Souris

Comparer six candidats vaccins vivants atténués contre la tuberculose au BCG actuel, dans deux fonds génétiques de souris de résistance différente : 554 souris sont utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont vaccinées une fois, subissent trois prélèvements sanguins, puis sont infectées par les bacilles de la tuberculose en chambre de contention pendant dix-sept minutes. Le porteur qualifie ces nuisances de modérées et de courte durée en les ramenant aux minutes de contention, sans décrire à cet endroit la pathologie que l'infection installe ensuite. Il annonce une grille de score et des points limites précoces sans en donner les seuils, et affirme que le modèle animal est "incontournable" faute de modèle cellulaire pertinent.

Objectifs

La tuberculose (TB) demeure un problème majeur de santé publique et constitue un frein au développement économique. Les données épidémiologiques pour cette maladie sont édifiantes : 1/4 de la population mondiale est infecté et le taux de mortalité chez les adultes (1.5 millions de mort par an) est plus élevé que celui causé par le SIDA, le paludisme et toutes les autres infections tropicales réunies. Des thérapies existent mais sont souvent tenues en échec par leur coût, leurs effets secondaires et l’apparition de souches résistantes. De même, un vaccin vivant, Mycobacterium bovis BCG, est disponible mais son efficacité est extrêmement variable en fonction des populations vaccinées. Il est donc urgent de développer et d’optimiser de nouveaux vaccins pour arriver à contrôler la tuberculose. Au cours des dernières années, différents candidats vaccins reposant sur des antigènes ou des combinaisons d’antigène ont été évalués mais n’ont pas permis d’obtenir une efficacité supérieure au vaccin actuel le BCG. Ces résultats ont poussé la communauté scientifique à reconsidérer les vaccins vivants dérivés de Mycobacterium tuberculosis, l’agent principal de la tuberculose humaine, ou de BCG. Dans ce contexte, notre objectif est de comparer, entre eux et avec le vaccin actuel, les 6 candidats vaccins les plus prometteurs. Cette étude multicentrique impliquera plusieurs laboratoires français et internationaux. Pour réaliser cette comparaison, les différents laboratoires utiliseront plusieurs modèles de souris et plusieurs voies de vaccination. Notre rôle dans cette étude, consistera à comparer l’efficacité de protection de ces 6 candidats dans les modèles deux modèles de souris immunocompétentes présentant différentes réponses anti-TB retrouvées chez l’homme.

Bénéfices attendus

Nos études visent à identifier un vaccin vivant atténué de nouvelle génération qui mérite d'être étudié plus en profondeur dans le cadre d'essais pré-cliniques et cliniques et d’un développement potentiel en tant que vaccin amélioré contre la tuberculose. L'analyse comparative des performances de 6 souches de vaccin vivant atténué administrées par différentes voies dans 2 modèles de souris présentant une résistance variable à l’infection par les bacilles de la tuberculose contribuera à orienter l'allocation cruciale de ressources mondiales limitées pour identifier et développer une souche de vaccin vivant atténué plus efficace pour remplacer le BCG.

Procédures

Ce projet implique: 1) pour la procédure de calibration du système d'infection: une infection sur animaux placés dans des chambres de contention. Celle-ci sera réalisée une fois et la durée maximale sera de 30 minutes. 2) pour la procédure d'évaluation de l'efficacité protectrice: Tous les animaux subiront 3 prélèvements. Ces prélèvements durent 2 min environ. Tous les animaux seront vaccinés une fois et la vaccination dure environ 2 min. Enfin tous les animaux seront infectés. Pour cela ils seront placés dans des chambres de contention pendant 17min.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont présents à deux niveaux dans nos expériences : 1) lors de l’anesthésie, des prélèvements, de la vaccination et de l’infection des animaux (piqûre, contention, et prélèvement de sang), et 2) lors de la pathologie éventuelle induite par l’infection. Il s’agit de nuisances modérées et de courtes durées (17 min de contention pour l'infection et 2 min environ pour la vaccination ou le prélèvement de sang).

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse du développement de l'infection (évaluation de la charge bactérienne dans les organes et analyse histopathologique).

