Souris
Développement d’un modèle Murin pour l’étude de l’hypertension pulmonaire dans le syndrome d’overlap 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Privées d'oxygène huit heures par jour ou jusqu'à vingt-quatre heures par jour pendant seize semaines, et pour certaines nourries d'un régime riche en graisses pendant la même durée, 270 souris vont toutes être tuées à l'issue. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à modéré, la mesure de pression intracardiaque étant faite sous anesthésie sans reprise de conscience, et comprennent six prélèvements de sang en deux heures par incision de la queue, une hypoglycémie provoquée, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. L'objectif est de mettre au point une méthode d'induction du syndrome d'overlap chez la souris, association d'une bronchopneumopathie obstructive et d'apnées du sommeil, pour explorer des pistes thérapeutiques dans de futurs projets. Le porteur écrit que le cumul de l'obésité et des deux formes de privation d'oxygène "peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude".
Objectifs
Développer un modèle original et innovant reproduisant certains mécanismes du syndrome d’overlap. Ce syndrome est défini par une bronchopneumopathie chronique obstructive liée à un manque d’oxygène dans le sang couplé à un syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Ce syndrome d’overlap sera mis au point avec ou sans obésité, afin d’identifier les déterminants biologiques de l’hypertension pulmonaire et d’explorer des pistes thérapeutiques ciblées dans de futurs projets.
Bénéfices attendus
Perspective d'application ou de développement éventuel de ce travail et incidences éventuelles sur la santé respiratoire : La mise au point de ce modèle murin inédit, combinant spécifiquement un manque d’oxygène chronique et intermittent, ainsi que l'obésité induite par régime, ouvrira des perspectives significatives tant sur le plan scientifique que clinique. Ce modèle permettra une caractérisation fine et détaillée des voies biologiques clés impliquées dans le développement de l'hypertension pulmonaire et des complications cardiaques du syndrome d’overlap. Grâce au développement de ce modèle préclinique robuste (en cas de succès du projet), il sera par exemple possible de tester de manière pertinente des stratégies thérapeutiques ciblées, actuellement utilisées dans l’hypertension artérielle pulmonaire, et qui pourraient être transposées dans le syndrome d’overlap pour lequel aucun traitement spécifique n’a démontré son efficacité actuellement, comme en témoigne notamment l’échec récent de l’essai clinique utilisant le tréprostinil inhalé. Ainsi, le modèle murin que nous développons permettra non seulement d’explorer et comparer l’efficacité des différentes voies thérapeutiques potentielles dans le contexte spécifique du syndrome d’overlap, mais aussi de mieux identifier les approches thérapeutiques les plus prometteuses pour de futurs essais cliniques chez l’homme. Bien que l’évaluation directe de traitements dépasse les objectifs immédiats du présent projet, elle constitue une perspective importante de notre recherche à venir.
Procédures
Les animaux seront soumis à un manque d’oxygène intermittent (8h/jour) et/ou chronique (16 à 24h/j) pendant 16 semaines. Certains animaux pourront également recevoir un régime riche en graisses durant 16 semaines pour induire une obésité. Afin de suivre leur glycémie et voir comment le glucose ou l’insuline sont régulés dans le sang, les animaux seront injectés avec du glucose ou de l'insuline (temps d’injection = 20 secondes) puis une goutte de sang sera prélevée de façon répétée 6 fois durant 2h. Une échographie du coeur associée à un électrocardiogramme seront réalisés sous anesthésie générale (15-20min). Juste avant la mise à mort de l’animal, sous anesthésie et analgésie, la pression à l’intérieur du cœur sera mesurée durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus au manque d'oxygène. Une augmentation de la fréquence respiratoire avec essoufflement et perte de poids s'observent les premiers jours d'exposition. Par la suite les animaux s'adaptent à ce changement d'ambiance. Les tests pour mesurer la régulation du taux de sucre dans le sang (= tests métaboliques) étant induits par une injection, une douleur minime peut se produire au site d'injection. Les animaux étant mis à jeun avant les tests métaboliques, cela peut induire un stress léger et de l'inconfort. Aussi, le suivi de la glycémie pendant ces tests se faisant à l'extrémité de la queue après une légère incision, une légère douleur et du stress peuvent être observés à ce moment-là. Un des tests métaboliques provoque une hypoglycémie transitoire contrôlée. Enfin l'obésité induite par le régime peut provoquer des mouvements plus compliqués pour l'animal mais aucune gêne majeure n'a été observée dans les précédentes études. Un stress légé peut-être associé à l'anesthésie nécessaire à l'échographie du coeur, l'électrocardiogramme et le transfert des animaux entre les deux animaleries. Le cumul de l'obésité et de l'exposition à l'hypoxie intermittente et stationnaire peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du coeur et des poumons (nécessité de prélever les organes). Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement du syndrome d'overlap. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque, la réactivité des vaisseaux, l'étude des tissus des poumons dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération du cœur à droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Lorsque les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme pour évaluer la fonction du coeur et des vaisseaux, les tissus prélevés (coeur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées (surplus de tissu) Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en utilisant le logiciel GPower en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations posteuthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Pour les tests de cathétérisme, des animaux de réutilisation pourront être utilisés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris car c’est le modèle actuellement le plus utilisé pour modéliser le syndrome d'apnées obtructives du sommeil dans notre laboratoire. Nous avons donc des données robustes associées à celui-ci. Aussi, notre dispositif d'exposition à l'hypoxie ne permet que l'utilisation des rongeurs. Nous utliserons pour ce projet des souris qui répondent également bien au régime induisant une obésité utilisé dans ce projet. Les données de la litérature montrent également que ce modèle est pertinent pour le projet.
Etude de la circulation pulmonaire et du remodelage dans un modèle d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par de l’hypoxie chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues quatre semaines en caissons hypoxiques pour développer une hypertension pulmonaire, reçoivent une injection sous-cutanée par jour pendant ces quatre semaines et subissent des mesures de pression cardiaque sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit que les souris deviennent un peu amorphes pendant les premières vingt-quatre heures puis "s'acclimatent ensuite très bien", et qu'aucune méthode ne permet d'étudier autrement les mécanismes de cette maladie, dont la survie humaine à cinq ans atteint 36 % dans les formes sévères. Une nécrose cutanée au point d'injection quotidien entraîne la mise à mort de la souris concernée.
Objectifs
L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire qui mène régulièrement à la mort du patient. La greffe cœur/poumons est l’ultime recours pour les patients car pas ou peu de traitements pharmacologiques permettent d’améliorer les conditions de vie des malades atteints d’hypertension pulmonaire. Il est ainsi nécessaire d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette maladie pour établir de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, notre objectif est d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l’hypertension pulmonaire
Bénéfices attendus
Actuellement, aucun traitement efficace ne permet de soigner l’hypertension pulmonaire. Pour cette maladie, 36% de survie des patients à 5 ans pour les formes sévères. Identifier des molécules permettant de soigner l’hypertension pulmonaire est donc une priorité
Procédures
- Hypoxie en continue pendant 4 semaines, - 1 injection quotidienne de 30 sec en sous-cutané, - Mesures de pression cardiaque sous anesthésie (1 minute/mesure)
Impact sur les animaux
- L’induction de l’HTAP nécessite d’héberger les animaux dans des caissons hypoxiques. Le changement d’environnement peut induire un stress sur les animaux. L’induction de l’HTAP rend les souris un peu « amorphe » sur les premières 24h, le temps qu’elles s’adaptent. Elles s’acclimatent ensuite très bien. - Toutes les molécules sont préalablement testées pour éviter des effets indésirables majeurs chez la souris. Seules les molécules montrant pas ou peu d’effets indésirables (toxicité, solubilité, bonne biodisponibilité de la molécule…) seront testées in vivo. - Stress induit par contention quotidienne pour injecter les molécules en sous-cutané pendant 4 semaines. Si une nécrose cutanée apparait, l’animal sera alors mis à mort.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements d’organes et pour analyses fonctionnelles et histologiques
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’étudier les mécanismes de développement de l’HTAP. Le modèle murin d’hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher de la pathologie humaine. Cette approche expérimentale permet ainsi d’étudier, dans un système intégré, les mécanismes impliqués dans le développement de la pathologie et également d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.
Réduction
Nous avons fait une sélection in vitro des molécules à tester pour réduire l’expérimentation animale. Comme toutes les molécules sélectionnées sont solubles, le solvant sera identique pour tous les tests. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les groupes contrôles. Nous utiliserons un test statistique ANOVA (Prism, GraphPad) pour interpréter nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Les cages des animaux sont enrichies avec des frisottis et des bâtonnets en bois. Les traitements dureront 4 semaines avec des injections quotidiennes en sous-cutanée par contention douce. Nous injecterons à différents endroits pour éviter l’apparition de lésions cutanées.
Choix des espèces
Le modèle murin soumis à une hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher le plus de la pathologie humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Pour étudier le potentiel thérapeutique des molécules, nous devons travailler avec un système pulmonaire et hémodynamique mature.
Évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin nasal contre l’infection au virus influenza dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir deux vaccinations sous anesthésie, une infection grippale intranasale et quatre ponctions du sinus submandibulaire à l'état vigile. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère, cette dernière classification portant sur l'infection grippale, que le porteur décrit avec une perte de poids, une prostration, une anorexie et un pelage hirsute entre le deuxième et le neuvième jour, et une mortalité possible chez les souris non vaccinées, le suivi comportemental annoncé après l'infection restant sans détail. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur indiquant que ces traitements modifieraient les résultats de l'étude. Les retombées annoncées, des formulations "transposables à l'Homme" et un renforcement des stratégies prophylactiques, sont renvoyées à l'issue du projet, quand la mortalité et les pertes de poids, elles, sont attendues dès les premières semaines.
