les souris recevront une alimentation enrichie dans des contenants déposés au sol afin qu’elles n’aient pas à se redresser pour se nourrir. Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations européennes, dans des cages collectives. Des objets appropriés (tubes cartons, lanières papier kraft, papier absorbant.) seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress, de faciliter leur thermorégulation et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques des souris. Même si les points limites ne devraient pas être atteints pour nos procédures, nous veillerons à éviter toute souffrance ou détresse chez les animaux. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise et aucun animal ne sera maintenu en souffrance.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -La litérature scientifique, définissant le système immunitaire murin comme pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille qui facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie). -la biodisponibilité des souris transgéniques permettant d’étudier des mécanismes immunitaires en détail. Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet, nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.
Evaluation pré-clinique d’anticorps à domaine unique synthétiques pour la détection et le traitement de tumeurs cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Transportées de l'élevage à l'animalerie entre 5 et 8 semaines, âge auquel le porteur indique qu'elles supportent mieux le voyage, 3 593 souris vont être utilisées pour tester des anticorps à domaine unique. 2 720 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 873 d'un niveau modéré, et toutes seront tuées pour prélever tumeurs et organes. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales sous la peau, dans le muscle ou par voie intraveineuse, jusqu'à deux injections par jour de traitement ou de produit de diagnostic, un prélèvement de sang toutes les deux semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur décrit les tumeurs intramusculaires comme pouvant empêcher la souris de se déplacer, et affirme que seuls les anticorps déjà efficaces en culture cellulaire passeront à l'animal, la réglementation exigeant de toute façon deux modèles animaux avant tout essai humain.
Objectifs
Le cancer reste une des principales causes de mortalité dans le monde, malgré des avancées médicales notables. Les traitements conventionnels rencontrent des limitations, notamment face à des tumeurs résistantes, nécessitant l'émergence de nouvelles approches thérapeutiques. L'immunothérapie se présente comme une révolution, mobilisant notre système immunitaire contre les cancers. Depuis vingt ans, les immunothérapies ont connu un développement rapide avec de nouvelles stratégies utilisant des anticorps (Ab). Ces Ab peuvent reconnaître une cible précise sur une cellule cancéreuse et induire une réponse spécifique. Ils peuvent aussi être exprimés à la surface des cellules immunitaires, redirigeant ces cellules spécifiquement vers leur cible tumorale (thérapie cellulaire). Une autre stratégie dans la lutte contre le cancer consiste à perfectionner les méthodes diagnostiques. En identifiant les cellules cancéreuses tôt, nous pouvons réagir rapidement. À un stade avancé, les métastases résultent de la migration de cellules cancéreuses vers d'autres parties du corps, générant de nouvelles tumeurs. Ainsi, les micro-métastases, bien que non détectables traditionnellement, indiquent le début de la propagation. La détection précoce des cellules cancéreuses est cruciale. Les Ab peuvent être liés à des molécules radioactives, et grâce à leur spécificité ils peuvent améliorer la détection radiologique des cancers. Cependant, les Ab classiques ont des limites en termes de taille. De nouveaux formats d'anticorps, ne possédant que la partie active des Ab, appelés anticorps à domaine unique (sdAb), ont été développés. Ils ont l'avantage d'être dix fois plus petits, ce qui leur permet de mieux pénétrer les tumeurs et d’améliorer à la fois les traitements et les diagnostics. Ces sdAb peuvent remplacer les anticorps classiques et augmenter les chances de survie des patients. Des lignées cellulaires dérivées des tumeurs, représentant la diversité de la maladie chez l'homme, seront utilisées pour tester le rôle diagnostique ou thérapeutique de nos sdAb. L'objectif de ce projet est de développer et tester des sdAb synthétiques afin d'offrir une meilleure solution diagnostique et thérapeutique en clinique.
