Souris

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie fixe une ailette métallique sur le crâne, puis chaque souris est maintenue par la tête et imagée éveillée une fois par semaine pendant trois semaines pour valider une méthode d'échographie photoacoustique de l'activité cérébrovasculaire. Le porteur indique que l'ouverture du cuir chevelu peut provoquer une douleur au réveil et que la contention induit un stress qu'il compte atténuer par habituation. Les applications cliniques et l'étude de maladies neurodégénératives sont renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de valider l'outil d'imagerie.

Objectifs

Nous souhaitons étudier et valider une approche innovante d'imagerie non invasive de la fonction cérébrale chez la souris éveillée (mâles et femelles) grâce à l'utilisation des ultrasons à haute résolution associé à la photoacoustique.

Bénéfices attendus

Le développement de ce modèle nous permettra de mieux comprendre la fonction cérébrovasculaire chez des animaux éveillés en utilisant des approches novatrices d'imagerie non invasive. Ce modèle pourra être étendu à l'étude de pathologies comportementales ou de neurodégénérescence. À terme, nous pensons que l'imagerie fonctionnelle par échographie photoacoustique permettra d'identifier précocement des biomarqueurs de ces maladies, offrant ainsi un fort potentiel de transfert vers des applications cliniques

Procédures

La mise en place d'une ailette métallique sur le crâne de l'animal nécessitera une chirurgie peu invasive sous anesthésie et analgésie. La période de récupération post-chirurgicale sera de 7 jours. Une période d'acclimatation et d'habituation au système de fixation de l'ailette sur l'appareil de stéréotaxie sera réalisée pendant 7 jours. Cet appareillage permettra de maintenir la tête de l'animal sans entraver ses mouvements de marche. Le protocole d'imagerie par échographie/photoacoustique permettra l'enregistrement de l'activité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli. Ce protocole sera réalisé une fois par semaine pendant 3 semaines et durera de 20 à 30 minutes

Impact sur les animaux

L'intervention chirurgicale, impliquant l'ouverture de la peau du crâne et le placement d'une petite ailette métallique sur le crâne, peut provoquer une douleur chez les animaux au moment du réveil. En revanche, le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution est une approche non invasive et non douloureuse. La fixation de l'animal sur le système peut induire un stress temporaire (d'une durée de 20 à 30 minutes par animal), que nous atténuerons en habituant progressivement les animaux à ces procédures.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du suivi échographique/photoacoustique pour des analyses des organes en biochimie et en histologie.

Remplacement

Malheureusement, il n'existe pas de modèle alternatif (in vitro ou in silico) bien validé pour étudier l'activité cérébrovasculaire dans sa globalité. Il est essentiel d'avoir des neurones connectés aux cellules gliales, au système immunitaire et aux vaisseaux sanguins pour étudier l'activité neurophysiologique au fil du temps. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté et adopté par la communauté des neurosciences. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté, et est largement adopté par la communauté des neurosciences.

Réduction

Nous avons limité le nombre de souris au minimum nécessaire. Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales répétées sur chaque souris. Les mêmes séries d'animaux seront utilisées pour les explorations fonctionnelles et en histologie pour les explorations moléculaires. Enfin, nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux projets.

Raffinement

Pour réduire la souffrance et le stress des animaux, des mesures sont mises en place pour gérer la douleur et le stress, comprenant l'utilisation d'analgésiques jusqu'à la mise à mort. Pour améliorer le bien-être des souris, des matériaux de litière et des structures de repos adaptées, tels que des mouchoirs en papier ou des rouleaux en carton, sont installés dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en fonction des modèles nécessaires à notre étude, tout en respectant les principes scientifiques des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en recherche animale. Les souris sont fréquemment utilisées dans la littérature pour étudier la fonction cérébrale. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour étudier la fonction cérébrovasculaire, car il n'est pas techniquement possible de le faire chez des animaux plus jeunes. De plus, selon la littérature, la réactivité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli est optimale entre 6 et 8 semaines d'âge.

