Souris
Le rôle des macrophages dans le maintien d’homéostasie du testicule
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie suit un régime supprimant un gène d'intérêt, d'autres subissent une chirurgie d'injection d'une toxine, avec tatouage des phalanges et prélèvement de la queue pour l'identification, pour étudier le rôle des macrophages du testicule dans la fertilité. Le porteur qualifie ces atteintes d'"inconfort léger" en s'appuyant sur l'absence d'effets observés lors de projets antérieurs. Il affirme que la complexité des interactions cellulaires rend le modèle animal "indispensable" et repose exclusivement sur des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Notre étude se concentre sur la compréhension des interactions entre les cellules immunitaires appelées macrophages, situées dans les testicules, et les cellules avoisinantes. Nous cherchons à mieux comprendre comment ces interactions influent sur le bon fonctionnement des testicules. Les macrophages jouent un rôle clé dans la protection contre les infections et le maintien de l'équilibre dans différents organes. Le développement et le maintien des macrophages résidents dans les tissus dépendent de la disponibilité et de la localisation de facteurs de survie. Dans les testicules, nous avons identifié deux types de macrophages : ceux situés sur les tubes séminifères, appelés macrophages péritubulaires (périMac), et ceux présents dans le tissu conjonctif entre les tubes, appelés macrophages interstitiels (interMac). Ces macrophages pourraient avoir des rôles importants liés à la fertilité. Elles pourraient aussi influencer le devenir des cellules non différenciées voisines en sécrétant des substances spécifiques. Nous avons découvert que les macrophages péritubulaires dépendent de deux molécules spécifiques produites par les cellules du tube séminifère, qui constituent leur source nutritionnelle. Nous avons également identifié trois gènes potentiels qui seraient essentiels dans l'interaction entre les macrophages péritubulaires et leur source nutritionnelle. Nos objectifs sont les suivants : 1. Examiner le rôle des macrophages péritubulaires dans le processus de production des spermatozoïdes et, par conséquent, dans la fertilité. 2. Explorer la possibilité que les macrophages péritubulaires influent sur le recrutement et la différenciation des cellules du tube séminifère, qui constituent leur source nutritionnelle. 3. Investiguer les mécanismes moléculaires des interactions entre la source nutritionnelle et les macrophages péritubulaires, et confirmer l'implication de ces trois gènes potentiels dans cette interaction.
Bénéfices attendus
Les testicules ont un double rôle qui est de 1/ libérer des hormones masculines comme la testostérone et 2/ produire les spermatozoïdes. Si une des deux fonctions est perturbée, la fertilité de l’individu est grandement impactée. Les PeriMacs ont été suggérés comme des cellules importantes et essentielles à la fertilité masculine. Comprendre comment ces interactions ont lieu pourraient avoir un rôle très bénéfique pour le développement de divers traitements contre l’infertilité masculine, qui selon des estimations représenterait près de la moitié des cas de l’infertilité au sein d’un couple .
Procédures
480 souris seront sous régime alimentaire enrichi en une molécule spéciale qui supprimera notre gène d’intérêt. Ce régime durera un mois. 60 souris subiront une procédure chirurgicale pour injecter une toxine qui permettra de supprimer localement des cellules d’intérêt.
Impact sur les animaux
Lorsque les phalanges sont tatouées et des échantillons de queue sont prélevées pour identifier les souris, cela peut leur causer un léger inconfort. Cependant, dans nos expériences passées, aucune conséquence majeure n'a été observée. Quand la molécule spéciale est introduite par voie orale à travers des croquettes spéciales, cela peut entraîner une légère perte de poids temporaire chez les souris en raison d'une diminution temporaire de leur appétit pour ces croquettes. Cependant, aucune conséquence grave n'a été constatée dans nos expériences antérieures. Dans le cadre du projet précédemment validé, qui utilisait des modèles murins impliquant la suppression du gène d’intérêt dans tous les sous-types cellulaires, aucun effet secondaire n'a été observée. Cela suggère qu'il est très peu probable qu'une mutation de ce gène, ciblant un type cellulaire spécifique, ait des effets néfastes. En ce qui concerne les interventions chirurgicales, bien qu'elles puissent causer une légère douleur au niveau de l'incision après la chirurgie, cela n'a généralement pas de conséquences graves sur les souris.
Devenir
A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les différents tissus pour analyse.
Remplacement
L'utilisation de modèles in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre les macrophages et le microenvironnement (cellules stromales) au sein d’un organe (testicule). Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées. La mise en œuvre d’expériences in vitro sera réalisée quand elle fait sens comme par exemple l’étude su rôle des PeriMacs dans la différenciation vis-à-vis de leur niche nutritive à savoir les cellules péritubulaires myoïdes (ou PTMC).
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide du logiciel http://biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (80%), le niveau de risque acceptable (5%) et l'écart de moyenne attendu entre les groupes expérimentaux et contrôle (40%).
Raffinement
Le statut EOPS de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les conditions d'hébergement des souris respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE. Les souris sont élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Du coton ou du sizzel pad ainsi que des dômes pour confectionner des nids seront introduits dans chaque cage. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur et veiller à ne pas dépasser des points limites. Pour les souris qui subissent une procédure chirurgicale, un antalgique sera mis dans les biberons des cages 24H avant l’opération et 72H post opération pour minimiser la douleur suite à l’opération.
Choix des espèces
L´utilisation du modèle animal est indispensable ici car il n´est pas possible de reproduire la complexité des interactions cellules stromales/macrophages in vitro. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées repose exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte entre 8-24 semaines car nous nous intéressons aux fonctions des macrophages de testicules à l’âge adulte.
Evaluation d’un radiotraceur diagnostique et thérapeutique ciblant la béta-glucuronidase dans des modèles de glioblastomes (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet, mené dans un second établissement, comprend une implantation de cellules de glioblastome dans le cerveau ou sous la peau, des séances d'imagerie nucléaire et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour valider un radiotraceur de diagnostic et de thérapie. Le porteur indique surveiller troubles de la conscience et mouvements circulaires liés à la tumeur cérébrale. Il affirme qu'"aucun modèle alternatif n'est disponible" et revendique une stratégie potentiellement "universelle" pour les tumeurs solides.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer deux molécules, complémentaires, et dédiées à la détection et au traitement des glioblastomes chez la souris. Pour cela notre stratégie repose sur la présence d’une enzyme dans les glioblastomes tumoraux, qui permettra l’accumulation des agents anticancéreux dans ces mêmes glioblastomes. Notre approche en deux étapes s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs solides.
