Souris

Toutes mises à mort au motif que leur souffrance est jugée irréversible, 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cent quatre d'entre elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses, puis des mesures de bioluminescence sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines. Toutes reçoivent l'anticancéreux qui provoque la neuropathie, dont la douleur est ensuite évaluée en appliquant des filaments sur la patte, au test de von Frey. Le porteur situe le débouché du projet sur le marché du cancer du sein triple négatif et annonce un dépôt de brevet avant tout passage chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.

Procédures

*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.

Remplacement

Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.

Choix des espèces

La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Isolées dix minutes par jour pendant trois jours, puis injectées dans l'abdomen avec un composé qui déclenche une crise d'épilepsie, 96 souris sont ensuite observées seules pendant deux heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit en plus un activateur de canaux potassiques, pour mesurer s'il atténue la crise. Le porteur indique avoir déjà obtenu l'effet de la mutation sur des neurones en culture, et affirme que ces résultats ne suffisent pas parce que le phénotype épileptique fait intervenir plusieurs organes, d'où le "besoin" d'un système intégré. Toutes les souris sont mises à mort dès la fin de la procédure, ce que le porteur présente comme un moyen de limiter leur détresse.

Objectifs

L’épilepsie est une maladie chronique d’origine neurologique caractérisée par la récurrence de crises d’épilepsie. Ces crises sont caractérisées par divers symptômes tels que désorientation, perte de conscience, troubles du mouvement ou des sensations (gustatives, auditives, visuelles) ainsi que de l’humeur ou d’autres fonctions cognitives. Du fait de ces crises, les personnes épileptiques ont tendance à présenter davantage de problèmes physiques (fractures par exemple) et psychologiques (anxiété et/ou dépression) et le risque de décès prématuré est jusqu’à 3 fois plus élevé comparé à la population générale. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, environ 50 millions de personnes sont touchées par cette pathologie avec approximativement 5 millions de personnes diagnostiquées chaque année ; l’épilepsie représentant une part non négligeable de la charge de morbidité à l’échelle mondiale. Malgré le nombre important d’études menées et en cours visant à comprendre les causes de l’épilepsie, celles-ci sont encore inconnues dans 50% des cas selon l’OMS. Dans ce contexte, notre équipe se focalise sur l’étude d’une nouvelle mutation portée par un canal potassique exprimé au niveau du système nerveux central et périphérique. Chez l’Homme, la présence de cette mutation est corrélée à la présence de diverses pathologies dont l’épilepsie. Le but de ce projet est, dans un premier temps, de démontrer le lien de cause à effet entre cette mutation et l’épilepsie dans un contexte physiologique (sur animal vivant), dans un second temps, d’évaluer dans quelle mesure un composé pharmacologique activateur des canaux potassiques est capable de réduire le phénotype épileptique.

Bénéfices attendus

L’épilepsie est un problème de santé publique car, selon l’OMS, environ 50 millions de personnes dans le monde sont affectées par cette pathologie et environ 5 millions de personnes sont diagnostiquées chaque année. De plus, les symptômes associés à l’épilepsie sont importants tels que désorientation, perte de conscience, troubles du mouvement ou des sensations (gustatives, auditives, visuelles) ainsi que de l’humeur ou d’autres fonctions cognitives. Du fait de ces crises, les personnes épileptiques ont tendance à présenter davantage de problèmes physiques (fractures par exemple) et psychologiques (anxiété et/ou dépression) et le risque de décès prématuré est jusqu’à 3 fois plus élevé comparé à la population générale. Cependant, malgré la gravité de cette pathologie, son étiologie est inconnue dans environ 50% des cas, justifiant des études approfondies. Nous pensons que l’étude de cette mutation impactant la fonctionnalité d’un canal potassique sera importante pour la compréhension des origines de l’épilepsie ; une meilleure compréhension permettra un meilleur traitement de cette pathologie. De plus, il est attendu que l’activation des canaux potassiques via ce composé pharmacologique soit en mesure de réduire la gravité du phénotype épileptique et, si tel est le cas, cette étude nous permettra de valider ces canaux comme cibles de choix et ce composé pharmacologique comme outil thérapeutique prometteur pour le traitement de l’épilepsie.

