Souris

2 400 animaux non-humains vont être utilisés, 960 souris et 1 440 rats, en majorité tués et pour partie réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés sont placés en atmosphère enrichie en oxygène pour provoquer une atteinte des vaisseaux de la rétine, puis reçoivent des gouttes ou des injections répétées, avec anesthésies et examens d'imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur teste des traitements contre les rétinopathies vasculaires et indique réutiliser les mères gestantes dans d'autres procédures après avis vétérinaire. Sur le remplacement, il affirme avoir besoin d'un œil perfusé en développement, que seul l'animal vivant fournirait.

Objectifs

Les pathologies de la rétine ou rétinopathies sont liées en grande partie à des anomalies de la vascularisation rétinienne. Parmi elles, on retrouve la rétinopathie du prématuré. Cette maladie liée à un mauvais développement du système vasculaire qui touche 30% des prématurés de moins de 31 semaines est la principale cause de cécité infantile dans le monde avec 30000 cas de malvoyance. Le but de ce projet est de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques et de trouver de nouveaux traitements en utilisant un modèle qui va mimer cette atteinte vasculaire chez le rongeur après une exposition à une atmosphère enrichie en oxygène. Plus généralement, lorsque le flux sanguin est altéré et que les vaisseaux perdent leur intégrité fonctionnelle, un mécanisme compensateur de réparation se met en place, avec la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux préexistants. Ce phénomène est appelé néovascularisation. Ces nouveaux capillaires sont souvent perméables et se développent de façon anarchique. Ils ne peuvent alors plus assurer correctement le transport du sang et aggravent de ce fait les dommages causés à la rétine. C’est le cas de nombreuses maladies comme la forme humide de dégénérescence maculaire liée à l’âge, première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans et la rétinopathie diabétique, première cause de cécité acquise dans les pays occidentaux chez l’adulte entre l’âge de 25 et 74 ans. Ce projet s’inscrit donc avec ce modèle de rétinopathie, développé dans les années 1950, dans un cadre plus large que la seule rétinopathie du prématuré. Il est largement utilisé depuis pour l’étude de l’angiogenèse et de la néovascularisation pathologique au niveau de la rétine. Il permet de ce fait de tester l’efficacité de thérapies luttant contre la grande famille des rétinopathies vasculaires. Sur la durée du projet, 10 études par espèce sont prévues en plus des études de formation du personnel aux bons gestes techniques, avec à chaque fois au moins un nouveau traitement ou une nouvelle formulation à tester. Chaque étude nécessite un nombre d’animaux minimum afin de pouvoir comparer les différentes conditions expérimentales et évaluer de l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de nouveaux traitements pouvant améliorer la prise en charge de la rétinopathie du prématuré bien sûr mais aussi toutes les maladies incluant une composante vasculaire telles que dégénérescence maculaire liée à l’âge ou rétinopathie diabétique par exemple.

Procédures

Dès la naissance (rats) ou 7 jours après (souris), les animaux seront placés dans des chambres permettant le contrôle du taux d’oxygène durant une durée définie (14 jours pour les rats, 5 jours pour les souris). La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 17 ou 20 jours de l’étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation à la lampe à fente, angiographie, tomographie…) seront généralement hebdomadaires et de dureront pas plus de 5 minutes. Des anesthésies seront pratiquées autant que nécessaire afin de permettre si besoin l’administration ou l’examen des animaux. Tous les examens réalisés ces procédures sont des examens pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Chez l’homme, toutes les procédures qui ont nécessité une anesthésie générale, se font la plupart du temps sous anesthésie locale. Les autres examens (lampe à fente…) sont totalement indolores ou sous anesthésie locale et ne durent que cinq minutes tout au plus. Chez l’animal, l’anesthésie générale est réalisée afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés aux conditions expérimentales d’hébergement, à leur manipulation et à l’administration des produits. La pathologie recherchée - néovascularisation et perméabilité vasculaire rétinienne - n'induit pas de douleur chez l'animal. La croissance des nouveau-nés et des mères exposés à l'hyperoxie (ou alternance de cycles hypoxie/normoxie) n’est que faiblement impactée. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet de la modification du taux d'oxygène sur le comportement des animaux. La manipulation des nourrissons peut introduire du stress chez les petits comme chez la mère. Les risques sont qu'un animal soit rejeté de la portée par la mère, ne soit plus alimenté ou mangé par la mère. Pour ne pas induire de stress chez les mères déclenchant ces comportements, les manipulations des animaux seront donc limitées au maximum et seront réalisées par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.

