Souris
Mise en place d’un modèle murin avec un microbiote intestinal contrôlé et un système immunitaire humain permettant d’évaluer des thérapies anti-tumorales
- Recherche appliquée
- Cancers
1362 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de modéré à sévère. Elles reçoivent des antibiotiques puis une transplantation de flore intestinale par gavage répété, une suppression de leur système immunitaire, une greffe de cellules immunitaires humaines et de cellules tumorales, avant l'administration de traitements anticancéreux. Le porteur indique que ces manipulations peuvent provoquer diarrhées et effets délétères mal connus, et que des souris sont tuées lorsque la tumeur ou le traitement entraîne des atteintes, ou pour des prélèvements incompatibles avec la survie. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet d'évaluer une thérapie en tenant compte à la fois du microbiote et d'un système immunitaire humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mettre en place un modèle de cancer chez la souris avec un microbiote intestinal contrôlé (= « flore intestinale ») et un système immunitaire de type "humain" permettant d'évaluer de nouveaux traitements anticancéreux à visées humaines.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices attendus sont d’évaluer le lien entre la composition du microbiote intestinal et l'efficacité des thérapies, en particulier des immunothérapies dans la lutte contre le cancer. A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments et stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers.
Procédures
Modification du microbiote des animaux (traitement de 1 semaine par antibiotiques), change des cages durant la durée du traitement par antibiotique (1 fois par jour pendant 2 à 8 jours), transplantation d’un nouvelle flore intestinale par gavage oral (durée du gavage inférieure à 1 min, à raison 3 fois par semaines pendant 3 à 8 semaines), suppression du système immunitaire d’origine (durée du protocole : 1 semaine maximum avec des injections régulières de durée inférieures à 1 min), greffe de cellules immunitaire humaine (durée de l'injection inférieure à 1 min) et greffe de cellules tumorales (durée de l'injection inférieure à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections). En cas de prélèvement de sang (durée de moins de 2min).
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention pour suivi des signes cliniques, administration des anesthésiques, analgésiques et des différents traitements par différentes voies (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille). Stress lié au change des cages. A noter que l’implantation d’un nouveau microbiote et suppression du système immunitaire d'origine pourra conduire à des désagrément intestinaux (ex: diarrhées). De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Egalement, le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas d’autres méthodes (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle thérapie anticancéreuse en considérant à la fois la composition du microbiote intestinal et un système immunitaire humain. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe, 10 à 12 animaux, est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Des analyses statistiques seront effectuées à chaque étape du projet afin de selectionner et valider des protocoles optimaux, de façon objective. Un nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe sera utilisé pour tester, sélectionner et valider différents protocoles expérimentaux.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période postopératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • Le suivi de la température et l'utilisation d'une chambre de réveil chauffée, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales • Un hébergement en groupe mais sous isolateurs ou en portoirs ou en cages ventilés (permettant un hébergement « sous bulles ») afin de réduire drastiquement les risques de complications pour les animaux à chaque étape du projet.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux jeunes adultes, implantation d'un microbiote (taille des animaux et atteintes de la maturité sexuelle) Animaux juvéniles, pour l'implantation d'un système immunitaire humain (tel que décrit dans la littérature) Animaux adultes, pour l'implantation des cellules tumorales (dès lors que le système immunitaire humain sera implanté / implantation entre 6 à 14 semaines)
Etude du rôle de l’intestin contre les infections aux Escherichia Coli adhérentes et invasives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré. Elles subissent gavages et injections répétés puis une infection par des Escherichia coli associées à la maladie de Crohn, qui provoque douleur intestinale et perte de poids. Le porteur indique que seuls les mâles sont utilisés et que les femelles et le surplus d'élevage sont tués, l'ensemble des souris étant tué pour prélever les organes. Il affirme que la complexité des interactions entre pathogène, hôte et microbiote justifie le recours à l'animal, tout en reconnaissant avoir mené des tests in vitro sur l'effet du fer et du fucose.
Objectifs
La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique de la paroi intestinale. Cette maladie s’accompagne d’infection par de nombreux pathogènes du microbiote dont les bactéries adhérente, invasive Escherichia Coli. Cependant, les facteurs déclenchant la virulence et l’effet délétère de ces pathogènes n’est toujours pas connu. Il est connu que le fer et le fucose sont des facteurs de virulences pour ces bactéries adhérente, invasive Escherichia Coli. Or ces deux nutriments sont essentiels pour l’Homme et sont absorbé au niveau intestinal, lieu de colonisation de ces bactéries pathogènes. L’objectif de ce projet est de déterminer si une mauvaise prise en charge du fer et du fucose par l’hôte contribuerait à la virulence des bactéries adhérente, invasive Escherichia Coli.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est la compréhension des mécanismes de compétitions nutritionnelle pour le fer et le fucose entre les pathogène et l’hôte et dans un plus long terme proposer une solution nutritionnelle pour les patients atteints de la maladie de Crohn afin de limiter le développement des pathogènes intestinaux.
Procédures
Sur animaux vigiles : identification et génotypage (10 secondes) + une à 2 contentions de 20 secondes pour le gavage/jour (maximum 2 gavages par jour et 5 gavages au total) + Contention pour injection en sous-cutanée (15 secondes par souris (contention + injection)). Sur animaux anesthésiés : Prélèvement sanguin (30 secondes par souris)
Impact sur les animaux
L’ingestion des bactéries Escherichia coli pathogène est nocif pour la souris car induit une douleur intestinale chez la souris ainsi qu’une perte de poids. De plus, les souris subiront un stress lors de de l’injection d’analgésique, de la contention et du gavage.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses concernant les procédures d'infection. Pour les animaux générés lors de l'élevage et qui ne peuvent être inclu dans les procédures d'infection, ils seront mises à mort. En effet, dans ce projet, seul les mâles seront utilisées.
Remplacement
Les modèles animaux sont développés ici dans le but d'obtenir des modèles pathologiques d'infection. Les processus d'infections sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux acteurs : le pathogène, l'hôte et son microbiote qui communiquent entre eux. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, des tests in vitro montrant l’influence du fer et du fucose sur les bactéries adhérentes, invasives Escherichia Coli ont été effectués.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par différents tests statitiques adaptés aux comparaisons effectuées. De plus, nous effectuons une étude pilote qui permet de déterminer la cinétique et la dose de fucose à utiliser, elle permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les gestes techniques réalisés sont maitrisés par notre équipe. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Le raffinement comprend l’utilisation d’antalgiques en cas de souffrance. Il comprend aussi l’utilisation d’anesthésiques (avant prélèvement sanguin) et d’analgésiques (30 minutes avant le prélèvement sanguin). De plus, pour les gavages des souris, nous utiliserons des canules adaptées à l'âge et à la physiologie de la souris (en inox). L'application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectué. Les souris seront suivies et scorées tous le long des procédures. Les souris sont hébergés dans un environnement avec accès à la nourriture et l'eau ad libitum ainsi qu'un milieu enrichie (maison, coton pour nidification).