Procédures
Pour le protocole d’implantation tumorale, qui constitue le seul acte réalisé au sein de l’établissement utilisateur secondaire, au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations seront réalisées sous anesthésie volatile, anesthésique local, analgésie par morphinique pour la chirurgie et un relai par anti-inflammatoire. Les autres actes réalisés pour ce projet se feront au sein de l’établissement utilisateur principal. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris se fera sous anesthésie volatile. L’acquisition des images sera réalisée chez des animaux sous anesthésie volatile pour une durée inférieure à 1h. Un onguent sera appliqué sur la cornée pour éviter toute sécheresse oculaire. Si plusieurs sessions d’imagerie sont envisagées chez une même souris, elles seront réalisées avec un écart au minimum de 2 heures pour les temps courts (1H, 4H et 6H), et de 1 jour entre 2 procédures pour les temps plus longs (24H, 48H & 96H). Un maximum de 6 acquisitions d’imagerie nucléaire (TEP ou TEMP) sera réalisé sur chaque animal. Un maximum de deux acquisitions IRM anatomique sera réalisé chez les souris porteuses de tumeurs au niveau du cerveau. Une seule chirurgie sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes dans le cerveau. Une seule implantation de cellules tumorales sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes sous-cutanés. Pour l’étude de la dose maximale tolérée, A J0 et à J14 post-injection du composé thérapeutique radiomarqué, un prélèvement de sang au niveau rétro-orbital sera réalisé, pour effectuer une numération de formule sanguine, et un dosage des enzymes hépatiques. Ce prélèvement n’excèdera pas le volume de 10 % du poids de l’animal comme préconisé pour cette espèce animale (GRICE). Un prélèvement terminal sera également réalisé post-mortem, après la mise à mort des animaux. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vigiles pour toutes les autres procédures.
Impact sur les animaux
Pour le protocole d’implantation tumorale orthotopique, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations entraineront un léger stress à l’implantation. On ne s'attend pas à ce que l'injection intracrânienne entraîne une mortalité aiguë. Pour le modèle orthotopique, les animaux développeront des tumeurs primaires dans le cerveau. Après l'implantation, il pourrait y avoir une réduction initiale du poids corporel, puis une reprise ultérieure du poids corporel. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour déceler tout signe de réaction altérée à la manipulation, de troubles de la conscience, de mouvements circulaires ou de stupeur. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris entrainera un léger stress à l’implantation. Les protocoles d’imagerie n’entraineront pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intraveineuse du radiotraceur à des animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure (caractérisation, biodistribution, dose maximale tolérée, efficacité), les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider et sélectionner le radiotraceur au potentiel le plus important pour l’imagerie et la thérapie des glioblastomes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider le meilleur candidat radiopharmaceutique pour l’imagerie et la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis de se restreindre à 4 molécules candidates pour ces tests in vivo (2 molécules candidates pour le diagnostic et 2 molécules candidates pour la thérapie).
Réduction
Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser les molécules présentant les meilleures propriétés pour l’imagerie, le diagnostic par biopsie respiratoire et la thérapie du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 400 animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie volatile, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intra veineuse de radiotraceur. Pour le protocole d’implantation tumorale au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité, sous anesthésie volatile, anesthésique local, et analgésie par morphinique suivie d’un relai par anti-inflammatoire non stéroïdien. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal (pour les tumeurs aussi bien sous-cutanées qu’au niveau du cerveau).
Choix des espèces
Les études précédentes utilisant notre prodrogue thérapeutique précurseur ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression de l'enzyme d'intérêt dans le proche environnement tumoral et ainsi déclencher l’activation de nos molécules. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques moléculaires invasives. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.
Infestation des souris avec des vers de taenia à des fins de tests comportementaux et physiologiques
- Enseignement supérieur
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à des fins d'enseignement universitaire. Chaque animal est infesté chirurgicalement par le ver Taenia crassiceps, gardé 70 jours, puis soumis à des tests comportementaux (open field, planche à trous, boîte claire-obscure, néophobie, rotarod) avant la mise à mort et le prélèvement des parasites. Le porteur décrit un projet pédagogique servant de "fil rouge" sur trois années de licence pour 200 à 250 étudiants. Il affirme qu'une partie des résultats repose sur une "approche pédagogique alternative" par analyse bibliographique.
Objectifs
Taenia crassiceps est un parasite à cycle complexe qui possède comme hôte définitif un canidé sauvage ou domestique et comme hôte intermédiaire un rongeur. Chez l’hôte intermédiaire la souris, le parasite réalise une multiplication asexuée intense. L’augmentation de la charge parasitaire est associée à une modification des taux d’hormones sexuelles chez les souris. Les souris femelles voient leur taux d’œstrogène augmenter très significativement. Les souris mâles arrêtent de produire de la testostérone et produisent des œstrogènes ce qui conduit à une féminisation des mâles hormonalement parlant. Ces changements hormonaux s’accompagnent de modifications profondes de la réponse immunitaire et des comportements des souris parasitées. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir étudier l’ensemble de ces modifications et du fonctionnement de cette interaction hôte parasite au travers de plusieurs enseignements réalisés en Licence de biologie en Licence 1ère année sera étudiée la multiplication asexuée par bourgeonnement du parasite, en licence 2ème année seront quantifiés les taux d’hormones sexuelles dans le sang de souris mâles et femelles, en licence 3ème année sera étudiée la réponse immunitaire des souris saines et infectées par le parasite ceci par l’intermédiaire de numérations lymphocytaires sur frottis sanguins et les comportements des souris saines et parasitées seront analysés en focalisant sur des comportements de stress et de mesure de la capacité physique des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet pédagogique permet aux étudiants d’aborder dans un modèle d’interaction hôte parasite de nombreux concepts écologiques, physiologiques, endocrinologiques et moléculaires. L’idée de ce projet est un fil rouge que les étudiants analysent tout au long de leurs trois années de licence et qui leur permet de comprendre comment un parasite peut prendre le contrôle de son hôte à son profit, ceci leur permet de développer des analyses intégratives des molécules aux populations pour comprendre comment cette prise de contrôle s’opère. Ceci est déterminant pour les apprentissages que l’équipe pédagogique souhaite que les étudiants maîtrisent en fin de Licence afin de les former au mieux pour leur poursuite d’étude en Master.