Remplacement

Différents modèles cellulaires ou animaux sont utilisés par les équipes travaillant sur la tuberculose. Malheureusement il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour comparer l’efficacité de candidat vaccin. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé en première intention est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases des projets seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, la taille des lots à utiliser a été déterminée par une équipe de statisticien. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures sont prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie lors de la vaccination, limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et des prélèvements, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à comparer l’efficacité de candidats vaccin-vivant, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes (avec un système immunitaire mature) et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant sept à quinze injections dans l'abdomen en seize jours selon la fréquence testée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trois prélèvements de sang au-dessus de la mâchoire s'y ajoutent par animal, sous anesthésie gazeuse. Le porteur reconnaît que ces injections répétées peuvent être douloureuses et stressantes, que les sites d'injection peuvent gonfler, et que plus la fréquence augmente, plus les désagréments augmentent. Le projet cherche la fréquence la plus basse qui reste efficace, la molécule ayant déjà été testée sur des cellules humaines, et le porteur affirme que le passage par un "organisme entier" est "nécessaire" pour repérer les effets secondaires.

Objectifs

Lorsque quelqu'un reçoit un organe d'une autre personne, son corps peut rejeter cet organe, c'est-à-dire que son système immunitaire attaque l'organe greffé, ce qui peut entraîner une perte de celui-ci. Ce phénomène, appelé "rejet vasculaire chronique", est la principale cause de perte d'un organe greffé à long terme. Parmi les cellules du système immunitaire qui participent à ce rejet, il y a un type de cellule appelé "Natural Killer" ou NK. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace sans effets secondaires importants permettant d’empêcher les cellules NK d’attaquer l’organe greffé. Ce projet vise donc à tester l’efficacité de deux molécules capables de bloquer l’activation des cellules NK dans un modèle de souris. Différentes fréquences d'administration seront donc testées afin de déterminer la fréquence la plus faible, c’est-à-dire nécessitant le moins d’injections tout en étant efficace. Lorsque l’efficacité d’une fréquence est démontrée, le projet s’arrête, la ou les autres fréquences restantes ne sont pas testées.

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous utilisons un modèle de souris pour tester l'efficacité d'un traitement qui vise à bloquer une voie spécifique dans les cellules NK lorsqu'elles sont dans un organisme vivant. Les résultats de cette étude nous aideront à déterminer quelle fréquence d'administration du traitement est la plus efficace tout en minimisant les effets secondaires. Il n’existe pas de traitement permettant de soigner efficacement le rejet causé par les cellules NK, c’est pourquoi découvrir de nouveaux traitements anti-rejet permettrait d’aider les patients greffés.

Procédures

Dans une première partie 32 animaux vigiles subiront une injection dans le ventre toutes les 54h à 60h (lundi à 7h, mercredi à 13h et vendredi à 19h) qui durera moins d’une minute pendant seize jours. Cela correspond à un total de 7 injections sur seize jours. Trois prélèvements de sang seront réalisés au-dessus de la mâchoire à huit jours d’intervalle minimum pour chacun des 32 animaux de la procédure qui auront été endormis au préalable à l’aide d’un gaz. Le prélèvement durera une à deux minutes. Le seizième jour les animaux seront endormis par respiration de gaz et seront mis à mort. Dans une deuxième partie, si elle est nécessaire, 32 animaux vigiles subiront une injection dans le ventre toutes les 48h qui durera moins d’une minute pendant seize jours. Cela correspond à un total de 8 injections sur seize jours. Trois prélèvements de sang seront réalisés au-dessus de la mâchoire à neuf jours d’intervalle minimum pour chacun des 32 animaux de la procédure qui auront été endormis au préalable à l’aide d’un gaz. Le prélèvement durera une à deux minutes. Le seizième jour les animaux seront endormis par respiration de gaz et seront mis à mort. Dans une troisième partie, si elle est nécessaire, 32 animaux vigiles subiront une injection dans le ventre toutes les 24h qui durera moins d’une minute pendant seize jours. Cela correspond à un total de 15 injections sur seize jours. Trois prélèvements de sang seront réalisés au-dessus de la mâchoire à neuf jours d’intervalle minimum pour chacun des 32 animaux de la procédure qui auront été endormis au préalable à l’aide d’un gaz. Le prélèvement durera une à deux minutes. Le seizième jour les animaux seront endormis par respiration de gaz et seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Au cours de la première partie du projet, les animaux recevront des injections dans le ventre toutes les 54 à 60 heures (lundi matin, mercredi après-midi et vendredi soir) pendant deux semaines. Au cours de la deuxième partie du projet, les animaux recevront des injections toutes les 48 heures pendant deux semaines. Au cours de la troisième partie du projet, les injections seront données toutes les 24 heures pendant deux semaines. Ces injections répétées peuvent être douloureuses et stressantes pour les animaux. Les endroits où ils reçoivent les injections peuvent gonfler et devenir douloureux à cause de la répétition. Plus les injections sont fréquentes, plus les désagréments sont importants. Les produits injectés peuvent aussi causer des effets secondaires, comme un changement de poids (prise ou perte de poids) chez l'animal, qui sera surveillé. Pour chaque procédure et pour chaque animal, on fera aussi trois prises de sang à au moins huit jours d'intervalle au niveau de la mâchoire. Cela peut être stressant et causer des douleurs pendant la guérison.