Choix des espèces
La souris (Mus muculus) est un modèle de choix pour les études des interactions hôte-pathogènes. Seule cette espèce possède des modèles où les gènes d'intérêts peuvent être suppriumé permettant l’étude de ce gène au cours de l'infection. De plus ce modèle d’infection est représentatif de la physiopathologie chez l’homme et récapitule ce qui est montré chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Les souris utilisées seront âgées de 8-10 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal mature sans impact du sevrage au niveau du microbiote et du contenu en nutriment dans la lumière intestinale.
Régulation du renouvellement et intégrité épithéliale dans l’homéostasie intestinale des mammifères
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent différentes molécules par injection quotidienne pendant trois à cinq jours ou par voie orale, pour étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal. Le porteur ne décrit que des désagréments brefs, stress de contention et sensibilité locale de quelques minutes, un contraste avec la gravité modérée déclarée pour le projet. Il indique utiliser en priorité des organoïdes in vitro mais affirme qu'une analyse in vivo reste nécessaire pour tenir compte du microenvironnement de l'organe.
Objectifs
L'épithélium intestinal est un tissu qui se régénère rapidement et qui résiste aux agressions tout en maintenant sa fonction de barrière tout au long de la vie adulte. Bien que nous connaissions certains types de cellules qui le composent, nous ne savons pas comment ces cellules sont capables de se renouveler sans perturber l'intégrité du tissu. Le but de ce projet est d'étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal chez les souris. Nos principaux objectifs sont de caractériser le comportement de types de cellules intestinales rares (cellules de « goblet » et « tuft ») et de comprendre les mécanismes de renouvellement et d'intégrité de l'épithélium dans l'homéostasie intestinale.
Bénéfices attendus
Étant donné le rôle essentiel de l'homéostasie épithéliale dans la (patho)physiologie, la recherche proposée aura de vastes implications et applications dans un certain nombre de domaines. L'extrapolation des données à différents contextes physiologiques ou pathologiques, notamment les troubles inflammatoires de l'intestin, le vieillissement et le cancer, sera déterminante pour la recherche fondamentale et appliquée. • En ce qui concerne la recherche fondamentale, l'identification des mécanismes impliqués dans l'établissement et le maintien du renouvellement épithélial aidera à comprendre le développement et la fonction normale des organes, ainsi que la façon dont la dérégulation de ce processus contribue aux troubles du développement, au vieillissement et, en particulier, au cancer. • Comprendre comment le nombre homéostatique de cellules est préservé dans l'intestin des mammifères est essentiel pour comprendre comment la pathologie peut se produire - le dérèglement du renouvellement épithélial, que ce soit par une prolifération excessive, une migration aberrante ou une extrusion, pourrait conduire au développement de tumeurs. Ainsi, l'élucidation de la manière dont ces processus sont régulés et couplés pour atteindre l'équilibre sera d'un intérêt particulier pour la communauté médicale, qui pourra également bénéficier de nos systèmes modèles et de nos technologies. • L'intégrité de l'épithélium est essentielle pour sa fonction de barrière, qui consiste à isoler le microbiome gastro-intestinal de l'environnement interne ; si cette fonction est compromise, elle peut conduire ou contribuer à une maladie inflammatoire. La découverte des voies de signalisation qui sont activées en réponse à des niveaux physiologiques ou pathologiques de stress mécanique sera utile pour le développement et la thérapie des maladies. • Les études sur l'intégrité épithéliale et la perméabilité de l'intestin sont bénéfiques pour l'industrie pharmaceutique ; de nouveaux médicaments pourraient être testés sur nos modèles ex vivet in vitro, afin d'évaluer leur sécurité avant de les tester sur des modèles animaux et des humains.
Procédures
Les animaux recevront différentes molécules par deux voies d'administration différentes, soit par injection, une fois par jour pendant 5 secondes pendant 3 à 5 jours selon la molécule, soit par administration orale d'une molécule une fois pendant 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 30 secondes. Certaines injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour recueillir les tissus.
Remplacement
Pour compléter et réduire les études in vivo, nous avons développé des modèles d'organoïdes intestinaux en 2D ou 3D. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo. Toutefois, ces études in vitro devront être complétées par une analyse in vivo pour étudier l'influence du microenvironnement de l'organe et du tissu sur la biologie de l'épithélium intestinal.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, sur la base de notre expérience antérieure et de tests statistiques, les analyses seront réalisées sur 3 expériences indépendantes, avec toutes les souris en double, ce qui donne une fourchette de 12 à 24 souris nécessaires au total pour 3 expériences indépendantes. Ceci constitue un minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables.
Raffinement
La surveillance renforcée permettra une vigilance accrue pendant l'expérimentation et la détection des atteintes des points limites. Les souris seront quotidiennement observées et pesées par du personnel compétent. Des grilles de scoring seront utilisées pour suivre les animaux en expérimentation afin de mettre en place, lorsque nécessaire, des mesures pour atténuer la douleur, l'angoisse ou le stress.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. Les modèles transgéniques proposés ont déjà été utilisés avec succès pour étudier le rôle du cytosquelette et des forces mécaniques dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Ces modèles nous permettront d'évaluer la contribution des forces mécaniques dans la régulation de l'homéostasie intestinal chez l'adulte, ce qui devient un sujet d'intérêt majeur dans le domaine de la recherche, ainsi que pour la communauté biomédicale. Nous utiliserons des souris adultes (2-4 mois) pour étudier l'homéostasie épithéliale dans l'intestin des mammifères adultes.
Les cellules ganglionnaires intrinsèquement photosensibles de la rétine (ipRGCs) et l’agressivité : effet direct de la lumière bleue ?
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 22
Autres rongeurs : 65
843 rongeurs, souris, rats et rats africains, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils subissent des tests d'agressivité où les affrontements provoquent morsures et griffures, des injections dans l'œil sous anesthésie, une chirurgie du crâne et des injections quotidiennes pendant trois semaines, pour tester un effet direct de la lumière bleue sur le comportement agressif. Le porteur indique que la lumière peut modifier l'anxiété et l'agressivité et que les injections répétées causent inflammation, douleur et perte de poids, les animaux étant tués pour prélever le cerveau. Il présente le rat africain comme un modèle diurne "plus représentatif de l'humain" et justifie l'usage d'animaux par l'absence de logiciel reproduisant fidèlement le cerveau.