Devenir

A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Dans le cadre de notre projet, nous avons besoin d’un œil perfusé en cours de développement. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus dans un environnement enrichi, (bouts de bois, coton pour le nid sur toute la période de l’étude) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Les examens qui nécessitent un immobilisme complet de l'animal pour la prise de photo, sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et après l’intervention. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques, depuis les années cinquantes pour étudier le développement de la vascularisation de la rétine et ses pathologies. Les espèces choisies sont le rat et la souris. Ce sont les espèces références pour ce modèle. Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le principe du modèle est d'agir sur le développement vasculaire de la rétine de nouveau-nés. Les animaux seront donc inclus dans l'étude quelques jours après leur naissance, avec leur mère pour subvenir à leurs besoins.

313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation reproduisant le syndrome NARP, avec un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire, et subissent des prélèvements de sang et d'urine ainsi que des tests de force, d'équilibre et d'endurance, des IRM et des échocardiographies sous anesthésie, de un à six mois. Le porteur indique qu'aucune caractérisation détaillée de cette lignée n'a été faite auparavant et que l'objectif est d'identifier des déficits mesurables avant de tester des candidats médicaments. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent incomplets pour un phénomène impliquant l'"organisme tout entier", et présente le recours à la souris comme une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

159 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales, un traitement oral quotidien pendant 93 jours et deux prises de sang, après administration d'un composé oncogène et d'un produit chimique reproduisant une rectocolite hémorragique, avec perte de poids et diarrhées pouvant contenir du sang. Le porteur teste une molécule déjà passée en essai clinique de phase 2 pour réduire le risque de cancer colorectal, la mise sur le marché restant l'objectif affiché. Sur le remplacement, il affirme que seul le modèle murin convient, une tumeur liée à l'inflammation ne pouvant selon lui être reproduite sur cellules en culture.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin affectant 1 personne sur 1000 dans le monde. Elle se manifeste généralement par poussées plus ou moins sévères caractérisées par des diarrhées, des douleurs abdominales et un amaigrissement pouvant amener à des complications comme une péritonite. Sur le long terme, les patients sont exposés à un risque plus élevé de cancer colorectal. Des traitements existent et permettent de réduire cette inflammation mais ne fonctionnent pas chez un grand nombre de patients. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de diminuer le risque d’apparition de cancer colorectal chez les patients atteints de rectocolite hémorragique traités par notre molécule.

Bénéfices attendus

La mise sur le marché de ce composé permettra d'améliorer la prise en charge des patients pour qui les traitements actuels ne fonctionnent pas et de limiter leur risque de développer un cancer colorectal.

Procédures

Les animaux recevront une injection par voie intrapéritonéale au début de l'étude puis une deuxième au jour 21, ce geste dure environ une dizaine de secondes. Nous administrerons également aux animaux un traitement par voie orale de façon quotidienne sur une durée de 93 jours. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte de très courte durée (10 secondes en moyenne). Deux prises de sang seront realisées, une avant le début de l'expérience et une seconde après 62 jours, d’une durée de 5 secondes en moyenne afin d'analyser différents paramètres biologiques. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé oncogène induisant l’apparition de tumeurs cancéreuses et de la prise du produit chimique qui mime une rectocolite hémorragique chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération de l’épithélium du colon qui provoque une perte de poids de l’ordre de 5% à 10% chez les souris malgré une alimentation et une hydratation normale et des diarrhées qui peuvent ou non contenir du sang.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Nous voulons étudier la prévention de l’apparition de tumeurs associée à une rectocolite hémorragique et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il n’est pas possible de reproduire le développement d’une tumeur suite à une inflammation sur des cellules en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en se garantissant l’obtention de résultats statistiquement représentatifs. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle de colite murine et d’après les résultats obtenus par des équipes travaillant sur le modèle.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur. L'administration répétée des composés par voie orale sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide. Ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser l’hydratation des souris.