Procédures
Infestations expérimentales de souris par les larves du cestode Taenia crassiceps par chirurgie. Une seule intervention chirurgicale est pratiquée chez les animaux, l'acte chirurgical dure environ 8 minutes / animal. Les animaux sont ensuite gardés à l'animalerie 70 jours avant euthanasie et prélèvement de sang et des parasites. Les animaux sont soumis à des tests comportementaux réalisés par les étudiants sur souris saines et infectées (openfield, planche à trous, boite claire/obscure, néophobie, rotary road), pour chaque souris, chaque test comportemental est réalisé pendant 60 secondes d'observation.
Impact sur les animaux
Les nuisances qui peuvent être attendues sur les animaux sont liées à la chirurgie pratiquée pour l’infestation. L’infestation est réalisée par une incision extrêmement réduite (3 mm), un seul point de suture est réalisé pour refermer l’incision. De plus, la gestion de la douleur post-opératoire est assurée par une injection sous-cutanée de Buprénorphine toutes les 12h pendant 24h. Le développement des larves dans la cavité péritonéale ne provoque pas de nuisances sur les tissus des rongeurs. Les larves du parasite sont libres dans la cavité péritonéale et ces larves se nourrissent par osmotrophie trans-tégumentaire sans aucun effet direct sur les tissus de leur hôte. A 70 jours, la charge parasitaire est faible chez les animaux et ces derniers sont euthanasiés avant que le parasite n’induise de potentielles souffrances chez l’animal.
Devenir
Le but du projet est de produire des parasites de l'espèce Taenia crassiceps et de récupéré du sang chez la souris souris, ainsi que d'étudier les comportements des animaux. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites et le matériel biologique afin d'assurer l'ensemble des approches pédagogiques envisagées.
Remplacement
IImpossible, on ne peut pas réaliser le cycle du parasite in vitro. Il n'existe pas non plus de culture cellulaire permettant de mener des approche similaires in-vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte intermédiaire pour être maintenu et la souris est connue pour être l’hôte intermédiaire privilégié pour cette espèce de cestode. La technique d’infestation chirurgicale permet de maintenir en laboratoire le parasite par transfert des parasites de souris à souris et donc en ne manipulant exclusivement que le stade larvaire du parasite, sans ne jamais passer par le stade adulte. Dans la stratégie 3R , le nombre d'animaux utilisé est le plus faible possible car nous veillons à ce que ce soit les mêmes animaux qui soient utilisés pour les tests comportementaux et pour ensuite la récupération des échantillons biologiques utilisés par les étudiants. Pour limiter également l'utilisation des animaux, une partie des analyses et des résultats exploités par les étudiants sont acquis à partir d'une approche pédagogique alternative reposant sur l'analyses bibliographiques de la litérature scientifique existante sur le sujet des modifications physiologiques et comportementales induites par les parasites chez leurs hôtes.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été pensé pour réduire au maximum les animaux utilisés tout en maintenant un travail statistiquement et scientifiquement robuste de la part des étudiants. Un total de 360 souris sera utilisé dans ce projet et cela permet de travailler avec les étudiants de 3 années de Licence dans 4 matières d’enseignement ce qui représente un contingent total d’environ 200 à 250 étudiants selon les années. La souris permet de produire des parasites et le matériel biologique nécessaire à l’ensemble des approches proposées sans ressentir de souffrance ou mortalité précoce. Le nombre d’animaux est basé sur 6 lots de 6 souris mâles ou femelles saines et parasitées. 6 lots car les étudiants en TP sont répartis en 6 groupes de 3 étudiants (trinômes) qui pourront chacun travailler avec 6 souris par conditions expérimentales afin d’avoir un nombre suffisant de réplicas biologiques pour mener des approches statistiques robustes. Pour les tests comportementaux les mêmes lots de souris sont utilisés. Le sang récupéré chez les souris à 70 jours d’infection est suffisant pour faire travailler l’ensemble des autres groupes d’étudiants de licence 1ère, 2ème et 3ème année toujours dans ce même objectif de réduire le nombre de souris qui sont utilisées. Ainsi le besoin annuel en animaux s’élève à 72 souris par an.
Raffinement
Nous avons fixé le nombre optimal de parasites qui sont utilisés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de cestodes et d’induire les modifications physiologiques et comportementales sans engendrer de mortalité chez la souris. Le temps de développement au sein de l’animal a également été optimisé pour récolter les parasites et les échantillons biologiques avant que la pathologie induite par le parasite soit dommageable pour la souris hôte. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Pendant le développement du parasite chez l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu. La mortalité ne survient jamais suite à l’infestation. L’infestation par chirurgie pour le transfert des larves du cestode peut être une source d’inconfort pour l’animal, mais des soins post-opératoires sont prévus afin de palier à ces potentielles souffrances, le protocole a été pensé pour éviter tout signe de souffrance. Cependant, durant cette période de développement parasitaire, tout rongeur retrouvé en souffrance, score de 3 dans les points limites (voir annexe 1), est euthanasié par un personnel habilité. L’euthanasie peut également être effectuée par le RBEA. Les points limites sont : la pâleur de l’animal, la perte de contacts sociaux, le dos vouté, le poil hérissé, les yeux mi-clos, diminution ou arrêt de l’alimentation, l’immobilité ou le museau gonflé ; le pointage pour chacun de ces points limites est de 1 ou 2. Chaque animal ayant un score égal ou supérieur à 3 est euthanasié au CO2. Aucune médication n’est donnée car l’infestation par le parasite n’est pas réversible ; aucune médication ne peut être donnée car elle interfère avec le développement du parasite. Le point d’arrêt a été fixé à 70 jours post-infestation. Avant chaque séance de travaux pratiques l'enseignant responsable et le technicien animalier (titulaires du niveau 1 et chirurgie) informent les étudiants sur la réglementation et l'éthique sur l'utilisation des animaux en science. Les bonnes pratiques en terme de manipulation des animaux leur sont présentées afin d'éviter tout stress pour les animaux en particulier dans les tests comportementaux pratiqués par les étudiants.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est l’hôte intermédiaire le plus souvent retrouvé en milieu naturel pour ce cestode parasite Taenia crassiceps. La souris apparaît donc comme le modèle principal pour maintenir les larves du cestode Taenia crassiceps en laboratoire. La souris permet de produire les parasites et le matériel biologique parfaitement adaptés aux tests envisagés en minimisant la souffrance et en utilisant le moins d’animaux possible. Animaux adultes. Les animaux infestés sont âgés de 8 à 9 semaines.