Objectifs
La lumière influence en profondeur la physiologie et les comportements des organismes vivants. Chez les mammifères, en plus de permettre la vision, la lumière influence de nombreuses fonctions biologiques via des cellules spécifiques sensibles à la lumière, localisées dans la rétine et activées par la lumière bleue: il s’agit des cellules mélanopsinergiques. Les cellules mélanopsinergiques projettent dans différentes régions du cerveau et permettent la régulation par la lumière de la physiologie et du comportement selon 2 mécanismes principaux : 1, la synchronisation de l’ensemble des fonctions biologiques avec le cycle jour/nuit, un effet qui implique l’horloge biologique centrale . 2, des effets directs sur de nombreux comportements via la projection des cellules mélanopsinergiques vers d’autres parties du cerveau. La société moderne vit sous une illumination quasi-permanente, en particulier à la lumière bleue (LED, smartphones, écrans d’ordinateurs). Il est connu que l’exposition excessive à ces lumières enrichies en bleu, en particulier en fin de période d’activité (soirée), peut provoquer des troubles des rythmes biologiques du sommeil, et divers effets comportementaux associés, notamment une augmentation de l’agressivité. Dans ce projet nous posons la question suivante : est-ce que la lumière bleue peut exercer un effet direct sur le comportement agressif, indépendamment d’une altération des rythmes biologiques? En effet, les projections des cellules mélanopsinergiques atteignent notamment les structures du cerveau impliquées dans le contrôle de l’agressivité. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif chez des modèles animaux 2) identifier les populations cellulaires du cerveau impliquées dans cet effet de la lumière bleue et 3) comprendre le rôle de structures spécifiques contrôlant l’agressivité dans ces effets sur le comportement agressif. Afin d’exclure un effet mettant en jeu l’horloge biologique centrale, l’exposition à la lumière bleue aura lieu spécifiquement à des créneaux de jour, auxquels elle ne peut pas entrainer de décalage de cette horloge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer de nouvelles connaissances sur les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif. Ces connaissances pourraient permettre d’élaborer de nouvelles stratégies vis-à-vis de l’éclairage/exposition à la lumière (intensité et spectre) dans les animaleries, afin de susciter au minimum les comportements agressifs. Les résultats obtenus seront aussi informatifs quant aux potentielles nuisances (facilitation d’un comportement agressif) induites par l’éclairage à dominante bleue chez l’humain. Ceci pourrait permettre de définir de nouvelles normes d’exposition lumineuse (environnements collectifs, agressivité pathologique) afin de diminuer l’expression des comportements hostiles. Enfin, en plus de renforcer les connaissances actuelles sur le comportement agressif de la souris, ce projet permettra aussi d’obtenir des informations sur le comportement d‘un modèle peu connu à ce jour le rat africain. Ce dernier pourrait donc représenter un modèle d’agressivité ainsi qu’un modèle des effets de la lumière bleue sur la physiologie et le comportement, plus représentatif de l’humain que le modèle de souris.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à un examen de l’œil d’une durée de 20 minutes. Un mois plus tard il sera soumis à trois tests comportementaux d’une durée de 1 à 5 minutes. Les animaux seront ensuite soumis à un nouvel examen de l’œil. Deux semaines plus tard ils recevront une injection dans l’abdomen d’une molécule qui empêche les effets de la lumière bleue sur l’organisme (durée injection 30 secondes). Ensuite ils seront soumis à un test comportemental d’une durée comprise entre 1 et 5 minutes. Un groupe d’animaux recevra une injection dans l’œil sous anesthésie locale et générale. Un autre groupe subit une chirurgie du crâne d’environ 45 minutes. Après 2 semaines de repos les animaux reçoivent une injection journalière dans l’abdomen pendant 3 semaines. A l’issue ils seront soumis à un test comportemental d’une durée de 1 à 5 minutes. Avenant: Les tests comportementaux seront répétés 3 fois maximum avec un intervalle de 10 jours entre les tests afin de laisser l’animal se reposer. Avenant : les animaux de la lignée Maoa KO subissent un prélevement de la queue environ 6 jours après la naissance entrainant une douleur légère et temporaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’impact de la lumière bleue peut changer le niveau d’anxiété et d’agressivité des animaux ce qui est l’objet de la question posée. 2) les tests comportementaux peuvent induire un stress ainsi que des blessures liées aux affrontements lors d’un des tests (plaies dues aux morsures et griffures). 3) les animaux sont soumis à différentes injections causant des désagréments communs (inflammation, douleurs, stress, risque infectieux, anxiété, perte de poids) ou spécifiques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de récupérer leurs cerveaux qui serviront pour analyse.
Remplacement
La première partie de projet consiste à obtenir des informations sur le comportement des animaux en réponse à une lumière bleue. Il n’existe pas de moyens de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour obtenir une réponse comportementale. Les deuxièmes et troisièmes parties consistent à obtenir des informations sur la chimie et le fonctionnement du cerveau animal. Or à l’heure actuelle aucun moyen alternatif (ex : logiciels informatiques) ne permet de représenter assez fidèlement le cerveau animal pour obtenir de telles informations.
Réduction
Une approche statistique a été utilisée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats fiables et robustes. Ce nombre est également appuyé par des études précédentes.
Raffinement
Les animaux ont à leur disposition du matériel pour pouvoir nidifier et ronger. Un tunnel en plexiglas est également ajouté à la cage. L’hébergement des animaux est optimisé afin de diminuer les affrontements au sein d’une cage. Les animaux isolés physiquement peuvent néanmoins se voir, s’entendre et se sentir. Avant chaque procédure les animaux participent à un entrainement afin de les habituer au contact avec l’humain et à la procédure. Toute procédure invasive potentiellement douloureuse est réalisée sous traitement antidouleur. L’'état général de l'animal ainsi que celui de chaque œil seront vérifiés quotidiennement et la souffrance éventuelle entrainée par les procédures est évaluée grâce au comportement et à l’aspect physique des animaux. En cas de souffrance, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et un traitement requis mis en place. Des points limites onté été établis permettant l'arrêt des procédures et ainsi réduire la souffra,ce animal. Une étude préliminaire est mise en place afin d’optimiser les données obtenues tout en minimisant l’impact sur les animaux.
Choix des espèces
Afin d’observer des réponses comportementales et des effets de la lumière sur l’œil et le cerveau il est indispensable d’utiliser des animaux. La connaissance approfondie de la génétique de la souris permet l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Cela donne accès à des outils indispensables pour l’étude des fonctions des structures du cerveau impliquées dans le comportement agressif. Le rat africain est un modèle animal diurne correspondant au mode d’activité de l’humain. Il possède également une rétine dont la composition est proche de la rétine humaine. Des informations comportementales complémentaires pertinentes pour l’humain seront alors collectées. L’agressivité des rongeurs semble décliner avec l’âge a l’instar des capacités motrices. Pour ces raisons nous avons choisi de jeunes adultes (2-4 mois). Cela permet d’utiliser des individus avec un comportement agressif encore développé. Nous utilisons également une tranche d’âge resserrée afin de s’affranchir des trop fortes variations d’agressivité liées l’âge.
Étude du rôle des comorbidités liées au vieillissement dans la réparation post ischémique dans un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois d'un régime induisant surpoids et troubles métaboliques, elles subissent un test au glucose puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt et un jours. Le porteur indique que le modèle provoque douleur peropératoire, perte sensorimotrice, perte de poids et déshydratation, les souris étant tuées pour prélever les tissus. Il affirme que l'étude de l'ischémie cérébrale dans ce contexte métabolique ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et présente les retombées cliniques comme applicables à l'humain.
Objectifs
Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).
Procédures
Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.
Impact sur les animaux
L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques
Remplacement
Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.
Suivi du lignage des cellules souches et tumorales dans la glande mammaire in vivo en temps réel
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent des tumeurs mammaires apparaissant dès cinq semaines, reçoivent une injection de tamoxifène puis une fenêtre d'imagerie posée par chirurgie sous la peau, avant des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer huit à dix heures. Le porteur indique une douleur et une perte de poids possibles après la chirurgie et prévoit d'utiliser les souris avant que les tumeurs n'atteignent les points limites. Il affirme avoir développé des organoïdes in vitro mais conclut qu'aucun modèle ne reproduit l'hétérogénéité tumorale et que la souris reste "essentielle" pour tracer les cellules dans la tumeur.
