Souris
Formation et maintien des compétences aux procédures et techniques d’administration et de prélèvement chez la souris
- Formation professionnelle
6 335 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, 500 d'entre elles manipulées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit au maximum trois gestes : prélèvements sanguins par différentes voies, gavages, injections, parfois un test de sensibilité à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie surveillée plusieurs heures. Aucune connaissance n'en sort. Il s'agit de former les techniciens, étudiants et chercheurs de l'établissement, le porteur reconnaissant que des souris factices permettent d'apprendre les mêmes gestes mais les jugeant "en décalage avec la réalité expérimentale" faute de pelage et de tonus musculaire. L'effectif, lui, est présenté comme un maximum théorique qui ne sera vraisemblablement jamais atteint, établi sur le nombre de personnes à former dans l'année.
Objectifs
La règlementation en vigueur concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (Décret n° 2013-118 du 1er février 2013) et relative à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques (Arrêté du 1er février 2013), requiert que le personnel soit compétent. A ces fins, les techniciens de notre institut suivent les formations théoriques obligatoires. En complément de l’aspect théorique, nous devons assurer la compétence des nouveaux arrivants ainsi que le maintien des compétences du personnel avec une formation « pratique » d’administration et de prélèvements sanguins, techniques que nous maitrisons et pratiquons en routine dans nos animaleries. Cette formation continue permet ainsi aux techniciens, étudiants et chercheurs de mener les projets de l’institut dans les meilleures conditions pour les animaux. L’ensemble de nos projets se déroulant sur des animaux vivants, il est impossible de proposer ces formations autrement qu’en utilisant la souris pour modèle. En revanche, afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, les animaux servant à cette formation proviendront d’autres projets de sévérité légère à modérée, dès que ceux-ci sont terminés. La règlementation imposant un maximum de 3 procédures par animal, le nombre d’animaux nécessaire pour une année de formations sera de 1234, donc sur l’ensemble du projet (5 ans) 6170 souris. Aucun dommage particulier n’est attendu au cours de ces formations, les procédures étant classées légères ou modérées. De plus, les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bon été général et toute procédure potentiellement stressante sera réalisée sous anesthésie générale afin de préserver au maximum le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre en place et maintenir les compétences du personnel réalisant les gestes techniques sur animaux, employés durant les protocoles expérimentaux dans notre établissement. Le bénéfice est lié à la parfaite réalisation de tous les projets réalisés sur notre plateforme afin de garantir un raffinement de nos procédure avec des gestes réalisés avec le minimum de stress pour l'animal et une réduction potentielle du nombre d'animaux utilisés dans les autres projets, en lien avec une plus faible variabilité dans les gestes.
Procédures
Les animaux seront soumis à un maximum de trois gestes : des prélevements sanguins réalisés par différentes voies, des gavages ou des injections seront pratiqués. Ces gestes durent quelques minutes et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure. Certaines procédures peuvent durer plus longtemps, tels que le test de sensibilité qui peut affecter l'état des animaux durant plusieurs heures du fait d'une possible hypoglycémie.
Impact sur les animaux
Parmi les nuisances attendues, des contentions pour les prélevements sanguins ou les gavages seront pratiquées. Le test de sensibilité à l'insuline qui peut entraîner une hypoglycémie passagère, qui sera surveillée durant plusieurs heures afin de s'assurer que les animaux se portent bien suite à cette procédure. Pour réduire l'inconfort des animaux, ceux-ci auront une semaine de repos entre chacune des procédures et un maximum de trois procédures par animal sera pratiqué. Cela nous semble un bon compromis entre réduction et raffinement.
Devenir
Une fois que les animaux ont subi 3 procédures de formation, ils seront mis à mort. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés une fois qu'ils ont subi de nombreuses procédures.
Remplacement
L’ensemble de nos projets se déroulant sur animaux vivants, il ne nous est pas possible de réaliser des formations apportant une compétence complète autrement que chez la souris. En effet, il existe des souris factices sur lesquelles on peut s’entrainer aux différents prélèvements et administrations. Parmi les gestes pouvant être pratiqués sur ces modèles: Manipulation et contention, les prélèvements sanguins, l'administration intraveineuse et l'administration orale. Néanmoins, ces modèles sont parfaits pour les personnes devant apprendre le geste dans les premières étapes, mais cela ne permet pas de finaliser la compétence sur animaux vivants qui est requise pour effectuer de manière efficace les expériences. L'absence de pelage, de tonus musculaire et de contraction sont en effet des élements facilitant l'apprentissage mais en décalage avec la réalité expérimentale. Pour les personnes n'ayant jamais manipulé d'animaux, c'est une première étape qui sera mise en place autant que possible pour éviter l'utilisation d'animaux pour apprendre la méthodologie de chaque geste avant une formation aboutie pour devenir compétent
Réduction
Nous avons établis les effectifs nécessaires pour la réalisation de ce projet, selon le nombre de personnels à former durant une année. Ainsi, cela inclut la formation des étudiants, des chercheurs qui arrivent dans notre animalerie, mais aussi le maintien des compétences pour le personnel. Les effectifs indiqués sont à considérer comme des maximum théoriques qui ne seront vraisemblablement jamais atteints. Nous souhaitons pouvoir assurer une formation efficace de toutes les personnes amenées à travailler sur des animaux, mais tous les efforts seront entrepris pour réduire autant que possible le nombre d'animaux employés. Dans le cadre de formation ou de maintien de compétences, aucun résultat scientifique n’est attendu ainsi aucune approche statistique n’est utilisée.
Raffinement
Le personnel réalise toujours ses formations sous la surveillance d’un « tuteur » compétant afin de s’assurer du respect de l’animal et d’éviter toute souffrance ou stress, les procédures les plus stressantes étant faites sous anesthésie générale (prise de sang au sinus infra-orbitaire). De plus, ces animaux sont suivis en respectant les procédures en vigueur dans l'institut
Choix des espèces
Notre institut travaille actuellement quasi en exclusivité avec la souris pour ses projets. Il est donc logique que la formation du personnel se fasse sur la même espèce. Les animaux seront adultes car pour la majorité issus d’autres projets d’une part et d’autre part parce que les projets de notre institut se font sur adulte et le personnel doit donc se former à ce stade.
Noyau Parasousthalamique, reconnaissance de saveurs, conditionnement et addiction au sucre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cartographier les connexions d'un noyau de l'hypothalamus postérieur, récemment identifié par l'équipe, sert de préalable annoncé à des recherches sur la boulimie et l'anorexie. 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement du cerveau. Chaque animal subit une chirurgie intracérébrale unique de trente à quarante minutes pour l'injection de traceurs, puis, trois semaines plus tard au minimum, deux tests comportementaux de quinze minutes portant sur la récompense alimentaire et l'anxiété, précédés parfois d'une injection intrapéritonéale. Sur le remplacement, le porteur écrit en une phrase qu'il n'existe pas d'alternative, sans indiquer ce qui a été examiné.
Objectifs
Depuis plusieurs années nos recherches sont orientées vers l’étude d’un noyau de l’hypothalamus postérieur (noyau parasousthalamique – PSTN) potentiellement associé à diverses fonctions notamment en lien avec la prise alimentaire. Nous continuons d’accroitre nos connaissances tant au niveau de l’organisation du réseau que des fonctions de cette structure récemment identifiée. Ce projet concerne l’étude descriptive et des connexions neuronales de cette région dans des circuits et fonctions en lien avec certains processus cognitifs (perception hédonique) et émotionels (anxiété). Ces travaux sont préliminaires à des recherches dans les domaines de la boulimie et de l’anorexie.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre l’organisation de la région que nous avons identifiée chez le Rongeur et chez l’Homme et son impliquation dans des pathologies psychiatriques (anoréxie, boulimie). Il est adossé à d’autres projets, notamment transversaux, qui vont aider à identifier les causes de certains effets indésirables chez des patients stimulés par DBS (deep brain stimulation) (ex : Parkinson) et chez lesquels une prise de poids importante est observée. Il va aussi donner des informations originales quant à la différenciation de phénotypes neuronaux, et peuvent encore déboucher à une meilleure compréhension des pathologies telles que boulimie et anorexie.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude recevront des injections de molécules nous permettant de déterminer l'endroit où les neurones ciblés envoient leurs axones. Cette technique nécessite une intervention chirurgicale unique par animal, sous anesthésie générale et avec injection d'analgésiques. La durée de l’intervention est de 30 à 40 mn, essentiellement due au temps de l’injection sur plusieurs minutes. Puis, nous allons étudier dans quelle mesure cette région est modulée par la manipulation du système de la récompense impliqué dans l’ingestion d’aliments palatables, ou encore vérifier si l’inhibition sélective de ces neurones dans l’hypothalamus postérieur peut moduler des comportements anxieux en lien avec l’alimentation (‘Binge-eating’ ou réaction de manque à une habituation au sucre). Ainsi donc les chirurgies seront suivies (trois semaines après minimum), de deux expériences comportementales de 15 min chacune. Des injections uniques intrapéritonéales seront aussi réalisées afin d’administrer des médicaments ou agents pharmacologiques. Ces injections sont suivies des mêmes expériences comportementales.
