Souris

Une partie des 1 220 souris utilisées sont des femelles gestantes, dont l'abdomen est ouvert sous anesthésie de 45 minutes pour injecter des particules dans le cerveau de leurs embryons, une injection de cinq secondes qui peut tuer certains d'entre eux. D'autres souris adultes restent anesthésiées deux heures pour une chirurgie du cerveau de quinze minutes, et des souriceaux sont anesthésiés par hypothermie pendant dix minutes avant une injection. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et une autre partie du projet consiste à induire chez des souris témoins les mutations responsables de la microcéphalie pour en caractériser les défauts. Les femelles gestantes sont tuées pour prélever leurs embryons, et les embryons, souriceaux et adultes ayant subi une procédure sont tués pour prélèvement d'organes et analyses génétiques.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse au développement du cerveau. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et de différentiation cellulaire peuvent entraîner des malformations cérébrales. Des études préliminaires nous ont permis de mettre au point des particules (PLA) ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division du cerveau embryonnaire. Ce projet vise (i) à déterminer si ce type de PLA est pertinent pour développer une approche de thérapie génique au cours du développement. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des PLA à compenser la perte de ce gène et corriger les anomalies de développement du cerveau qui lui sont associées. Nous voulons également (ii) utiliser cet outil pour étudier un autre type de malformation cérébrale, la microcéphalie, en induisant des mutations du gène responsable de cette pathologie chez des souris contrôles, afin de mieux caractériser les défauts liés à la perte de ce gène.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation de PLA pour corriger une anomalie génétique constitue une approche thérapeutique valide. Le deuxième bénéfice est de comprendre les défauts développementaux qui apparaissent après une mutation d'un gène entraînant une microcéphalie chez l'humain.

Procédures

Des animaux adultes subiront une injection dans la queue d'une durée de 20 secondes. Des femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Des animaux subiront des injections d’une minute 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection d’une durée de 5 secondes. Des animaux adultes subiront une anesthésie de 2 heures lors d’une chirurgie d'une durée de 15 minutes qui permettra l’injection des PLA dans le cerveau d’une durée de 4 minutes et des points de suture. Des souriceaux subiront une anesthésie par hypothermie de 10 minutes, et une injection d’1 minute. Des animaux subiront, au moment de la mise à mort, une anesthésie et analgésie générale terminale.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent un stress léger et une douleur légère de quelques secondes. L’induction de l’anesthésie gazeuse lors des chirurgies entraîne un stress moyen de quelques secondes, une hypothermie, un déssèchement des yeux et une déshydratation. Les injections intra-cérébrale in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons. L'anesthésie pour les injections stéréotaxique entraîne un stress léger de quelques secondes, une hypothermie et un déssèchement des yeux.

Devenir

Les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvement des embryons. Les embryons, nouveaux nés et animaux adultes qui ont subi une procédure sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses génétiques et phénotypiques.

Remplacement

Les questions scientifiques posées dans le cadre de ce projet concernent le développement du cortex cérébral, un processus complexe qui ne peut être étudié que sur des cerveaux prélevés sur des embryons de mammifères. A l’heure actuelle, aucun modèle de culture cellulaire ne permet de reproduire l’ensemble des étapes de développement cortical ni d’en mimer la diversité cellulaire et les interactions qui s’y déroulent. Le modèle murin, en particulier la souris, constitue une référence dans ce domaine en raison de la richesse des outils génétiques disponibles et de la caractérisation fine des processus qui permettent le développement du système nerveux, ce qui en fait un modèle de choix pour la conduite de ces recherches.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté et en groupe social avant et après la procédure. Lors des actes chirurgicaux les souris, placées sur une plaque chauffante, seront anesthésiées et recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux et du PBS chauffé à 37°C sera administré aux femelles afin de prévenir la déshydratation. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Une expérimentation est menée sur des embryons entre les jours embryonnaires E12.5 et E15.5, ce qui correspond aux fenêtres d’expression de nos gènes d’intérêt. Une expérimentation se déroulera sur des animaux adultes, car la question à laquelle veut répondre cette expérimentation ne nécessite pas de stade de développement particulier. Des animaux utilisés dans une autre expérimentation seront injectés au jour post-natal P0 et mis à mort à P15 et P30. Cela nous permet d’étudier les effets de notre traitement sur les défauts qui apparaissent à ces stades.