Objectifs
Le cancer est une maladie progressive et son évolution est associée à l'acquisition graduelle de nouvelles propriétés par les cellules. Il en résulte une grande hétérogénéité, dont la complexité est amplifiée par les interactions entre les cellules cancéreuses et leur environnement. Malgré les récents progrès, l'identité et le comportement des cellules tumorales au cours de la progression des cancers restent mal compris. Certains cancers émergent de cellules différenciées, d’autres à partir de cellules souches. Les cellules différenciées assurent la fonction d’un organe alors que les cellules souches sont requises pour la régénération tissulaire. Nous proposons un projet original qui devrait permettre de démêler l'hétérogénéité des tumeurs et découvrir quelles cellules sont à l'origine du cancer du sein. Notre objectif principal est d’étudier les relations hiérarchiques entre les différentes cellules à l’origine des tumeurs du sein et les mécanismes contrôlant leur plasticité, qui, une fois dérégulés, sont responsables de la formation du cancer. A ce jour, la plupart des études des cellules souches adultes sont basées sur des expériences sur des échantillons fixés, ce qui empêche de détecter des changements dans la localisation et la dynamique des cellules et de suivre le destin de ces cellules au cours du temps. Afin d’étudier les cellules souches ainsi que les premières cellules tumorales au cours du temps, nous caractériserons le comportement dynamique des cellules souches par imagerie en temps réel in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet va nous permettre d’étudier in vivo la dynamique des cellules et la compétition entre les différents clones au cours des premières étapes du développement tumoral. Tout d’abord, nous étudierons la prolifération et la migration des cellules qui changent leur destinée après l’activation d’un oncogène. Dans un second temps, nous étudierons la compétition entre différentes cellules au début du développement tumoral. Ce projet apportera des connaissances fondamentales concernant les premières étapes du développement tumoral et révèlera quelles mutations rendent les cellules plus compétitives et performantes au sein de la tumeur. . Ce projet nous permettra de visualiser les comportements dynamiques des différentes cellules tumorales et de leur progéniture clonale que nous suivons par traçage de lignage pendant le développement tumoral. Ceci sera couplé à d’autres analyses nous permettant d’identifier les cellules qui prennent part au développement de tumeurs mammaires. Ces résultats pourront à terme permettre d’identifier les cellules à l’origine des tumeurs dans des tumeurs humaines.
Procédures
Afin d’induire l’activation de l’enzyme permettant la visualisation par fluorescence des cellules d’intérêt dans nos modèles, une injection unique de tamoxifène non toxique par voie intra-péritonéale sera réalisée sur tous les animaux (durée du geste inferieur à 10 sec). Pour pouvoir suivre le devenir des cellules tumorales par imagerie, une petite incision sera réalisée au niveau de la peau des animaux anesthésiés pour y glisser une fenêtre d’imagerie (durée de la chirurgie 40 min). L’ensemble des animaux sera anesthésié minium 24h après la chirurgie pour être imagés. Pour une partie des animaux, une session unique d’imagerie sera faite, qui durera entre 8 et 10h et les animaux seront mis à mort à la fin de la session d’imagerie. L’autre partie des animaux aura plusieurs séances courtes d’imagerie (durée de l’anesthésie max 2h). Les séances d’imagerie seront réalisées à raison de 1 à 2 séances par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés développent à l’âge de 5 semaines des tumeurs palpables qui deviennent invasives à l'âge de 13 semaines et peuvent éventuellement former des métastases pulmonaires à l'âge de 16 semaines environ. Les animaux seront utilisés de 5 semaines à 10 semaines maximum évitant le développement de tumeurs atteignant les points limites. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée). À la suite de la chirurgie, des douleurs post-opératoires et une perte de poids peuvent apparaitre dans la semaine qui suivant la chirurgie. Pour éviter les infections, une antibioprophylaxie sera mise en place. L’imagerie en elle-même est indolore mais nécessite une anesthésie générale pour permettre la contention de l’animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au fil des ans, notre équipe a déployé beaucoup d'efforts pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de l'homéostasie tissulaire. Cependant, les cellules mammaires modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches mammaires. De plus, les animaux seront essentiels pour tracer les cellules souches cancéreuses au sein de la tumeur, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler l’hétérogénéité cellulaire tumorale.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, plusieurs types d'informations seront obtenues à partir du même animal. De plus, lorsque c’est possible, différents tissus seront prélevés sur le même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées. L’imagerie intravitale permet le suivi longitudinal d’un même animal évitant ainsi de mettre à mort un lot d’animaux à chaque point d’analyse souhaité.
Raffinement
Les animaux sont manipulés le moins possible. Il est important de noter que les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour des projets spécifiques. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. Un examen complet, au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution), des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie (voir grille de score). La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et effectuée par une personne formée en chirurgie dans des conditions d’asepsie optimisées qui limiteront les nécroses tissulaires, les inflammations et les infections. L’animal sera opéré dans une pièce dédiée, calme, bien éclairée, avec peu de passage. Un cocktail analgésique et antibiotique sera injecté en pre-opératoire et post-opératoire.
Choix des espèces
L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la tumorigenèse. De plus, la souris est un mammifère, donc le modèle animal de laboratoire le plus adapté permettant l’analyse de la glande mammaire et des tumeurs mammaires. Le suivi des lignages des cellules marquées pendant le développement des tissus sera réalisé pendant la puberté et chez l’adulte. Pour l’analyse des tumeurs mammaires, les souris utilisées auront entre 5 et 10 semaines (âge compatible avec le développement spontané des tumeurs mammaires dans notre modèle).
Rôle d’un facteur de croissance dans le vieillissement vasculaire pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant maintenue sous anesthésie jusqu'à la mort. Elles sont placées 21 jours dans un caisson à 9 % d'oxygène pour induire une hypertension pulmonaire, ou reçoivent de l'élastase dans la trachée par chirurgie pour provoquer un emphysème, avec mesure de la pression cardiaque et de la fonction pulmonaire sous anesthésie. Le porteur indique une perte de poids modérée et un stress liés aux manipulations, ainsi qu'une douleur légère au poinçonnage de l'oreille servant à l'identification. Il mène en parallèle des cultures de cellules humaines mais affirme que la souris génétiquement modifiée reste "incontournable" pour étudier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier".