Exploration des bases moléculaires de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections de tamoxifène, d'autres sont rendues obèses par un régime gras pendant quatre mois, avec des phases d'hébergement individuel, pour étudier l'inflammation cérébrale déclenchée par un repas gras. Le porteur qualifie l'obésité induite et l'isolement de nuisances sans "signes comportementaux" d'inconfort, en s'appuyant sur ses publications passées. Il affirme que la satiété et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, ou PIR) systémique est maintenant bien documentée mais ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. La PIR cérébrale n’est pas déclenchée par un repas équilibré standard. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas gras. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques futurs après consommation d’un repas hyperlipidique hypercalorique. Toutefois, les bases moléculaires de ce phénomène biologique sont encore totalement inconnues. Pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la PIR cérébrale et en comprendre les déterminants, nous allons étudier des souris transgéniques particulières permettant de recueillir des informations biologiques nouvelles, avec une très grande précision, au sein des cellules microgliales spécifiquement. Les animaux seront étudiés dans différentes phases prandiales : avant ou après un repas, et en fonction de la nature des repas consommés (standard ou gras), et en fonction de leur état métabolique (sain ou obèse). Après étude du comportement alimentaire, des analyses de biologie moléculaire seront faites post-mortem sur des biopsies cérébrales. Au total, 1850 souris seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur processus cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété. Ainsi ce projet qui apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
L’obtention de souris mutantes A nécessite un traitement au tamoxifène durant 5 jours par une injection péritonéale quotidienne à l’âge de 5 semaines. La procédure 1 implique une mise en cage individuelle pendant 3 jours au maximum, afin de mesurer la prise alimentaire de chaque individu, ce qui peut engendrer stress et inconfort. Des contentions seront réalisées pendant les expériences afin de mesurer le poids corporel et en fin d’expérience afin d’anesthésier les animaux avant mise à mort. Une injection intrapéritonéale d’anesthésique durant 5 secondes sera réalisée avant la mise à mort sous sédation.
Impact sur les animaux
Le traitement par le tamoxifène des souris mutantes A peut induire des signes d’inconfort et de mal-être. Obésité nutritionnelle induite Les principales nuisances sont liées à la production de lots d’animaux obèses, dont l’obésité sera induite par exposition à un régime gras hypercalorique pendant 4 mois. Nous utilisons ce modèle depuis plus de 15 ans. Cela provoque une obésité associée chez certains individus à une résistance à l’insuline. Une accumulation de graisses ectopique peut être observée au niveau des muscles ou du foie. En revanche, il n’y a pas de signes particuliers comportementaux suggérant un inconfort, une douleur ou un mal-être. Hébergement individuel pendant 3 jours Pour assurer contrôler les prises alimentaires individuelles lors de ces études, les animaux seront placés en cage individuelle. Cette condition de vie imposée est brève et ne produit aucune gêne ni aucun changement hormonal visible, comme nous l’avons attesté et publié , mais reste un acte pouvant affecter le bien-être des souris. Contention et injection intrapéritonéale En fin d’expérience, la contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent d’anesthésique avant la mise à mort représentent des nuisances potentielles. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal , l'ensemble de la manipulation durera 5 minutes.
Devenir
Les 1850 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses de biologie moléculaire.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits.
Raffinement
Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront élevés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Pendant les expériences, la surveillance quotidienne du bien-être animal sera assurée de manière visuelle, à travers les cages transparentes. De plus, lors des changements de conditions nutritionnelles à l’échelle d’un repas (induction des états prandiaux contrôlés sur 3 heures), une observation directe des animaux sera faite. L’induction des états prandiaux se fait en cohérence avec la physiologie des animaux (introduction des repas à l’extinction des lumières, en début de phase active).
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Evaluation d’un radiotraceur diagnostique et thérapeutique ciblant la béta-glucuronidase dans des modèles de glioblastomes (1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une implantation de cellules de glioblastome, dans le cerveau ou sous la peau, puis des séances d'imagerie nucléaire et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour évaluer un radiotraceur de diagnostic et de thérapie. Le porteur indique surveiller troubles de la conscience, mouvements circulaires et stupeur liés à la tumeur cérébrale. Il affirme qu'"aucun modèle alternatif n'est disponible" et revendique une stratégie qui pourrait devenir "universelle" pour les tumeurs solides.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer deux molécules, complémentaires, et dédiées à la détection et au traitement des glioblastomes chez la souris. Pour cela notre stratégie repose sur la présence d’une enzyme dans les glioblastomes tumoraux, qui permettra l’accumulation des agents anticancéreux dans ces mêmes glioblastomes. Notre approche en deux étapes s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs solides.