Une seconde chirurgie de deux à quatre heures trente, après une première d'une heure : 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées. Le rythme respiratoire de chacune est manipulé, ce qui leur impose une physiologie inhabituelle, et certaines reçoivent jusqu'à sept administrations d'agents anxiogènes ou panicogènes utilisés en psychiatrie. Les séances d'enregistrement, jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, se déroulent sur souris éveillée maintenue en contention, et une partie exécute en plus des tâches d'une à trois heures pendant plusieurs mois, portant sur la perception de la respiration, la prise de risque et l'apprentissage. Le porteur prévoit des points limites gradués à partir d'une grille de score, appliqués au suivi après chirurgie et à l'inconfort pendant les tâches, et annonce des doses minimales d'agents pharmacologiques.

Objectifs

La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.

Bénéfices attendus

La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux. MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.

Réduction

Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.

Raffinement

Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs ou alors à deux dans une cage avec séparateur pour éviter l'isolement si les animaux doivent être séparés.] Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

Des vésicules extracellulaires prélevées dans le plasma de patients atteints du syndrome de Sjögren sont injectées à 360 souris à l'âge de cinq mois, puis sept et vingt-huit jours plus tard, puis chaque mois jusqu'à douze mois. À chaque échéance mensuelle s'ajoutent un prélèvement sanguin, une collecte de salive et une mesure des larmes par test au rouge phénol, sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et se terminant par la mise à mort de toutes les souris pour examiner leurs glandes salivaires et lacrymales. Le porteur écrit que les seules nuisances attendues tiennent aux manipulations techniques et qu'elles ne génèrent ni douleur prolongée ni atteinte durable, alors qu'une partie des souris utilisées est transgénique et développe d'elle-même les manifestations de la maladie à partir de six mois. Il présente cette lignée comme "l'un des meilleur modèle murins de la maladie de SjD", du fait d'un développement lent et proche de la maladie humaine.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est d’explorer l’impact physiopathologique de vésicules extracellulaires dérivées du plasma de différents types de patients (sur l’apparition des signes cliniques et biologiques de la maladie de Sjögren). Nous utiliserons des vésicules extracellulaires issues de donneurs sains ainsi que de patients atteints de la maladie de Sjögren. Nous voulons évaluer l’effet des vésicules extracellulaires humaines sur des souris immunocompétentes non prédisposées ou sur des souris génétiquement sensible, notamment en termes d’induction de signes de la maladie, de production d’auto-anticorps et d’infiltration lymphocytaire des glandes salivaires et lacrymales. Chaque mois des prélèvements sanguins et urinaires et des test lacrymaux et salivaires seront réalisés. Ce projet vise à répondre à une question jamais explorée à ce jour : les vésicules extracellulaires circulantes des patients Sjögren possèdent-elles un potentiel pathogène in vivo ?

Bénéfices attendus

Mieux comprendre la maladie de Sjögren est indispensable pour pouvoir développer un jour un traitement efficace, sans aucune molécule n’ayant reçu d’autorisation de mise sur la marché à ce jour dans cette maladie. Si les vésicules extracellulaires jouent un rôle dans la maladie, cela pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet contribuera donc à l’avancée des connaissances nécessaires pour améliorer la prise en charge future.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections de vésicules extracellulaires (VE) plasmatique purifiées de donneurs sains ou de patients SjD actif afin d’évaluer leur impact chez des souris saines et chez des souris pathologiques. Les VE seront injectées à une dose physiologique, doses 1 et 2 définies avant le début de l’étude. Les VE seront injectées aux souris à l’âge de 5 mois (J1), puis à J7, J28, puis une fois par mois jusqu’à l’âge de 12 mois. Des prélèvements sanguins seront réalisés à l’âge de 5 mois. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser les recherches d’auto-anticorps. Les mesures des fonctions salivaires et lacrymales seront faites tous les mois dès l’âge de 5 mois avant le début des traitements. La salive sera collectée dans la cavité buccale des souris après stimulation . La quantité de larmes sera mesurée à chaque œil par un test au rouge phenol. La mesure de la fonction lacrymale, de la fonction salivaire ainsi que le prélèvement sanguin mensuels seront réalisés en même temps afin de ne pas multiplier les procédures et de bénéficier de l'anesthésie parentérale.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances anticipées sont liées aux manipulations techniques : injections intraveineuses, prélèvements sanguins ponctuels, tests de fonction lacrymale et salivaire. Ces gestes pourront occasionner un inconfort transitoire, mais ne génèrent ni douleur prolongée ni atteinte durable de l’état général, par ailleurs les souris seront anesthésiées par voie parentérale pour ces manipulations. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel qualifié, entraîné aux manipulations chez la souris. Un monitoring attentif sera réalisé afin de détecter précocement tout signe de souffrance ou d’évolution anormale.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour évaluer si l’injection de VE humaine de patient SjD à induit une infiltration des glandes salivaires et lacrymales ; élément caractéristique de la maladie de SjD.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire les interactions complexes entre VE humaines et un système immunitaire complet. La question posée nécessite un organisme entier, incluant les compartiments immunitaire, vasculaire et glandulaire. Aucun modèle alternatif ne peut remplacer l’expérimentation animale pour ce type de mécanismes physiopathologiques.