Objectifs
Malgré la disponibilité de vaccins prophylactiques, les infections virales respiratoires restent insuffisamment contrôlées à l’échelle mondiale. L’efficacité limitée des stratégies actuelles s’explique notamment par la grande diversité antigénique des virus, leur capacité à franchir la barrière d’espèce, la durabilité restreinte de l’immunité induite par l’infection ou la vaccination, ainsi que par une réponse vaccinale souvent suboptimale chez les populations vulnérables. À cela s’ajoutent des facteurs sociétaux tels que l’hésitation vaccinale. Ces limites soulignent la nécessité de développer des approches antivirales alternatives et/ou complémentaires. Dans ce contexte, notre projet vise à développer une plateforme innovante dédiée à la prévention des infections virales respiratoires, avec un focus particulier sur le virus de l’influenza A (grippe). S’appuyant sur des données préliminaires solides et sur l’expertise conjointe de spécialistes en vaccination et en administration par voie respiratoire, ce projet ambitionne de concevoir de nouvelles stratégies d’immunoprophylaxie ciblant directement les muqueuses respiratoires. L’objectif principal est de concevoir et d’évaluer des candidats vaccins par la voie respiratoire, afin d’optimiser la réponse immunitaire locale et systémique. Ces approches seront administrées par voie nasale ou pulmonaire, dans le but d’induire une protection rapide, efficace et durable au niveau du site d’entrée des pathogènes. Ce projet vise ainsi à répondre à des enjeux scientifiques et cliniques majeurs, en proposant des solutions mieux adaptées à la prévention des infections respiratoires, notamment dans des contextes d’émergence virale ou chez des populations à risque.
Bénéfices attendus
Le projet vise à développer et évaluer une vaccination nasale contre le virus influenza A (grippe), ciblant directement les muqueuses respiratoires pour limiter l’infection initiale et la transmission. Il permettra de caractériser les réponses immunitaires locales et systémiques, d’analyser leur durabilité et d’évaluer l’intérêt d’un rappel nasal en complément des vaccins classiques par exemple. Les résultats contribueront à valider des formulations transposables à l’Homme et à renforcer le développement de stratégies prophylactiques innovantes contre les infections respiratoires.
Procédures
Au maximum, chaque souris pourra être soumise à deux vaccinations, réalisées soit par instillation intranasale, soit par administration oro-trachéale, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Chaque intervention durera environ 2 à 5 minutes, incluant l’induction anesthésique et le geste technique. Une semaine après la dernière vaccination, les animaux des procédures concernées pourront être soumis à une infection intranasale par le virus Influenza, sous anesthésie gazeuse, d’une durée d’environ 2 à 5 minutes. Tout au long de l’expérimentation, une prise de sang hebdomadaire pourra être réalisée (4 prélèvements maximum au total selon la durée du protocole), chaque prélèvement durant quelques secondes à 1 minute maximum. Pour les animaux soumis à l’infection influenza (procédures concernées), un suivi clinique post-infection sera réalisé, comprenant pesée, observation comportementale et score clinique, en quelques minutes par animal. La fréquence et le nombre exacts d’interventions dépendront de la procédure expérimentale concernée.
Impact sur les animaux
La vaccination intranasale a été administrée, dans notre laboratoire, chez des souris BALB/c et K18-hACE2 sans effet secondaire observé. Classée légère, cette procédure implique une manipulation respiratoire et une anesthésie ; toutes les précautions sont prises pour limiter gêne et stress. La vaccination oro-trachéale (intrapulmonaire) permet une délivrance reproductible de la solution dans les poumons. Réalisée sous anesthésie gazeuse à l’aide d’un cathéter, elle est classée modérée en raison de son caractère invasif et des risques respiratoires potentiels. Le prélèvement sanguin, classé léger, est effectué par ponction du sinus submandibulaire sur animal vigile. La douleur est limitée à la piqûre, le stress est généralement très bref. Cependant ce geste, peut entrainer un hématome au site de ponction. Le nombre de prélèvements est limité à 1 ponction maximum par semaine et par animal, en respectant les volumes sanguins autorisés (100μL de sang maximum). Les infections respiratoires sont généralement peu douloureuses car le poumon n’est pas un organe nociceptif. Toutefois, elles entraînent une inflammation et une gêne respiratoire pouvant devenir douloureuse selon l’intensité. Dans le modèle d’infection grippale chez la souris, les signes cliniques apparaissent entre J2 et J5 post-infection selon la dose et l’effet vaccinal, avec un pic entre J7 et J9. Ils incluent une perte de poids liée à une altération des comportements (prostration, anorexie, réduction de la prise d’eau, pelage hirsute). L’amélioration survient progressivement entre J10 et J12 avec retour au poids initial. Cette procédure est classée comme sévère en raison du stress physiologique et d’une mortalité possible chez les animaux non vaccinés.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, etc.). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum nécessaire. Avant toute expérimentation chez l’animal, les candidats vaccins sont d’abord testés en laboratoire sur des modèles in vitro. Seuls les candidats les plus prometteurs sont ensuite évalués chez l’animal. Le protocole expérimental a été conçu de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir d’un même animal (réponse immunitaire, analyses des tissus, présence du pathogène), et les organes prélevés sont utilisés pour différentes études. Cette approche permet de maximiser les informations obtenues sans augmenter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe ainsi que l’organisation des expériences ont été soigneusement calculés afin d’assurer la validité scientifique des résultats tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont inclus dans l’étude afin de prendre en compte les différences biologiques éventuelles entre mâles et femelles. Chaque groupe comprend un nombre équilibré d’animaux des deux sexes. Les résultats sont analysés à l’échelle du groupe, avec la possibilité d’examiner également l’influence du sexe si nécessaire. Dans l’ensemble, ce projet vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies (matériaux de nidification et éléments favorisant leur comportement naturel). Tout au long de l’étude, leur état de santé est surveillé plusieurs fois par jour par du personnel formé, afin de détecter rapidement tout signe de gêne ou de souffrance. Une attention particulière est portée dans les jours suivant l’infection, période durant laquelle les effets sont les plus susceptibles d’apparaître. Des mesures sont mises en place pour faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, notamment pour les animaux les plus affectés (par exemple, mise à disposition de nourriture adaptée directement dans la cage). L’utilisation de traitements antidouleur ou anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce modèle, car ils pourraient modifier les résultats de l’étude. Toutefois, des critères d’arrêt stricts sont appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive et garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé avec des souris adultes, dont le système immunitaire est pleinement développé. La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des réponses immunitaires et du développement de vaccins. Elle présente des similitudes importantes avec l’Homme, ce qui permet d’obtenir des informations pertinentes pour la recherche en santé. Différents types de souris sont utilisés afin d’étudier de manière complémentaire les différentes composantes de la réponse immunitaire. Cela permet d’évaluer à la fois la production d’anticorps et les réponses immunitaires plus complexes. L’utilisation de l’animal est nécessaire dans ce projet, car la réponse immunitaire implique de nombreux mécanismes et interactions entre différents organes, notamment les voies respiratoires. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire sur des modèles non animaux. Ce modèle permet également de suivre l’évolution de l’infection et de la réponse immunitaire dans le temps, dans un organisme entier. Enfin, les expériences sont conçues de manière à optimiser les données obtenues à partir de chaque animal, notamment en réalisant plusieurs analyses à partir des mêmes échantillons, afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés.
Etude des séquelles métaboliques de la malaria cérébrale par imagerie 1/2
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à huit examens d'imagerie sous anesthésie gazeuse, dont quatre de quatre-vingt-dix minutes, dix injections intrapéritonéales quotidiennes et six gouttes de sang prélevées à la queue : 84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Celles qui sont infectées développent une perte de poids, des poils hérissés, une léthargie, une chute de la température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience, et une partie d'entre elles est tuée après un unique examen, sans traitement. Il s'agit de mesurer par imagerie comment le cerveau utilise le glucose après guérison d'une malaria cérébrale, et de chercher une inflammation résiduelle. Le porteur retient la souris parce que les déficits neurologiques y ressemblent à ceux des enfants, et parce que le parasite employé, spécifique de cette espèce, a selon lui l'avantage "de ne présenter aucun risque pour l'expérimentateur humain".