Procédures
Pour le protocole d’implantation tumorale, qui constitue le seul acte réalisé au sein de l’établissement utilisateur secondaire, au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations seront réalisées sous anesthésie volatile, anesthésique local, analgésie par morphinique pour la chirurgie et un relai par anti-inflammatoire. Les autres actes réalisés pour ce projet se feront au sein de l’établissement utilisateur principal. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris se fera sous anesthésie volatile. L’acquisition des images sera réalisée chez des animaux sous anesthésie volatile pour une durée inférieure à 1h. Un onguent sera appliqué sur la cornée pour éviter toute sécheresse oculaire. Si plusieurs sessions d’imagerie sont envisagées chez une même souris, elles seront réalisées avec un écart au minimum de 2 heures pour les temps courts (1H, 4H et 6H), et de 1 jour entre 2 procédures pour les temps plus longs (24H, 48H & 96H). Un maximum de 6 acquisitions d’imagerie nucléaire (TEP ou TEMP) sera réalisé sur chaque animal. Un maximum de deux acquisitions IRM anatomique sera réalisé chez les souris porteuses de tumeurs au niveau du cerveau. Une seule chirurgie sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes dans le cerveau. Une seule implantation de cellules tumorales sera prévue sur chacun des animaux destinés à l’étude des glioblastomes sous-cutanés. Pour l’étude de la dose maximale tolérée, A J0 et à J14 post-injection du composé thérapeutique radiomarqué, un prélèvement de sang au niveau rétro-orbital sera réalisé, pour effectuer une numération de formule sanguine, et un dosage des enzymes hépatiques. Ce prélèvement n’excèdera pas le volume de 10 % du poids de l’animal comme préconisé pour cette espèce animale (GRICE). Un prélèvement terminal sera également réalisé post-mortem, après la mise à mort des animaux. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vigiles pour toutes les autres procédures.
Impact sur les animaux
Pour le protocole d’implantation tumorale orthotopique, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité. Ces implantations entraineront un léger stress à l’implantation. On ne s'attend pas à ce que l'injection intracrânienne entraîne une mortalité aiguë. Pour le modèle orthotopique, les animaux développeront des tumeurs primaires dans le cerveau. Après l'implantation, il pourrait y avoir une réduction initiale du poids corporel, puis une reprise ultérieure du poids corporel. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour déceler tout signe de réaction altérée à la manipulation, de troubles de la conscience, de mouvements circulaires ou de stupeur. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris entrainera un léger stress à l’implantation. Les protocoles d’imagerie n’entraineront pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intraveineuse du radiotraceur à des animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure (caractérisation, biodistribution, dose maximale tolérée, efficacité), les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider et sélectionner le radiotraceur au potentiel le plus important pour l’imagerie et la thérapie des glioblastomes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider le meilleur candidat radiopharmaceutique pour l’imagerie et la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis de se restreindre à 4 molécules candidates pour ces tests in vivo (2 molécules candidates pour le diagnostic et 2 molécules candidates pour la thérapie).
Réduction
Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser les molécules présentant les meilleures propriétés pour l’imagerie, le diagnostic par biopsie respiratoire et la thérapie du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 400 animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie volatile, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intra veineuse de radiotraceur. Pour le protocole d’implantation tumorale au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité, sous anesthésie volatile, anesthésique local, et analgésie par morphinique suivie d’un relai par anti-inflammatoire non stéroïdien. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal (pour les tumeurs aussi bien sous-cutanées qu’au niveau du cerveau).
Choix des espèces
Les études précédentes utilisant notre prodrogue thérapeutique précurseur ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression del'enzyme d'intérêt dans le proche environnement tumoral et ainsi déclencher l’activation de nos molécules. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques moléculaires invasives. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.
Effets des modulateurs des récepteurs du GABAA sur le syndrome de Cushing.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une dizaine d'injections et jusqu'à dix-huit prélèvements de sang, pour tester si la neutralisation d'une protéine circulante limite les effets du syndrome de Cushing. Le porteur décrit des nuisances "très limitées" et un inconfort "léger", tout en indiquant que les glucocorticoïdes peuvent induire obésité, résistance à l'insuline et ostéoporose. Il affirme que l'appétit et le comportement alimentaire ne sont pas modélisables in vitro et conclut au caractère "indispensable" de l'animal vivant.
Objectifs
Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. L’augmentation de cette protéine accroît la prise alimentaire, réduit la glycémie, et encourage la lipogenèse à tous les niveaux. La neutralisation de cette protéine apparaît donc comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’obésité. Or, l'exposition chronique à des niveaux excessifs de glucocorticoïdes entraine un syndrome de Cushing qui est caractérisé par le développement de l'obésité, une résistance à l'insuline, une perturbation des taux de graisses dans le sang, une faiblesse musculaire, une fragilité des os et des accidents vasculaires. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la neutralisation de cette protéine circulante peut empêcher/réduire les effets secondaires indésirables du Syndrome de Cushing.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique afin de limiter ou d’éradiquer le syndrome de Cushing (effets indésirables associés à une exposition importante aux glucocorticoïdes).
Procédures
Pour certains animaux 12 injections sous anesthésie locale par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux: 10 injections par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux, 11 injections par souris (durée quelques secondes), 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute). Pour tous, 1 prélèvement de sang unique sous mandibulaire (100µL, 1 minute), à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Les injections sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort léger, local et transitoire. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les glucocorticoïdes peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie et l'ostéoporose.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible de modéliser, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.
Réduction
Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de détecter toute modification.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Evaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique couplant l’utilisation d’ultrasons à des thérapies ciblées innovantes dans un modèle de gliome chez des souris et rats.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 298
1 108 rongeurs, 810 souris et 298 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances d'imagerie, des injections d'agents thérapeutiques et des prélèvements sanguins, pour tester une combinaison d'ultrasons focalisés et de médicaments contre les gliomes. Le porteur indique que les traitements peuvent avoir une toxicité sur les organes sains et que le réveil après imagerie peut désorienter les animaux. Il revendique un fort "potentiel de transfert chez les patients", bénéfice renvoyé au conditionnel.