Réduction

Avant de commencer notre étude sur les animaux, nous allons réaliser une quantification en cytométrie en flux de la concentration moyenne de VE en circulation chez nos donneurs sains et patients SjD actif pour pouvoir injecter une quantité physiologique de VE à nos souris. De plus une revue de la littérature à été menée pour déterminer la fréquence d’injection de nos VE. Nous avons décidé d’injecter les VE à nos animaux à J1, J7, J28 puis une fois par mois jusqu’à la fin du protocole, c’est-à-dire jusqu’à la mise à mort à 12 mois. Ces deux approches nous permettront de définir une seule dose à tester et un seul schéma d’injection, donc d’empêcher la duplication inutile des conditions expérimentales et diminuer significativement le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi ; chaque cage sera agrémentée de « carfil nesting », paille, bois et coton, inoffensif pour le milieu et propre afin d'amener un enrichissement aux souris et les stimuler dans la réalisation de leur propre nid au sein de la cage. Le nombre d’animaux par cage sera compris entre 3 et 5 selon leur âge et leur taille. Les manipulations, injections et prélèvements seront effectués par du personnel expérimenté afin d’éviter toute douleur inutile et de manière à limiter le stress. Un suivi clinique quotidien permettra d’identifier tout signe de souffrance, et les points limites établis permettront une intervention rapide. Les procédures potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique de pathologie auto-immune comme la maladie de SjD. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Cette espèce est donc adapté à l’étude de la physiopathologie de la maladie de SjD. Nous utiliserons des souris Il14α transgénique qui est l’un des meilleur modèle murins de la maladie de SjD de fait de son développement lent et très proche de la maladie humaine. Les souris IL14Tg développent spontanément un phénotype de type maladie de SjD avec une apparition progressive de manifestations immunologiques et glandulaires, décrite dans la littérature à partir d’environ 6 mois. Afin d’évaluer si l’administration de VE dérivées de patients atteints de la maladie de SjD peut accélérer l’apparition ou aggraver les manifestations de la maladie, les souris seront incluses dans l’étude à partir de l’âge de 5 mois.

912 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 irradiées et 64 soumises à une chimiothérapie pour préparer la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent soixante souris nouveau-nées reçoivent une transplantation de cellules, et 128 d'entre elles une seconde neuf à douze mois plus tard. Le conditionnement peut provoquer un amaigrissement et une anémie, le traitement par voie orale une irritation de l'œsophage, et la chirurgie d'injection ajoutée par modification une douleur postopératoire et un défaut de cicatrisation. Les bénéfices annoncés vont de nouveaux essais cliniques à des économies pour les systèmes de santé, tous au conditionnel, quand la mise à mort sert dès maintenant à prélever moelle osseuse, rate et thymus.