Objectifs
La malaria, aussi appelée paludisme, est une maladie parasitaire grave transmise par les moustiques. En 2024, elle a touché 282 millions de personnes et causé plus de 610 000 décès, surtout en Afrique, selon l’Organisation mondiale de la santé. Les enfants de moins de 5 ans sont les plus vulnérables, en particulier lorsqu’ils développent une complication sévère touchant le cerveau appelée malaria cérébrale. La malaria cérébrale provoque des convulsions, une altération de la conscience pouvant aller jusqu’au coma et entraîner le décès. Même après guérison, certains enfants gardent des séquelles : troubles de la mémoire, difficultés à marcher ou à parler, crises d’épilepsie, ou problèmes de concentration. Ces séquelles, souvent ignorées, peuvent handicaper leur développement et leur scolarité, avec des conséquences durables pour eux et leur famille. Pour étudier les séquelles cérébrales à court et moyen termes, nous utilisons des souris comme modèle. Nous les infectons avec un parasite similaire à celui qui provoque la malaria chez l’humain, puis nous les soignons avec un médicament antipaludéen dès qu’elles montrent des signes de complication cérébrale. Grâce à des techniques d’imagerie médicale aussi utilisées chez l’humain, nous avons déjà observé des anomalies persistantes plusieurs mois après la guérison. Par exemple, le cerveau semble avoir des difficultés à utiliser correctement le sucre (glucose), qui est sa principale source d’énergie. Cela pourrait être dû à une inflammation cachée qui persisterait même après la disparition du parasite. Notre objectif est de mieux comprendre ces anomalies pour développer des traitements qui pourraient limiter les séquelles. Nous allons étudier comment le cerveau des souris ayant eu la malaria cérébrale utilise le sucre et s’il existe une inflammation résiduelle. Nous espérons que ces recherches permettront un jour d’améliorer la prise en charge des enfants touchés par la malaria cérébrale, afin qu’ils puissent grandir et s’épanouir sans les conséquences de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les séquelles de la malaria cérébrale, une forme grave de la maladie qui touche principalement les jeunes enfants, notamment en Afrique. Pour cela, nous utilisons des souris comme modèle d’étude, car leur maladie ressemble beaucoup à celle des enfants. Grâce à des techniques d’imagerie médicale modernes, nous pouvons observer en détail ce qui se passe dans leur cerveau, de manière non invasive et avec des méthodes similaires à celles utilisées pour les humains. Des recherches antérieures par imagerie chez la souris ont déjà montré que la malaria cérébrale provoque un gonflement du cerveau, ce qui réduit l’apport en oxygène au cerveau, et représente la cause du décès chez les enfants. Ces observations ont été confirmées par la suite chez des enfants africains atteints de la maladie. Notre objectif principal est d’identifier les séquelles qui persistent chez les souris ayant survécu à la malaria cérébrale après avoir été traitées avec un médicament antipaludéen. Nous allons nous concentrer sur deux aspects importants : d’une part, les perturbations dans la manière dont le cerveau utilise le sucre, qui est sa principale source d’énergie, et d’autre part, la présence éventuelle d’une inflammation cachée qui pourrait persister même après la guérison et continuer à endommager le cerveau. Le sucre est essentiel au bon fonctionnement du cerveau, et un dysfonctionnement dans son utilisation pourrait expliquer certains troubles neurologiques observés, comme des difficultés d’apprentissage ou des crises d’épilepsie. Si nous parvenons à établir un lien entre ces perturbations métaboliques et une inflammation résiduelle, cela pourrait permettre de tester, dans de futures études, l’efficacité de traitements anti-inflammatoires pour réduire les séquelles chez les enfants. À plus long terme, cette étude pourrait aider à développer des outils pour mieux diagnostiquer les enfants à risque de complications après une malaria cérébrale, améliorer leur suivi médical en identifiant des signes précoces, et tester de nouveaux traitements pour limiter les dommages au cerveau. En somme, ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension des effets durables de la malaria cérébrale afin de rechercher des traitements pour améliorer la vie des enfants touchés par cette maladie.
Procédures
Les animaux induits pour la malaria recevront une injection intrapéritonéale de globules rouges parasités. Ils subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang espacés de 3 jours en moyenne, sur une période de 7 jours. Les animaux avec malaria qui seront traités par un médicament antipaludéen subiront deux prélèvements supplémentaires d’une goutte de sang chacun, effectués à 4 jours d’intervalle en moyenne, durant la période de traitement. Les animaux contrôles sains et les animaux avec malaria qui seront traités recevront au total 10 injections intrapéritonéales à l’état vigile (une injection quotidienne pendant 10 jours en alternant chaque jour le côté). Les animaux avec malaria non traités subiront un seul examen clinique par imagerie sous anesthésie gazeuse d’une durée de 45 minutes environ. Les autres animaux subiront, selon les groupes, soit une seule session de 4 examens cliniques par imagerie sous anesthésie gazeuse étalés sur une période de 10 jours, soit deux sessions de 4 examens (8 au total), chacune étalée sur une période 10 jours, le délai entre les 2 sessions d’imagerie étant de 60 jours. Pour chaque session d’imagerie, les deux premiers examens auront une durée d’environ 90 minutes et les 2 autres de 30 minutes. Deux des quatre examens d’imagerie de chaque session nécessiteront la mise à jeun des animaux pendant 4 heures ainsi que le prélèvement d’une à deux gouttes de sang pour mesurer la glycémie (3 gouttes au total pour une session d’imagerie, et 6 gouttes au total pour 2 sessions). Les animaux subiront 3 injections intrapéritonéales et une injection intraveineuse d’agents de contraste ou de traceurs sous anesthésie gazeuse, étalées sur 10 jours pour la réalisation de 4 examens d’imagerie (1 session). Pour 8 examens (2 sessions), ils subiront 6 injections intrapéritonéales et 2 injections intraveineuses effectuées sur une période de 3 mois.
Impact sur les animaux
Pendant cette étude, les souris pourraient subir plusieurs sources d’inconfort et de stress, bien que tout soit mis en œuvre pour limiter leur souffrance. D’abord, elles recevront des injections quotidiennes pendant 10 jours, alternativement sur chaque côté du corps, ce qui peut provoquer une gêne locale ou une légère douleur. Certaines souris subiront jusqu’à quatre injections différentes (médicaments, produits de contraste ou traceurs pour l’imagerie) selon les examens prévus. Les examens d’imagerie, bien que nécessaires, imposent aussi des contraintes : les souris seront placées sous anesthésie gazeuse à plusieurs reprises, ce qui peut causer un stress ou une désorientation au réveil. Certaines devront jeûner 4 heures avant certains examens, ce qui peut entraîner une sensation de faim ou d’inconfort. De plus, des prélèvements de sang (2 à 4 gouttes) seront effectués au niveau de leur queue, une procédure qui, bien que rapide, peut être légèrement douloureuse. Les souris infectées par le parasite de la malaria développeront des symptômes graves : perte de poids, poils hérissés, léthargie, puis une baisse dangereuse de leur température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience. Certaines ne recevront pas de traitement et seront euthanasiées après un seul examen, tandis que d’autres, traitées avec un médicament, pourront malgré tout, souffrir d’une infection persistante.
Devenir
Les animaux utilisés en procédure 1 seront tous euthanasiés. Ces animaux atteints d’une forme mortelle de malaria ne peuvent survivre. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation pendant la maladie afin de compléter les données d’imagerie in vivo. Les animaux utilisés en procédure 2 seront aussi tous euthanasiés. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation après guérison de la malaria afin de compléter les données obtenues par imagerie in vivo. Ces données seront comparées à celles des souris contrôles de même âge.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico. Notre projet a pour objectif d’étudier à court et moyen terme l’évolution du neurométabolisme et de l’inflammation cérébrale. Le suivi des animaux sur plusieurs mois devrait permettre d’identifier les anomalies immédiates et/ou plus tardives, les éventuelles récupérations/compensations, ainsi que les effets combinés de l’âge.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasives permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. Un grand nombre de données sera recueilli sur un même animal dans des conditions de stress minimal, l’examen clinique par imagerie étant réalisé sous anesthésie gazeuse. La taille des groupes a été calculée à partir de données antérieures en utilisant un test statistique. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique adaptée aux petits échantillons. Nous devrions ainsi générer des données robustes en utilisant le minimum d'animaux permettant de vérifier les hypothèses scientifiques du projet.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement par la chloroquine, un examen clinique quotidien ou biquotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie en accord avec les points limites prédéfinis. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite de la malaria chez la souris est un modèle validé et reconnu de la malaria cérébrale pédiatrique. De plus, les déficits neurologiques et cognitifs décrits dans ce modèle après guérison sont très proches de ceux rapportés chez l’Humain. Enfin, le parasite spécifique de la souris possède l’avantage de ne présenter aucun risque pour l’expérimentateur humain.
Evaluation de la réponse immunitaire de différents types de nanoparticules chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Trois injections intramusculaires dans la cuisse, échelonnées sur quatre semaines, sont administrées à chacune des 32 souris utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur assimile ces injections à celles de n'importe quel vaccin et n'en attend que des "nuisances très superficielles", hématomes légers, contractures passagères et inflammation locale. Il annonce vérifier si ses nanoparticules peptidiques induisent une réponse immunitaire au même niveau que les vaccins à ARN messager du marché, tout en rapportant que l'étude précédente leur avait donné 20 à 66 % de réponses positives, contre 100 % pour la formulation commerciale. Toutes les souris sont tuées au trente-cinquième jour, le sang total étant prélevé pour obtenir des "volumes de serum conséquents".