Impact sur les animaux
Une douleur modérée est attendue suite à l’injection intracérébrale. Ainsi, ces injections seront effectuées sous anesthésie générale avec adjonction d’analgésiques qui seront aussi administrés après l’injection proprement dite. Certains états de malaise léger ou d’anxiété légère seront aussi induits par nos conditions expérimentales, mais ils seront de courte durée et améliorés par du raffinement.
Devenir
La mort des animaux à l’issue de toutes les procédures est indispensable pour le prélèvement du cerveau.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation du modèle souris à ce projet qui est ciblé pour cette espèce en tant que modèle pour comprendre les comportements animaux et humains, et nécéssite des interventions sur le cerveau.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé, les coordonnées des sites d’injections intracérébrales seront déterminées initialement sur animaux morts. Pour calculer le nombre d’animaux, nous nous sommes basés sur un outil en ligne gratuit du NC3Rs, conçu pour guider les chercheurs dans la conception de leurs expériences : l’EDA. Certains des animaux avec des injections inadéquates pourront être considérés comme contrôle supplémentaire, dépendamment du nombre.
Raffinement
Les principales mesures de raffinement concerneront les soins pré-, per- et post-chirurgicaux apportés aux animaux (par l’administration d’analgésiques et la surveillance quotidienne) et les conditions d’hébergement (enrichissement du milieu). Les animaux sont régulièrement manipulés par les expérimentateurs afin de diminuer le stress lors des procédures, notamment comportementales, et ils seront habitués aux conditions expérimentales afin de diminuer tout stress potentiel. Pendant les expériences, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de vérifier leur condition. Toute souffrance potentielle sera évaluée grâce à des critères qui, s’ils sont constatés, déclencheront l’intervention de la structure du bien-être animale et si les points limites sont atteints, provoqueront l’intervention du vétérinaire attaché à notre animalerie. Les décisions de soin ou d’arrêt des souffrances seront alors prises.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est dicté par les modèles existants permettant d’obtenir des résultats qui seront exploitables à la fois pour l’Homme et l’animal dans la compréhension des mécanismes cérébraux gouvernant l’expression de comportements adaptés ou pathologiques en lien avec la prise alimentaire. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront adultes.
Injection cérébrale postnatale d’AAV chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis une chirurgie terminale sans réveil pour prélever l'encéphale : 480 souris nouveau-nées porteuses d'une mutation provoquant des calcifications cérébrales sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit une intervention de quinze minutes réalisée une seule fois par animal, et signale des troubles moteurs possibles liés aux calcifications ainsi qu'une perte de poids après l'opération. Il annonce pourtant des points limites intermédiaires qui permettraient d'éviter l'euthanasie des animaux, alors que le protocole prévoit la mise à mort de tous. Les 480 souris sont tuées sous anesthésie pour analyse histologique du cerveau.
Objectifs
La forme familiale primaire de calcification cérébrale (PFBC) est une maladie rare présentant une calcification progressive des vaisseaux sanguins cérébraux amenant à leur dégénérescence. Un modèle murin portant une mutation génétique permet d’étudier cette pathologie : il présente une altération du réseau vasculaire et de ses propriétés. Des données préliminaires nous indiquent un lien entre l’altération du développement vasculaire cérébral observé dans ce modèle animal et les astrocytes. Le but de ce projet est de disséquer les voies moléculaires impliquées en diminuant l’expression de certains gènes dans les précurseurs d’astrocytes pendant les premiers stades postnataux.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la PFBC et dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentiels sur les modalités des régulations astrocytaires et apportera un éclairage essentiel sur de nombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les interventions sous anesthésie générale (injection intracérébrale puis chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau) durent 15 minutes et ne sont réalisées qu’une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé présente également l’apparition de calcifications cérébrales, ce qui en fait un bon modèle de la pathologie humaine. Ces calcifications peuvent engendrer, chez certains individus, des problèmes moteurs qui seront surveillés. Par ailleurs, les animaux subiront une injection intracérébrale qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie. L'opération peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire. Enfin les manipulations par contention et l’injection d’analgésiques et d’anesthésiques peuvent engendrer un stress transitoire.
Devenir
L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques. Cependant, des études préliminaires in vitro permettent de valider les plasmides avant qu’ils soient utilisés chez les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés (480) sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entreles différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la surutilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 4 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement (présence dans la cage de coton pour faire un nid et objets en carton) et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal en accord et en dialogue avec notre SBEA et notre vétérinaire référente. Dans nos expériences où une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte. Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie. Les animaux opérés feront donc l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. Une procédure avec des points limites gradés a été mise en place pour la surveillance des animaux post opération. Elle est basée sur l'état du pelage (pelage légèrement hirsute, légère piloérection, horripilation marquée), le comportement (Bébé hors du nid (>15 min)), les fonctions corporelles (prise alimentaire, augmentation de la taille par rapport à la portée) et la locomotion (démarche/posture, problèmes de mobilité significatifs/réticence à bouger). Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux seront respectés évitant l'euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Cette espèce est aussi choisie en raison de l’existence d’un modèle génétique déjà établi. Nous prévoyons 3 stades à étudier, choisis sur la base de nos études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent qu’il existe dès la naissance une altération du répertoire moléculaire des astrocytes dans ce modèle, et une altération du réseau vasculaire dans les jours suivants. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux ou maintenu chez l’adulte.
Elevage de rongeurs développant un modèle d’immunodéficience (2/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 3000
Expédiés vers d'autres établissements, utilisés sur place ou mis à mort au titre de la gestion de l'élevage, 904 000 rongeurs, dont 901 000 souris et 3 000 rats, sont élevés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces animaux naissent immunodéficients, donc sans défense contre les microorganismes, et sont maintenus derrière des barrières sanitaires pour que cette fragilité ne se déclare pas. Une partie subit une biopsie sur animal vigile pour génotypage, et des femelles gestantes peuvent être transportées avant le dernier tiers de la gestation. Le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer ces effectifs, et renvoie au savoir-faire de l'établissement et à ses données historiques.
Objectifs
Dans le développement de la recherche pour traiter les maladies humaines, les modèles de souris dépourvues d’un système immunitaire, c’est-à-dire des éléments du sang permettant de lutter contre les infections et les tumeurs sont devenus de plus en plus nombreux. Ce sont des souris immunodéficientes, donc dépourvues d’un système de défense contre des éléments étrangers au corps de la souris. Grâce à un système immunitaire très faible, ces modèles de souris peuvent recevoir des morceaux d’organes, des morceaux de cancers, ou les éléments du sang d’autres espèces comme l’Homme sans que ces éléments étrangers soient attaqués et détruits par le système de défense de la souris. Le but de ce projet est d’élever ces modèles de souris immunodéficientes afin de pouvoir les utiliser dans des projets qui peuvent imiter toutes sortes de maladies humaines. Ces animaux pourront servir par exemple à comprendre comment certaines maladies fonctionnent, à chercher des nouveaux traitements contre le cancer. Ces animaux peuvent aussi servir à reconstituer dans le corps de la souris un système de défense contre les microbes (système immunitaire) provenant de l’Homme pour étudier des maladies touchant le système immunitaire humain, ou pour trouver des traitements utilisant ce système de défense humain. De nouvelles méthodes dans le domaine de la lutte contre le cancer utilisent justement le système de défense humain et lui apprennent à attaquer les cancers afin de les détruire. Cela peut donc être reconstitué dans le corps de la souris, avec un système immunitaire humain, et un cancer humain, avant d’être testé chez des personnes atteints de cancer. Ces animaux dépourvus de système de défense contre les éléments étrangers sont susceptibles de développer dans la nature des maladies, c’est pourquoi elles sont élevées dans des conditions particulières de propreté afin qu’elles ne soient pas malades. Les animaux issus de cet élevage pourront servir dans notre établissement à créer certains modèles, comme les modèles avec un système immunitaire humain, ou alors pourront être directement redirigés vers d‘autres centre de recherche qui pourront les utiliser dans le cadre de leurs recherches spécifiques, comme la recherche contre le cancer ou la recherche sur les maladies du système immunitaire humain. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux présentant des déficiences immunitaires à divers degrés et par des voies différentes provoquées par la délétion qualitativement ou quantitativement d'un ou plusieurs gènes. Certains modèles sont génétiquement modifiés afin de les rendre plus immunodéficients et de leur permettre de tolérer des tissus ou des cellules d’autres espèces, notamment humains. Ces modèles de souris et de rats permettent de reconstituer un système immunitaire humain, et permettent la greffe de tissus humains, comme des tissus tumoraux, au plus proche de la maladie humaine, et sont donc très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques dans le domaine de la cancérologie et de l’immunité.