Objectifs

La greffe de cellules souches du sang, appelées aussi cellules souches hématopoïétiques (CSH), est le traitement de référence pour de nombreuses maladies du sang, malignes (comme les leucémies ou les lymphomes) et non malignes (incluant les déficits immunitaires, en particulier chez les enfants). Cependant, la maladie du greffon contre l'hôte, les infections et les rechutes sont des obstacles majeurs au succès de cette thérapie. Certains de ces obstacles sont liés à une lente reconstitution du système immunitaire après la greffe de CSH. Dans ce contexte, une nouvelle stratégie thérapeutique a été développé pour améliorer la régénération immunitaire lors des greffes de CSH et augmenter la chance de survie des patients greffés. Cette stratégie repose sur la production in vitro de progéniteurs lymphoïdes et leur greffe, pour favoriser une production rapide de cellules immunitaires. Par rapport à la transplantation de CSH, la transplantation des progéniteurs lymphoïdes à des souris immunodéficientes nouveau-nées conduit à une régénération plus rapide des cellules du système immunitaire qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes et les cellules cancéreuses. Les progéniteurs lymphoïdes transplantés sont immatures, une caractéristique qui confère une grande sécurité à ce produit en termes de risque de maladie du greffon contre l’hôte. Nos objectifs de recherche du projet proposé sont de tester ces progéniteurs T produits in vitro pour leur capacité à régénérer les lymphocytes T de patients âgés. En effet, avec l’âge, le thymus, organe jouant un rôle central dans la production des lymphocytes T, fonctionne moins bien ce qui complique la reconstruction du système immunitaire. De précédentes études expérimentales ont suggéré que l’ajout de progéniteurs lymphoïdes lors de la transplantation de CSH améliorerait le fonctionnement du thymus. Ce processus encore mal compris nécessite une investigation approfondie pour en optimiser les effets dans le cadre de futures applications thérapeutiques de ces progéniteurs chez les personnes âgées. Cela passe par une meilleure compréhension des mécanismes de vieillissement et par l'amélioration du système immunitaire après la greffe, dans le but d'augmenter les chances de survie des patients. MODIFICATION/Le projet a été modifié afin de prendre en compte des ajustements méthodologiques issus des premières observations expérimentales.

Bénéfices attendus

Le projet actuel présente des bénéfices potentiels significatifs, tant à court qu'à long terme. Tout d'abord, les résultats attendus permettront d’approfondir la connaissance du produit de thérapie cellulaire à base de progéniteurs lymphoïdes T. Ce projet permettra d'éclaircir son mode d'action chez les individus âgés, d'affiner ses caractéristiques de qualité et d'évaluer son efficacité au-delà de la simple reconstitution des lymphocytes T. Ces découvertes pourraient déboucher sur de nouveaux essais cliniques ou sur l'optimisation des essais en cours, favorisant ainsi des avancées thérapeutiques. En outre, ce projet ouvre la voie à l'élargissement des applications thérapeutiques du produit, initialement conçu pour traiter l'immunodéficience combinée sévère chez les enfants. Les progéniteurs lymphoïdes pourraient également bénéficier à d'autres groupes de patients, notamment ceux dont la fonction thymique est diminuée, que ce soit en raison du vieillissement, du VIH/SIDA ou de l'exposition aux radiations ionisantes. Cela pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces populations vulnérables. Enfin, d'un point de vue sociétal et économique, les progéniteurs lymphoïdes pourraient réduire les hospitalisations post-greffe de cellules souches hématopoïétiques et diminuer les risques de rechutes, entraînant ainsi des économies substantielles pour les patients et les systèmes de santé. Ces bénéfices contribueront non seulement à l'amélioration des traitements actuels, mais aussi à la réduction des coûts de santé à l'échelle globale. Ce projet vise également à approfondir notre compréhension des processus de vieillissement, de dégénérescence et de régénération du thymus, organe essentiel pour la production de cellules du système immunitaire. Il propose notamment d'identifier des molécules capables d'influencer le vieillissement immunitaire et les altérations du thymus. Une connaissance fine des mécanismes permettrait une régénération de l'architecture thymique dégradée avec l’âge et faciliter une greffe plus efficace des progéniteurs lymphoïdes et une meilleure reconstitution des cellules immunitaires.