Objectifs
Ce projet vise à améliorer les vaccins à ARN messager (ARNm), comme ceux utilisés contre la COVID‑19. Aujourd’hui, ces vaccins doivent être conservés à des températures très basses (entre –20 °C et –80 °C), car leur formulation est fragile et perd rapidement en efficacité. Nous développons une solution alternative à partir de petites molécules naturellement présentes dans le corps. Ces molécules permettent de transporter efficacement différents types d’ARN, de les conserver stables plusieurs semaines à 4 °C facilitant grandement le stockage et la distribution des vaccins. Des premiers tests montrent que ces molécules peuvent déclencher une réponse immunitaire. Nous allons donc comparer, chez l’animal, des vaccins formulés avec les deux formulations puis vérifier si les anticorps produits protègent bien contre une infection virale.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules peptidiques à induire une réponse immunitaire au même niveau que celle générée par les vaccins à ARN messager actuels sur le marché permet d'ouvrir des perspectives intéressantes pour le développement de vaccins présentant une formulation, un transport et une conservation grandement simplifiés. Ce nouveau type de formulation pourrait permettre de réduire les couts de production des préparations vaccinales en allégeant fortement les contraintes pratiques associées à l’usage de nanoparticules lipidiques. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de quatre. Une première injection intramusculaire d’une dose vaccinale est programmée le premier jour de l'étude. Une deuxième injection identique se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation et une dernière injection réalisée le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». Chacune des injections sera réalisée en moins d'une minute. L’animal sera euthanasié au 35eme jour et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
LLes différents groupes recevront intramusculairerement dans la cuisse trois doses vaccinales d'un volume de 50 microlitres échelonnées sur 4 semaines (J0, J14, J28). Ces injections peuvent être considérées comme de simples injections réalisées pour n'importe quel type de vaccin (COVID19, Tétanos, DTPolio...). Elles ne devraient occasionner que des nuisances très superficielles (légers hématomes, contractures musculaires passagères, inflammation locale). Lors de la première phase, aucun signe n'a été observé pour les différents groupes traités
Devenir
Pour obtenir des volumes de serum conséquents, toutes les souris seront euthanasiées et le sang total sera prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de caractériser les réponses immunitaires induites par la plateforme vaccinale testée. Bien qu’il soit possible de réaliser des études in vitro avec des lignées cellulaires, il est impossible à l’heure actuelle de recréer in vitro la complexité des interactions entre les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans le fonctionnement du système immunitaire d’un mammifère. Le modèle murin (souris) dont la physiologie est proche de l’homme permet d’étudier les réponses immunitaires induites par la vaccination. Ce modèle permet donc de générer des données indispensables avant d'envisager de tester dans le futur un vaccin sur des sujets humains.
Réduction
Nous nous efforçons de maximiser le nombre d'expériences réalisées tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Pour établir la signification de la réponse immunitaire induite par nos préparations vaccinales, nous avons déterminé que des groupes de 10 animaux sont suffisants. En effet, les vaccins commerciaux actuellement sur le marché affichent des taux de réponse immunitaire d'environ 95%. Ainsi, nous avons obtenu dans l'étude précédente 100% de réponses positives à la vaccination dans le groupe ayant reçu les doses commerciales. Les groupes traités avec nos nanoparticules ont montré des taux de réponses de l'ordre de 20 à 66% seulement, ce qui constitue un écart clairement significatif. Le nombre d'animaux choisi (10 animaux par groupe) nous permet donc ainsi d'avoir un effet attendu significatif avec un écart-type acceptable.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être, tout en limitant le stress et la souffrance des animaux. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie. Notre projet ne nécessite pas la mise en place de mesures de raffinement plus spécifiques.
Choix des espèces
Il s’agit de souris particulièrement adaptées à des études générales incluant des études de toxicologie, de pharmacologie ou de physiologie. Les choix de cette espèce animale reposent sur des résultats probants obtenus dans une étude préliminaire. Nous souhaitons ainsi confirmer une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire équivalente. Nous recevrons les animaux âgés de 2 mois et ils seront suivis pour une durée de 6 semaines. L’âge de deux mois pour les souris traitées correspond à l’âge auquel le système immunitaire est pleinement développé. Nous maintenons ce critère afin de reproduire au mieux les résultats antérieurs qui s’étaient montrées positifs.
Evaluation de l’effet analgésique et du traitement de l’inconfort oculaire chez le lapin et le rongeur.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 2100
Lapins : 2100
6 300 animaux non-humains vont être utilisés, 2 100 souris, 2 100 rats et 2 100 lapins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des instillations oculaires répétées plusieurs fois par jour, maintenus immobiles à chaque application, puis subissent des examens de la sensibilité cornéenne à l'esthésiomètre de Cochet-Bonnet, des mesures de la fente palpébrale à la règle et des observations comportementales que le porteur ne détaille pas. Provoquer chez eux un inconfort et une douleur oculaires, rougeurs et irritations comprises, est l'objet même du projet, qui vise ensuite à évaluer des traitements candidats. Environ 90 % sont tués pour des analyses histologiques de la rétine, de la choroïde et de la sclère, les 630 autres, écartés avant l'induction ou en cours de protocole, pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur affirme mener ces inductions dans le "strict respect des principes du bien-être animal".
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et de mettre en œuvre, dans le strict respect des principes du bien‑être animal, des modèles expérimentaux induisant un inconfort léger à modéré chez l’animal. Ces modèles ont pour finalité de mieux comprendre les mécanismes de l’inconfort oculaire et de permettre l’identification, la caractérisation et l’évaluation de traitements candidats susceptibles de le prévenir ou de le réduire. L’ensemble des procédures est conçu de manière à minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par le recours à des méthodes non invasives, des durées d’exposition limitées et une surveillance régulière des paramètres de bien‑être. Les modèles expérimentaux utilisés représentent un compromis nécessaire entre la pertinence scientifique et l’application rigoureuse des principes des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), afin de garantir une utilisation responsable et éthique des animaux à des fins de recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet résident dans l’identification, la caractérisation et la sélection de nouveaux traitements susceptibles d’améliorer la prise en charge clinique de l’inconfort et de la douleur oculaires. Les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées, visant à soulager les patients présentant des affections oculaires associées à une altération du confort visuel et du bien‑être. À terme, ce projet pourrait ainsi participer à l’amélioration de la qualité de vie des patients, en favorisant l’accès à des options thérapeutiques innovantes et mieux adaptées aux besoins cliniques, tout en répondant aux exigences actuelles de sécurité, d’efficacité et de tolérance.
Procédures
Tous les animaux recevront des instillations oculaires conformément au protocole expérimental. Ils seront maintenus immobile pendant quelques secondes pour permettre l'application topique. Ces administrations sont répétées plusieurs fois par jour et étalées sur un ou plusieurs jours selon la procédure choisie. Les examens réalisés dans le cadre des évaluations sont non invasifs et ne durent que quelques minutes. Ils reposent principalement sur des observations comportementales, sur l’évaluation de la sensibilité cornéenne à l’aide d’un esthésiomètre de Cochet‑Bonnet, la mesure de la fente palpébrale avec une règle et l'apparence de la surface oculaire. Ces examens, conçus pour limiter au maximum toute gêne ou contrainte pour l’animal, peuvent être répétés plusieurs fois au cours de la même journée en fonction du plan expérimental, sans impact significatif sur le bien‑être animal, il dure chacun quelques secondes à quelques minutes. L'animal est alors maintenu afin qu'il reste immobile pour permettre l'évaluation. L'ensemble de ces interventions seront étalées sur une journée.
Impact sur les animaux
Le projet a pour but de trouver des traitements à la douleur ou à l'inconfort oculaire. Les animaux vont sur une courte période ressentir un inconfort ou une douleur modérée. Des rougeurs et des irritations ponctuelles et réversibles pourront aussi apparaitre.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux ayant suivi la totalité du protocole pourront être euthanasiés de manière éthique et conforme à la réglementation, afin de permettre les analyses ex vivo nécessaires. Ces analyses pourront comprendre notamment : des études histologiques des structures oculaires (rétine, choroïde, sclère), des dosages biochimiques ou moléculaires, ainsi que des évaluations morphologiques complémentaires indispensables à la validation scientifique des résultats. En revanche, les animaux non inclus dans l’intégralité de la procédure, estimés à environ 10 % (hors exclusions pour atteinte d’un point limite), pourront être réutilisés dans d’autres protocoles compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Il en va de même pour les animaux retirés avant l’induction pour une anomalie anatomique ou physiologique, un défaut oculaire préexistant. Ces individus n’auront subi ni induction, ni administration de traitement expérimental. Ils n’auront été exposés qu’à des examens non invalidants, sans conséquences durables. Dans ces conditions, leur réutilisation éventuelle s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en permettant une réduction du nombre total d’animaux utilisés tout en garantissant la protection du bien‑être animal et le respect des exigences scientifiques du projet.
Remplacement
L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, constitué de structures anatomiques et physiologiques étroitement interconnectées (cornée, cristallin, rétine, choroïde, sclère, nerf optique), jouant un rôle central dans la perception sensorielle et la réponse aux stimuli irritatifs ou nociceptifs. Le maintien du confort oculaire repose sur des équilibres mécaniques, physicochimiques et biologiques précis, ainsi que sur une innervation et une vascularisation fonctionnelles. Toute perturbation de ces équilibres peut conduire à l’apparition d’inconfort ou de douleur oculaires. Bien que des approches alternatives telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico aient progressé ces dernières années, elles demeurent insuffisantes pour reproduire l’ensemble des interactions structurelles, fonctionnelles et pharmacocinétiques impliquées dans la genèse et la modulation de l’inconfort et de la douleur au sein d’un œil vivant. Ces modèles ne permettent notamment pas de simuler de manière fiable les réponses tridimensionnelles des tissus oculaires, l’intégration des signaux sensoriels et nociceptifs, ni les réponses cliniques et comportementales associées. Dans ce contexte, l’étude in vivo reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Elle permet d’observer de manière intégrée et dynamique les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’apparition de l’inconfort et de la douleur oculaires, d’évaluer l’efficacité et la tolérance de traitements administrés par voie oculaire ou systémique, et d’étudier leurs effets à court et à long terme sur les différents tissus oculaires au sein d’un environnement physiologique complet, intégrant innervation, vascularisation et régulations neurosensorielles.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilités. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8-12 semaines, ces âges correspondent à la maturité visuelle.