Choix des espèces

Le modèle murin de cancer colorectal associé à une colite est très documenté et permet de reproduire les symptômes, les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique ainsi que le développement de tumeurs observés chez le patient. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets de la molécule.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer du foie puis une chimiothérapie combinée à un anticorps deux fois par semaine pendant six semaines, pour tester si cette association ralentit la croissance tumorale. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée et que la chimiothérapie entraîne perte d'appétit et de poids. Il affirme avoir mené des études in vitro et sur tissus de patients, mais juge nécessaire une validation sur "animal entier" avant le passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer du foie est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à une combinaison de chimiothérapie, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement chimiothérapeutique standards entraine une augmentation de l’expression de la protéine ciblée par notre anticorps. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et le traitement de référence pourrait améliorer l’efficacité du traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord d’identifier la dose adéquate de chimiothérapie à utiliser puis d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre le traitement de référence et notre anticorps sur la progression tumorale.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront un traitement par chimiothérapie et anticorps 2 fois par semaine pendant 6 semaines par injection intrapéritonéale. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Le traitement par chimiothérapie peut entrainer une perte de poids de la souris (perte d’appétit, fatigue).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

1 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de bactéries provoquant une septicémie, puis des antibiotiques toutes les deux heures, pour tester l'efficacité de nouveaux traitements contre des Escherichia coli ultrarésistantes selon la quantité de bactéries. Le porteur décrit une septicémie apparaissant deux heures après l'inoculation et une surveillance par grille de score déclenchant la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il affirme que la complexité d'une infection in vivo rend le remplacement par des tubes à essai "non réalisable" et le passage par l'animal "indispensable".

Objectifs

Il est urgent de développer de nouvelles molécules antibiotiques pour lutter contre les bactéries ultrarésistantes. Parmi elles, Escherichia coli (E. coli) est la bactérie la plus fréquemment responsable d’infections urinaires et digestives et d’infections généralisées (septicémies) chez l’homme. Elle est aussi parmi les plus touchées actuellement par la résistance aux antibiotiques, avec parfois plus aucun antibiotique efficace (bactéries ultrarésistantes). De nouveaux antibiotiques ont été très récemment développés et ont montré leur efficacité pour tuer certaines bactéries ultrarésistantes. Ces antibiotiques ont montré leur efficacité au laboratoire dans des tubes à essai contre des souches de E. coli ultrarésistantes, mais chez l’homme, faute de données d’efficacité suffisamment nombreuses et du fait d’échecs de traitement rapportés chez certains malades, ces antibiotiques ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours et lorsque le recours aux autres options disponibles n’est pas envisageable. On dispose actuellement de très peu de travaux de recherche sur l’utilisation de ces nouveaux antibiotiques, notamment peu de choses sur leur efficacité quand il y a une quantité importante de bactéries (appelé « inoculum important »). L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi avant de les tester chez l’homme il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal, en l’occurrence la souris. L’objectif de notre travail est l’analyse de l’efficacité de ces nouveaux antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes (ou inoculum différent) pour s’assurer qu’ils restent efficaces même pour tuer de grandes quantités de bactéries. Nous utilisions pour ces expériences un modèle d’infection intra abdominale de la souris qui provoque une septicémie et avec lequel on peut faire varier la quantité de bactéries. L’efficacité des antibiotiques sera évaluée en termes de survie des animaux infectés et nombre de bactéries présentes apres traitement au niveau de la rate des animaux (qui correspond à ce qui se trouve dans le sang).

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail pourront permettre de mieux définir les conditions de l’utilisation de ses molécules chez l’Homme et comprendre pourquoi parfois elles ne marchent pas.