Procédures

480 animaux vigiles seront conditionnés à la greffe par une irradiation d'une durée inférieure à 5 minutes. Ce procédé est rapide et non douloureux. 64 animaux vigiles recevront une chimiothérapie de conditionnement pour la greffe, chaque traitement durant environ 1 minute/animal. 96 animaux, sous anesthésie gazeuse, recevront des molécules de régénération du thymus d’une durée de 1 minute/traitement et un seul traitement/animal. 96 animaux vigiles recevront en vigile différentes molécules de conditionnement/régénération du thymus chaque jour pendant 15 jours, chaque traitement durant 1 minute/animal. 704 animaux sous anesthésie gazeuse seront transplantés avec des cellules souches/progénitrices, durée de l’action 1 minute/animal. 160 animaux nouveau-nés vigiles recevront une transplantation de cellules (1 minute/animal). 128 d’entre eux recevront sous anesthésie une seconde transplantation, 9 à 12 mois plus tard, chaque action durant 1 minute, une seule action/animal. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront un prélèvement sanguin juste avant leur euthanasie. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront deux prélèvements sanguins au cours de leur suivi, à au moins 5 mois d’intervalle. Chaque prélèvement sanguin dure environ 1 minute. MODIFICATION/48 animaux recevront une transplantation de cellules par méthode chirurgicale sous anesthésie, durée de l’action 10 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les conditionnements à la greffe (chimiothérapie ou irradiation), nécessaires pour préparer l’organisme à recevoir une greffe de CSH et mimer ainsi les conditions des patients humains, peuvent occasionner chez la souris des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress transitoire. Le traitement par voie orale peut provoquer un stress, une douleur, et une légère irritation au niveau de l’œsophage chez l’animal surtout lors des traitements en continu. L’anesthésie gazeuse générale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. MODIFICATION/ La chirurgie d’injection ciblée peut provoquer une douleur post-opératoire transitoire, un stress lié à la procédure, ainsi qu’un risque de complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation).

Devenir

Afin de mesurer la production des cellules lymphoïdes T humaines après injection, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (Moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou non de l’injection effectuée.

Remplacement

Ce projet n'a pas d'alternative non animale. L’utilisation d’un modèle préclinique in vivo capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’Homme est indispensable pour évaluer et comprendre les effets de la greffe de progéniteurs lymphoïdes sur la reconstitution du système immunitaire. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine

Réduction

Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Toutes les souris sont hébergées en portoir à cages ventilées dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12h/12h. Chaque cage est indépendante des autres, l’air entrant est filtré et l’eau utilisé est filtrée, et donc constitue une entité séparée. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires chez les animaux greffés. Toute irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. Les greffes seront précédées par une anesthésie générale. Lors des greffes chez le nouveau-né, l’expérimentateur transfère l’odeur de la cage sur ses gants en le frottant sur la litière pour ne pas risquer une réaction négative de la mère par rapport à ses petits. En outre, les mères sont isolées durant les greffes afin de diminuer leur stress durant la manipulation des petits. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l’euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes qui reproduisent de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l’Homme. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines normales et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Nous utiliserons les souris âgées entre 9 et 12 mois. Le thymus des souris immunodéficientes âgées ressemble à celui des patients humains atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients. Nous utiliserons aussi les animaux nouveau-nés pour humaniser leur système hématopoïétique sans passer par l’irradiation.

Les 872 souris utilisées sont immunodéficientes, donc plus sensibles aux infections, et reçoivent une injection de cellules tumorales de cancer colorectal. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune peut subir jusqu'à trente injections de traitement à l'état vigile, deux par semaine, et quinze séances d'imagerie sous anesthésie générale. La croissance tumorale peut provoquer une cachexie, les administrations fréquentes un risque de péritonite, et les sites de piqûre peuvent s'infecter. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant que l'injection de cellules tumorales rend impossible de les garder en vie et que les analyses portent sur les tissus et organes prélevés après la mort.

Objectifs

Nous avons mis en évidence, via des analyses ex vivo sur des cohortes de patients, que l’induction de l’expression d’une protéine cible est impliquée dans la progression des cancers colorectaux. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse et d’évaluer l’efficacité de l’inhibition de cette protéine comme nouvelle stratégie thérapeutique du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