Production d’ascite sarcome TG180 chez la souris
- Production de routine
- Tests réglementaires
10 831 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune servant à fabriquer environ 1 100 tests de diagnostic, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules de sarcome TG180, puis développe pendant quatorze jours une ascite abdominale qui lui fait prendre jusqu'à 50 % de son poids initial, avant d'être tuée pour que ce liquide soit prélevé. Le porteur compare cet état à une gestation, indique que les souris continuent à se toiletter, à se déplacer et à se nourrir, et écrit que la méthode ne demande pas d'analgésie du fait de son caractère "peu invasif". Douze références de réactifs marqués CE dépendent de cette production, et le porteur écrit que certaines ont déjà pu être produites in vitro, ce qui a divisé par deux le nombre de souris utilisées, l'arrêt complet restant conditionné au rythme des autorisations de commercialisation des nouveaux produits.
Objectifs
L’ascite de souris sarcome TG 180 est utilisée dans la production de 12 références de tests de diagnostic in vitro de pathologies humaines à forte mortalité ou graves conséquences parmi lesquelles nous retrouvons la toxoplasmose, les troubles thyroïdiens, différents cancers, l’anémie, des bilans hormonaux, des marqueurs d’allergies respiratoires… Tous les réactifs concernés sont marqués CE conformes à la directive européenne.
Bénéfices attendus
Ces tests de diagnostics sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule appelée alors antigène. Ces principes immunologiques sont exploités pour révéler une molécule d’intérêt présente dans l’échantillon du patient grâce à un/des anticorps spécifique(s) présent(s) dans le réactif. Une souris permet la fabrication d’environ 1100 tests de diagnostic. L’ascite TG180 de souris est utilisée pour éliminer des réactions non-spécifiques éventuellement dues à la présence d’anticorps anti-souris dans l’échantillon du patient et pouvant amener à un faux résultat.
Procédures
Une injection sur souris vigile d’une durée 15 secondes maximum Un prélèvement sur animal préalablement euthanasié.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules à des souris de 30g, provoque la production d’ascite après 14 jours d’incubation, avec une prise de poids n’excédant pas 50% du poids initial. Cette production provoque un inconfort comparable à une gestation. Toutefois les souris continuent à se toiletter, à se déplacer, à se nourrir, à boire ou à interagir.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié en vue de prélever leur ascite. En aucun cas ce prélèvement s’effectue sur animal vigile.
Remplacement
Le redéveloppement de ces tests de diagnostic nécessite de définir les matières de substitution, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Il s’agit là d’un programme d’innovation s’étendant sur des années. La réduction de l’utilisation du nombre de souris sera donc progressive et fonction du rythme d’obtention des autorisations de commercialisation des nouveaux produits dans les pays où ils seront commercialisés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste suivant les besoins nécessaires pour la fabrication de l’ensemble des kits dans lesquels rentrent le produit. Dans le passé un gros travail de sélection des souches, visant à sélectionner des souches les plus productives avec un niveau de qualité supérieur, a été effectué permettant d’avoir aujourd’hui une productivité optimisée et constante. Ce travail a permis, au fil du temps de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour le même volume de produit. L’ascite entre dans la composition de nombreux kits de dépistage de maladie humaine. Aujourd’hui certaines références ont pu être produites in-vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation de ce produit. Cette avancée a permis de diviser par deux le nombre d’animaux utilisés. Les essais vont continuer dans cette voie afin de diminuer voire arrêter cette production dans le futur.
Raffinement
Les souris réceptionnées sont acclimatées à leurs nouvelles conditions d’hébergement pendant 14 jours Les animaux sont hébergés sur litière sciure. Des lanières cartons sont introduites dans chaque caisse permettant aux souris de construire un nid. Un tunnel en PVC est également placé dans les caisses permettant aux souris de se cacher. Tous ces éléments assurent l'enrichissement du milieu. Un suivi quotidien et individuel permet en cas d’apparition de signe clinique lors du protocole, l’application de points limites prédictifs adaptés afin de limiter toute souffrance animale. Cette méthode ne nécessite pas de recours à l’analgésie du fait de son caractère peu invasif. Une observation attentive des animaux n’a pas montré d’altération significative du comportement des animaux, mais plus un inconfort lié à la prise de poids du fait de la production d’un volume conséquent d’ascite, comparable à un état de gestation.
Choix des espèces
La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains. Les animaux utilisés sont des souris de 21-39g. La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains.
Comparaison des effets de différents extraits de Rosmarinus officinalis sur la cardioprotection et la cytoprotection suite à un stress
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un extrait de romarin par voie orale pendant dix jours, ce qui peut selon le porteur provoquer des douleurs modérées, puis, aux jours huit et neuf, une injection dans le péritoine d'une molécule qui déclenche un stress cardiaque et peut accélérer leur rythme cardiaque. Le bénéfice avancé, une prévention de l'infarctus pour les patients qui ne peuvent pas pratiquer d'activité physique, dépend d'abord de savoir laquelle des formulations comparées protège le mieux du stress oxydant. Le porteur écrit que des expérimentations sur cellules ont déjà été conduites et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "nécessaire" pour évaluer le passage de la molécule dans le sang.
Objectifs
Explorer le rôle protecteur cardiaque des extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), sera déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre objectif sera de comparer des effets protecteurs et anti-oxydants de différents extraits et différentes formulation de R. Officinalis sur des rongeurs, suite à une injection de molécule mimant un stress cardique modéré.
Bénéfices attendus
Explorer le rôle cytoprotecteur des phytonutriments issus d'extraits de Romarin, sera donc déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde (IdM). Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger du stress oxydant dans le coeur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires sont peu nombreuses et sont très attendues pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).
Procédures
Les animaux subiront chacun un traitement par voie orale pendant 10 jours (intervention évaluée à moins de 15 minutes). Puis dans l'heure suivant cette prise orale, aux jours 8 et 9, une injection de molécule entraînant un stress cardiaque modéré sera injectée.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Il n'y a pas d'effets toxique attendus à ces doses. Nous n'attendons pas d'effets délétères pour les animaux à la dose utilisée par voie orale. Les deux doses de molécules entrainant un stress cardiaque modéré aux jours 8 et 9 du protocole par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des rougeurs au point d'injection. De plus, la molécule entrainant un stress cardiaque modéré (une tachycardie peut être observée), donc dans l'heure suivant l'injection les animaux seront sous surveillance. L'ensemble des prélèvements sera réalisé post-mortem après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules ont été conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et vasculaires. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules, de leurs extractions et de leurs formulations sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité (importance du passage de la molécule active dans la circulation sanguine) et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Les tests statistiques apropriés seront ensuite réalisés.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum (à volonté) et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale, les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Afin d’éviter tout stress ou douleur, l’ensemble des prélèvements seront réalisés postmortem suite à une anesthésie et une euthanasie appropriée. Par ailleurs, durant toute la période d'hébergement des animaux, le bien-être des animaux sera évaluée par une grille de score présente en annexe. Il est prévu d'enrichir le milieu ainsi que l'alimentation. Lors de l'administration de la dose orale : les procédures seront réalisées par des personnels expérimentés ; et les animaux auront été au préalable habitués. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. De plus, dans l'heure suivant l'injection de la molécule entraînant un stress cardiaque modéré, une surveillance accrue sera mise en place avec une grille de score adaptée présente en annexe.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences et nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les souris seront utilisés à un stade mature pour être représentatif d’une population adulte.
Impact de la modification du cytosquelette sur le développement de la tauopathie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des groupes de souris sont tués à deux, quatre, six, huit et dix mois, à mesure qu'apparaissent chez elles les signes d'une neurodégénérescence programmée par modification génétique. 2 739 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint le niveau de souffrance sévère, pour éprouver le rôle du cytosquelette des neurones dans la maladie d'Alzheimer et d'autres tauopathies. Celles qui deviennent paralysées trouvent nourriture et eau gélifiée au fond de la cage et sont observées une à trois fois par semaine. La description des procédures tient en deux phrases et celle des effets néfastes en une seule, sans que soit précisé ce qui déclenche la mise à mort d'une souris avant l'échéance prévue.
Objectifs
Les tauopathies, dont la maladie d’Alzheimer, sont des maladies neurodégénératives, dans lesquelles une protéine, la protéine tau, s’agrège, ce qui provoque la mort de neurones du cerveau. Ces maladies sont aujourd’hui incurables et ont un impact important sur les patients, leur proches et toute la société. Ce projet a la vocation d’explorer une piste jusqu’alors ignorée : l’effet de l’état du cytosquelette des neurones dans le développement de ces maladies. Le cytosquelette est un réseau de fibres présents dans toutes nos cellules, et donc aussi dans les neurones, qui sert à organiser l’intérieur des cellules, notamment en servant de « routes » sur lesquelles sont transportés les différents éléments des cellules. Ce transport est très important pour emmener ces éléments aux bons endroits dans les cellules. Pendant la vie des cellules, la surface des fibres du cytosquelette peut être altérée pour influencer ce transport. Dans les neurones sains, la protéine tau interagit avec le cytosquelette et ainsi le stabilise. Le changement de la surface des fibres du cytosquelette pourrait donc contribuer au détachement de tau du cytosquelette et à son agrégation toxique dans les neurones. A ce jour, les recherches se sont surtout concentrées sur les changements de la protéine tau elle-même dans la pathologie. Notre projet cherche donc à mettre en lumière un nouveau mécanisme en jeu dans les tauopathies, et notamment dans la maladie d’Alzheimer, les perturbations du cytosquelette. Ces perturbations pourraient un jour devenir la cible des thérapies contre ces maladies aujourd’hui incurables.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier les mécanismes jusqu’alors inexplorés responsables du développement et de la progression de maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer ou la démence frontotemporale. Ces maladies sont à ce jour incurables et présentent un poids économique et sociétal considérable dans notre société. Nos résultats permettront le développement d’approches diagnostiques, qui pourront mener à une prise en charge précoce de la pathologie, ce qui augmentera la qualité de vie des patients et de leurs familles. A plus long terme, cette étude permettra également le développement de thérapies dans le but d’empêcher l’apparition de symptômes et prévenir la perte définitive de neurones.