Bénéfices attendus
Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde et, malgré les traitements classiques et le développement des nouvelles thérapies ciblées, cette maladie dans ses formes métastatiques reste majoritairement incurable. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est nécessaire et représente un réel défi pour la médecine. En développant et testant de nouveaux anticorps thérapeutiques, plus efficaces et/ou plus spécifiques que les anticorps déjà utilisés en clinique, nous pouvons améliorer le pronostic de certains cancers. Il est également important d’augmenter la connaissance et d'améliorer les différentes immunothérapies déjà utilisées en clinique. Une autre manière d'améliorer le pronostic des patients atteints de cancer est d'améliorer la spécificité et la détection précoce des cellules cancéreuses, par exemple lors de l’apparition des métastases. L'utilisation des anticorps comme outil de diagnostic, en les liant par exemple à des marqueurs radioactifs ou fluorescents, permettra la détection de micro-métastases et surmontera les limites des méthodes de diagnostics classiques. Cela signifie qu'il sera possible d'intervenir à des stades plus précoces du développement du cancer, ce qui contribuera à améliorer le pronostic des personnes atteintes de la maladie.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux seront réparties en deux lots. Pour le premier : Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles ou anesthésiées (1 fois par expérience). Lorsque les animaux sont anesthésiés, l'anesthésie durera entre 30 et 40 minutes. Si l'injection est faite sans anesthésie, le geste durera également 10 à 30 secondes. Le deuxième lot d'animaux suivra une procédure similaire avec des injections et des traitements supplémentaires pour les traitements. Les injections supplémentaires seront effectuées sans anesthésie et prendront environ 10 à 30 secondes. Les injections peuvent être faites une seule fois ou plusieurs fois, par exemple 1 fois par semaine ou 1 ou 2 fois par jour pour certains diagnostiques ou traitements. Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie inferieure à 5 min). Par la suite, les animaux seront suivis régulièrement. Le suivi des tumeurs sera fait 1 ou 2 fois par semaine. Il sera fait par le pied à coulisse ou par imagerie sous anesthésie générale (durée 20minutes maximum). 10 minutes avant l’imagerie un produit spécifique pour visualiser les tumeurs est injecté aux souris (injection 10 sec). Le suivi par imagerie peut se faire une fois toutes les 2 semaines pour les tumeurs qui poussent lentement.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de cellules selon différentes voies seront celles liées à la piqûre elle-même (gêne de courte durée). A plus long terme, les souris greffées avec des cellules tumorales sous la peau (par voie sous-cutanée ou intradermique), vont développer des tumeurs primaires in situ mais peuvent selon les pathologies développer des métastases dans le foie, le péritoine ou bien dans les poumons. Les cellules injectées par voie intraveineuse vont notamment développer des métastases au niveau des poumons. Les cellules injectées dans le muscle (voie intramusculaire) conduiront au développement de tumeur in situ (= dans le muscle) pouvant empêcher la souris de se déplacer.
Devenir
les animaux sont mises à mort, les organes et les tissus tumoraux sont prélevés pour des analyses post-mortem ultérieures
Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les formats d’anticorps, sera préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seuls les anticorps ayant montré une efficacité in vitro seront ensuite testés in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la durée de l’efficacité du traitement, les doses et la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets des anticorps et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance.
Réduction
Le nombre de souris utilisées est basé sur notre expérience avec des sdAb et également sur des études bibliographiques. Ce nombre tient compte du taux de la prise tumorale, de l’hétérogénéité d’efficacité des cellules thérapeutiques et de l’hétérogénéité des réponses animales. Le nombre d'animaux par expérience est déterminé à l'aide d'outils statistiques. Pour les mises au point des expériences le nombre de souris est réduit au minimum en fonction des résultats obtenus in vitro. Afin de réduire le nombre de souris pour un modèle donné: - Les souris utilisées pour étudier la croissance des tumeurs peuvent aussi servir pour la mise au point des sdAb diagnostiques. - Plusieurs thérapies pourront être testées en parallèle et par conséquent les mêmes souris "contrôles" seront alors utilisées. - Si au cours des expériences nous constatons que le sexe n'affecte pas la progression de la tumeur ni le traitement, nous pourrons réduire le nombre de souris initialement prévu.