Objectifs
Le vieillissement des vaisseaux sanguins avec diminution du nombre de capillaires est un élément clé du vieillissement de l'organisme, ce qui réduit l'apport de nutriments et d'oxygène aux tissus. Ce phénomène semble lié à la diminution d'un facteur synthétisé par les cellules endothéliales des vaisseaux. L’action de ce facteur serait perturbée par une protéine. En absence de ce facteur sécrété par les cellules endothéliales, celles-ci vieillissent plus rapidement, avec un arrêt de leur multiplication et la libération de facteurs nocifs pour le poumon. Il a été démontré qu'un nombre élevé de cellules endothéliales vieillissantes est associé au vieillissement prématuré du poumon et à plusieurs maladies pulmonaires. Notre objectif est de comprendre comment l'absence de ce facteur contribue à ce vieillissement prématuré entrainant des maladies comme l'hypertension et/ou l'emphysème pulmonaires. Pour cela, nous étudierons la protéine, le vieillissement des cellules endothéliales pulmonaires, la fonction pulmonaire et la densité des vaisseaux sanguins chez des souris jeunes et âgées, avec ou sans maladies pulmonaires. De plus, nous travaillerons avec des souris génétiquement modifiées pour produire plus du facteur synthétisé par les cellules endothéliales afin de prévenir l’action de la protéine le perturbant, et ainsi protéger les souris du vieillissement prématuré du poumon.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer et de décrire le lien suspecté entre la diminution de l'action du facteur VEGF et le vieillissement des vaisseaux pulmonaires. Nous étudierons ce lien au cours du vieillissement et dans deux maladies, l'hypertension artérielle et l'emphysème pulmonaires. A l’issue de ce projet, nous souhaitons tester le sVEGFR1 comme un marqueur du vieillissement et de la sévérité de la maladie pulmonaire chez des patients atteints d’emphysème.
Procédures
Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. A l'issue de la procédure d'hypoxie, les animaux seront profondément anesthésiés pour la mesure de la pression au niveau du coeur droit. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) par injection dans la trachée sous anesthésie générale lors d'une intervention rapide (5 minutes). Une petite incision à partir de la base du cou est effectuée afin de visualiser la trachée, la souris est maintenue anesthésiée tout au long de l'injection. Une fois le traitement effectué, un point de suture à l’aide d’un fil résorbable sera réalisé. A la fin de la procédure d'injection d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil (Flexivent) durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectées grâce à une sonde. Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (1 seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois), nécessaire à leur identification.
Impact sur les animaux
Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, instillation intratrachéale, Flexivent) peuvent générer un stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cages. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit alors également un stress. Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (un seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois). Cette méthode d'identification peut causer une douleur légère de courte durée.
Devenir
L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (quantification des marqueurs de sénescence, expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
En parallèle des études menées sur la souris, une étude sera portée sur des cellules issues d’échantillons pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. La culture de cellules endothéliales permet d’étudier et de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l’augmentation du VEGF sur des souris avec des maladies pulmonaires, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de ces maladies.
Réduction
Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.
Raffinement
L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris porteuses d'hypertension pulmonaire. Aucune perte de poids supérieure à 10% n'est attendue.
Choix des espèces
Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour étudier l’effet de l'augmentation de cellules vieillissantes chez ces souris mutantes.
Impact d’une exposition aux nanoparticules de dioxyde de titane sur le développement et le fonctionnement des réseaux respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des mères gestantes ingèrent des nanoparticules de dioxyde de titane mêlées à de la pâte chocolatée, et l'activité respiratoire des nouveau-nés est mesurée sans intervention pendant onze jours, pour évaluer l'effet d'une exposition périnatale sur les réseaux respiratoires. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, seulement une légère hausse transitoire de la fréquence respiratoire des petits. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit "la complexité d'un organisme entier" et justifie l'essai par la définition de valeurs limites d'exposition pour l'humain.
Objectifs
Au cours de ces dernières années, le domaine de la nanotechnologie et des nanoparticules a subi une croissance fulgurante. Les propriétés uniques des nanoparticules ont permis de très nombreuses avancées dans les domaines technologiques (informatique, électronique), agroalimentaire, cosmétique ou encore médical. Cependant, du fait de leur taille extrêmement réduite (
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux appréhender les risques, durant la période périnatale, d’une exposition chronique aux nanoparticules de métal, telles que celles présentent dans l’alimentation ou certains produits tels que les médicaments ou encore le dentifrice. Ces travaux sont nécessaires afin de définir des valeurs limites d’exposition pour l’humain et identifier les conséquences de ce type d’exposition sur la mise en place et le fonctionnement des réseaux neuronaux vitaux tels que les centres respiratoires.
Procédures
Les expérimentations auront lieu essentiellement suite à la mise à mort des animaux, ou sur animal vigile qui ne subiront pas d'intervention (mesure de l'activité respiratoire de manière non invasive), durant 5 minutes, de manière quotidienne sur 11 jours. Des groupes d'animaux auront une alimentation normale à laquelle sera ajoutée une dose de pâte chocolatée seule ou associée à des nanoparticules de dioxyde de titane.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs. Les animaux (mères et petits) ne montrent pas de déficit fonctionnel majeurs. Il n’y a pas de surmortalité des petits, pas de modification de leur développement (poids corporel, taille). Il est attendu une légère augmentation de la fréquence respiratoire des petits mais sans conséquence sur leur bien-être. Cette modification de la fréquence respiratoire ayant disparu au 7ème jour post-natal.
Devenir
Mise à mort
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire, ou modéliser la complexité d’un organisme entier. Néanmoins afin de remplacer au maximum l’utilisation d’animaux, nous utilisons un modèle informatique pour prédire la distribution des nanoparticules de dioxyde de titane dans les différents organes.
Réduction
Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèdera pas 12 animaux, c'est à dire le nombre d'échantillon permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine lors de l’étude de l’activité respiratoire chez le nouveau-né. Par ailleurs afin de limiter le nombre d'animaux que nous serons amenés à utiliser, une banque de tissus (cerveau + moelle épinière) sera constituée afin de pouvoir mener ultérieurement des analyses immunohistochimiques complémentaires sans devoir sacrifier d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux sont placés dans des cages adaptées par deux ou trois afin de maintenir la vie en collectivité dans un milieu enrichi (papier, abris). Les animaux engagés dans cette procédure seront habitués aux dispositifs expérimentaux autant que possible. Les animaux néonataux seront testés dans un environnement chauffé (lampe chauffante) pour prévenir les chutes de température et seront immédiatement remis à leur mère après l'expérimentation. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales, par exemple en utilisant une méthode volontaire per os de prise de nanoparticules, celle-ci se substituant aux méthodes "classiques" d'injections pouvant, quand elles sont réalisées sur le long court entrainer stress ou mal-être chez l'animal. En outre, nous utilisons une méthode de mesure de l'activité respiratoire in vivo non stressante et non invasive, où l'animal est placé dans une chambre d'enregistrement. Cette méthode est substituée aux méthodes classiques utilisant un masque, évitant ainsi une situation pouvant induire mal-être et stress chez l'animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est motivé par le fait que la souris est un animal docile, facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus certain pour la réalisation de projets tels que le notre associé à un aspect développemental. En outre, nous disposons aujourd’hui d’un nombre conséquent de données sur ce modèle, ce qui justifie nos travaux sur ce modèle animal. Ce projet vise à étudier les conséquences de l'administration de nanoparticules sur le développement embryonnaire et ses conséquences post-natales. Les animaux exposés (femelles) le seront dès le début de la gestation jusqu'à la fin de celle-ci. L’étude se portera donc aux stades néonataux et embryonnaire puisqu’elle vise à étudier la mise en place des réseaux respiratoires.
Nouvelle approche de traitement de cancer du sein grâce à un scanner nouvelle génération chez la souris EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine triple négative, une injection intratumorale de nanoparticules puis des séances d'irradiation sous anesthésie, avec transfert entre deux établissements. Le porteur indique que l'injection intratumorale est douloureuse, que la tumeur peut se nécroser et que les contentions répétées stressent les souris, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Il affirme que "la règle de remplacement ne peut être appliquée" et renvoie les essais chez l'humain à un éventuel futur conditionné par une efficacité démontrée chez la souris.