Devenir

Pour obtenir les résultats à la fin de chaque partie du projet, les cellules contenues dans un organe de l’animal sont nécessaires (la rate). Ils seront tous mis à mort de manière réglementaire à la fin de chaque expérience.

Remplacement

Il n'existe pas d'autre méthode que l'utilisation des animaux pour vérifier l'efficacité du traitement dans un organisme vivant. L'efficacité du traitement a déjà été testée sur des cellules humaines en laboratoire, mais l'utilisation d'animaux est nécessaire pour voir comment il fonctionne dans un organisme entier et pour détecter les effets secondaires. Des interactions complexes entre les cellules ont lieu dans un organisme vivant, il n’est pas possible de recréer ces échanges en laboratoire, c’est pourquoi l’utilisation des animaux est nécessaire pour répondre à notre question.

Réduction

Les fréquences d'administration seront testées une par une, avec des intervalles de temps de plus en plus courts, pour arrêter le projet dès que l'efficacité est prouvée. Le nombre minimum d'animaux nécessaires pour chaque test a été fixé pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre a été déterminé grâce à un test de puissance permettant de connaître le nombre d’animaux minimal pour tirer une conclusion.

Raffinement

Les injections seront faites à différents endroits du ventre pour éviter les zones rouges et gonflées, afin de ne pas causer de douleur aux animaux. Les prises de sang au-dessus de la mâchoire seront faites à différents endroits chaque semaine, et les animaux seront endormis avec un gaz avant. Le poids des animaux sera surveillé tout au long du traitement : ils seront pesés avant chaque injection. Dans la première partie, ils seront pesés trois fois par semaine, dans la deuxième partie quatre fois par semaine, et dans la troisième partie, tous les jours. Les signes de douleur seront contrôlés 5 jours sur 7 pour les parties 1 et 2 , et tous les jours pour la partie 3. On surveillera si les animaux ont le dos et courbé, des poils ébouriffés, une activité réduite, un changement d'appétit, ou s'ils s'isolent. Les animaux seront habitués à leur nouvel environnement pendant deux semaines avant de commencer les procédures, pour réduire le stress. Ils resteront en groupe pour éviter le stress lié à l'isolement. Leur comportement sera aussi surveillé, comme leur alimentation, leur toilettage, la construction de nids et l'exploration de leur environnement. Leur habitat sera enrichi pour permettre ces comportements. Enfin, les animaux seront endormis avec un gaz avant chaque geste de mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un animal avec une anatomie et un fonctionnement du corps assez similaires à ceux de l'être humain. Le système immunitaire de la souris fonctionne de manière comparable à celui de l'humain, notamment en ce qui concerne le rejet d'organes. C'est pourquoi la souris a déjà été utilisée dans la recherche pour étudier ces mécanismes. Des souris de plus de 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, leur système immunitaire est mature. Elles seront aussi âgées de moins de 2 ans et demi, ce qui correspond chez l'humain à la fourchette d'âge où on peut recevoir une greffe d'organe.