Procédures
Les animaux génétiquement modifiés seront générés, et l’apparition des signes cliniques de la neurodégénérescence sera observée. A des âges définis, des groupes d’animaux seront mis à mort
Impact sur les animaux
Les animaux modifiés génétiquement dans cette étude vont développer les symptômes de neurodégénérescence.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les maladies neurodégénératives affectent la survie de cellules du cerveau, les neurones. La particularité de ces cellules est leur interconnectivité : les neurones de différentes parties du cerveau sont branchés d’une manière très précise pour transmettre les signaux nécessaires pour un bon fonctionnement du cerveau et de l’organisme. La mort de certaines populations de neurones, comme c’est le cas dans les maladies neurodégénératives, perturbe cette connectivité précise et mène à l’apparition de symptômes. Pour ces raisons, l’étude de ces pathologies requiert l’utilisation d’organismes modèles, dans lesquels les effets de neurodégénérescence peuvent être évaluée au niveau de l’organe et l’organisme entier. Pour cette raison les approches sur cellules, ou in vitro, ne sont pas compatibles avec ce type de recherche. Cela dit, notre projet a de solides bases établies dans ces modèles de remplacement : culture cellulaire et système in vitro (système reconstitué avec les protéines purifiées). Malgré cela, la partie in vivo est nécessaire pour la validation de nos hypothèses dans le contexte complexe de l'organisme entier. Sans utilisation de ces approches in vivo, il n’est pas possible aujourd’hui de confirmer la pertinence de nos approches dans le contexte de la maladie.
Réduction
Nos collaborateurs ont mené une étude pilote, qui a permis de mettre en évidence l’existence d’une relation entre la présence de tau mutée et la modification de cytosquelette. Ces résultats nous permettent donc de précisément cibler le temps d’apparition de symptômes dans les animaux d’intérêt, limitant ainsi leur nombre. Pour permettre une analyse statistiquement valable, nous analyserons 8 animaux venant d’au moins deux portées différentes par âge et par génotype. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à l’utilisation d’outils statistiques
Raffinement
Étant donné que les animaux d’intérêt développent une neurodégénérescence se traduisant par une paralysie, ces souris seront observées une à deux fois par semaine. Une surveillance renforcée, 3 fois par semaine sera mise en place dès le début d’apparition de la neurodégénrescence. Cette fréquence pourra être ré-adaptée selon la vitesse d’apparition des signes cliniques, et une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau (en forme d’eau gélifiée) au fond de la cage (facilitation d’accès à la nourriture). Les souris seront perfusées sous analgésie et anesthésie profonde.
Choix des espèces
La souris possède un système nerveux assez développé pour permettre les analyses de maladies neurodegeneratives. De plus, nous avons montré précédemment une forte ressemblance entre les symptômes des patients humains et ceux des souris présentant la même perturbation du cytosquelette, ce qui prouve que le modèle souris est parfaitement adapté pour l’exploration de ces maladies. Ce projet analyse la progression d’une neurodégénérescence, qui intervient chez les animaux adultes. Les animaux seront donc mis à mort pour analyse d’apparition de changements pathologiques (phénotypes) à 2 mois (jeune adulte), puis 4, 6, 8 et 10 mois (âge d’apparition de symptômes les plus sévères). Ces temps sont choisis par rapport aux temps d’apparition connus de phénotypes dans la lignée décrite précédemment.
Evaluation de la réponse immunitaire et de l’innocuité des produits immunologiques (sur modèles rongeurs) destinés à protéger des espèces domestiques par l’analyse de marqueurs biologiques
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Cochons d'Inde : 200
Hamsters dorés : 1000
Le projet sert à constituer les dossiers d'autorisation de mise sur le marché de vaccins vétérinaires destinés aux espèces domestiques. 3 000 souris, 1 000 hamsters dorés et 200 cobayes, soit 4 200 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun recevant jusqu'à quatre injections espacées de 48 heures et des prélèvements sanguins tous les quatorze ou quinze jours. Les injections provoquent des rougeurs, des œdèmes, des nodules ou des démangeaisons, une perte de poids, un poil hérissé et une baisse d'activité, effets que le porteur annonce répétés au fil des administrations. 3 700 de ces rongeurs sont tués pour des prélèvements terminaux, dont certains par voie intracardiaque, et 500 peuvent être adoptés après avis vétérinaire, le porteur situant le passage au tout in vitro comme "l'ambition ultime et à très long terme" de l'entreprise.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans les premières étapes de création de nouveaux vaccins et produits stimulant l'immunité -Son objectif principal est d'étudier la sécurité (tolérance par l'organisme) et la capacité à déclencher une réponse immunitaire protectrice de ces futurs vaccins chez le rongeur avant leur administration chez les espèces auxquelles se destinent ces produits. -Les données recueillies permettront de définir les meilleures conditions d'utilisation du produit et d'éliminer les produits qui n'est pas conforme en termes de réponses et de tolérance — notamment la dose la plus efficace, la façon de l'administrer, et la sélection des bons ingrédients complémentaires (adjuvants et excipients) — afin d'orienter la suite de son développement.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits immunologiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les requis pour la mise sur le marché de ces produits. Ce projet s’inscrit dans la prévention de maladies pouvant être graves et causer de la souffrance animale et des zoonoses. Les produits immunologiques ainsi développés permettent de protéger les espèces domestiques contre un agent pathogène par la réduction des signes cliniques de maladie voire la mortalité ainsi que par la réduction de sa propagation auprès de ses congénères et de l’Homme (dans le cas de zoonoses). Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou de l’amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de ces procédures seront la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, efficacité, mécanisme d’action) ainsi que la réalisation des études nécessaire à la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM).
Procédures
Le nombre d’interventions dépend de l’objectif de chaque étude. La durée de présence des animaux dans le projet varie de 1 jour à 3 mois, avec une durée moyenne de 28 jours. Les nuisances liées aux interventions sont les suivantes : ● Administrations (Vaccinations) : Les animaux reçoivent une ou plusieurs administrations de produit immunologique. Chaque acte dure entre 3 et 30 secondes. Entre chaque administration, un minimum de 48 heures est respecté ainsi qu’un site d’injection différent. ● Suivis et prélèvements simples : Des prélèvements sanguins sont effectués de manière régulière (souris : 1 prélèvement tous les 14 jours / hamster : 1 prélèvement tous les 14 jours / cobaye : 1 prélèvement tous les 15 jours selon le poids ou 1 fois par mois) , d'une durée de 10 à 30 secondes chacun sous anesthésie. ● Les contraintes de manipulation, le stress lié à la contention et la séparation temporaire d'avec les congénères constituent des nuisances transitoires. Inhérents au suivi de base, ces désagréments sont de courte durée et ne s'étendent que sur quelques heures. L'ensemble de ces interventions est réalisé par du personnel qualifié afin de minimiser le stress et la durée de contention des animaux.
Impact sur les animaux
Les administrations de produits (produit testé, anesthésiques ou traitements) par voies parentérales sont des injections réalisées sur l'animal vigile, entraînant une douleur légère et transitoire. Suite à ces administrations, les animaux peuvent présenter des réactions locales transitoires au site d’injections telles que des rougeurs, des gonflements (œdèmes, nodules) ou des démangeaisons (prurit). Des réactions générales passagères peuvent également être observées, incluant une perte de poids (selon le modèle), une baisse de la consommation alimentaire ou des signes d'inconfort comme un hérissement des poils (aspect ébouriffé) et une baisse d'activité. En raison du schéma vaccinal prévoyant des administrations multiples (jusqu'à 4 injections/minimum 48h entre chaque injections et changement de site d’injection pour chaque injection), ces nuisances sont susceptibles d'être répétées au cours de la procédure et seront suivie au cours de l’observation quotidienne des animaux. Les contraintes de manipulation, le stress lié à la contention et la séparation temporaire d'avec les congénères constituent des nuisances transitoires. Inhérents au suivi de base, ces désagréments sont de courte durée et ne s'étendent que sur quelques heures. La caractérisation de l’immunogénicité des candidats vaccins s’appuie sur des prélèvements sanguins, de suivi ou terminaux, dont les modalités d’exécution sont définies selon l’objectif de l’étude. Afin de limiter les nuisances, ces actes pourront être effectués sous une anesthésie générale profonde ou légère, selon la voie d’accès (veine saphène, veine jugulaire, veine mandibulaire ou par voie intracardiaque).