Objectifs
Le cancer du sein est le plus fréquent des cancers chez la femme et le cancer du sein triple négatif parmi les plus agressifs, avec souvent des échecs aux thérapeutiques classiques du cancer. Le pronostic de ce type de cancer est mauvais et la recherche continue activement pour trouver des nouvelles thérapeutiques. Chez ces patientes, il est important de disposer de médicaments améliorant la survie et leur qualité de vie. Une thérapeutique innovante d’irradiation sélective à basse dose grâce aux rayons X a vu le jour. Elle permet de déclencher un processus de mort cellulaire en cascade grâce à des nanoparticules. Les nanoparticules sont spécifiquement conçues pour agir à la fois comme produit de contraste et agent thérapeutique. Un modèle animal murin pour le cancer du sein triple négatif sera utilisé afin d’investiguer 2 nanoparticules innovantes, pour évaluer l'efficacité thérapeutique après irradiation. Le projet est mené entre 2 établissements utilisateurs .Une injection intra tumorale de la nanoparticule sera réalisée dans des conditions de concentration du produit et de dose d’irradiation restreints, suite de précédentes études. Le développement et l’optimisation doit impérativement se faire chez l’animal pour pouvoir assurer la translation des résultats à terme chez l’être humain. La règle de remplacement ne peut être appliquée.
Bénéfices attendus
Chez les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif , plusieurs stratégies de traitement existent telles que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'immunothérapie, mais les résultats sont souvent insuffisants. Au stade localement avancé ou métastatique, le besoin médical, en première ligne (chez les patientes n’ayant pas précédemment reçu de chimiothérapie en situation métastatique), est actuellement mal couvert par les alternatives disponibles. De plus, même si dans certains cas la survie à cinq ans après traitement peut être encourageante, les conditions de vie des patientes se dégradent du fait des effets secondaires des thérapies. De nouveaux traitements spécifiques, moins toxiques, plus puissants et surtout des approches thérapeutiques combinatoires constituées de différentes modalités et donc complémentaires les unes des autres représentent une approche extrêmement prometteuse pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de cancer. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité thérapeutique de cette nouvelle thérapie et de prouver que l'approche combinatoire offre un bénéfice maximal avec un profil de toxicité acceptable pour les animaux, ce qui justifierait les bases d'études cliniques chez l’homme. A court terme, une efficacité antitumorale démontrée au stade pré clinique dans cette méthode de traitement innovante, permettrait éventuellement d’envisager de futurs essais chez l’homme.
Procédures
EU 1 Anesthésie locale (1x, 30sec): identification des souris _Contention 3x/semaine 25sec- mesure de la taille/pied à coulisse EU 1 et 2 _ EU 2Injection intratumorale sous cutanée 1x 100µL 30sec_Procedure 1 : Injection intratumorale de nanoparticule (1injection, 30sec)_Irradiation : 1x/sem ou 4x/sem_ Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j._Procedure 2 : selon précédents résultats, choix schéma irradiation et nanoparticule (en 1x /sem ou en 4x/sem) en variant dose et concentration._Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j.
Impact sur les animaux
Dans de très rares cas, un phénomène de gêne à la mobilité peut être observé après injection des cellules cancéreuses. Dans de rares cas, une nécrose de la tumeur peut apparaitre . Douleur lors de l'injection intratumorale du traitement ( douleur inférieure à celle procurée par un traitement anesthésique + contention) . Les contentions multiples (lors des mesures au pied à coulisse, des anesthésies, des pesées) de l’animal peuvent générer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car les tumeurs seront prélevées pour des analyses histologiques.
Remplacement
Une présélection des nanoparticules sera effectuée grâce à des expériences in vitro pour exclure les combinaisons de traitement inefficaces et éviter ainsi des expériences animales inutiles. Pour confirmer l'efficacité in vivo et assurer la possible translation chez l'humain à terme, le modèle murin est nécessaire car les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire entièrement le l'environnement complexe de la tumeur
Réduction
La conception des expériences et les procédures par étapes conditionnelles permettent de réduire le nombre d'animaux calculés à l'aide d'un test statistique . De plus, nous testons uniquement 2 nanoparticules sur 4 intialement produites ; ce choix a été basé sur l’ensemble des résultats obtenus par nos précédentes expériences in vitro et celles de nos collaborateurs
Raffinement
Une anesthésie locale est prévue pour l’identification des souris. Une anesthésie générale est prévue lors des sessions d'irradiation avec l’imagerie. De la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. Une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant l’entrée des animaux en protocole . Surveillance des points limites, et des souffrances possibles, via une grille de scoring établie avec la SBEA. Mesures de raffinement prévues pour le transfert entre les EU ( 5 maximum par cage pour le transport, trajet court,alimentation, abreuvement, aération des cages)
Choix des espèces
Le modèlede cancer du sein triple négatif par greffe de lignées cellulaires humaines de sein immortalisées est un des modèle le plus utilisé pour les études visant à étudier l’efficacité des thérapeutiques anticancéreuses. Les souris immunodéprimées permettent de greffer des tumeurs humaines, ce qui permet de tester la réponse des tumeurs d'origine humaine. Les greffes de tumeurs humaines représentent des modèles cliniquement pertinents de cancer humain, qui simulent de nombreuses caractéristiques du cancer, notamment un microenvironnement tumoral distinct avec des structures vasculaires mal organisées et des régions de cellules hypoxiques, ce qui affecte négativement la sensibilité des cellules cancéreuses aux radiations. Greffe chez des athymic nude femelles à l’âge de 6-7 semaines, ce stade permet d’optimiser la prise de la greffe
Régulation de l’homéostasie intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et, pour une partie, une fenêtre d'observation implantée dans l'abdomen suivie de séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie. Le porteur indique que la pose de la fenêtre et la perte de perméabilité intestinale peuvent provoquer douleur, perte de poids, diarrhée et déshydratation, toutes les souris étant tuées pour analyses. Il présente les retombées, sur le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque, comme des applications potentielles à long terme d'une recherche avant tout fondamentale.
Objectifs
L’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments qui proviennent de notre alimentation. Aussi, du fait de son contact direct avec l’environnement, il est susceptible d’être soumis à des attaques bactériennes et biochimiques qui peuvent compromettre l’étanchéité de la barrière intestinale. Cette barrière est formée par une unique couche de cellules, cellules épithéliales, qui tapissent l’intestin. Pour maintenir l'intégrité du tissu, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en 3 à 5 jours (chez la souris). Ce renouvellement est permis par la division des cellules souches qui se trouvent dans des invaginations du tissus appelées cryptes. À la sortie des cryptes, les cellules se différencient en cellules épithéliales (sécrétoires, absorbantes, et entéroendocrines). L’intestin est un bon modèle d’étude de la migration cellulaire car les cellules différenciées vont ensuite migrer pour enfin être éliminées dans la lumière intestinale. L’objectif général est de comprendre les processus physiologiques au niveau du tractus gastro-intestinal.