Une à deux séries de cinq injections dans l'abdomen, une chirurgie de dix minutes pour implanter une micro-pompe sous la peau du dos, quinze minutes d'anesthésie pour une échocardiographie : 3 040 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le projet cherche à savoir si le passage des lipides à travers la paroi des capillaires cardiaques peut être contrôlé, dans une forme d'insuffisance cardiaque liée à l'obésité et au vieillissement. Vingt souris par groupe sont demandées, au motif qu'une seule souris ne suffit pas à toutes les analyses. Le porteur résume en quatre mots les atteintes attendues, un surpoids et une bosse sur le dos, sans dire ce que délivre la micro-pompe ni comment le surpoids est obtenu.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente 50% des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée, dans laquelle, le ventricule gauche ne se remplit pas assez de sang parce que le muscle cardiaque est raide et incapable de se détendre. Il a récemment été proposé que l’accumulation de lipides dans les cellules cardiaques en particulier chez les patients obèses puisse être toxique pour le cœur et induire une rigidification des parois cardiaques. Il faut savoir que pour atteindre les cellules cardiaques, les lipides qui circulent dans le sang doivent passer à travers la paroi des capillaires constituée de cellules endothéliales. Nous avons fait l’hypothèse que l’accumulation toxique des lipides dans le cœur pourrait être limitée en contrôlant la fonction de barrière de la paroi des capillaires sanguins. L'objectif de ce projet est d'une part de tester cette hypothèse et d'autre part de caractériser le rôle de certaines voies de signalisation dans le contrôle du passage des lipides à travers les cellules endothéliales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l'insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée ce qui est nécessaire pour identifier de nouvelles cible thérapeutiques et améliorer la qualité de vie et la survie des patients.

Procédures

Les souris subiront 1 à 2 séries de 5 injections intrapéritonéales (chaque injection dure mois de 15 secondes), une chirurgie de 10 minutes visant à implanter une micro-pompe en sous cutané et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.

Impact sur les animaux

Administration intrapéritonéales répétées (pendant 5 jours consécutifs), Douleur post-chirurgicale, Surpoids, présence d'une bosse sur le dos

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure pour prélevement d'organes

Remplacement

L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions diverses entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes, fibroblastes) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas, à l'heure actuelle, être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.

Raffinement

L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.

Jusqu'à quatorze heures sans nourriture pendant leur période d'activité, pour qu'elles cherchent un morceau de fromage enfoui dans la sciure : 460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent le pneumovirus murin par instillation nasale sous anesthésie, et jusqu'à 360 d'entre elles sont contaminées par simple contact avec des congénères infectées, pour étudier la transmission du virus entre individus. Le porteur nomme les tests olfactifs et en donne la durée, sept minutes au maximum, qu'il juge sans stress pour un animal habitué. Il précise que les lignées transgéniques seront utilisées avant six mois d'âge et ne disposeront d'aucune mesure de raffinement spécifique.

Objectifs

Le projet présente deux objectifs : Mieux comprendre la physiopathologie des virus respiratoires au niveau de la cavité nasale en utilisant le pneumovirus murin (PVM) comme modèle, et mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la dissémination inter-individuelle. Le PVM est un virus naturellement adapté à la souris, la souris y est donc naturellement sensible, contrairement à d'autres modèles murins basés sur des virus humains par exemple. Elle développe une infection permettant la production de nouvelles particules virales, et une pathologie typique d’une infection par virus respiratoire.