Raffinement
Les injections peu invasives et seront faites sans anesthésie alors que les injections intramusculaires seront faites sous anesthésie avec traitement antalgique associé. Le suivi tumoral d'une tumeur palpable sera fait par le pied à coulisse sans nécessité d’anesthésie. Le suivi tumoral de tous types d'injections sera effectué par imagerie et sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Evaluation de l’état général de la souris : une grille de score déterminera les points limites. Un suivi clinique approfondi sera réalisé au minimum une fois par semaine et les animaux seront mis à mort dès atteinte des points-limite selon la grille de score. Les points de limite comprennent la taille des tumeurs, lorsqu'elle est mesurable au pied à coulisse, ainsi que la perte de poids liée à la maladie du greffon contre l'hôte. Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et c’est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. - La réglementation demande que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, entre 5 à 8 semaines, les animaux à cet âge supportent mieux le transport depuis l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que les traitements. Par ailleurs, les résultats ne seront pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Etude de l’impact de la déplétion des neutrophiles dans la croissance tumorale mammaire précoce chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Volume tumoral trop important, nécrose de la tumeur, perte de poids : les 20 souris de ce projet seront tuées à l'atteinte d'un de ces points limites. Elles reçoivent 54 injections et subissent sept prélèvements de sang sur animal vigile, pendant qu'une tumeur mammaire se développe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur cherche à établir qu'un type de cellules immunitaires participe à l'élimination précoce des cellules pré-cancéreuses. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles pour des immunothérapies préventives du cancer du sein, restent au conditionnel, quand la croissance de la tumeur et sa nécrose sont, elles, programmées.
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer rchez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité liée à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). Le cancer du sein regroupe un ensemble d’entités pathologiques hétérogènes, et le sous-type appelé HER2 reste très agressif avec un bon nombre de patients qui ne répondent pas ou montrent une résistance au traitement de référence. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. La considération du microenvironnement dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est une option prometteuse, et plus particulièrement le microenvironnement immunitaire. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire et dans la littérature scientifique mettent en évidence que les cellules immunitaires sont impliquées dans le développement tumoral précoce des tumeurs mammaires chez la souris et chez l’Homme. Notre projet de recherche a pour objectif de determiner qu'un type de cellules immunitaires joue un role dans l'élimination précoce des cellules pré-cancéreuses dans un modèle pré-clinique murin, pouvant aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des patients atteints de cancer du sein.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes impliqués dans la détection et l’élimination des cellules pré-tumorales, par les cellules du système immunitaire, devrait permettre de découvrir de nouvelle cibles thérapeutiques qui pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, des approches d’immunothérapies innovantes, visant à rétablir la reconnaissance précoce des cellules tumorales par le système immunitaire, représentent une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.
Procédures
Injections (54 injections, 2min par injection) Prélévement de sang sur animal vigil (7 prélèvements, 2min par prélèvement)
Impact sur les animaux
Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, voire une douleur légère et locale. Les injections peuvent entrainer une douleur légère au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer une douleur locale légère.
Devenir
A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort car ils auront atteinte un point limite (par exemple volume tumoral trop important, nécrose de la tumeur,perte de poids...)
Remplacement
À notre connaissance, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et les cellules tumorales ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détection des cellules transformées par le système immunitaire.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé à minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 20 souris sera utilisé dans ce projet.
Raffinement
Certains gestes (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable, un anti douleur sera administré.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser les cellules immunitaires au cours du développement des tumeurs mammaires. Les animaux seront utilisés à 6 semaines, correspondant à l’age adulte des souris et à la maturité du système immunitaire.