Devenir
L'issue pour les animaux inclus dans ce projet est définie selon deux orientations possibles, privilégiant systématiquement les principes de Réduction et de Réhabilitation : 1. Placement (Adoption) Les rongeurs pour lesquels un prélèvement terminal n’a pas été réalisé et après confirmation par le vétérinaire que leur état de santé et leur comportement permettent une vie domestique, conformément à la réglementation en vigueur. 2. Mise à mort pour prélèvements terminaux Les rongeurs seront euthanasiés par une méthode humaine pour les nécessités de l'étude : ● Analyses approfondies : Collecte de sérum, tissus et organes pour caractériser la réponse immunitaire et les mécanismes d'action. ● Développement de méthodes alternatives : Utilisation des échantillons pour mettre au point des tests sérologiques in vitro (tests de libération), visant à terme le remplacement des épreuves virulentes sur animaux.
Remplacement
L'absence de méthodes alternatives validées capable de reproduire la complexité systémique d'un organisme vivant rend nécessaire l'utilisation du modèle animal pour caractériser l'innocuité et l'efficacité des produits immunologiques. Ce protocole est indispensable pour répondre aux exigences réglementaires précliniques. Ce projet vise spécifiquement le recueil exhaustif de données pour remplacer les infections expérimentales lors des tests de libération de lots par des suivis d'immunogénicité (prises de sang). Si le passage au tout in vitro demeure l'ambition ultime et à très long terme de l’entreprise, le présent projet constitue l'étape intermédiaire indispensable de collecte de données pour y parvenir.
Réduction
Le nombre d’animaux a été dimensionné pour répondre aux exigences de la Pharmacopée Européenne et de la réglementation, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Pour les premières études de développement (préclinique préliminaire), les effectifs sont déterminés sur la base de données bibliographique, de modèles similaires et de l'historique de projets antérieurs. Au fur et à mesure de l'avancement vers les phases réglementaires, ces effectifs sont affinés grâce à une approche statistique (calcul de risque et de puissance), permettant de réduire au strict minimum le nombre d’animaux par lot. L'estimation globale sur 5 ans intègre une planification pluriannuelle afin d'optimiser l'utilisation de ces lots. Enfin, dans une démarche de réduction active, la mutualisation des groupes témoins est systématiquement privilégiée dès que possible : évaluer plusieurs produits simultanément permet de partager un groupe contrôle unique, réduisant ainsi de manière significative le nombre total d'animaux inclus dans le projet.
Raffinement
Les animaux bénéficient d'un hébergement en groupe et d'un enrichissement du milieu adapté à l’espèce (abris, matériel de nidification), garantissant ainsi leur confort social et physique. Une phase d'acclimatation systématique et adaptée précède le début de chaque essai. Afin de minimiser la douleur et le stress, les procédures invasives, telles que les prélèvements de sang de suivi, sont réalisées sous anesthésie générale légère, associée si nécessaire à une analgésie adaptée. Les prélèvements sanguins terminaux sont, quant à eux, systématiquement effectués sous anesthésie générale profonde, également couplée à une analgésie. En amont de toute administration, la sûreté des produits (candidats vaccins ou immunostimulants) est garantie par une caractérisation et un contrôle préalable in vitro (vérification de la stérilité et de l'inactivation microbiologique). Enfin, ce projet repose sur l'application stricte de points limites spécifiques, prédéfinis pour l’innocuité des produits immunologiques selon le modèle utilisé. Basés sur des scores cliniques objectifs, ces points limites garantissent une prise en charge précoce, une sortie de procédure ou, en dernier recours, une euthanasie anticipée, afin d'éviter toute douleur ou détresse inutile
Choix des espèces
Le choix des espèces repose sur les exigences de la réglementation. - La souris est sélectionnée pour la richesse des outils d'analyse disponibles et des données préexistantes, évitant ainsi la duplication d'essais inutiles. - Le hamster est retenu pour sa sensibilité spécifique à certains microbes, garantissant une meilleure application des résultats d'efficacité du vaccin. - Le cobaye constitue un modèle de référence par sa proximité physiologique avec l’espèce cible et est souvent requis par la réglementation pour valider l'efficacité et la sécurité des produits. Ces modèles de petite taille optimisent la fiabilité scientifique grâce à un contrôle rigoureux des paramètres expérimentaux et présentent un comportement immunitaire pertinent par rapport aux espèces de destination. Cette approche garantit une évaluation solide de la protection vaccinale dans un organisme vivant. Concernant les stades de développement, les études seront réalisées sur des animaux jeunes (sevrés) ou adultes, conformément à la réglementation en vigueur et aux données scientifiques existantes.
La production intestinale de glucose comme signal régulateur central de l’activité physique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
À sept jours de vie, un fragment de 1 mm du pavillon de l'oreille est prélevé sur les souriceaux pour les génotyper. Parmi les 672 souris utilisées, une partie porte une modification génétique qui empêche son intestin de produire du glucose et s'accompagne d'une légère anxiété, et le porteur indique que les régimes riches en fibres et en protéines leur sont néfastes. Dix-huit semaines d'alimentation hypercalorique provoquent surpoids, obésité et diabète, et les souris courent 46 minutes trois fois par semaine pendant deux mois sur un tapis, avec des tests de force et des tests d'endurance allant jusqu'à cinquante minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes sont tuées après six heures de jeûne pour prélever du sang et des tissus, le porteur concluant que l'utilisation de la souris reste "indispensable" faute de méthode reproduisant la coordination entre muscles et nerfs, la motivation à l'effort ou la fatigue.
Objectifs
L’obésité affecte le fonctionnement de nombreux organes et augmente le risque de maladies comme le diabète, les problèmes de foie gras (stéatose hépatique) ou encore certains troubles du comportement (stress, anxiété). Chez l’Homme comme chez les rongeurs, manger trop (en quantité et en apport calorique) conduit au surpoids, voir à l’obésité, et provoque souvent une baisse de l’activité physique. Cette baisse favorise d’autant plus la prise de poids. C’est pourquoi, combiner une activité physique régulière avec une alimentation équilibrée est un moyen efficace pour lutter contre l’obésité. L’activité physique joue aussi un rôle important dans la santé intestinale et la composition des bactéries intestinales (microbiote). Ce projet s’intéresse particulièrement à une fonction biologique appelée production intestinale de glucose (PIG), par laquelle l’intestin fabrique du sucre (glucose). Nous avons montré que les effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète des fibres et des protéines passent par l’activation de cette fonction. Mais la PIG ne se limite pas à son rôle métabolique. Grâce à une communication entre l’intestin et le cerveau, elle protège les souris de l’obésité et de ses conséquences, tant sur le plan métabolique que comportemental. Elle prévient l’obésité, le diabète et les troubles du foie gras, mais elle réduit aussi le stress et l’anxiété. Par exemple, dans des tests de comportement, les souris avec une PIG activée explorent plus et se déplacent plus vite, tandis que celles sans PIG présentent des troubles métaboliques et comportementaux, même avec une alimentation saine. Ces observations suggèrent un lien étroit entre cette fonction intestinale et l’activité physique. Nous faisons donc deux hypothèses : 1. La PIG pourrait favoriser l’activité physique spontanée et améliorer les performances. 2. À l’inverse, l’activité physique pourrait stimuler la PIG, renforçant ainsi ses effets anti-obésité. Pour tester ces hypothèses, nous proposons d’étudier si la PIG peut augmenter l’activité physique et si l’activité physique peut, en retour, activer la PIG, contribuant ainsi à la lutte contre l’obésité.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de compléter les travaux sur les effets bénéfiques de la PIG et de mieux comprendre cette fonction intestinale, afin de la proposer comme cible thérapeutique intéressante contre l’obésité et ses complications.
Procédures
Pour déterminer le génotype des souris génétiquement modifiées nécessaires à l’étude, un petit bout du pavillon de l’oreille (1mm) sera prélevé pour analyser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Une partie des souris recevront une injection quotidienne sous la peau pendant 5 jours. Chaque injection dure quelques secondes par souris. L’activité spontanée et les performances physiques des animaux seront évaluées lors de tests de force (15 secondes, 2 fois) et d’endurance. Lors de ces tests, les souris seront partiellement isolées pour évaluer leur activité spontanée (3 jours, 2 fois), et seront entrainées (46 minutes, 3 fois par semaines, 2 mois) et/ou testées (50 minutes maximum, 2 fois) sur un tapis de course. Les souris seront nourries avec une alimentation normale, riche en fibres, riche en protéines ou hypercalorique pendant 14 semaines pour les 3 premières, et 18 semaines pour l’alimentation hypercalorique. En fin de procédure, une partie des souris seront mises à jeun pendant 6h et, un prélèvement sanguin rapide (15secondes) sera effectué juste avant la mise à mort. L’autre partie recevra une injection d’analgésiques sous la peau (10 secondes) avant la mise à mort des souris qui sera réalisée par l’injection d’un médicament à visée euthanasique.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7 jours, on prélève un petit morceau du pavillon de l’oreille pour analyser l’ADN des souris génétiquement modifiée. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés mais le geste est rapide (quelques secondes). Vers 7-8 semaines, elles recevront une injection quotidienne (piqure sous la peau, 5 jours). L’injection est rapide mais peut entrainer une légère douleur et un léger stress. Le phénotype des animaux génétiquement altérés comprend une incapacité de l’intestin à produire du glucose ainsi qu’une légère anxiété. Les fibres et protéines sont bénéfiques pour les souris ayant une production intestinale de glucose fonctionnelle, mais sont néfastes lorsque qu’elle ne l’est pas. L’alimentation hypercalorique provoquera un surpoids/obésité et un diabète, qui sera observé plus tôt en l’absence de production intestinale de glucose, mais pas plus grave. Les tests d’endurance sur tapis de course pourront créer un stress chez les souris qui seront interrompus dès que l’animal est fatigué (endurance maximale) ou s’il refuse de courir. L’isolement partiel nécessaire à l’évaluation de l’activité physique spontanée pourra engendrer un léger stress. A la fin de l’expérience, les souris seront mises à jeun pendant 6h, ce qui peut affecter leur bien-être et augmenter leur un stress. La prise de sang, qui nécessite une piqûre et une contention, cause aussi une légère douleur et du stress.