Procédures
Les souris et les rats sont immunodéficients donc sans certaines cellules de l’immunité impliquées dans la défense de l’organisme contre les microorganismes extérieurs (pathogènes, opportunistes). Ces animaux sont maintenus dans des structures avec un niveau sanitaire élevé (SOPF signifiant sans une liste de pathogènes et d'opportunistes) afin de ne pas développer de phénotype dommageable. Pour certains animaux, une biopsie est réalisée sur animal vigile pour son génotypage. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, EU1 pour l'élevage et EU2 pour les prestations de sciences de la reproduction (accouplement, fécondation in vitro, et cryopréservation des gamètes).
Impact sur les animaux
Les animaux sont immunodéficients et sont donc particulièrement sensibles aux organismes extérieurs (microorganismes pathogènes, opportunistes) pouvant amener des infections et une dégradation de leur état.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur ou utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort (gestion de l'élevage).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de cancers ou de maladies auto-immunes ou de maladies infectieuses, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
L’hébergement est réalisé dans des conditions sanitaires élevées SOPF, c’est-à-dire exemptes d’organismes pathogènes ou opportunistes. Dans ces conditions, les animaux ne déclarent pas de pathologie liée à leur immunodéficience. Un hébergement standard est réalisé (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Pour des lignées particulièrement fragiles, un enrichissement complémentaire est mis en place (matériel de nidification supplémentaires) et les densités au sevrage peuvent être diminuées. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Une attention particulière est apportée aux barrières sanitaires et aux contrôles sanitaires permettant de garantir le statut sanitaire SOPF nécessaire au maintien en bonne santé de ces souches immunodéficientes. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris et des rats sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Le rôle du récepteur CAR dans la formation de nouveaux neurones et la plasticité du cerveau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour établir le rôle d'un récepteur dans la formation de nouveaux neurones chez l'adulte, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cœur, du foie et des reins. Chaque animal reçoit une injection quotidienne pendant huit jours et un transpondeur RFID implanté sous la peau derrière l'oreille, avant vingt-quatre heures d'observation filmée par groupes de cinq. Le porteur justifie l'effectif par un calcul donnant dix souris par groupe, répété sur quarante groupes. Les souris dépassant le score de 15 sur la grille d'évaluation sont mises à mort avant le terme prévu.
Objectifs
Dans la présente étude, Nous étudierons le rôle de une protéine présente dans plusieurs parties du cerveau, mais sa fonction exacte reste peu connue. Des études suggèrent qu’il pourrait jouer un rôle important dans la production de nouveau neurones adulte, c’est-à-dire le processus par lequel de nouveaux neurones se forment dans le cerveau adulte, surtout dans l’hippocampe, une zone clé pour la mémoire et l’apprentissage. La production de nouveau neurones adultes est cruciale pour : la mémoire et l’apprentissage, la régulation de l’humeur, la réparation du cerveau après une lésion. Ces processus sont essentiels pour la santé mentale et sont probablement impliqués dans des maladies comme la dépression, la dégénérescence neuronale (maladies neurodégénératives) et la récupération après un traumatisme cérébral. Le projet vise à : Comprendre le rôle de cette protéine dans la production de nouveaux neurones : Étudier comment cette protéine aide à former et intégrer de nouveaux neurones dans une partie du cerveau appelée hippocampe, qui est essentielle pour la mémoire. Voir comment l’absence de cette protéine affecte le cerveau : Découvrir si le manque de cette protéine impacte la capacité du cerveau à s’adapter et à apprendre, ainsi que les fonctions cognitives. Examiner son lien avec les maladies neurodégénératives : Explorer si la perte de cette protéine pourrait être associée à des maladies du cerveau comme la maladie d’Alzheimer ou d’autres formes de dégénérescence neuronale. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait aider à développer de nouveaux traitements pour les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre le fonctionnement du cerveau : Ce projet aidera à mieux connaître comment le cerveau produit de nouveaux neurones chez l’adulte et les mécanismes impliqués. Nouvelles pistes pour des traitements : Découvrir le rôle de cette protéine pourrait permettre de créer de nouveaux traitements pour des maladies comme Alzheimer ou des problèmes de mémoire. Progrès en neurosciences : Les résultats de cette recherche enrichiront nos connaissances sur la façon dont le cerveau s’adapte et se répare tout au long de la vie. Impact sur les maladies neurologiques : Les découvertes pourraient contribuer à des avancées pour soigner des maladies affectant le cerveau adulte, comme les maladies neurodégénératives
Procédures
Les souris recevront une injection chaque jour pendant 8 jours. Insertion du transpondeur RFID : sera inséré sous la peau, généralement derrière l’oreille. Test comportemental : Cinq souris sont placées dans une boîte d’observation pendant 24 heures, où elles ont accès à de la nourriture, de l’eau et des jouets. Elles sont filmées par des caméras situées au-dessus de la boîte. Grâce à un transpondeur RFID que chaque animal porte, nous sommes en mesure d’identifier et d’analyser le comportement de chaque souris de manière indépendante. Les souris recevront une injection quotidienne pendant 8 jours. Un transpondeur RFID sera inséré sous la peau, généralement derrière l’oreille. Un test comportemental sera ensuite effectué : cinq souris seront placées dans une boîte d’observation pendant 24 heures, avec accès à de la nourriture, de l’eau et des jouets. Elles seront filmées par des caméras situées au-dessus de la boîte. Grâce au transpondeur RFID, chaque souris pourra être identifiée, permettant une analyse individuelle de leur comportement. Pour le prélèvement du cerveau, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée. Après anesthésie profonde confirmée, les souris ne se réveilleront pas.
Impact sur les animaux
Injections répétées peuvent causer un stress temporaire ou un inconfort local. L’insertion de transpondeurs RFID sous la peau pourrait entraîner une douleur à court terme. Les interventions nécessitant une anesthésie générale (comme l’insertion de RFID) peuvent provoquer une légère gêne pendant la phase de réveil. La manipulation fréquente des souris pour les injections ou les observations comportementales peut générer du stress.
Devenir
Les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, conformément aux protocoles éthiques approuvés. Cette décision est justifiée par la nécessité de prélever des échantillons des différents organes (comme le cœur, le foie, les reins, etc.) afin d’effectuer des analyses approfondies à la fois sur le plan histologique, moléculaire et biochimique.
Remplacement
Malgré les efforts pour développer des modèles alternatifs, l’utilisation des souris reste essentielle dans les études sur la neurogenèse adulte en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d’étudier ces mécanismes dans un contexte vivant. Bien que des cultures de cellules souches neurales et des organoïdes cérébraux puissent être utilisés pour étudier la neurogenèse, ils ne reproduisent pas les interactions complexes du microenvironnement cérébral (comme les interactions avec les astrocytes, microglies, et les cellules vasculaires) qui sont essentielles pour comprendre la neurogenèse dans un contexte naturel. Des avancées dans les modèles informatiques permettent de simuler certains aspects de la neurogenèse, mais ces simulations sont limitées par la quantité de données disponibles sur les processus biologiques sous-jacents et par la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris ont une neurogenèse adulte active dans des régions spécifiques comme l’hippocampe, ce qui les rend très utiles pour étudier les mécanismes de la formation de nouveaux neurones. De plus, les souris sont génétiquement modifiables, ce qui permet de créer des modèles spécifiques à des moments précis et à des âges différents, pour étudier des gènes comme le récepteur CAR.