Objectifs
De nouvelles innovations thérapeutiques à base d’anticorps et de peptides spécifiques pourraient améliorer significativement les conséquences des cancers du cerveau les plus graves : les gliomes. Ces thérapies ciblent spécifiquement des molécules exprimées principalement par les gliomes et diminuent considérablement les effets secondaires tout en augmentant l’efficacité thérapeutique. Malheureusement l’efficacité de ces traitements est freinée une barrière naturelle, appelée « barrière hémato-encéphalique » (BHE), qui limite la diffusion dans le cerveau des médicaments qui pourraient être efficaces contre ces tumeurs. Les gliomes, qui sont des tumeurs cérébrales très agressives, restent essentiellement incurables même si la BHE est partiellement compromise par la présence de cette tumeur. L’objectif du projet est d’évaluer une stratégie thérapeutique qui vise à surmonter la limitation de la diffusion des médicaments dans la tumeur, en combinant des ultrasons focalisés à des médicaments innovants, associés ou non avec des isotopes thérapeutiques. Les isotopes directement injectés dans la circulation sanguine, agissent comme une radiothérapie interne. Ils ont aussi été montrés stimuler le système immunitaire en plus de leur effet thérapeutique sur les cellules tumorales. Les ultrasons focalisés ont prouvé leur capacité à faciliter la diffusion de divers médicaments dans le cerveau grâce à une ouverture transitoire et sécurisée de cette barrière sans causer de lésions cérébrales. Nous exploiterons cette perturbation de la BHE pour adresser les médicaments directement dans la tumeur, tout en y associant une radiothérapie interne. Cette stratégie sera évaluée sur des modèles de rongeurs (souris et rats) présentant soit un statut immunitaire normal soit une immunorésistance, pour évaluer toutes les conditions pouvant se présenter en clinique humaine. . Ce projet sera réparti entre deux établissements pour réaliser d’un côté la thérapie et de l’autre le suivi par imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques en utilisant des traitements innovants et des ultrasons focalisés. Ces approches thérapeutiques présentent un fort potentiel de transfert chez les patients. Dans le cadre de ce projet, une évaluation des thérapies par imagerie TEP est également envisagée. Cette méthodologie, associée à l'utilisation de radioligands, pourrait bénéficier aux patients de deux manières : en améliorant la sélection des patients pouvant bénéficier des traitements innovants et en optimisant la dose médicamenteuse afin de réduire les effets toxiques potentiels.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place du modèle tumoral (45 minutes d’intervention chirurgicale, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale dans une sous-structure du cerveau : le striatum pour la formation de tumeurs o L’injection de molécules permettant l’imagerie chez l’animal sous anesthésie générale pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 3). o L’injection des agents thérapeutiques qui aura lieu tous les deux à trois jours pendant deux semaines environ (temps d’injection de la thérapie 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 6). o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 6 sessions d’imagerie. o Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 5 maximum au total ). Le diagnostic et la thérapie seront réalisés dans un premier établissement utilisateur alors que le suivi par imagerie sera réalisé dans un autre établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (70 minutes maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical lors de la mise en place du modèle tumoral induira une douleur au niveau de la boite crânienne. L’acte chirurgical durera 30 min. Les traitements peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour des analyses ex vivo de biomarqueurs d’intérêt tumoraux et au niveau du système immunitaire.
Remplacement
Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont évaluées sur des cultures cellulaires et des tumoroides pour déterminer leur pertinence, ainsi que pour identifier une éventuelle surexpression de biomarqueurs au niveau des tumeurs. Un travail impliquant plusieurs équipes spécialistes des gliomes et de la BHE porte notamment sur l’élaboration de modèles tumoroides couplant gliomes et microenvironnement tumoral pour évaluer in vitro les différentes stratégies thérapeutiques. Les tests in vitro préliminaires sont mis en place afin de définir la stratégie qui sera appliquée in vivo, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour l'évaluation sur un modèle murin. Cependant, nos modèles in vitro sont limités quant à l’interaction entre les cellules tumorales et le microenvironnement tel que les différentes populations du système immunitaire.Afin de valider les thérapies et la stratégie associée par imagerie, il est nécessaire d'implanter les tumeurs dans l'organe cible, en l'occurrence le cerveau. L’ouverture de la BHE par l’utilisation d’ultrasons thérapeutiques ne peut être que testée dans un environnement complexe récapitulant le flux sanguin, les jonctions de la barrière cérébrales, l’infiltration immunitaire et les flux lymphatiques cérébraux uniquement observable in vivo. Cette approche permet de mieux simuler le contexte physiologique et de fournir des données plus pertinentes pour le transfert clinique de ces stratégies.
Réduction
L’imagerie TEP permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux étant donné que l’impact des traitements sera suivi de manière longitudinale sans avoir recours à des euthanasies à différents temps d’imagerie. Cette évaluation nécessitera d’avoir recours à un traitement des images et l’utilisation de modèles mathématiques pour extraire un maximum de données directement transférables en clinique. En tenant en compte les différentes données préliminaires et les données bibliographiques, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé entre 10 et 12 afin d’être statistiquement significatif. Les données quantitatives issues de l’imagerie seront exprimées en moyenne avec un écart-type associés.
Raffinement
Toutes les interventions invasives à savoir les injections de radioligands, les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux seront entrainés à la manipulation pour éviter tout stress. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Si une souffrance est observée, un antalgique pourra être administré en accord avec le/la vétérinaire référent-e. sera administrée. Les rongeurs seront transportés dans des cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le transport sera réalisé dans un véhicule dédié aux transports des animaux avec une climatisation. Le parcours entre les deux sites est de 20 minutes maximum.
Choix des espèces
Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux axes thérapeutiques qui peuvent être directement transférables à l’humain. En fonction de la lignée cellulaire tumorale utilisée, la souris ou le rat sont des animaux de choix pour la mise en place de modèle tumoraux. Ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers cérébraux chez les patients majoritairement à l’âge adulte.