Devenir
Afin de caractériser les effets de l’activation de la PIG sur l’activité physique et inversement, plusieurs tissus devront être récupérés pour des analyses moléculaires et histologiques. Pour cela tous les animaux seront mis à mort selon une méthode respectant les règles éthiques pour prélèvement de sang et de certains tissus.
Remplacement
Même si l’on peut maintenant modéliser le fonctionnement de plusieurs organes en laboratoire, cette étude nécessite l’utilisation d’animaux car le glucose produit dans l’intestin agit sur l’ensemble du corps et implique des communications entre différents organes. Pour atteindre les objectifs de ce projet, il est nécessaire d’évaluer la motricité, l’endurance et l’activité physique dans un organisme vivant. Aujourd’hui, il n’existe aucune méthode en laboratoire ou sur ordinateur capable de reproduire de manière fiable la coordination entre muscles et nerfs, la motivation à l’effort, la fatigue ou les adaptations physiologiques observées dans ces tests. Ces méthodes alternatives peuvent étudier certains mécanismes moléculaires ou métaboliques, mais elles ne peuvent pas refléter le comportement moteur global ni les interactions entre les systèmes nerveux, musculaire et cardiovasculaire. Pour ces raisons, l’utilisation de la souris reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le projet utilisera un nombre de souris calculé au plus juste pour répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le recours aux animaux. Nous travaillerons avec des souris transgéniques (avec la PIG modifiée) et leurs témoins issus de la même portée, ce qui réduit le besoin d’autres animaux. Les mâles et les femelles seront étudiés pour vérifier si les effets de la PIG diffèrent selon le sexe. Si aucune différence n’est observée entre les sexes, les mâles et les femelles pourront à l’avenir être regroupés dans des mêmes groupes expérimentaux, indépendamment du sexe. Après les expériences, certains tissus seront conservés dans une banque pour des analyses futures, évitant ainsi l’utilisation de nouveaux animaux. A noter, que grâce à l’utilisation d’échantillons déjà présents dans notre collection (issus de projets précédents), nous avons déjà pu commencer l’étude des effets de la PIG sur le métabolisme musculaire (sans entrainement). Au total, 672 souris au maximum seront nécessaires pour ce projet
Raffinement
Toutes les procédures ont été pensées pour réduire le stress et la douleur des souris. Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages enrichies, manipulés régulièrement par du personnel qualifié et transférés avec un tunnel pour limiter l’anxiété. Ils seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine, et leur état de santé et de bien-être sera suivi à l’aide d’outils spécifiques (ayant recours à l’échelle de grimace des souris). Les tests comportementaux seront précédés d’une période d’habituation, et toute souris montrant des signes de détresse, de fatigue ou de blessure verra le test interrompu immédiatement. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour limiter la douleur dans les procédures concernées. Des mesures spécifiques ont été prévues pour réduire l’isolement et l’inconfort, par exemple l’isolement partiel avec vision des congénères pour l’activité spontanée, ou l’utilisation de signaux non douloureux pour le tapis de course. Enfin, les tissus prélevés seront conservés dans une banque de tissus, ce qui permettra de réaliser certaines analyses à l’avenir sans utiliser de nouveaux animaux. Ces mesures garantissent que les procédures respectent le principe de raffinement en limitant au maximum la souffrance et le stress des animaux tout en permettant d’atteindre les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée et inductible. Les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. Une biopsie de l’oreille pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. Le reste de l’étude sera réalisé chez des souris âgés de 12 semaines.
Développement d’un modèle Murin pour l’étude de l’hypertension pulmonaire dans le syndrome d’overlap 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant seize semaines privée d'oxygène huit heures par jour ou jusqu'à vingt-quatre heures par jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au modéré, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Certaines reçoivent en plus un régime riche en graisses pendant seize semaines pour devenir obèses, puis des injections de glucose ou d'insuline suivies de six gouttes de sang prélevées en deux heures après incision de la queue, et une échographie cardiaque sous anesthésie. Juste avant la mise à mort, la pression à l'intérieur du cœur est mesurée pendant cinq minutes, le cœur et les poumons étant ensuite prélevés. Aucun traitement n'est testé ici, le porteur écrivant que l'évaluation directe de traitements dépasse les objectifs immédiats du projet, les bénéfices annoncés étant renvoyés à de futurs essais sur un syndrome pour lequel aucun traitement n'a démontré son efficacité.
Objectifs
Développer un modèle original et innovant reproduisant certains mécanismes du syndrome d’overlap. Ce syndrome est défini par une bronchopneumopathie chronique obstructive liée à un manque d’oxygène dans le sang couplé à un syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Ce syndrome d’overlap sera mis au point avec ou sans obésité, afin d’identifier les déterminants biologiques de l’hypertension pulmonaire et d’explorer des pistes thérapeutiques ciblées dans de futurs projets.
Bénéfices attendus
Perspective d'application ou de développement éventuel de ce travail et incidences éventuelles sur la santé respiratoire : La mise au point de ce modèle murin inédit, combinant spécifiquement un manque d’oxygène chronique et intermittent, ainsi que l'obésité induite par régime, ouvrira des perspectives significatives tant sur le plan scientifique que clinique. Ce modèle permettra une caractérisation fine et détaillée des voies biologiques clés impliquées dans le développement de l'hypertension pulmonaire et des complications cardiaques du syndrome d’overlap. Grâce au développement de ce modèle préclinique robuste (en cas de succès du projet), il sera par exemple possible de tester de manière pertinente des stratégies thérapeutiques ciblées, actuellement utilisées dans l’hypertension artérielle pulmonaire, et qui pourraient être transposées dans le syndrome d’overlap pour lequel aucun traitement spécifique n’a démontré son efficacité actuellement, comme en témoigne notamment l’échec récent de l’essai clinique utilisant le tréprostinil inhalé. Ainsi, le modèle murin que nous développons permettra non seulement d’explorer et comparer l’efficacité des différentes voies thérapeutiques potentielles dans le contexte spécifique du syndrome d’overlap, mais aussi de mieux identifier les approches thérapeutiques les plus prometteuses pour de futurs essais cliniques chez l’homme. Bien que l’évaluation directe de traitements dépasse les objectifs immédiats du présent projet, elle constitue une perspective importante de notre recherche à venir.
Procédures
Les animaux seront soumis à un manque d’oxygène intermittent (8h/jour) et/ou chronique (16 à 24h/j) pendant 16 semaines. Certains animaux pourront également recevoir un régime riche en graisses durant 16 semaines pour induire une obésité. Afin de suivre leur glycémie et voir comment le glucose ou l’insuline sont régulés dans le sang, les animaux seront injectés avec du glucose ou de l'insuline (temps d’injection = 20 secondes) puis une goutte de sang sera prélevée de façon répétée 6 fois durant 2h. Une échographie du coeur associée à un électrocardiogramme seront réalisés sous anesthésie générale (15-20min). Juste avant la mise à mort de l’animal, sous anesthésie et analgésie, la pression à l’intérieur du cœur sera mesurée durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus au manque d'oxygène. Une augmentation de la fréquence respiratoire avec essoufflement et perte de poids s'observent les premiers jours d'exposition. Par la suite les animaux s'adaptent à ce changement d'ambiance. Les tests pour mesurer la régulation du taux de sucre dans le sang (= tests métaboliques) étant induits par une injection, une douleur minime peut se produire au site d'injection. Les animaux étant mis à jeun avant les tests métaboliques, cela peut induire un stress léger et de l'inconfort. Aussi, le suivi de la glycémie pendant ces tests se faisant à l'extrémité de la queue après une légère incision, une légère douleur et du stress peuvent être observés à ce moment-là. Un des tests métaboliques provoque une hypoglycémie transitoire contrôlée. Enfin l'obésité induite par le régime peut provoquer des mouvements plus compliqués pour l'animal mais aucune gêne majeure n'a été observée dans les précédentes études. Un stress légé peut-être associé à l'anesthésie nécessaire à l'échographie du coeur, l'électrocardiogramme et le transfert des animaux entre les deux animaleries. Le cumul de l'obésité et de l'exposition à l'hypoxie intermittente et stationnaire peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du coeur et des poumons (nécessité de prélever les organes). Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement du syndrome d'overlap. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque, la réactivité des vaisseaux, l'étude des tissus des poumons dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération du cœur à droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Lorsque les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme pour évaluer la fonction du coeur et des vaisseaux, les tissus prélevés (coeur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées (surplus de tissu) Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en utilisant le logiciel GPower en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations posteuthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Pour les tests de cathétérisme, des animaux de réutilisation pourront être utilisés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris car c’est le modèle actuellement le plus utilisé pour modéliser le syndrome d'apnées obtructives du sommeil dans notre laboratoire. Nous avons donc des données robustes associées à celui-ci. Aussi, notre dispositif d'exposition à l'hypoxie ne permet que l'utilisation des rongeurs. Nous utliserons pour ce projet des souris qui répondent également bien au régime induisant une obésité utilisé dans ce projet. Les données de la litérature montrent également que ce modèle est pertinent pour le projet.