Réduction
Pour estimer le nombre d’animaux nécessaires dans notre étude, nous nous sommes basés sur des expériences précédentes et des données obtenues en laboratoire. Nous avons utilisé un outil de calcul statistique qui prend en compte la variabilité des résultats afin de déterminer le nombre optimal d’animaux. Ce calcul nous a permis de définir un nombre de 10 souris par groupe. Les données recueillies seront ensuite analysées avec des outils statistiques, et nous comparerons les résultats entre les groupes traités et les groupes placebo. Pour ce faire, nous aurons besoin de 40 groupes de 10 souris chacun, soit un total de 400 souri. Ce protocole permet de minimiser le nombre d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables et éthiques.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires pour prévenir tout impact négatif sur le bien-être des animaux seront mises en œuvre tout au long du projet. L’expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d’hébergement adaptées, un enrichissement de l’environnement, ainsi que la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse chez les animaux. Ils seront placés dans des cages avec une maison en carton et du coton, pour répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. La manipulation des animaux sera effectuée par un personnel qualifié en expérimentation animale, doté d’une expertise spécifique des procédures décrites. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera contrôlé une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures afin de réduire la douleur. Après les interventions, de la nourriture et de l’eau gélifiée seront placées au sol pour faciliter leur alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour surveiller étroitement les effets des interventions. Les animaux présentant l’un des points limites ou une note supérieure à 15 sur cette grille seront systématiquement euthanasiés.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’adolescence chez l’humain (environ 15-20 ans). Nous nous concentrons sur le rôle d’une protéine spécifique dans la production de nouveaux neurones chez l’adulte. À ce stade de leur vie, les souris présentent une activité maximale de création de nouveaux neurones, un processus qui diminue avec l’âge, tant chez la souris que chez l’humain. Nous inclurons des souris mâles et femelles car certaines régions du cerveau, ainsi que les risques, l’incidence et la gravité des maladies neurologiques, varient selon le sexe.
Evaluation du Potentiel therapeutique et neuroprotecteur d’un estrogène naturel dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une incision entre l'œil et l'oreille, l'os du crâne dégagé pour poser une sonde laser-Doppler, et l'artère cérébrale moyenne obstruée pour provoquer un accident vasculaire : 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la substance testée pendant les sept jours précédant l'opération, ou au moment où le sang est rétabli. Toutes sont tuées pour récupérer leur sang et leur cerveau. Le porteur écrit que "la chirurgie en soi n'induit pas de douleur ou de souffrance" et ne signale qu'une perte de poids d'environ 10 % dans les 48 heures, pour une intervention qui consiste à provoquer un infarctus cérébral.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aiguë d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation) pour restaurer le flux sanguin. A ce jour, il n’y a pas de traitement approuvé pour protéger le tissu cérébral. Cette étude s’inscrit dans le cadre de développement de stratégies neuroprotectrices après un accident vasculaire cérébral ischémique . Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un traitement par un estrogène naturel modulateur des récepteurs des oestrogènes qui affecte de manière minime les paramètres de coagulation, dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral. Le mode d’action unique de cet estrogène se traduit par un profil bénéfice/risque amélioré par rapport aux autres œstrogènes. Nous évaluerons l’impact du traitement sur le volume de la lésion cérébrale, de la perte des cellules neurales et des troubles neurologiques et moteurs. Nous utiliserons un modèle expérimental d’ischémie cérébrale par occlusion de l’artère cérébrale moyenne suivi de reperfusion .
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un eostrogène naturel dans un contexte d’accident vasculaire cérébral. Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances précliniques qui pourront être à la base d’une proposition de nouvelles stratégies neuroprotectrices susceptible de réduire le dommage ischémique cérébral et corriger les déficits neurologiques et moteurs après la survenue d’un accident vasculaire cérébral (AVC).
Procédures
Les souris subiront une chirurgie au niveau du cou qui dure moins de 20 min pour induire une ischémie cérébrale suivie de reperfusion.. Une substance susceptible de réduire les effets délétaires de l'ischémie ou son solvant sont injectés aux souris soit avant la chirurgie pendant 7 jours ( effet neuroprotecteur) soit après la chirurgie à la reperfusion (effet thérapeutique) La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Une incision de la peau est effectuée entre l’oeil et l’oreille gauches et l’os ducrâne est dégagé, pour poser une sonde de laser-Doppler sur la boîte crânienne afin de mesurer le débit sanguin cérébral dans le territoire de l’artère cérébrale moyenne. La peau est refermée après la pose de la sonde.
Impact sur les animaux
La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale . La chirurgie en soi n’induit pas de douleur ou de souffrance. Une perte de poids d’environ 10% peut survenir dans les 48h qui suivent la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés pour récupérer le sang et le cerveau afin de faire des analyses.
Remplacement
Ces études nécessitent des expériences in vivo utilisant des animaux. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Le projet a pour but d’étudier l’effet dans le contexte de l’ischémie cérébrale, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier (système nerveux, système vasculaire et la connexion entre les organes). Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que des conséquences physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Le modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo permet de reproduire une grande partie des signes cliniques observés chez lles patients après AVC et d’évaluer in vivo les effets sur le cerveau et sur la récupération fonctionnelle (score neurologique, coordination motrice). Actuellement, Il n’existe aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas d’étudier l’efficacité d’un traitement visant à limiter la taille des lésions cérébrales et les déficits sensori-moteurs. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d’animaux à utiliser a été déterminé en tenant compte de la sensibilité des techniques utilisées et de la variabilité attendue du modèle sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature. Le nombre d’animaux par série expérimentale a été estimé au plus juste et est réduit au minimum, de façon à mettre en évidence des différences statistiques avec un risque d’erreur moins que 5%, sur la base de notre expérience de ce modèle et de nos études antérieures.. Nous avons optimisé les techniques de façons à évaluer le maximum de paramètres sur les mêmes groupes d’animaux (tests de comportement, taille de l’infarctus, et études immunohistochimiques au niveau du cerveau sont évalués sur les même lots d’animaux.
Raffinement
Les conditions de travail pour l’utilisation des souris ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Les expériences sont réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Une attention particulaire est portée pendant la chirurgie en particulier le maintien de la température corporelle grâce à une couverture chauffante. lLs souris sont observées régulièrement (à 6h et quotidiennement après l’ischémie) - les souris sont pesées avant et quotidiennement après ischémie pour évaluer la perte de poids. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées tout le long de l’étude jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont bien établis et maitrisés. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Souris adultes (8-12 semaines) pour lesquels le modèle d’ischémie cérébrale est bien validé
Etude des cellules dendritiques dérivées de monocytes in vivo en condition inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Huit applications d'un produit provoquant une dermatite sur une oreille, un jour sur deux jusqu'au quatorzième, mise à mort le quinzième : 462 souris vont être utilisées, 182 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 280 un niveau modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. D'autres reçoivent une injection dans l'abdomen qui déclenche une inflammation, ou des allergènes d'acariens instillés dans le nez chaque jour du septième au onzième jour. Le but consiste à trouver des critères permettant de distinguer un type de cellule immunitaire d'un autre, objectif de connaissance dont le porteur tire des perspectives thérapeutiques pour l'asthme et la dermatite atopique. Aucun analgésique ne sera employé, le porteur indiquant que cela pourrait affecter les résultats de l'expérience.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de trouver une méthode pour identifier un type spécial de cellules immunitaires, appelées cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDCs), chez les souris. Ces cellules ont été découvertes il y a 30 ans par différentiation de monocytes in vitro et étaient souvent utilisées pour étudier le fonctionnement des cellules dendritiques en général et pour des essais médicaux. Cependant, des recherches récentes ont montré que les moDCs sont différentes des autres cellules dendritiques que l’on trouve dans le sang et les organes, ce qui a créé des débats sur leur existence et leur rôle dans le corps. Actuellement, il n'existe pas de méthode fiable pour distinguer les moDCs des autres types de cellules dendritiques. Cela signifie que nous ne comprenons pas encore bien comment ces moDCs se développent dans le corps. Pour résoudre ce problème, nous allons utiliser un modèle de souris avec une inflammation abdominale, où nous avons récemment découvert que les moDCs se forment. Nous allons comparer les moDCs avec d'autres types de cellules dendritiques pour établir des critères clairs qui nous permettront de les identifier. Nous testerons également ces critères dans deux modèles d'allergies (asthme et dermatite atopique), car il est possible que les moDCs jouent un rôle important dans ces maladies. En résumé, ce projet a pour but de créer une méthode fiable pour identifier les moDCs chez la souris, afin de mieux comprendre leur rôle dans différentes maladies.