Procédures

Les souris seront infectées par une injection dans le ventre (intra péritonéale) à l'aide d'une aiguille fine de 250μL contenant un mélange de bactéries sur animal vivant non anesthésié (durée du geste environ 5 secondes) et traitées par antibiotiques par une injection sous la peau du cou de 0,2mL toutes les deux heures (durée du geste 5 secondes). Elles seront surveillées de façon très rapproché puis euthanasiées si elles montrent le moindre signe de souffrance avant la fin de l'expérimentation. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur souris vivante. Un prélèvement stérile de liquide péritonéal (2mL) et de la rate seront réalisés après euthanasie de la souris. Un prélèvement sanguin (2mL) par ponction intra-cardiaque sera également réalisé après l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce modèle représente un modèle de sévérité modérée d’infection péritonéale bactérienne avec septicémie qui apparait à partir de 2h après l’inoculation bactérienne. Aucune douleur n’est à attendre, en revanche les souris peuvent être stressées, avec des signes tels que les poils hérissés et une fatigue.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de l'experimentation ou avant en cas d'atteinte d'un point limite pour limiter au maximum des souffrances inutiles. La durée totale est de 30h au maximum (2h infection + 24h traitement + 4h post traitement). Tous les animaux seront mis à mort, car nous aurons à faire des prélèvements des organes et du sang, qui ne peut se faire sur animal vivant.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi, avant de les tester chez l’homme, il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal. En effet, la complexité d'une infection in vivo rend pour l’instant le remplacement de ce modèle expérimental par des modèles in vitro (tube à essai) non réalisable.

Réduction

De nombreuses analyses seront réalisées en amont pour réduire les conditions testées et les animaux utilisés. Les analyses déjà réalisées au sein de l’équipe seront une base pour cibler les doses des traitements antibiotiques nécessaires, permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutes les molécules testées sont des antibiotiques. Pour le cefiderocol, une étude de dose (pharmacocinétique) sera nécessaire car cette molécule n’a jamais été utilisée dans le modèle ; en revanche pour l’avibactam et aztreonam l’étude a déjà été réalisée dans notre laboratoire et ne sera donc pas refaite, pour limiter le nombre de souris utilisées. Des souris dites "contrôles", c'est a dire traitées avec des antibiotiques dont on sait qu'ils sont efficaces, seront utilisées, mais ces contrôles ne seront pas répétés à chaque experimentation pour limiter le nombre de souris utilisées. Les organes (rate, liquide péritonéal) seront congelés et conservés à -80°C pour permettre une analyse ultérieure en cas de besoin sans devoir recourir à nouveau à l'expérimentation chez la souris.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement, il sera obtenu grâce au respect d’un délai d’au moins 72h entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale, le respect des conditions optimales d’hébergement des souris en animalerie en portoirs ventilés, c'est à dire en cages adaptées bien ventilées (5 souris par cage) et la surveillance des animaux toutes les 2 heures pendant toute l’expérimentation, avec accès facile à l’eau et à la nourriture. L’apparition de signes chez l’animal de souffrance avec un score de points limites sera surveillée de près. Les délais entre l’infection par les bactéries et le traitement antibiotique sont réduits à deux heures pour limiter le risque de souffrance. L’euthanasie sera programmée 4h après la fin du traitement antibiotique qui dure 24 h, sans attendre de décès spontané, ou avant si des signes de souffrance apparaissent (torpeur, poil hérissé ...). Un score de points a été établi, prenant en compte 3 paramètres, avec à chaque fois une gradation de 0 à 4: la posture normale voutée, voutée+ et voutée ++, la mobilité: normale, altérée, altérée + et prostrée et le poils: sans atteinte, hérissés, hérissés + et hérissés ++. Le point limite est atteint si la somme des points est > ou = à 6 ou si le score de 3 est atteint pour la mobilité ou la posture. En cas d’atteinte du point limite, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection intrapéritonéale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection intra-péritonéale. Les souris utilisées ont 8 semaines (environ 25 grammes). Ce sont des animaux adultes pour utiliser des souris de poids suffisant.