Evaluation du potentiel addictogène de nouveaux candidats médicaments
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1620
2 100 rongeurs, 480 souris et 1 620 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée à l'issue et 360 réutilisés dans d'autres projets. Les animaux reçoivent les substances à tester, peuvent recevoir un cathéter veineux et des puces RFID, subissent des prélèvements sanguins et sont soumis à des tests de conditionnement et de sevrage avec une restriction alimentaire à 80-90 % de leur ration. Le porteur indique que le test de sevrage peut provoquer hypothermie, tremblements et perte d'appétit, pour évaluer le potentiel d'addiction de candidats-médicaments. Il présente ces tests comme "requis par les agences réglementaires" et signale que des méthodes in vitro et in silico existent pour la sélection préalable des molécules.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’anticiper des problématiques de mésusage et pharmacodépendance pour de futurs candidats médicaments avant leur mise sur le marché. En effet, de par leurs actions au niveau du système nerveux central, des candidats médicaments une fois mis sur le marché peuvent êtres mésusés, leur utilisation détournée ou consommés de manière récréative et/ou de façon abusive. Les procédures décrites dans ce projet sont des tests comportementaux réalisés chez le rongeur et qui ont pour objet l'évaluation de l'innocuité de candidats médicaments sur le système nerveux central et suivent les recommandations des instances réglementaires (européenne et américaine).
Bénéfices attendus
Les procédures décritent dans ce projet permettent de vérifier l'absence d'effets indésirables tels que le mésusage et la pharmacodependance pour les candidats médicaments avant leur mise sur le marché. Si un risque de ce type est détecté, ces informations seront indiquées sur la notice d'utilisation, les conditions d’accès à ce médicament et son utilisation pourront alors être encadrées (médicament réservé à un usage hospitalier, par exemple). De plus les professionnels de santé seront informés du risque de détournement et pourront ainsi mettre en place un suivi du patient adapté afin de pouvoir détecter les signes relatifs à un état de dépendance tels que l’impossibilité d’arrêter ou de diminuer les doses du médicament; le fait d’avoir besoin de doses plus importantes pour obtenir les mêmes effets ; l'apparition d’un état de manque en l’absence de prise du médicament ; le fait de consacrer du temps à chercher à se procurer le médicament.
Procédures
Les substances à évaluer, les contrôles positifs et les contrôles négatifs sont administrées par bolus ou infusion d’une durée de quelques secondes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou semaines, selon l’objectif de la procédure. Les procédures peuvent également nécessiter l’implantation de puces RFID (durée de quelques secondes à quelques minutes selon le site d’implantation) et/ou la pose d’un cathéter veineux sous anesthésie (durée d’environ 1 heure). Par ailleurs, des prélèvements de sang (durée du prélèvement : quelques secondes à 3 minutes) pourront être réalisés selon une fréquence déterminée dans la limite des considérations éthiques (8 maximum sur 24 heures). Les phases de test comportemental surviennent le plus souvent quotidiennement durant toute la durée de la procédure et peuvent consister en une simple observation de l'animal sans manipulation ou en des phases de conditionnement et de tests (visites de compartiments ou appuis sur leviers) dans des dispositifs spécifiques (durée de l'ordre de 20 minutes à 2 heures maximum, sur 5 jours ou plusieurs semaines en fonction des procédures).
Impact sur les animaux
Les administrations, les phases chirurgicales ou les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress ou une douleur. Dans le test de sevrage, l'animal peut ressentir des symptômes associés au sevrage pharmacologique (tels que l’hypothermie, des tremblements, une diminution de l’activité locomotrice, une perte d’appétit). Ces symptômes apparaissent généralement dans les 24 heures suivant l’arrêt du traitement et peuvent persister pendant toute la durée suivant la phase d'administration (en général 7 jours). Dans les autres tests, les animaux sont placés dans des dispositifs spécifiques (boites de conditionnement) pour une durée de 10-20 minutes à 2 heures, ce qui peut induire un stress lors de la première exposition du fait de la nouveauté de l'environnement (auquel les animaux s'habituent rapidement). Dans les procédures de conditionnement opérant, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire (80-90% de la consommation quotidienne standard) qui peut augmenter la sensation de faim, mais n'empêche pas la croissance pondérale.
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Les animaux soumis à un prélèvement terminal seront euthanasiés.
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils permettent l’étude des potentiels effets secondaires de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques). De plus, ces tests sont requis par les agences réglementaires lorsque les candidats médicaments (ou leurs métabolites) ont une action sur le Système Nerveux Central. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour toute procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère de type isolflurane sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Aujourd’hui encore, les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer le potentiel addictif et/ou à induire une pharmacodépendance des candidats médicaments selon les recommandations des agences réglementaires et la littérature. Il s'agit principalement de rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la littérature scientifique et aux textes réglementaires.
Etude du mécanisme d’action de la protéine PML dans la réponse thérapeutique aux chimiothérapies dans les leucémies aiguës myeloïdes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques par injection, des prélèvements intra-fémoraux et des traitements de chimiothérapie, pour étudier le rôle de la protéine PML dans la réponse aux traitements de la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids et souffrir en phase finale de leucémie, ceux perdant plus de 20 % de leur poids étant alors tués, et précise que l'analgésie ne sera pas administrée pendant la phase de traitement pour ne pas fausser les résultats. Sur le remplacement, il affirme avoir testé les molécules sur cellules mais conclut à la nécessité d'un "organisme entier".
Objectifs
La protéine PML (ProMyelocytic Leukemia) peut s’assembler pour former des structures en coques sphériques appelées « corps nucléaires PML » (CN) dans le noyau des cellules. Sur ces CN s'associent des protéines partenaires qui y subissent alors des modifications. PML est impliquée dans différents mécanismes cellulaires, et peut également jouer un rôle de suppresseur de tumeur. En effet, PML est sous-exprimée ou absente dans de nombreux cancers (cancer du sein, de la prostate, du système nerveux central), en phase tardive mais aussi à des stades précoces. D’autre part, PML est sensible à l’oxydation. Lorsque la cellule est exposée à un stress oxydant, PML va déclencher une réponse de défense menant à la mort de la cellule, ce qui participe probablement à son rôle de suppresseur de tumeur. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont dues à la prolifération incontrôlée de cellules malignes immatures qui vont d’abord envahir la moelle osseuse puis d’autres organes suite à leur passage dans le sang. La leucémie aigue promyélocytaire (LAP) est une LAM particulière dans laquelle les CN PML sont anormaux. Suite au traitement par une combinaison d’acide rétinoïque et d’arsenic, les CN PML normaux se reforment entraînant la différenciation des cellules leucémiques vers un stade mature et leur élimination, permettant la guérison des patients. La LAP est la seule leucémie pour laquelle il existe un traitement ciblé. Les patients atteints d’autres types de LAM sont actuellement traités par combinaison de doxorubicine et de cytarabine, des agents de chimiothérapie large spectre. Nos résultats préliminaires montrent que PML est importante dans la réponse thérapeutique aux agents de chimiothérapie classique. Le but de ce projet est d’étudier in vivo le mécanisme par lequel la protéine PML exerce un rôle en réponse à ces agents. En effet, nous savons que PML est un senseur d’oxydation et les chimiothérapies engendrent du stress oxydant. Notre hypothèse est que la protéine PML est importante dans le déclenchement de la mort des cellules cancéreuses par ces chimiothérapies. Nous souhaitons donc étudier le rôle de PML dans la réponse aux traitements à la doxorubicine et la cytarabine dans le contexte de la LAM due à l’oncogène de fusion MLL/ENL.