Bénéfices attendus
Nous pensons identifier un nouveau mode de régulation du colon. Nous prévoyons aussi que notre projet contribue à expliquer comment la barrière intestinale est maintenue intacte. En général, notre étude sera bénéfique pour la communauté scientifique intéressée par l’intestin. Les avantages à long terme seront de mieux comprendre comment l’intégrité de la barrière intestinale est maintenue, avec des potentielles applications pour des pathologies comme le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque.
Procédures
Une premier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Alternativement, de 2 h jusqu’à 72 h avant la mise à mort, les souris recevront une unique injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen (durée du geste inférieure à 10 sec) Dans un second lot, les souris recevront une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) et seront mises à mort après un jour de repos. Enfin un dernier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Nous implanterons ensuite une fenêtre abdominale sur les souris anesthésiée (durée du geste 20 minutes) pour réaliser des sessions d’imagerie sur souris anesthésiées (durée d’imagerie 120 minutes par jour, pendant 2-3 jours).
Impact sur les animaux
Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences directes et courtes sont à prévoir : - Douleur liée à l’injection intrapéritonéale - Stress lié à la contention pour l’injection intrapéritonéale Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences indirectes et longues (i.e. jusqu’à la mise à mort sont à prévoir : - Douleur, perte de poids, inflammation à la suite de la pose d’une fenêtre d’observation - Douleur, perte de poids, diarrhée, déshydratation et/ou constipation liées à la perte de perméabilité de l’intestin
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe qui implique de nombreux composants : bactéries, circulations sanguine et lymphatique, neurones, muscles, système immunitaire etc. Les objectifs de ce projet étant d'identifier le mode de fonctionnement du tissu ainsi que le maintien de son intégrité. La réduction à un système in vitro pourrait nous affranchir de découvertes pertinentes qui seraient liées à la complexité des interactions présentes dans l’intestin. Par exemple, comme la perturbation de l’étanchéité intestinale peut avoir des conséquences sur le système immunitaire, notre projet est étudiable seulement grâce à des études in vivo, impossible à remplacer par des approches in vitro. Cependant, certains aspects liés à l’intégrité de la barrière intestinale pourraient être explorés in vitro. À cette fin, nous générerons des organoïdes qui permettront de réduire le nombre de souris utilisées . De plus, nous utiliserons des méthodes substitutives partielles comme des explants de tissu observés ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables, soit entre 3 et 5 souris par expérience . Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront réalisées afin d’optimiser le niveau de perte d’adhésion entre les cellules épithéliales et la membrane basale. Ces expériences utiliseront des animaux des deux sexes et les tissus extraits seront utilisés à la fois pour l'histologie et l'extraction de protéines afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire tous les génotypes. Nous produirons un stock d'organoïdes à partir des mêmes souris pour les études in vitro de fonctionnalisation. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires au projet et ainsi optimiser le nombre d’animaux. La prolifération et la migration des cellules seront étudiées dans la même souris. Ces souris seront également utilisées pour l'histologie et l'immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Notre analyse post-mortem sera faite à l’aveugle, ce qui assure l’impartialité des résultats obtenus.
Raffinement
- Pour les injections d’un produit non douloureux dans l’abdomen, une surveillance sera mise en place tous les jours jusqu’à la récupération post-mortem des tissus. Durant cette période, la mise au point de points limites permettra la détection de signes précoces de détresse ou de mal être avant que cela n’impacte les souris ou le projet. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort - Pour la chirurgie, une gestion de l’analgésie-anesthésie est mise en place : les souris recevront des analgésiques en préopératoire ainsi que des anti-inflammatoires après la chirurgie. Nous utiliserons une anesthésie générale gazeuse. Durant le temps de la procédure nécessitant une anesthésie, un gel lacrymal empêchera le dessèchement oculaire et l’animal sera maintenu sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante de manière à maintenir la température corporelle dans les constantes normales. L’animal est ensuite transféré dans une cage isolée (afin d’éviter toute lésion par une autre souris) et placée sur un tapis chauffant jusqu’à son réveil. De l’anti-inflammatoire sera ajouté à l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés de près et mis à mort dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans la grille de score.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude de perméabilité intestinale ainsi que migration cellulaire, la structure de l’intestin étant similaire à celle de l’Homme. Des animaux adultes seront utilisés car nous somme intéressé par la migration cellulaire et les jonctions inter-cellulaires dans des processus physiologiques, lorsque le développement de l’animal est terminé.
Développement d’un système de libération contrôlée de glucose pour assurer la survie des cellules souches mésenchymateuses transplantées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
243 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en sous-cutané un biomatériau libérant du glucose, sont suivies par imagerie sous anesthésie répétée, et 80 d'entre elles subissent une thoracotomie pour visualiser les vaisseaux, avant mise à mort à des temps échelonnés jusqu'à huit semaines. Le porteur indique que la chirurgie d'implantation peut entraîner douleur, stress et infection, et que la taille de certains implants peut gêner l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit l'environnement complexe de l'implantation et vise à terme une alternative aux autogreffes osseuses.
Objectifs
L’objectif du projet est de limiter la mort des cellules souches post-implantation dans le cas des défauts osseux dont la taille est trop importante pour permettre une réparation osseuse spontanée (défaut osseux de taille critique). Les autogreffes osseuses où le greffon est prélevé directement sur le patient sont la référence clinique. Cependant, ces greffons présentent des inconvénients tels que le recours à une deuxième chirurgie, et une quantité et qualité osseuses limitées. Une alternative développée est donc d’implanter des cellules souches dans le défaut osseux afin qu’elles induisent la formation osseuse soit en se différenciant en cellules osseuses soit en attirant les cellules osseuses environnantes. Malgré des résultats prometteurs, la réparation osseuse reste moins efficace qu’avec de l’autogreffe, à cause de la mort massive des cellules souches implantées (90%) observée lors des 15 premiers jours post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel sont implantées les cellules souches est très peu vascularisé et caractérisé par un manque d’oxygène, de glucose et une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose était le facteur responsable de cette mort cellulaire. L’objectif de ce projet est donc de limiter la mort des cellules souches transplantées afin de pouvoir augmenter leur contribution à la réparation du tissu lésé et à terme de remplacer les autogreffes. La stratégie développée par le laboratoire consiste donc à placer les cellules dans un biomatériau leur fournissant du glucose en quantité suffisante jusqu’à revascularisation du tissu. Le biomatériau comprend de l’amidon et une enzyme. Le glucose est ainsi fourni par dégradation de l’amidon sous l’action de l’enzyme. La preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie in vitro et in vivo sur des temps courts, sans permettre cependant une survie cellulaire à long terme (28 jours). Une 2e version du biomatériau a donc été développée afin d’assurer une libération de glucose sur des temps plus longs. L’enzyme est cette fois-ci encapsulée dans des microparticules afin de ralentir sa libération et donc son effet sur l’amidon. Après une série de tests in vitro démontrant une survie des cellules souches sur du plus long terme, nous devons maintenant valider l’intérêt de cette 2e version du biomatériau sur la viabilité et fonctionnalité des cellules souches in vivo.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre biomatériau d’assurer la survie des cellules souches transplantées dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci le biomatériau au sein d’un défaut osseux de taillle critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes osseuses autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions d’ischémie (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, transplantation de cellules souches pour les infarctus du myocarde).