Les souris utilisées portent une modification génétique qui provoque un syndrome de Leigh : perte de poids et retard de croissance vers quatre semaines, difficultés croissantes à se déplacer, puis détresse respiratoire peu avant la mort, vers sept ou huit semaines. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, à 21 jours, elles reçoivent dans leur nourriture deux molécules qui freinent le système immunitaire, et passent un test de coordination sur rotarod à 40 jours, après un entraînement à 30 jours. Le traitement dure jusqu'à la mise à mort, décidée par une grille de score : une perte de poids de plus de 20 %, une détresse respiratoire ou une mobilité fortement réduite suffit à atteindre le seuil de 3 points. Le porteur mesure l'efficacité au retard d'apparition des signes cliniques, et garde donc les souris en vie jusqu'à ce que leur état franchisse ce seuil.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques selon la grille de points suivante: Perte de poids 20% = 3 points; Détresse respiratoire = 3 points; Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront sacrifiées (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

Une souris, un rat ou un hamster immobile, au poil hérissé ou au dos courbé est mis à mort sur-le-champ, et une perte de plus de 20 % du poids en trois jours, associée à d'autres signes, conduit à la mise à mort ou à une adaptation de la dose. Au total, 4 750 rongeurs vont être utilisés (2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés), tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir de quatre ou six semaines d'âge et jusqu'à 34 semaines, ils reçoivent des régimes hypercaloriques, parfois avec des boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, des traitements une à deux fois par jour et trois prises de sang, puis passent une échographie du cœur et 24 heures isolés sur grille en cage métabolique. Ces régimes doivent permettre de tester des molécules contre l'obésité, le diabète ou la stéatose hépatique. Le porteur retient le hamster pour l'alcool parce qu'il en "consomme spontanément", et invoque la hausse de la consommation pendant les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 34 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

1250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intrapéritonéale des prélèvements biologiques humains ou animaux pour isoler et collectionner des souches de toxoplasme, puis sont tuées pour récupérer les tissus où le parasite s'est enkysté. Le porteur indique surveiller les signes d'infection dans les 72 heures et ne traiter qu'en cas de signes limites, l'infection restant le plus souvent asymptomatique. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire n'atteint pas la même sensibilité et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative in vitro" à la souris.

Objectifs

La toxoplasmose est une parasitose dont la prévalence chez l’Homme, en France, est d’environ 40% dans la population générale. Il s’agit dans plus de 80% des cas d’une infection asymptomatique et bénigne. Plus rarement, cette infection peut revêtir un caractère de gravité, et un traitement médicamenteux peut être mis en place pour limiter les conséquences de la toxoplasmose. Ainsi, chez la femme enceinte,l’infection par ce parasite peut être responsable d’une toxoplasmose congénitale par atteinte du foetus (transmission transplacentaire). Le diagnostic de toxoplasmose congénitale réalisé à la naissance, repose sur la sérologie et l’analyse du placenta et du sang de cordon/sang de bébé. Seule la présence formelle du parasite dans ces liquides biologiques, par biologie moléculaire, permet de déterminer si les prélèvements sont positifs. Dans ce cas, ces prélèvements (liquide amniotique, placenta ou sang de cordon/bébé) venant de toute la France, sont envoyés pour isolements des souches. Le modèle murin, sensible à l’infection par le toxoplasme est donc le plus approprié et le seul disponible, il n'y a pas d'alternative in vitro. Dans le cadre de la recherche, l’inoculation par voie intrapéritonéale à la souris, d’échantillons biologiques permet aussi l’isolement et la collection des souches de toxoplasmes en vue de leur caractérisation phénotypique et génotypique.

Bénéfices attendus

Cette caractérisation contribue à l’étude de la biodiversité du parasite et permet une recherche fondamentale (identification de marqueurs de virulence, de résistance thérapeutique…).