Bénéfices attendus
L'étude des cellules dendritiques dérivées de monocytes (moDCs) et des cellules dendritiques classiques dans des zones comme l’abdomen enflammé, les poumons des personnes asthmatiques, la peau des personnes atteintes de dermatite atopique, ainsi que dans les ganglions lymphatiques voisins, devrait nous aider à comprendre les rôles spécifiques de ces cellules dans ces maladies. Ces recherches pourraient nous permettre de trouver de nouvelles façons de traiter ces affections, ce qui aiderait à soulager la douleur des patients, à améliorer leur qualité de vie, et à faciliter leur intégration à l'école, au travail et dans la société. Cela pourrait également contribuer à réduire l'impact social et économique de ces maladies.
Procédures
1er type d’intervention : Les souris vont recevoir une injection brève dans leur abdomen pour provoquer une inflammation. Trois jours plus tard, elles seront mises à mort pour que les chercheurs puissent les analyser. Un groupe de souris recevra aussi une injection courte de cellules 18 heures après l’inflammation, puis elles seront également mises à mort trois jours après pour des analyses. 2ème type d’intervention : Sous anesthésie, les souris auront une solution contenant des allergènes d’acariens instillée dans leur nez pendant quelques secondes. À partir du septième jour, elles seront exposées à ces allergènes tous les jours jusqu’au onzième jour. Le quatorzième jour, elles seront mises à mort pour des analyses. 3ème type d’intervention : Sous anesthésie, une oreille des souris sera traitée pendant quelques secondes avec une solution qui provoque une dermatite. Elles recevront ce traitement tous les deux jours, pour un total de huit fois, jusqu’au quatorzième jour. Le quinzième jour, elles seront mises à mort pour des analyses.
Impact sur les animaux
La piqûre pour l'injection dans l'abdomen des souris peut causer une légère douleur, mais celle-ci ne dure pas longtemps. Ce traitement peut aussi provoquer des effets secondaires comme une inflammation de l'abdomen, une perte de poids, un pelage en désordre et moins de mouvement dans leur cage. Pour l'inhalation d'une solution dans le nez, les souris ressentent un léger inconfort pendant le traitement. Après une semaine, elles peuvent développer des symptômes allergiques, ce qui entraîne une souffrance modérée. Quant à l'application d'un produit sur l'oreille pour provoquer une dermatite, cela se fait sans douleur grâce à l'anesthésie. Cependant, à partir du deuxième jour, cela peut causer une irritation qui entraîne une douleur modérée jusqu'à ce que les souris soient mises à mort.
Devenir
A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. Soit un total de 462 animaux.
Remplacement
Ce projet vise à mesurer différents aspects de la réponse du système immunitaire lors d'une inflammation. Comme le système immunitaire est très complexe et que de nombreuses cellules interagissent entre elles pour réagir à une inflammation, il est important d'utiliser des modèles d'études sur des organismes vivants. Cela permet d'avoir une vue d'ensemble complète et précise de ce qui se passe dans le corps.
Réduction
Nous allons réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour notre étude. Nous travaillons avec des souris ayant une génétique uniforme, ce qui nous permet de limiter chaque groupe à 8 souris pour chaque condition testée. Actuellement, nous n'avons pas trouvé de données suffisamment fiables sur certaines cellules immunitaires pour calculer précisement le nombre d'animaux nécessaires pour chaque groupe. Cependant, une approche statistique basée sur les données disponibles indique qu'avoir 8 souris par groupe devrait être suffisant. Pour les groupes qui ne reçoivent pas de traitement, nous allons réduire le nombre à 6 souris, car il y a moins de variabilité dans ces cas. Après avoir analysé les résultats de la première expérience pour chaque condition inflammatoire, nous pourrons déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour les réglages des instruments, nous n'utiliserons qu'une seule souris de chaque type. Nous prévoyons de répéter chaque expérience trois ou quatre fois. En raison des différences possibles entre les analyses in vitro et celles sur des animaux, nous répéterons chaque premier groupe expérimental quatre fois. Cela nous permettra de définir des critères précis pour identifier les différents types de cellules. Si tout se passe bien lors de la première expérience, trois répétitions par condition seront suffisantes, ce qui réduira encore le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, nous les garderons en groupe autant que possible. Ils auront accès à du matériel pour construire des nids et seront surveillés chaque jour. Nous avons mis en place des points limites pour chaque procédure. Les interventions sur les animaux seront effectuées par des professionnels qualifiés et expérimentés afin de minimiser le stress lié à ces procédures. Nous utiliserons également du gaz anesthésiant pour les endormir lors des procédures. En revanche, nous ne pourrons pas utiliser d'analgésiques, car cela pourrait affecter les résultats de l'expérience. Donc, ils ne seront pas employés dans ce projet.
Choix des espèces
Les souris sont un excellent choix pour nos études en raison de leur taille, de leur cycle de reproduction rapide et de leur génétique. Elles nous permettent de mener des expériences en direct, y compris avec des souris génétiquement modifiées. De plus, leur fonctionnement biologique est assez similaire à celui des humains, ce qui nous aide à mieux comprendre comment fonctionne notre système immunitaire. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 12 semaines, car elles sont déjà matures sur le plan de leurs défenses immunitaires. Pour éviter les différences qui pourraient affecter nos résultats, nous veillerons à ce que l'âge des souris dans chaque groupe ne varie pas de plus de 2 semaines.
Thérapie oncolytique dans un modèle de glioblastome chez la souris. Etude en imagerie TEP/TDMX
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour des analyses sur les tissus prélevés, 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, jusqu'à deux injections d'un virus modifié ou de solution salée, et deux séances d'imagerie de seize minutes sur cinq semaines. Le virus retenu se fixe 210 fois plus sélectivement sur les cellules cancéreuses que sa version d'origine, selon des essais menés en culture cellulaire. Parmi les bénéfices attendus, le porteur annonce une régression tumorale "sans perte de poids ou effet secondaire notable", alors que la liste des effets indésirables qu'il prévoit comprend la perte de poids, une nécrose au point d'injection et une encéphalite provoquée par le virus.
Objectifs
Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable ainsi que la possibilité d’administrer le virus par voie intraveineuse tout en conservant son efficacité
Procédures
Dans la procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum 3 injections sous anesthésie gazeuse de 3 minutes chacune soit 9 minutes maximum. Pas de prélèvement sur animal vigile. Dans la procédure 2 : Chaque animal aura : - 1 anesthésie de 3 minutes pour injection de cellules tumorales à J0 - 2 anesthésies de 3 minutes pour injection de virus ou solution saline - 2 anesthésies de 16 minutes pour les séances d'imagerie . Total 50 minutes maximum sur 5 semaines
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection intraveineux caudale (72h maximum) , - nécrose transitoire des tissus au niveau du site d'injection intratumoral, - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus
Devenir
a la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le Sindbis (virus non modifié) n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumoralespar rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus Sinerpedoxx (virus modifié ciblant les intégrines) permet une infection 210 fois plus sélective (que le variant Sindbis) des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des virus Sindbis et Sinerpedoxx à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire ainsi que l’impact de la voie d’administration (intraveineuse ou intratumorale) sur l’effet thérapeutique.
Réduction
L’imagerie TEP est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons ainsi 10 souris par radiotraceur à l'inclusion afin d’avoir des statistiques sur les résultats obtenus. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.
Raffinement
Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.
Choix des espèces
Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 ou 8 semaines conformément à la littérature et à notre expérience
Approche nanomédicale pour normaliser la maturation des érythrocytes dans l’anémie congénitale par ARN messager
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Porteuses d'une délétion du gène de la chaîne bêta de l'hémoglobine, les souris de ce projet naissent avec une thalassémie et une anémie aux globules rouges déformés. 486 souris vont être utilisées, 414 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 un niveau léger. 156 reçoivent des nanoparticules lipidiques chargées d'ARN messager, 44 subissent sept prélèvements sanguins sous anesthésie espacés de deux semaines, et les animaux de quatre des cinq procédures sont tués pour caractériser leur système sanguin, la cinquième servant à produire ceux des deux dernières. Le porteur reconnaît que les symptômes développés par ce modèle murin "ne sont que partiellement décrits" et comble ce vide en énumérant ceux que ressentent les patients humains.