Procédures
Pour tous les animaux (243 souris) : Mise en place des biomatériaux en sous cutané sous anesthésie générale et antalgie (1x, durée 20-30 min). Pour les animaux de l’étude 1 (43 souris) : Acquisition du signal fluorescent sous anesthésie générale gazeuse (8x, durée 5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 2 (100 souris) : Acquisition du signal bioluminescent sous anesthésie générale gazeuse (5x, durée 2x5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 3 (80 souris) : Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque par thoracotomie sous anesthésie générale et antalgie (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l’étude 4 (20 souris) : Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). .
Impact sur les animaux
La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée. Enfin, la taille de certains implants peut entraîner une gêne de l’animal. Les anésthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.
Devenir
Après implantation, suivi par fluométrie ou par bioluminescence, les animaux impliqués dans les procédures 2 et 3 seront mis à mort au temps terminal prévu (4 semaines) afin de pouvoir explanter les biomatériaux et approfondir les résultats par des analyses histologiques ou histochimiques. Tous les animaux concernés par la procédure 4 seront mis à mort suivant des temps prédéfinis (1, 2, 3 et 4 semaines) afin de suivre la formation des vaisseaux sanguins au cours du temps, car la visualisation des vaisseaux sanguins par agent de contraste nécessite la mise à mort de l’animal. Les animaux de la procédure 1 non impliqués dans les procédures 2,3 et 4 seront mis à mort à 4 et 8 semaines afin de pouvoir explanter les biomatériaux et quantifier la formation osseuse par examen radiologique de l'explant.
Remplacement
L’environnement post-implantatoire choisi est un milieu très peu vascularisé et complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses intéractions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par sécrétion d’alarmine, d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des intéractions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 intéractions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des cellules stromales mésenchymateuses en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les études 1 et 2 seront des études de suivi longitudinal : les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). L’étude 1 permettra de sélectionner les groupes dans lesquels l’enzyme restera sur site d’implantation au moins 7 jours sans fuir hors du site. Ces groupes sélectionnés seront donc ensuite utilisés pour l’étude 2. Pour les études 3 et 4, seuls 2 profils sélectionnnés lors de l’étude 2 seront utilisés. Il s'agit du profil permettant la survie cellulaire la plus longue et du profil présentant une augmentation de la population cellulaire en début d’implantation. De plus, la comparaison avec le biomatériau de 1ère génération se fera en se basant sur les résultats historiques des études précédemment réalisées au laboratoire. En prenant en compte les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses, un test statistique (test paramétrique) sera utilisé afin d'étudier l’effet de la composition des biomatériaux, l'impact de la durée d’implantation et leurs intéractions.
Raffinement
Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points surveillés et scorés sur le comportement, l’aspect général (perte de poids) et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical (infection du site d'implantation) permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si le score des points surveillés dépasse le seuil limite défini en amont du projet, l’animal sera retiré de l’étude. Pour les protocoles d’imagerie non invasifs, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse puis installées dans la chambre d’imagerie pour acquérir le signal fluorescent ou bioluminescent in vivo. Lors de ces acquisitions, les souris seront maintenues sous anesthésie au masque. Un gel oculaire sera appliqué pour éviter un éventuel déssèchement occulaire.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.
La mort cellulaire immunogène dans le dialogue inhibition de la transcription et dommage à l’ADN : mécanismes et prédiction de nouveaux inducteurs grâce à l’intelligence artificielle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis deux à cinq injections de molécules anticancéreuses, avec un suivi de la croissance des tumeurs sur les flancs, pour étudier la mort cellulaire dite immunogène. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les souris et que la chimiothérapie peut entraîner perte d'appétit et de poids, les analyses se faisant sur organes après mise à mort. Il revendique un modèle "complet et fonctionnel" irremplaçable in vitro et présente un algorithme d'intelligence artificielle comme moyen de réduire à terme le nombre d'expériences.
Objectifs
La chimiothérapie est un traitement clé contre de nombreux cancers. Certains médicaments peuvent provoquer un type de mort cellulaire spécifique appelé "mort cellulaire immunogène". Cela déclenche une réponse immunitaire antitumorale tout en protégeant contre la réapparition du cancer. Récemment, des recherches ont montré que bloquer la transcription de l'ARN est crucial pour déclencher cette mort. En utilisant un microscope, nous avons remarqué des changements spécifiques dans le noyau des cellules suite à l'utilisation de médicaments déclenchant la morte cellulaire immunogène. Ces changements sont liés à l'inhibition de la synthèse d'ARN. Nous avons développé un algorithme informatique capable de repérer ces changements dans les cellules sans avoir besoin d'utiliser des colorants. De plus, des études récentes ont montré que les effets secondaires de certains médicaments anticancéreux, comme la toxicité cardiaque ou la stérilité, sont liés aux dommages causés à l'ADN. Cependant, il existe des versions de ces médicaments qui conservent leur efficacité contre le cancer sans provoquer ces effets secondaires. C'est pourquoi nous examinons comment l'arrêt de la transcription de l'ARN et les dommages à l'ADN sont impliqués dans la mort cellulaire immunogène. Ce projet vise à confirmer dans des modèles animaux l'effet stimulant sur le système immunitaire de nouvelles molécules anticancéreuses. Ces molécules ont été sélectionnées soit par des tests sur des cellules évaluant leur impact sur la transcription et l'ADN, soit par des algorithmes informatiques capables de prédire ces effets à partir de leurs caractéristiques chimiques. Nous étudierons également leur effet sur la croissance des tumeurs.
Bénéfices attendus
Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles molécules candidates et à approfondir notre compréhension de la potentielle implication du dommage à l’ADN dans l’immunogénicité. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les molécules issues de l’algorithme d’intelligence artificielle permettant de prédire la capacité des différents composés à induire le dommage à l’ADN et l’inhibition de la synthèse d’ARN, présentent également des propriétés immunogènes. Cette approche constitue un atout en matière de criblage de molécules, offrant la possibilité de réduire considérablement le nombre d’expérimentations nécessaires.
Procédures
Suivant les groupes, les animaux recevront de 2 jusqu’à 5 injections, d’une durée de moins d’une minute chacune, sous anesthésie générale ou locale, dépendamment des injections. Ils seront manipulés brièvement (
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un stress léger. Les diverses injections pourraient générer des inconforts transitoires et légers. Les traitements chimiothérapeutiques peuvent entraîner des effets modérés comme une perte d’appétit et donc une perte de poids modérée chez la souris. Les tumeurs qui vont se développer sur les animaux pourront croitre et les gêner modérément au niveau des flancs.
Devenir
Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail (les procédures sont en ordre séquentiel et non mises en oeuvre si l'hypothèse précédente est invalidé). Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience décroissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux dispo-seront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par un système de scoring. Des me-sures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons importantes. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Dans notre centre de recherche, la souris est souvent utilisée, ce qui présente des avantages pratiques. Nous disposons d'installations adaptées pour les élever, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. La souris est également largement reconnue dans la communauté scientifique internationale comme un modèle animal standard pour les études précliniques. Son utilisation répandue facilite la comparaison des résultats entre différentes études, renforçant ainsi la validation des observations. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines), afin de disposer d’un organisme dont le processus de développement est achevé et qui possèdent un système immunitaire complet et fonctionnel.