Bénéfices attendus

Nos résultats permettront de comparer l’impact de ce virus PVM vis-à-vis de la littérature par rapport aux infections par d’autres virus respiratoires illustrant les différentes stratégies d’infections virales et les différentes défenses immunitaires de l’hôte. Nos travaux devraient ouvrir de nouvelles connaissances pour lutter contre des virus responsables de nombreux décès chez l’humain et de baisse de productivité dans les élevages animaux. La dernière pandémie (COVID-19) a ainsi tué au moins 7 millions de personnes dans le monde, la grippe aviaire est responsable chaque année de l’abattage de plusieurs millions d’animaux juste en France. A ce jour ; la physiopathologie de ces virus dans la cavité nasale ainsi que leur transmission restent largement à caractériser.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux (en dehors des animaux servant à étudier la propagation naturelle du virus soit au maximum 360 souris) seront soumis à une instillation nasale par souris sous anesthésie générale qui durent moins de 5 min afin de procéder à l’infection par le PVMLes animaux pourront suivre des tests olfactifs qui durent moins de 7 min par animal ce qui n’engendre pas de stress pour un animal habitué (toutes les souris pourront être concernées soit 460 souris). Ces tests seraient réalisés en début de journée jusqu’à 3 fois au cours du protocole. Au cours de ces tests, l'animal cherche de la nourriture cachée dans la sciure (petit morceau de fromage). Afin de motiver l’animal dans ces recherches, il peut être nécessaire de les mettre à jeun sur 14h maximum pendant leur période d’activité. Les capacités respiratoires des animaux seront mesurées à l’aide d’un appareil spécifique adapté aux souris.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont limités à une perte de poids et des difficultés respiratoires, car le virus utilisé est peu pathogène chez les souris utilisées. L’instillation nasale peut engendrer un stress chez l’animal et une fausse déglutition. L’évaluation du comportement olfactif induit un stress léger car il consiste à laisser l’animal seul rechercher de la nourriture enfouie. Ce test est également réalisé après une mise à jeun de 14h maximum.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus qui seront utilisés pour étudier les infections virales et la réponse immunitaire de l'hôte.

Remplacement

Les études concernant les interactions virus-hôte ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes avec un système immunitaire et un écoulement de mucus normal de la cavité nasale. Nous utiliserons ici des lignées modifiées génétiquement qui montreront des fonctions de mucus modifiées afin d’étudier son importance dans les infections respiratoires. Certaines interactions seront réalisées sur des cultures primaires de tissus issus de la cavité nasale de souris permettant de réaliser plus d’expérience par animal utilisé.

Réduction

Le nombre d'animaux est limité par des expériences pilotes déjà réalisées ainsi que des effectifs adaptés de 10 animaux des deux sexes par groupe pour obtenir des différences statistiques en se basant sur nos précédentes expériences.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupe sociaux pour éviter le stress lié à l’isolement, ils disposent également d’un enrichissement de leur environnement notamment pour créer un nid à l’abri d’une maison en carton de type igloo ainsi que de bout de bois à ronger. Préalablement à l'infection des animaux par instillation intranasale, et lors de l'euthanasie, les animaux seront anesthésiés. Les études comportementales seront précédées d'une période d'habituation pour limiter le stress des animaux lors de la réalisation des tests. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue lorsqu’ils seront soumis aux infections respiratoires et selon le statut génétique (prise de poids journalier et évaluation de l’état de l’animal quotidienne). Des points limites sont déterminés pour éviter la douleur des animaux. En cas d'atteinte de ces critères, les animaux seront euthanasiés. Les lignées transgéniques seront utilisées avant que leur état général soit altéré (

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature permettant d’étudier les relations hôtes-pathogènes. Le choix de la souris repose sur les nombreux outils existant pour étudier la physiologie de cette animal modèle. Les lignées transgéniques permettront de spécifiquement étudier le rôle du mucus dans l’infection virale au niveau de la cavité nasale.

Gavées une fois par semaine pendant sept semaines pour déclencher une allergie alimentaire, ou huit fois en deux semaines pour induire une tolérance orale, puis exposées aux acariens par voie intranasale sous anesthésie légère à cinq reprises sur seize jours, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent deux à trois prélèvements sanguins sous anesthésie et des collectes de fèces en cage individuelle. Le projet mesure l'effet d'une alimentation périnatale plus végétale sur le risque d'allergie de la descendance, les régimes étant donnés à la mère pendant la gestation et la lactation puis aux petits au sevrage, et les mâles reproducteurs sont isolés une semaine avant l'accouplement. Les souris sont tuées pour prélever leurs tissus, sauf 480 reproducteurs et reproductrices que le porteur dit vouloir proposer à d'autres utilisateurs de l'unité expérimentale, faute de quoi ils seront tués à leur tour.