Objectifs
L'anémie, marquée par une insuffisance de globules rouges sains, touche un quart de la population mondiale. Environ 40 à 50 % des cas ne sont pas dus à une carence en fer et peuvent indiquer des maladies congénitales rares telles que l'anémie Diamond-Blackfan, la β-thalassémie ou l'anémie de Fanconi. Les anémies congénitales, des maladies héréditaires de la moelle osseuse, entraînent une production déficiente d’érythrocytes. Les troubles héréditaires de l'hémoglobine incluent les troubles structurels (comme la drépanocytose) et de production de globine (comme la thalassémie). Les traitements incluent des molécules stimulant la production de globules rouges, des transfusions sanguines ou des transplantations de moelle osseuse, mais ils sont souvent limités en efficacité et associés à des effets secondaires graves, affectant la qualité de vie des patients et engendrant des coûts élevés pour le système de santé européen. La β-thalassémie, un trouble héréditaire, se caractérise par des anomalies de la synthèse des chaînes β de l'hémoglobine, entraînant une érythropoïèse inefficace et un déficit en érythrocytes fonctionnels. Le projet vise à tester une formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) contenant un ARNm-candidat pour améliorer l’érythropoïèse dysfonctionnelle dans la β-thalassémie et d'autres anémies non ferriques. Nous fournirons une preuve de concept sur un modèle murin de β-thalassémie applicable à d’autres anémies. Cinq procédures expérimentales seront menées : 1. Sélection de la meilleure formulation et voie d’administration des LNP chez des souris sauvages. 2. Caractérisation de la biodistribution des LNP. 3. Élevage et production des souris beta thalassémiques. 4. Évaluation in vivo de l’impact des LNP contenant l’ARNm-candidat sur l’expression du gène chez les souris. 5. Évaluation in vivo de l’impact des LNP sur le développement de l’anémie chez les souris β-thalassémiques.
Bénéfices attendus
Notre proposition de thérapie basée sur l'ARNm-candidat ciblant la moelle osseuse fait partie du plan stratégique de recherche « Horizon Europe » (2021-2024) des thérapies innovantes et avancées pour les maladies non transmissibles. Notre projet devrait constituer une amélioration considérable par rapport aux options de traitement actuelles des pathologies sanguines en termes d'efficacité et sécurité. De plus, nous fournissons des connaissances essentielles sur l’administration ciblée de polynucléotides non viraux, qui pourra être exploitée pour des thérapies cellulaires et géniques de nouvelle génération dans un contexte plus large.
Procédures
156 animaux subiront une administration de nanoparticules (2min), 8 d’entre eux auront deux acquisitions d’imagerie optique 44 autres subiront une série de 7 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 2 semaines. L’ensemble des animaux sera manipulé et pesé 2 fois par semaine afin de vérifier leur bien-être à l’aide d’une grille de score (2min).
Impact sur les animaux
Les souris beta thalassémiques présentent une anémie microcytaire (taille anormalement petite des globules rouges), une poïkilocytose (déformation des globules rouges) et une réticulocytose (taux des réticulocytes dans le sang, indice de la productivité de cellules érythrocytaires de la moelle). D'après la définition de l'OMS, l’anémie est une maladie qui se caractérise par un nombre de globules rouges ou un taux d’hémoglobine des globules rouges inférieur à la normale. Les symptômes développés par le modèle murin que nous prévoyons d'impliquer dans ce projet de mise au point de nouvelles thérapies contre l'anémie ne sont que partiellement décrits mais chez l'humain, les symptômes courants sont : fatigue, vertiges, extrémités froides, maux de tête, essoufflement à l'effort. Les prélèvements sanguins, la biopsie de queue (douleur légère de courte durée), l’administration du traitement à évaluer et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. L'ensemble des manipulations, dont l'imagerie optique, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les animaux des procédures 1, 2, 4 et 5 feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique qui nécessitera leur mise à mort. La procédure 3 a pour objectif de produire les individus impliqués dans les procédures 4 et 5.
Remplacement
L’objectif de cette étude est la manipulation thérapeutique de l'expression génétique de cellules progénitrices responsables de l’hématopoièse humaine. Afin de minimiser au maximum l'utilisation d'animaux vivants, toutes nos recherches feront d'abord l'objet d'une caractérisation détaillée des LNP et des doses in vitro à l'aide de cellules cultivées. Cependant, l’analyse préclinique de l’efficacité in vivo de nanoparticules lipidiques ne peut se faire que sur des souris, modèle mammifère de β-thalassémie, elles ne peuvent pas être remplacées par un autre modèle car sur la base de critères génétiques et hématologiques, les souris homozygotes pour l'allèle mutant représentent le premier modèle animal de bêta-thalassémie.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis (calcul basé sur un test d’effectif) pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir la caractérisation de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules lipidiques ciblant la moelle osseuse dans le contexte pathologique d’une β-thalassémie. Dès que possible, nous utiliserons l’imagerie optique par bioluminescence qui est une méthode non invasive qui permet de caractériser la cinétique de biodistribution d’agents thérapeutiques sans nécessiter la mise à mort de l’animal. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests de student adaptés à la comparaison de moyennes de 2 groupes non pairés.
Raffinement
L'hébergement des animaux est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de domes en carton et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. De plus, l’ensemble des administrations de nanoparticules lipidiques et d'imagerie sera réalisé sous anesthésie gazeuse (Vetflurane 3%).
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie hématologique. Les souris beta-thalassémiques choisies pour ce projet portent une délétion spontanée au locus du gène de la chaine β de l’hémoglobine (gène Hbb) caractérisée par une β-thalassémie, anémie microcytaire (taille anormalement petite des globules rouges). Sur la base de critères génétiques et hématologiques, ces souris représentent le premier modèle animal de bêta-thalassémie extrapolable à l’Homme. Hors procédure d’élevage, les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 10-12 semaines, âge auquel les souris présentent une anémie.
Evaluation de l’infection testiculaire des arbovirus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Hamsters dorés : 648
Rendus transitoirement incapables de se défendre par une injection d'anticorps, puis inoculés avec des arbovirus, 1 080 souris et 648 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit trois à neuf anesthésies gazeuses et des prélèvements de sang répétés tous les deux à sept jours, l'infection pouvant provoquer une maladie virale aiguë avec atteintes neurologiques. Le projet cherche à savoir si ces virus se répliquent dans les testicules et peuvent se transmettre sexuellement, une question que le porteur juge très peu étudiée hors du virus Zika. Le travail se déroule en confinement de niveau 3, ce qui exclut par avance toute réutilisation comme toute adoption, et tous les animaux sont tués.
Objectifs
L’émergence de nouvelles pathologies virales et la réémergence de pathologies déjà connues est un enjeu majeur de santé publique du fait de leur récurrence depuis ces dernières décennies. Les arbovirus sont des agents pathogènes principalement transmis par piqure d’arthropodes hématophages. L’évolution de la répartition géopraphique de leurs vecteurs, conséquence du changement climatique, fait des arbovirus un danger menacant une proportion croissante de la population humaine. Chez l’Homme et l’animal, ces virus sont capable d’infecter une multitude de tissus (hépatique, reinal, cardiaque, cérébral, …). Pour certains de ces agents pathogènes, il a également été rapporté un tropisme pour les organes de l’appareil reproducteur (dont le testicule), avec pour principal exemple le virus Zika. Excepté ce virus, la possibilité d’un transmission sexuelle ou materno-fœtale des arbovirus n’est que très peu étudié. Sur cette thématique, ce projet propose d’étudier l’infection des organes reproducteurs mâles par des arbovirus présentant un intérêt majeur en santé humaine car à l’origine d’une morbi-mortalité importante chaque année. Ce projet permettrait d’attirer l’attention sur les risques de transmission sexuelle et de pathologie urogénitale des arboviroses.
Bénéfices attendus
En s’appuyant sur les précédents travaux du laboratoire et les études publiées par la communauté scientifique sur les modèles animaux et ex vivo d’infection du tractus génital, ce projet permet d’identifier les arbovirus à risque de transmission sexuelle et/ou d'induire une pathologie urogénitale.