Procédures

Nous induirons un phénotype épileptique à nos souris par une unique injection intrapéritonéale d’un composé épileptogène (l’injection sera rapidement réalisée en quelques secondes). Le but sera d’évaluer le degré de sévérité de la crise chez ces souris durant 2 heures maximum post injection. Sur d’autres lots d’animaux, nous évaluerons dans quelle mesure l’activation de canaux potassiques via une unique injection intrapéritonéale d’un composé pharmacologique (l’injection sera rapidement réalisée en quelques secondes) permet de réduire le degré de sévérité du phénotype épileptique chez nos souris induit par une unique injection intrapéritonéale d’un composé épileptogène (l’injection sera également réalisée rapidement en quelques secondes). Le but sera d’évaluer le degré de sévérité de la crise chez ces souris durant 2 heures maximum post injection.

Impact sur les animaux

Durant la phase d’habituation, les souris seront isolées pendant 10 minutes sur 3 jours consécutifs induisant potentiellement un léger stress. L’acte d’injection peut potentiellement induire de la douleur et des signes démangeaisons et de gonflements. Durant la phase de test, les souris seront isolées pendant 2 heures maximum induisant potentiellement un stress. Par ailleurs, l’induction pharmacologique de l’épilepsie nécessaire à la réalisation de notre projet de recherche, sera dommageable pour l’animal car induisant potentiellement de la douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort immédiatement à la fin de la procédure afin de limiter la détresse des animaux.

Remplacement

Nous avons préalablement mené des expériences in vitro afin de caractériser l’effet de la mutation sur le canal. En exprimant le canal muté dans une lignée cellulaire et en enregistrant son courant, nous avons observé un fort effet délétère de la mutation sur la fonctionnalité du canal. Ce résultat a justifié une étude de l’effet de cette mutation dans un contexte plus physiologique ; pour ce faire, nous avons réalisé des cultures primaires de neurones de souris sauvages et porteuses de la mutation sur le canal. Une analyse des propriétés électriques de ces neurones nous a permis de montrer une hyperexcitabilité neuronale causée par la mutation justifiant la mise en place d’expérience de comportement in vivo. Bien que ces résultats tendent à confirmer notre hypothèse, à savoir que la mutation du canal induit le phénotype épileptique observé chez le patient, ils ne sont pas suffisants pour la confirmer formellement et une étude sur l’animal est requise. En effet, le phénotype épileptique fait notamment intervenir différents organes tels que le cerveau, les muscles etc justifiant le besoin d’un système intégré tel que l’animal vivant pour mieux l’appréhender. Une étude sur l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée à ce niveau.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l’obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel de statistiques GPower). Il sera réduit autant que possible et toute expérience rendue inutile par des résultats précédemment obtenus ne sera pas réalisée. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique approprié afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Nos estimations suggèrent que des lots de 10 souris par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 16 souris par groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests et dont l’intensité lumineuse modulable permet la réduction du stress des souris. Ainsi, nous mettrons en place 3 jours d’habituation en amont des tests (10 minutes par jour). Un enregistrement vidéo sera réalisé pour chaque souris en procédure nous permettant notamment de garder une trace du phénotype et d’effectuer d’autres analyses au besoin sans avoir à répéter l’expérience dans un objectif de réduction et de raffinement. Les animaux seront hébergés avec un environnement enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Par ailleurs, au cours de l’expérience d’induction de la crise d’épilepsie, nous avons défini des points limites que nous veillerons à respecter scrupuleusement dans le but de limiter au maximum les nuisances potentielles liées à l’épilepsie.