Procédures

Inoculation intrapéritonéale, 2 fois, 30sec - prélèvement à la queue, 1 fois, 1minute

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, l’infection peut être suspectée sur des signes d’infection précoce (poils hérissés, gonflement de l’abdomen).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour la récupération des tissus où se sont enkystés les parasites. La réutilisation ou l'adoption de l’animal n'est pas envisageable du fait du traitement préalable. Toutes les souris sont euthansiées.

Remplacement

Le modèle murin est le plus sensible à l’infection par le toxoplasme et est le seul actuellement disponible. Des essais antérieurs au sein du laboratoire n'a pas permis d'obtenir d'isolement de souches par culture. Cependant, des essais supplémentaires sont continuellement effectués pour améliorer la sensibilité de culture cellulaire permettant l'isolement des souches . A l'heure actuelle, il n'y a donc pas d'alternative in vitro.

Réduction

Suite à une comparaison d’efficacité, nous avons transposé ce protocole de diagnostic clinique pour l’isolement de toxoplasmes à partir d’autres prélèvements (animaux ou humains) puis optimisé le protocole en réduisant le nombre de souris nécessaire pour l’obtention de souches de toxoplasmes : le nombre de 2 ou 4 souris par prélèvement permet une optimisation entre la diminution du nombre de souris et la sensibilité de l’isolement. Il n' y aura pas de tests statistiques d'effectuer. Deux animaux pour les petits de volumes de prélèvements et 4 animaux pour des plus gros volumes.

Raffinement

Une surveillance accrue est effectuée dans les 72 heures après inoculation. En cas de signes cliniques limites (points limites) 72h après l’inoculation, laissant supposer une atteinte toxoplasmique, un traitement traitement anti-toxoplasmique sera institué. Ce traitement permet une amélioration des signes cliniques dans les jours suivants. Dans la majorité des cas, le traitement n'est pas nécessaire car il n'y a pas d'apparition de signes cliniques (asymptomatique). Le traitement anti-toxoplasmiques reste exceptionnel. Des copeaux et rouleaux de carton sont ajoutées dans la cage.

Choix des espèces

L’isolement à partir de prélèvements (animaux ou humains) pour l’obtention de souches de toxoplasmes ne peut être que la souris. La comparaison avec la culture cellulaire n'a pas permis d'avoir une sensibilité comparable que l'inoculation à l'animal. Souris de 8 semaines 20g, à ce stade de développement le système immunitaire est bien en place et fonctionnel.

743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs leur sont implantées dans le flanc ou les poumons, suivies de traitements par virus oncolytique et d'injections intrapéritonéales répétées jusqu'à 36 fois, les tumeurs pulmonaires pouvant gêner la respiration. Fortement immunodéprimées, ces souris humanisées sont plus sensibles aux infections, ce que le porteur décrit comme un phénotype dommageable. Il veut induire des structures lymphoïdes dans les tumeurs pour améliorer le pronostic des patients et affirme qu'aucune alternative, pas même les organoïdes, ne remplace le modèle animal.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu en immunothérapie. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives favorables chez les patients atteints de cancers. Il a, récemment, été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées par un virus capable d’infecter la tumeur (virus dit oncolytique), à induire la formation de TLS dans les tumeurs, dans des modèles de souris présentant un système immunitaire humain afin de se rapprocher au mieux de la physiopathologie humaine.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de manipuler les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) à visée thérapeutique afin de les induire chez des patients atteint d’un cancer présentant peu ou pas de TLS, et d’augmenter ainsi leur pronostic vital. Pour répondre à cette problématique, il nous est impossible d’avoir recours à d’autres alternatives que les modèles animaux. En plus de nous permettre d’établir une nouvelle stratégie thérapeutique des cancers, les résultats issus de ce projet nous permettront d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la formation de TLS. Si un effet probant est observé, le projet pourra se poursuivre vers un développement clinique.