Procédures
Les animaux sont soumis à l’injection d’anticorps (1 à 2 injections, durée : 5min), injection de virus selon différentes voies d’injection (une injection unique, durée : 7min), et à des prélèvements sanguins étalés dans le temps (prélèvement unique ou tous les 2-7jours en fonction des procédures, durée : 7min). Toutes ces interventions sont réalisées sous anesthésie gazeuse (3-9 anesthésies selon les procédures, durée : 7min)
Impact sur les animaux
La piqure d’aiguille nécessaire pour l’injection des anticorps, des virus d’études et des prélèvements sanguins entraine une douleur légère et de courte durée chez les animaux. L’immunodépression transitoire (suppression transitoire de l'immunité innée) accroit la sensibilité des animaux aux infections virales. L’infection par les virus d’étude est susceptible d’induire une maladie virale aigue, caractérisée par des atteintes neurologiques et/ ou systémiques de type modérées à sévères.
Devenir
Les expérimentations sont réalisées au sein d'un laboratoire de confinement de niveau 3 avec des virus à haut potentiel infectieux. Les animaux ne peuvent donc pas être réutilisés, replacés ou adoptés en raison du risque biologique.
Remplacement
Notre projet a pour but d’étudier la réplication des arbovirus dans les organes reproducteurs mâles, plus spécifiquement le testicule, et ainsi évalué la transmissibilité sexuelle des arboviroses qu'ils induisent. L’utilisation d’animaux est indispensable car elle permet d’évaluer ce paramètre en condition réelle, physiologique, en mettant en jeu la complexité biologique d’un être vivant. En collaboration avec un laboratoire spécialisé en atteintes urogénitales virales, nous sélectionnons les candidats d'intérêt pour une étude chez l'animal.
Réduction
Afin de réduire la quantité d'animaux sans compromettre les résultats de l'expérimentation, nous avons déterminé les effectifs minimums nécessaires à notre travail. Malgré le recours à l'animal indispensable pour ce type de projet, une étude poussée des virus avant leur utilisation chez l'animal permet de réduire au maximum le nombre de virus à étudier, et ainsi le nombre d'animaux utilisées. Certains paramètres font l'objet d'un monitoring chez un même animal afin de réduire d'avantage les effectifs nécessaires.
Raffinement
Un temps d’acclimatation est respecté entre la réception des animaux et le début des procédures. Les animaux sont hébergés dans des espaces adéquats, enrichis et sans privation d’eau et de nourriture. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille d’évaluation permet un suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Les modèles souris et hamsters sont des modèles de référence pour étudier les arbovirus. Les animaux utilisés devront être fertiles. Les souris et hamsters seront donc agés d'au moins 6 et 8 semaines, respectivement.
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 1000
Produits sur place, dans une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat, 20 000 souris et 1 000 rats âgés de 7 à 21 jours vont être identifiés et génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né reçoit un tatouage digital ou une puce sous-cutanée, puis l'extrémité de sa queue est amputée, sans anesthésie ni analgésie locale, le porteur indiquant qu'un produit appliqué au bout de la queue serait léché par la mère. Hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère et modification du comportement liée à la douleur figurent parmi les effets indésirables reconnus, présentés comme très rares. Les animaux au génotype recherché partent en expérimentation ou en reproduction, les autres sont réorientés vers d'autres projets ou vers la formation, et ceux qui ne trouvent aucun emploi sont tués.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans notre Etablissement Utilisateur, le génotypage permettant d'identifier les animaux porteurs d'une modification génétique d'intérêt. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital ou en l’implantation d’une puce d’identification, suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal âgé de 7 à 21 jours. Cette demande d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Cette demande couvre environ une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt, à la fois pour l'élevage, la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d'organes ou de tissus pour études ex vivo. L’identification par tatouage/pucage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux identifiés et génotypés sont soumis 1) à l'implantation en sous-cutané d'une puce ou en un tatouage digital ) 2) à une bisopsie du bout de la queue. L'implantattion d'une puce est réalisée une seule fois et le geste dure une dizaine de seconde. Le tatouage est réalisé une seule fois et la contention dure de 30sec à 1 min. La bisopsie de queue est réalisée une unique fois et dure 5sec.
Impact sur les animaux
le tatouage ou l'implantation d'une puce d'identification et la biopsie de queue peuvent entraîner une légère douleur. La contention de l'animal durant ces gestes peut être source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère, modification du comportement liée à la douleur.
Devenir
Les animaux ayant un génotype d'intérêt partirons en expérimentation ou seront utilisés pour perpétrer l'élevage. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt scientifique seront utilisés dès que possible dans d'autres projets ou pour formation. Les animaux ne pouvant être utilisés dans les projets, les formations ou l'élevage seront euthanasiés.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base de salive ou de poils ne permettent pas de procéder à l'identification d'animaux génétiquement modifiés de façon fiable. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements. Une erreur se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; la naissance d’animaux non viables ; l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages/puçage et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’Etablissement et l'équipe de zootechnie établissent les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’Etablissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’Etablissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Sur nouveau-nés pas de médication envisagée car tout anesthésique local serait difficilement applicable au bout de la queue et serait ensuite léché par la mère, ce qui engendrerait des effets indésirables. Dans la balance bénéfice risque, ce sont les gestes maitrisés et les instruments appropriés qui sont garant du raffinement de la procédure pour limiter toute douleur, souffrance et stress. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions misent en place n'ont pas les résultats escomptés, l'équipe de zootechnie prends la décision sans délai de mise à mort d'un animal. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée avec eau et nourriture ad libitum, dans des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Ils sont hébergés en groupe sociaux avec un enrichissement adapté pour reproduire les comportements naturels (tunnel/dômes pour se refugier, pelote de bois pour la nidification, bâtons à ronger) et leur bien-être est évalué quotidiennement par des personnels formés et compétents.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le modèle rongeur. La souris et le rat représentent une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux du rongeur permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus à l’espèce humaine. Par ailleurs, les rongeurs peuvent être manipulés génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Les rongeurs sont donc des animaux sur lesquels les évaluations comportementales dans le domaine des neurosciences sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille dont l'élevage est facilement réalisable et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l'animalerie de l'unité. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 21 jours, âge où les gestes sont réalisés plus facilement et plus rapidement car la contention est plus facile. La biopsie est également plus aisée à cet âge et moins douloureuse car le cartilage n'est pas encore complètement formé. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.
ETUDES DE PHARMACOLOGIES SUR DES MODELES TUMORAUX GREFFES PAR VOIE INTRA-TIBIALE CHEZ LA SOURIS IMMUNODEPRIMEE
- Recherche appliquée
- Cancers
Perte de poids, dégradation de l'état général et perte de mobilité déclenchent la mise à mort avant le terme prévu. 3 255 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules leucémiques humaines directement dans le tibia sous anesthésie, puis des traitements oraux, intrapéritonéaux ou intraveineux quotidiens ou bi-quotidiens, et des prélèvements de sang à la patte sur animal vigile atteignant 15 % de son volume sanguin sur 28 jours, pendant 60 à 120 jours d'étude. L'établissement présente ce modèle comme un outil à intégrer dans son processus de sélection de candidats médicaments, plus fidèle que la greffe sous la peau qu'il reconnaît pourtant moins invasive.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde (LAM ou AML en anglais) est un cancer hématologique relativement rare dont le besoin thérapeutique reste important. Elle représente environ 1,2 % de l'ensemble des cancers diagnostiqués chaque année dans le monde. L’AML est une pathologie agressive qui se développe rapidement et nécessite une prise en charge rapide. Le pronostic des patients atteints d’AML reste sombre malgré les progrès réalisés ces dernières années. Le taux de survie globale à 5 ans pour l’AML est d'environ 25 % chez les adultes, mais il chute considérablement avec l'âge, atteignant moins de 10 % chez les patients de plus de 65 ans. L’AML peut également toucher les enfants, elle représente 15 à 20% des leucémies pédiatriques. L'arsenal thérapeutique contre l’AML se compose principalement de la chimiothérapie intensive, des thérapies ciblées pour certaines mutations, et de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, ces traitements présentent des limites importantes : une toxicité élevée, une résistance des tumeurs aux thérapies ciblées et surtout des options limitées pour les rechutes. Les AML se développent au sein de la moelle osseuse, puis se disséminent dans le système sanguin ou lymphatique. C'est dans cet environnement propice à la croissance et à la différenciation des cellules sanguines que les cancers des cellules hématopoïétiques prennent leur origine et se développent en premier. L’objectif de ce projet consiste à mettre en place et à intégrer dans nos études sur la souris immunodéprimée (sans système immunitaire, permettant la greffe de tumeur humaine), la greffe orthotopique (qui est située à son emplacement anatomique habituel) des leucémies, via une injection de cellules tumorales dans l’espace intra-tibial, l’un des sièges de la moelle osseuse qui présente l’intérêt d’être facile d’accès. Ce modèle présente un intérêt particulier pour l’étude de la pathologie humaine. En effet, il y a une diffusion des cellules tumorales dans le système sanguin avec pour résultante le développement de signes cliniques similaires à ceux rencontrés chez le patient. Cette approche vise à mieux reproduire les conditions de développement pathologique chez le patient, rendant ainsi les observations et les conclusions obtenues chez la souris plus pertinentes pour les futures applications cliniques.