Choix des espèces

Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les souris mutantes correspondent au modèle murin de la mutation trouvée chez les patients épileptiques. Les souris invalidées pour les gènes codant pour les deux autres canaux potassiques ont été choisies car nos résultats préliminaires suggèrent que la mutation sur le canal d’intérêt altère le fonctionnement de ces deux autres canaux et que ceux-ci participent au développement du phénotype épileptique (nous nous attendons à un phénotype épileptique plus sévère comparé aux souris sauvages) notamment car il a déjà été montré que l’invalidation génétique de ces canaux rendent les souris plus sensibles à l’injection du composé épileptogène, avec un phénotype plus sévère. Des animaux âgés de 2 à 4 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l’impact de la mutation portée par le canal TRESK en nous affranchissant de biais potentiels liés au développement et au vieillissement.

Toutes tuées pour prélever organes et tissus, 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un AVC leur est provoqué avec ouverture du crâne sous anesthésie, puis un activateur du plasminogène muté leur est injecté, l'ensemble durant deux heures, avec deux passages de dix minutes en imagerie par résonance magnétique. Le porteur annonce une perte de masse corporelle, des douleurs postopératoires, du stress et des déficits fonctionnels, et compte un test comportemental répété quatre fois vingt secondes sans en préciser la nature. Il écrit que la mise à mort de tous les animaux répond au critère de réduction et que la sévérité de l'AVC ne permet pas, pour leur bien-être, de les garder en vie.

Objectifs

Lors d’un AVC ischémique, le traitement pharmacologique est une injection d’une enzyme recombinante (sans mutations) qui est l'activateur tissulaire du plasminogenè (tPA). Il permet de déclencher la dégradation du caillot sanguin mais présente un risque d’hémorragie, une augmentation de l’inflammation et un risque d’ouverture de la barrière hémato-encéphalique qui augmenterait la lésion. Or, le tPA existe sous deux formes : simple chaine et double chaine. Ces deux formes ont des effets différents dans l’organisme. Le tPA une fois clivé au caillot sanguin devient un tPA double-chaine qui serait responsable des effets indésirables. Alors, afin de les diminuer, nous avons muté le tPA afin de générer des nouveaux mutants originaux. Après une évaluation précise et significative in vitro de leur capacité à lyser des caillots sanguins ainsi qu’une étude préliminaire in vivo afin de déterminer leur demi-vie et leur répartition dans l’organisme nous avons sélectionné les meilleurs mutants. Notre objectif est d’évaluer chez la souris l’efficacité des nouveaux tPA mutants. Au regard du risque hémorragique, du volume de lésion, de la recanalisation, de la reperfusion, de l’inflammation et de la récupération fonctionnelle, nous déterminerons les effets des nouveaux mutants du tPA in vivo pour in fine proposer une alternative au traitement classique de l’AVC ischémique chez l’humain. De façon concomitante, nous comparerons les différences entre les deux formes du tPA afin de mieux comprendre leurs effets lors d’un traitement de l’AVC ischémique.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet pourront grandement améliorer notre compréhension de la physiopathologie de l’AVC et présentent un grand potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

- Procédures 1 et 3 : habituation à la préhension (>1 semaine), test comportemental (4 fois de 20s), procédure chirurgicale (induction de l’AVC avec craniotomie sous anesthésie et analgésie suivi de l'administration du traitement (tPA), 2h ), imagerie par résonnance magnétique (2 fois pendant 10min), mise à mort (chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie en vue du prélèvement des organes, 5min). - Procédures 2 et 4 : procédure chirurgicale (induction de l’AVC avec craniotomie sous anesthésie et analgésie suivi de l'administration du traitement (tPA), 2h), imagerie par résonnance magnétique (2 fois pendant 10min), mise à mort (chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie en vue du prélèvement des organes, 5min).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient pour l’ensemble des procédures : une perte de masse corporelle, des douleurs post-opératoires, du stress et des déficits fonctionnels.