Le cancer du côlon est la quatrième cause maligne diagnostiquée et la cinquième cause de décès par cancer dans le monde. En France, il touche chaque année plus de 47 500 personnes et cause près de 17 000 décès. Il présente un des pronostics les plus sombres en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer du côlon.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une seule injection de cellules tumorales. Une partie des souris sera soumise à une anesthésie générale (moins de 5 minutes/animal). Tous les animaux vigiles seront soumis à des injections pour des traitements antitumoraux (pour un total maximum de 30, 2 fois par semaine, moins d’une minute par animal). Une partie des souris sera soumise à des examens non invasifs d’évaluation tumorale sous anesthésie générale (dix minutes par animal, une fois par semaine, 15 fois maximum). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes présentent une sensibilité accrue aux infections. L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de l’inhibition d’une protéine cible. Ces stratégies inhibitoires (via des anticorps et des oligos antisense) ont été développés, in vitro, après l’identification de cette protéine via des criblages transcriptomiques sur des cohortes de patients. Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il est essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les cytokines peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 872 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, …). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général et le poids des animaux sera suivi. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie générale des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Selon le modèle, afin de réduire l’inconfort, une analgésie est prévue. Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Une greffe de cellules de lymphome dans le flanc sous anesthésie, puis trois injections de nanoparticules lipidiques chargées de chimiothérapie ou trois injections d'un anticorps bloquant, pratiquées sur animal vigile, attendent 98 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour récupérer les tumeurs et les organes. Le travail porte sur le rôle de la granzyme A, une enzyme produite par les cellules cancéreuses, dans la croissance du lymphome et l'immunité intratumorale. Le porteur annonce que les souris vont développer des cancers avec prolifération des cellules au niveau du flanc, et qualifie de temporaire l'inconfort des injections. Sur l'effectif, il écrit seulement qu'une réflexion biostatistique a été intégrée à la construction du projet, sans donner ni calcul ni taille de groupe, et il ne précise pas les points limites retenus pour la taille des tumeurs.

Objectifs

Le lymphome est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules matures cancéreuses. Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de comprendre l’évolution de ce développement tumoral. Nous avons identifié, dans plusieurs modèles in vitro (lignées cellulaires humaines), que les cellules lymphomateuses expriment la granzyme A, une protéine physiologiquement utilisée par les cellules de l’immunité pour défendre l’organisme, et dont le rôle, lorsqu’elle est produite par des cellules cancéreuses, n’a pas encore été établi. Une lignée cellulaire murine exprime également l’enzyme d’intérêt et nous souhaitons dans ce projet, à travers l’utilisation d’un modèle murin, comprendre son rôle sur la croissance tumorale et les perturbations de l’immunité intratumorale. Pour cela, nous allons utiliser des greffes de différentes cellules cancéreuses murines dans des souris. Certains animaux recevront un traitement à base de nanoparticules lipidiques transportant une chimiothérapie et d’anticorps bloquants afin d’évaluer le rôle de l’enzyme d’intérêt et son interaction avec l’immunité antitumorale et la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal concerne la compréhension du rôle d’une enzyme dans le développement du lymphome et de son rôle sur l’immunité intratumorale, pouvant contribuer à la mise en place d’une thérapie chez les patients atteints de lymphome.

Procédures

Les animaux seront soumis à une transplantation de cellules de lymphome dans leur flanc, de 30 seconde, après avoir été anesthésiés. Les injections des nanoparticules lipidiques se feront sur des animaux vigiles, trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. D’autres souris recevront l’injection d’un anticorps bloquant à 3 reprises également, en vigile, d’une durée qui sera de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection, donc du flanc de l’animal. Les injections des nanoparticules lipidiques peuvent causer un inconfort temporaire pendant quelques minutes.

Devenir

Les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences, dans le but de récupérer les tumeurs ainsi que des organes pour des analyses biologiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Nous avons d’ores et déjà testé in vitro par des méthodes alternatives l’expression de la protéine cible dans des lignées cellulaires, ainsi que les nanoparticules lipidiques que nous allons tester dans ce projet préclinique. Il nous faut maintenant valider sur une étude préclinique in vivo le rôle de cette protéine sur la croissance tumorale et l’immunité antitumorale. Le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche, où l’interaction du système immunitaire au sein de l’organisme constitue un élément clé de notre recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un établissement utilisateur autorisé. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupes de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture, conformément aux conditions réglementaires. Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, nous utilisons des protocoles pensés pour réaliser plusieurs analyses en une seule expérience lorsque cela est possible. Nous utilisons également une grille établie au préalable de points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Toute anomalie dans le comportement social, alimentaire, et la gestuelle (apparition de signes de douleur) de l’animal détectée par l’expérimentateur lors de ses visites (tous les 2 jours minimum) entraîne une prise en charge immédiate, qui peut inclure un soulagement de la douleur ou l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal. En dernier recours, si le soulagement de la douleur ne peut pas être résolu par l’expérimentateur, une mise à mort de l’animal est réalisée.

Choix des espèces

Cette étude ne peut se réaliser que sur le modèle murin. L’étude sur l’immunité antitumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme et c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les lymphomes et l’immunité en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.