Bénéfices attendus
Actuellement, parmi les modèles de recherche préclinique utilisés pour étudier les cancers, l’évaluation de l’efficacité et de la pharmacodynamie (vérification de l’atteinte de la cible thérapeutique) des thérapies candidates s’effectue sur des cellules tumorales greffées sous la peau de la souris avec mesure au pied à coulisse de la taille des tumeurs. Cependant cette approche ne récapitule pas l’ensemble des conditions environnementales et pathologiques des maladies du sang chez l’Homme (telles que la leucémie). Les greffes en intra-veineuse (IV) quant à elles miment la propagation de la maladie chez l’Homme dans le sang ou la lymphe, mais le micro-environnement initial n’est pas le même. Le modèle de greffe intra-tibiale, est quant à lui plus représentatif de la physiopathologie chez le patient. Il permet de sélectionner les futurs candidats médicaments dans un contexte de propagation tumorale qui reproduit plus fidèlement le contexte environnemental et pathologique du patient lors du développement de leucémies. Ce modèle vise à être intégré dans notre processus de sélection et de caractérisation de candidats thérapeutiques dans les pathologies de leucémies en complément de la greffe IV qui reste cependant moins invasive que la greffe intra-tibiale. Le choix de l’un ou l’autre de ces modèles dépendra de nombreux paramètres, tel que l’indication finale d’application du candidat médicament, la question posée ou l’objectif de l’expérience par exemple. En outre, certaines formes de cancer hématologique ne peuvent pas être reproduites chez la souris par greffe sous-cutanée ou intraveineuse, car le microenvironnement n'est pas adapté à leur développement. La greffe intra-tibiale favorise la croissance de ces tumeurs, car elle reproduit le microenvironnement propice à leur développement. Contrairement à la greffe en sous-cutanée qui permet un taux de prise de la greffe oscillant entre 70% et 90%, la greffe intra-tibiale permet un taux de prise proche de 100% ainsi que des tumeurs plus homogènes (selon sources bibliographiques). Ce modèle nous permettra donc d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments pour le traitement de l’AML.
Procédures
- Analgésie préalable à la greffe : injection sous cutanée 20 à 30 minutes avant la greffe (10 secondes/souris) - Greffe intra-tibiale pour l’implantation des cellules tumorales : cette procédure prendra moins de 5 minutes et sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes. - Prélèvements de sang au niveau des membres inférieurs sur animal vigile, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de l’envahissement tumoral ou le suivi pharmacocinétique) (environ 20 secondes par prélèvement par souris). Réitération toutes les 3 semaines. - Traitements sur animal vigile : administrations aigues orales, intra-péritonéales ou intra-veineuses de candidats médicaments (10 à 15 secondes par souris). Traitements sur plusieurs semaines, en quotidien ou bi-quotidien. Dans le respect des limites éthiques.
Impact sur les animaux
Dans de rares cas, gonflement ou hématome au niveau du genou, provoquant une douleur modérée. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la patte doivent être effectués une fois par semaine et ce toutes les 3 semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation (60 jours s’il n’y a pas d’envahissement tumoral ou 120 jours lors des études d’efficacité avec des candidats médicaments qui provoquent la disparition des cellules tumorales) : - Piqûre au niveau de la veine saphène et prélèvement du sang qui provoque une douleur légère. Ce geste dure au maximum 1 minute par animal. L’envahissement tumoral des leucémies dans la moelle osseuse et dans le sang peut provoquer une perte de poids ainsi que l’apparition de divers signes cliniques : détériorations de l’état général et altération de la mobilité.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié en fin d'étude (ou cours d'étude en cas d’apparition de signes cliniques limites) pour réalisation d'études post-mortem.
Remplacement
L’identification de candidats médicaments est réalisée selon différentes étapes. Les premières études réalisées in vitro permettent de caractériser les composés candidats et de ne sélectionner que les molécules les plus efficaces en amont des études in vivo. Mais à l’heure actuelle, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité d’une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et c’est encore plus complexe pour des maladies du sang. Aussi les études in vivo demeurent indispensables pour étudier les effets pharmacologiques d’un candidat médicament, ses potentiels effets secondaires et prédire ses effets potentiels chez l’homme. La greffe intra-tibiale représente un modèle d’intérêt pour la recherche de produits anti-cancéreux dans le cadre du traitement des AMLs puisque ce modèle se développe dans le tissu d’origine, qu’il récapitule de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine et qu’il reconstitue les interactions entre les cellules tumorales et leur micro-environnement. Ainsi à ce jour, il n’y a pas de méthode substitutive. De plus, le modèle sera utilisé dans des phases avancées de développement des candidats médicaments, lorsque l’on se rapproche des phases cliniques chez le patient. Il visera à évaluer un nombre restreint de candidats médicaments dans ce modèle complexe et translationnel.
Réduction
Un des intérêts majeurs dans la mise en place de cette approche expérimentale, en plus du fait qu’elle reproduise très finement la complexité environnementale du contexte pathologique qui existe chez le patient, est qu’elle permet un taux de réussite de greffe chez la souris proche de 100%, soit la quasi-totalité des souris greffées qui pourront être incluses dans les études. Les candidats médicaments testés dans ce projet sont issus d’une présélection drastique in silico et in vitro incluant de nombreux modèles substitutifs à l’utilisation de l’animal. Les candidats médicaments sont également évalués en amont pour les aspects de sécurité non clinique et pour définir des doses non toxiques à administrer aux souris. Selon les besoins, une évaluation pharmacocinétique (permettant d’apprécier la distribution des candidats médicaments dans le système sanguin) sera intégrée au sein des études d’efficacité thérapeutique, permettant ainsi de ne pas réaliser deux études indépendantes et ainsi réduire le nombre d’animaux. Pour les prélèvements de sang de cette partie pharmacocinétique, la technique de prélèvement à la veine du membre inférieur, sera privilégiée, donnant la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal, dans le respect des limites physiologiques et des préconisations applicables au bien-être animal. Le nombre d’animaux par groupe pour la première phase dédiée à la détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale est déterminé sur la base bibliographique de chaque lignée tumorale à étudier, et en respect des volumes de sang prélevables recommandés par la SBEA. Des études statistiques pour cette première étape seront focalisées sur la différence entre mâles et femelles. Nous réaliserons ensuite des études statistiques et nous prendrons en compte l’avancement du développement des candidats médicaments afin de réduire le nombre de groupe par étude si possible : une approche statistique basée sur les données de détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale permettra potentiellement d’affiner le nombre d’animaux par groupe ou le nombre de groupe/étude pour l’étude de l’efficacité des composés.
Raffinement
• Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Un scoring individuel (axé sur l’activité et le comportement en complément des points limites standards et spécifiques au modèle sont mis en place afin de pouvoir suivre le bien-être animal et limiter toute souffrance). • Pour des prélèvements de sang, la technique de prélèvement de sang à la veine latérale du membre inférieur, sera privilégiée. Le volume total de prélèvement est conforme aux recommandations de la structure de bien-être animal afin de respecter la volémie physiologique et le bien-être animal. Cette technique est peu invasive. • Pour la greffe en elle-même, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie, protégés de l’hypothermie par l’utilisation de tapis chauffant. Un gel oculaire sera appliqué pour prévenir la sécheresse oculaire et une administration sous cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir la déshydratation. • À la suite de la greffe, il sera nécessaire de comprimer la zone d’injection par des gestes sûrs et acquis auprès d’un expert formateur afin d’éviter les risques de complications post injection. Les candidats médicaments sont également préalablement évalués pour les aspects de sécurité non clinique et les doses administrées dans ce modèle sont déterminées comme non toxiques pour le rongeur.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.