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours du projet seront mis à mort afin de récupérer les organes et les tissus pour des analyses cytologiques, histologiques, biochimiques et enzymatiques. Cela répond au critère de réduction puisqu’il permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. De plus la sévérité de l’AVC ischémique ne permet pas pour le bien-être animal de garder en vie les animaux.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Les alternatives comme la culture cellulaire en déprivation d'oxygène et de glucose ou encore des cultures organotypiques de tranches de cerveaux ne permettent pas dévaluer les effets secondaires du tPA dont notamment le risque pro-hémorragique et ne permettent pas d'évaluer la récupération fonctionelle à la suite du traitement. De plus, nous avons au préalable mener des expériences in vitro.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature mais aussi en fonction de la part d'inconnu avec laquelle nous souhaitons mettre au point un nouveau modèle animal. Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues) et de la significativité des résultats. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement à ce nouveau modèle et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des sous-étapes de techniques in vitro déjà validées pourront également compléter et vérifier le passage de la prochaine étape in vivo.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Il sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum et une période d'une semaine d'acclimatation sera respectée. Les animaux seront placés dans un environnement enrichie avec un dôme de cellulose, des carrés de cotons et du papier kraft dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux (acclimatation, observation, médication, réveil dans enceinte chauffée, croquettes mouillées, masse corporelle) pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant tout le projet jusqu’à la mise à mort de l’animal. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), ou soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques).

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes âgées de 8 à 15 semaines. Ces âges correspondent à ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.

Paralysie partielle ou totale des membres, douleurs articulaires, automutilation possible : 10000 rongeurs subissent l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune ou d'une arthrose, puis reçoivent des substances à tester, parfois chaque jour jusqu'à leur mise à mort. 4500 souris, 2500 rats, 1500 cochons d'Inde et 1500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des analyses in vitro et ex vivo. Les maladies sont provoquées par des injections répétées sur des rongeurs éveillés, sous la peau puis dans la cavité abdominale pour l'encéphalomyélite, afin d'évaluer l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux pour l'industrie pharmaceutique et les "clients" de l'établissement. Le porteur justifie le choix des rongeurs par leur petite taille, un organisme "similaire à l'Homme" et le fait qu'ils sont "faciles à héberger". Il affirme aussi que les traitements testés "minimiseront les nuisances", alors que l'objectif inclut d'en évaluer la toxicité.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux, l’arthrose et l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de pathologies, soit l’arthrose et la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.

Procédures

Pour le développement du modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs injections d’une substance en sous-cutané, de 2 à 5 injections. Ensuite, une substance sera inoculée en dose unique ou répétée après le développement de l’arthrose. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intra-articulaire ou orale. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’injection d’une première substance en sous-cutanée, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’injection en intrapéritonéale d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. Une substance test peut ensuite être injectée par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. A l’issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.

Impact sur les animaux

Le modèle de développement d’arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations. Les effets liés au développement de modèle peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, …). Les traitements testés minimiseront les nuisances. Le modèle de développement d’encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres. Cette paralysie peut s’accompagner d’une allodynie et/ou d’une douleur plus ou moins persistante au niveau des membres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaitre avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Les effets liés au développement de ce modèle peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d’activité, baisse de la prise alimentaire) et physiques (perte de poids, absence de réflexes, immobilité). Les traitements testés minimiseront les nuisances.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 4, comme décrit dans les procédures internes.

Raffinement

De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.

1 200 souris et 1 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La voûte plantaire d'une patte arrière est incisée sous anesthésie générale, ou un produit inflammatoire y est injecté, puis les seuils de douleur sont mesurés le lendemain. La douleur est ici l'effet indésirable attendu et le paramètre étudié, le projet visant à mesurer l'effet antalgique propre de produits déjà utilisés en clinique. Le porteur affirme que l'étude de la douleur exige un "organisme entier", pose douze animaux par condition comme un minimum, et indique que la seconde espèce ne sera pas utilisée si la première donne des résultats satisfaisants.

Objectifs

Le but du projet est de rechercher des produits efficaces pour diminuer ou supprimer une douleur aiguë, notamment les douleurs postopératoires qui sont caractérisées par une hypersensibilité tactile. La douleur est définie comme une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, liée à une lésion tissulaire existante ou potentielle. Elle peut être aiguë ou chronique, spontanée ou provoquée, discrète ou intense, mais elle est avant tout personnelle, subjective, émotionnelle et comportementale. La douleur postopératoire aiguë est causée par un geste chirurgical et elle est présente immédiatement après l'opération, provoquée par des lésions induites par la chirurgie ainsi que par un processus inflammatoire qui entraine un excès de sensibilité à la douleur (nociception). Quand la douleur postopératoire est mal traitée, une douleur postopératoire chronique peut persister pendant plusieurs semaines ou mois. Si elle persiste, elle risque de ralentir le rétablissement et de devenir chronique. Elle est alors plus difficile à traiter. Notre projet permet de déterminer l’effet antalgique propre d’un produit.