7 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines, génétiquement modifiées, reproduisent des maladies neurologiques rares et développent troubles moteurs, dégradation de l'état général et perte de poids, tandis que des candidats médicaments leur sont administrés jusqu'à treize semaines, avec pose de mini-pompes sous la peau et prélèvements sanguins répétés. Le porteur fixe un point limite à 20 % de perte de poids, seuil qui déclenche la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il affirme que seul l'animal possède un répertoire comportemental et neurophysiologique intégré permettant de tester l'efficacité des composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques, handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple l’amyotrophie spinale infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui d’identifier des composés issus de notre recherche capable de ralentir ou d’arrêter la progression de ces maladies, afin de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont testés in vivo chez la souris saine ou génétiquement modifiée afin d’évaluer leur effet dans le traitement des maladies rares neurologiques, et destinés à être administrés chez l’homme par différentes voies de traitement. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, le remplacement total ou partiel dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées génétiquement modifiées. Nous avons également recours à des souris génétiquement modifiées répondant en tant que modèle de physiopathologie humaine récapitulant une partie des caractéristiques pathologiques observées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner des candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques.

Procédures

• Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) • Administration de composés testables, de référence ou véhicule (selon la voie d'administration) : animal vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 13 semaines maximum ou sous anesthesie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 25 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) ou encore avec mise en place d’une mini-pompe pour l’administration continue de composé implantée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 10 min – 1 fois par mois si nécessité de changer la mini-pompe) • Prélèvement de sang sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : Contention d’une durée maximale de 2min ; Piqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes ; Prélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : -Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -de l’administration de composés testés réalisée dans la première procédure chez la souris vigile avec une contention de 30s et une injection d’environ 10s qui peuvent également générer du stress. -Ou, dans la seconde procédure de la phase chirurgicale nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire. -Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. -D’une perte de poids limitée à 20% du poids de l’animal. -Des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). -De signes cliniques liés à l’expression des altérations génétiques : les souris génétiquement modifiées miment les pathologies humaines et sont susceptibles de développer ainsi des signes cliniques évolutifs tels que des troubles moteurs (incoordination motrice), une altération de l’état général, des dermatites, de la perte de poids.

Devenir

Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sains et génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Dans un premier temps, une caractérisation des composés de référence est réalisée afin de déterminer la dose pharmacologiquement pertinente, choix basé sur les données de la littérature et les brevets issus de la concurrence (3 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Les effets toxiques potentiels des traitements pharmacologiques seront évités en administrant aux doses définies dans la littérature ou après détermination de la première dose toxique par l’équipe de toxicologie. A l’issue des premiers résultats obtenus, nous pouvons tester à la dose identifiée les candidats médicaments avec un faible effectif (3 à 5 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Ce premier filtre vivo permet de discriminer les composés afin de sélectionner uniquement les candidats pharmacologiquement intéressants. Ils seront ensuite évalués à différentes doses et différents temps post-administration à l’aide d’une approche descriptive (pas de tests statistiques). Les meilleurs candidats seront testés dans des études nécessitant plus d’animaux (pharmacocinétique / pharmacodynamie, …), une modélisation non linéaire et une approche statistique multi-critères est effectué en collaboration avec le service statistique dédié. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. La technique de prélèvement de sang dite par microsampling, peu invasive et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés par projet de recherche.

Raffinement

Les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Seules les souris opérées pour l’implantation d’une mini-pompe (type pompe alzet) seront remises en groupe après la phase de chirurgie si les caractéristiques de la souche le permettent. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Etre Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées). Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales, pour les souris génétiquement altérées, et/ou soumises à une étude pharmacologique chronique (procédure 2), réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Un suivi particulier sera réalisé pour les animaux faisant l’objet d’une administration de composés par voie intracérébrale. Plus précisément, un suivi post injection sera assuré dès le réveil de l’animal et par l’intermédiaire d’une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les animaux disposeront d’enrichissement dans leurs hébergements bâtonnets de coton ‘cocoon’ et de sizzle pad pour se construire un nid ou de morceau de bois à ronger dans leur cage d’hébergement et d’un tube en plexiglass.

Choix des espèces

La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. La souris est génétiquement modifiable, avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), et offre une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neuropsychiatriques. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. Quel que soit le modèle, l’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.