Procédures

Des tumeurs seront implantées dans le flanc ou dans les poumons des souris par injection de cellules tumorales en sous-cutané ou intraveineuse, respectivement. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. L’administration du traitement par voie intra-tumorale ou par voie intraveineuse sera aussi réalisée sur souris vigile, à une seule reprise, et ne durera pas plus d’une minute. L’administration du traitement par instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale sous-cutanée se fera pas mesure du volume tumoral au pied à coulisse, 2 fois par semaine, sur souris vigile, et ne durera que quelques secondes. Les injections intrapéritonéales d’un inhibiteur de point contrôle immunitaire seront réalisées 3 fois par semaines en alternant de côté, sur souris vigiles et ne dureront pas plus d’une minute. Les souris seront systématiquement manipulées sous un poste de sécurité microbiologique (PSM) en raison de leur forte immunodéficience (sensibilité élevée aux infections).

Impact sur les animaux

La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales et des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 2 reprises par animal et par procédure. Il en est de même pour l’injection intrapéritonéale de l’inhibiteur de point de contrôle immunitaire qui aura lieu au maximum 36 fois par animal. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires pourra occasionner une gêne respiratoire. Les tumeurs métastasées sont rarement observées. Cependant, si elles surviennent, elles pourraient entraîner de la douleur, perturber le fonctionnement des organes, causer des complications physiologiques, altérer l'alimentation et la nutrition, ainsi qu'impacter la qualité de vie des animaux concernés. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires. Les souris utilisées ont un phénotype dommageable en raison de leur forte immunodépression, elles sont donc plus sujettes aux infections et peuvent être plus sensibles à certains traitements que des souris immunocompétentes.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.

Remplacement

Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, systèmes vasculaire et lymphatique) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Différents prélèvements seront faits sur les animaux destinés à être euthanasiés, afin d’évaluer la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Du fait de la variabilité de la croissance tumorale entre les animaux, particulièrement élevée dans les modèles de souris humanisées, nous utiliserons 12 souris par groupe traité et nous réduirons le nombre de souris à 10 dans le groupe non traité. Nous répéterons jusqu’à trois fois les expériences car la reproductibilité des résultats est une question centrale dans les bonnes pratiques des laboratoires. Tous les groupes expérimentaux seront réalisés simultanément pour réduire le nombre d’animaux contrôles dans le projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nous utiliserons au maximum 743 animaux dans ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure a un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle et conforme à la réglementation (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture libitum et eau par abreuvage automatique). Compte tenu de leur caractère immunodéficient, les souris seront maintenues dans un environnement stérile (cages individuellement ventilées, change sous hotte, aliment/litière irradiée, autoclavage, etc.). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. La présence de points limite définis permettra de stopper les expériences en cas d’atteinte de ceux-ci. Les actes d’instillation intranasale seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris humanisées représentent le seul modèle d’étude préclinique d’une réponse immunitaire de cellules humaines, in vivo. De plus, les propriétés oncolytiques des virus de la vaccine sont nettement supérieurs dans les cellules cancéreuses humaines que dans les cellules cancéreuses murines. Un tel modèle permet d’apprécier à la fois les propriétés oncolytiques directes des virus oncolytiques sur des tumeurs humaines, la capacité d’un armement avec des molécules humaines à stimuler les défenses immunitaires anti-tumorales humaines et, d’appréhender la pharmacocinétique des virus face à un système immunitaire humain afin de mieux extrapoler les effets thérapeutiques du traitement à l’homme. Les souris humanisées seront reçues à l'âge de 22 semaines, puis mises en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. La tranche d’âge des souris a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte. Les expériences, visant en partie à mesurer la survie des animaux en réponse à un traitement, dureront au maximum 3 mois ou jusqu’à l’apparition de signes de souffrance, dans le respect de la règle des 3R.