Objectifs

Les allergies sont un problème majeur de santé publique. Elles résultent d’une réponse immunitaire inappropriée contre certaines protéines d’aliments, de pollens ou d’acariens, appelées allergènes. Normalement inoffensifs pour l’organisme, ces allergènes devraient être tolérés : l’allergie résulte ainsi d’une maturation inadéquate du système immunitaire. Différents facteurs environnementaux peuvent agir dès l’enfance, voire dès la grossesse, et favoriser le développement des allergies. Ces facteurs peuvent interférer avec la maturation de la muqueuse intestinale, du système immunitaire associé et du microbiote intestinal. Un défaut de l’un de ces paramètres peut être déterminant dans la propension de l’enfant à développer plus tard une allergie. Les protéines intégrées dans l’alimentation du nouveau-né, au sevrage et lors de la diversification, participent à la maturation du système immunitaire. Cependant, si l’effet protecteur d’une diversification alimentaire plus précoce a été démontré sur la prévention des allergies, le rôle de l’origine et de la diversité des protéines alimentaires n’est pas encore connu. Par ailleurs, la diminution de la consommation de protéines animales constitue un enjeu environnemental, économique et de santé majeur. Afin de répondre aux attentes sociétales sur ce sujet, nous devons mieux comprendre les facteurs et déterminants permettant une plus forte végétalisation de l’alimentation. Il est alors indispensable d’en définir les impacts sur la santé, notamment pendant les périodes sensibles de la vie. Notre projet a pour but d’étudier, dans un modèle murin, l’effet de la végétalisation de l’alimentation pendant la période périnatale sur la propension à développer plus tard une allergie. Différents régimes alimentaires seront donnés à la mère durant la gestation et la lactation, puis à la descendance au moment du sevrage. L’impact de ces régimes présentant différents degrés de végétalisation sera évalué au niveau de la composition du microbiote intestinal et de la maturation du système immunitaire chez la descendance, en lien avec sa propension à développer, suivant différents modèles expérimentaux, une allergie alimentaire, une allergie respiratoire ou une tolérance orale à un aliment. Ces travaux sont fondés sur la littérature et l’utilisation de données issues de l’analyse de cohortes de naissance pour l’identification de facteurs pertinents et ils ne cherchent pas à reproduire des travaux déjà réalisés.

Bénéfices attendus

Trouver des sources protéiques alternatives aux protéines animales, constitue un enjeu environnemental, économique et de santé publique majeur. Nos travaux participent à l’évaluation de l’impact sur la santé d’une végétalisation accrue de nos régimes alimentaires. Ils permettront ainsi plus globalement d’enrichir la connaissance scientifique sur les facteurs périnataux favorisant le développement de pathologies liées à des dysfonctionnements immunitaires tels que les allergies. De plus, ces travaux aideront à établir des politiques publiques de prévention efficace dans le contexte de l’épidémie des allergies. Les résultats permettront également de mieux caractériser l’impact de nos changements de régimes alimentaires sur notre santé, en parallèle de l’impact environnemental envisagé, et peut-être à terme, aboutir à l’élaboration de nouvelles formules infantiles.

Procédures

- Des administrations intra-gastriques sur animaux vigiles seront réalisés pour les animaux soumis à un protocole d’induction d’allergie alimentaire (1 gavage par semaine, pendant 7 semaines) ou d’induction de tolérance orale (8 gavages sur 2 semaines puis 1 gavage par semaine pendant 7 semaines). Le gavage est réalisé en un minimum de temps (environ 30 secondes). - Des administrations intranasales d’allergènes respiratoires (acariens de poussière de maison) sous anesthésie légère seront réalisées chez les animaux soumis au protocole d’induction d’allergie respiratoire (5 administrations, réparties sur 16 jours) - Deux à trois prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie légère, selon les groupes. Les prélèvements sont réalisés en 1-2 minutes maximum - Des prélèvements des fèces seront réalisés sur animaux vigiles : les fèces sont collectés au fond des cages, après mise des animaux en cage propre individuelle pendant 3 à 5 minutes.

Impact sur les animaux

Toutes les interventions sur animaux seront réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant au maximum le stress des animaux. On ne peut cependant exclure le stress lié aux manutentions répétées lors des administrations intra-gastriques, des anesthésies, des changes et des pesées. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie légère. Au maximum, 3 prélèvements sanguins/animal sont prévus, avec des intervalles et des volumes adaptés et conformes à la règlementation. Le stress est limité, lié à la contention. Un isolement des mâles en cage individuelle est réalisé pendant 7 jours, juste en amont des mises en accouplement, ce qui peut générer un stress modéré pour ces mâles.