Bénéfices attendus

Une douleur postopératoire mal traitée peut entrainer des douleurs chroniques qui persistent à distance de la chirurgie pendant plusieurs semaines ou mois. Celle-ci est fréquente et peut se retrouver chez 40% des patients. Elle est associée à une hypersensibilité tactile diffuse autour de la chirurgie et qui est assez difficile à bien prévenir et ensuite à bien traiter quand elle s'est développée. La prise en charge rapide et efficace de la douleur postopératoire est importante pour assurer un confort postopératoire et une réhabilitation précoce, et pour éviter le développement de douleurs prolongées ou chroniques. Ce projet permet de déterminer précisément l'effet antalgique de produits utilisés en condition clinique, notamment sur la prévention d'une hypersensibilité tactile.

Procédures

Une chirurgie avec incision de la voute plantaire d'une patte arrière est réalisée sous anesthésie générale, en 10 minutes au maximum, la veille des tests, avec une durée maximale de 2 jours. Une administration d'un produit inflammatoire dans une patte arrière, et les tests sont réalisés le jour même avec une durée maximale d'une journée. L'objectif des procédures est de déterminer l'efficacité de molécules antinociceptives en réalisant des mesures des seuils de douleur.

Impact sur les animaux

L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie se font sous anesthésie générale à l'isoflurane afin de réduire le stress de la manipulation. Cependant, les effets indésirables attendus de ces 2 protocoles sont une douleur qui est le principal paramètre étudié. Des effets indésirables peuvent survenir après la chirurgie. Une inflammation au niveau de la cicatrice peut survenir nécessitant une désinfection.

Devenir

Les procédures étant classées "sévère", les animaux ne seront pas réutilisés dans un autre projet. A la fin de chaque expérimentation, après recueil des paramètres prévus, les animaux seront euthanasiés quand la procédure est terminée. Aucun prélèvement de sang ou d’organe n’est prévu dans le projet.

Remplacement

L'étude de la douleur chez l'animal implique l'utilisation d'animaux entiers. La sensibilité à la douleur est complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. L'utilisation de modèle avec des organes isolés ne permet pas d'évaluer l'influence de différents produits sur la sensibilité à la douleur. Des résultats obtenus lors de précédentes études et des données de la littérature permettent de sélectionner les produits à étudier (doses, voies d'administration, volumes). Des alternatives non animales ne peuvent être envisagées pour rechercher l'ensemble des objectifs prévus. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de la douleur, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.

Réduction

La variabilité des réponses aux effets d’un traitement chez le rongeur justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance. En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté. En cas de trop petit nombre d'animaux, il faudrait refaire une étude pour confirmer les effets et observer des différences significatives entre les groupes. En cas de faible ou non efficacité d'un produit, son étude sera arrêtée. Si une étude réalisée chez une espèce donne des résultats antalgiques satisfaisants, la deuxième espèce ne sera pas utilisée.

Raffinement

Une surveillance attentive des animaux est réalisée. Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels et/ou du Sizzle dry et des aliments directement dans les cages (dans les copeaux). Les administrations des différents produits sont effectuées par du personnel expérimenté. L'administration par voie orale se fera à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie (animaux placés sur une plaque chauffante pour limiter le refroidissement) se feront sous anesthésie générale. Un produit protecteur est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites. Ils seront euthanasiés en cas d'atteinte des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Choix des espèces

Après recherche bibliographique, le rat et la souris sont apparus parmi les modèles animaux les plus fréquemment décrits, et les plus appropriés pour ce projet. Les animaux utilisés sont des adultes conformément aux publications de référence.