Devenir

les souris seront euthanasiées, pour prélever des tissus d’intérêt afin d’évaluer l’effet des expositions sur les différents paramètres de l’homéostasie (barrière intestinale, immunité, microbiote, métabolisme global) et de l’inflammation allergique. En fin de projet, les animaux reproducteurs seront proposés pour une réutilisation aux différents utilisateurs de l’Unité Expérimentale (sous accord éthique) sinon ils seront également euthanasiés.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n’est disponible pour tester l’impact des facteurs périnataux sur la descendance : ces effets résultent en effet du passage transplacentaire/dans le lait maternel d’une information (protéines alimentaires, molécules ou cellules inflammatoires en résultant...), et/ou d’un comportement impactant la mise en place in utero puis en période néonatale du système immunitaire et du microbiote intestinal chez le petit – les deux étant étroitement liés. L’impact de ces maturations altérées ne se révèleront que plusieurs semaines plus tard, sur la capacité à induire une tolérance ou au contraire une allergie. Cette étude nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal permettant d’analyser de façon intégrative ces différents facteurs. Un modèle mère-enfant et un modèle expérimental d’allergie alimentaire/de tolérance orale induite chez le rongeur seront ainsi mis en œuvre..

Réduction

Afin de limiter le nombre de conditions expérimentales potentiellement testées et donc le nombre d’animaux en expérimentation, nos expériences seront basées sur les informations pertinentes obtenues par des analyses épidémiologiques (cohortes de naissance). La taille des lots est fixée à 8-12 animaux/lot, selon les taux de reproduction et la descendance obtenue. Ce nombre d’animaux à inclure est déterminé par notre expérience, et permet de prendre en compte la forte variabilité interindividuelle observée sur les paramètres mesurés, tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Des analyses statistiques seront dans un premier temps réalisées sur l’ensemble des paramètres mesurés pour chaque animal, permettant d’identifier tout individu ou toute variable aberrante. Des analyses statistiques seront ensuite menées, visant à construire un modèle discriminant nos groupes de traitement à l’aide de tous les paramètres analysés, et permettant d’identifier les groupes de variables permettant de discriminer les lots. Des analyses sur chaque paramètre mesuré pris individuellement seront réalisées en parallèle, afin de confirmer nos observations. La combinaison de ces approches statistiques permettra une analyse objective et maximisée de l’ensemble des paramètres analysés.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux sont réalisées dans une salle dédiée par du personnel expérimenté, limitant le stress des animaux. Les cages sont enrichies par des sopalins et des coques type boîte à œuf, permettant la fabrication d’un habitat et des nids. Les animaux sont hébergés par groupe, avec une taille de cage règlementaire adaptée au nombre d’animaux, permettant un comportement grégaire et sociable. Les cages sont placées dans des portoirs ventilés, permettant une isolation phonique vis-à-vis de l’extérieur. Les animaux sont surveillés visuellement quotidiennement pour identifier rapidement tout animal en souffrance. Des points limites sont établis pour identifier ces animaux. Si un tel animal est identifié, une fiche de suivi individuel est initiée et l’animal sera isolé afin de faciliter son rétablissement et surveillé spécifiquement plusieurs fois par jour, par les zootechniciens et les responsables de la procédure. En cas de non amélioration, il sera sorti de la procédure expérimentale et euthanasié. Par ailleurs, chaque animal est suivi par mesure hebdomadaire de son poids.

Choix des espèces

Le modèle souris présente de nombreux avantages, notamment la disponibilité de lignées caractérisées, un système immunitaire bien décrit, de nombreuses données sur la réponse allergique. De plus, de nombreux réactifs permettant l'étude du système immunitaire sont disponibles chez cet animal. La souche de souris utilisée est particulièrement utilisée dans nos protocoles du fait d’un phénotype biaisé vers une réponse immune mimant le sujet atopique (c’est-à-dire la prédisposition génétique à développer une allergie). Ce modèle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire, ainsi que le modèle mère-enfant. La mère en devenir, gestante et/ou allaitante, sera exposée aux différents régimes alimentaires, à des doses réalistes, afin d’étudier l’impact de ces expositions en période critique sur la santé de la descendance, qui sera évaluée après le sevrage.