Bénéfices attendus
Nous espérons pouvoir définir le rôle et les mécanismes liés à PML dans la réponse thérapeutique aux agents de chimiothérapie doxorubicine et cytarabine. Ces résultats pourraient permettre de mieux connaître le mode d'action de ces traitements très largement utilisés chez les patients, et ainsi de les optimiser et de mieux les utiliser en fonction des pathologies de chaque patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à une première injection intraveineuse (correspondant à la greffe de cellules leucémiques), puis à un éventuel prélèvement intra-fémoral environ deux semaines plus tard. Les traitements seront ensuite administrés par injections intra-veineuses ou intra-péritonéales sur animaux vigiles pendant maximum 5 jours d'affilée (maximum trois injections lors d'une seule journée). Chacun de ces gestes ne dure pas plus de quelques minutes. D'autres prélèvements intra-fémoraux pourront être réalisés post-traitement pour monitorer la rechute, espacés de minimum deux semaines.
Impact sur les animaux
Nous avons pu constater dans certains cas une perte de poids chez des souris en cours de traitement. Cependant, ici les traitements ne dureront que 5 jours et dans la grande majorité des cas, les animaux reprennent du poids à l'arrêt du traitement. Néanmoins, si la perte de poids venait à être trop importante (plus de 20% du poids initial), nous procèderons à l'euthanasie plus précoce des animaux. L'autre effet indésirable peut être une souffrance liée à l'atteinte de la phase finale de la leucémie. Nous pouvons éviter cela de par notre bonne connaissance de la cinétique de développement de la maladie et par son monitoring via l'apparition de splénomégalie détectable par simple palpation.
Devenir
Atteints de leucémie, tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, et les organes nécessaires aux analyses ultérieures seront prélevés.
Remplacement
L’objectif du projet est de déterminer le mécanisme par lequel la protéine PML joue un rôle dans la réponse aux chimiothérapies classiquement utilisées chez l’Homme dans les cas de LAM. Nous avons au préalable testé ces molécules ex vivo sur les modèles cellulaires tels que des lignées de cellules leucémiques immortalisées ou encore des cellules souches embryonnaires de souris. Il est maintenant nécessaire d’être dans des conditions qui reproduisent au maximum celles retrouvées chez les patients comme le micro-environnement des cellules myéloïdes, les interactions avec les autres types cellulaires, ou encore la métabolisation des médicaments par un organisme entier. Enfin, PML et la mitochondrie sont deux éléments cellulaires très sensibles au stress oxydant, leur étude en modèle animal permet de retrouver le même statut de stress oxidatif que chez le patient (hypoxie notamment).
Réduction
Une estimation des effectifs nécessaires pour mener l’étude a été faite en tenant compte de données antérieures, afin de garantir l’obtention de résultats interprétables. Chaque groupe sera donc constitué de 12 à 28 souris. Nous utiliserons au maximum 768 souris sur les 3 ans que durera le projet, réparties en un groupe contrôle et 5 groupes tests (2 molécules thérapeutiques combinées, 2 inhibiteurs seuls et les combinaisons de ces différentes molécules). Quatre temps d’analyse (entre 2h et 5 jours post-traitement) seront réalisés pour chacun des 4 modèles de souris développant des leucémies.
Raffinement
Les animaux seront surveillés à l'aide d'une grille d’évaluation, tenant compte notamment de leur apparence et de leur comportement. Elle sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher une mesure corrective (séparation en cas d'agressivité inter-individus, accès facilité à la nourriture, désinfection d'une plaie, etc.). Ce suivi clinique sera quotidien lors de la phase de traitement. L'utilisation d'antalgique ou analgésique sera possible jusqu'à la phase de croissance de la leucémie, mais ne sera pas envisageable à partir de la phase de traitement au risque d'induire un stress oxydant, auquel est très sensible la protéine étudiée.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. La grande expérience de notre laboratoire sur la protéine PML montre que PML chez l’Homme et chez la souris sont proches en séquences et en fonction. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les études passées et présentes menées dans ce domaine par la communauté scientifique sont réalisées essentiellement sur ce modèle. La composition de la moelle osseuse change avec l’âge des individus, notamment la quantité de progéniteurs. Il existe de nombreux sous-types de LAM de l’adulte, dont certains touchant des cellules à un stade précoce de leur développement. Ainsi nous utilisons des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations. Nos études précédentes et celles faites dans les autres laboratoires travaillant dans ce domaine sont couramment réalisées à ce stade de développement.
Caractérisation de la réponse immunitaire et de l’implication des neurones sensoriels dans un modèle murin de nécrolyse épidermique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Pour étudier la nécrolyse épidermique toxique, réaction allergique rare à un médicament où la couche supérieure de la peau se nécrose et se décolle, 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 70 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère. Les procédures comprennent une biopsie de queue pour le génotypage, un rasage du dos et du ventre, un test de chaleur dans un bain à 52 °C que le porteur dit "sensiblement douloureux", de 2 à 7 injections sans anesthésie, l'élimination chimique des neurones sensoriels ou l'application d'un produit allergisant et irritant. Dans la première partie, un test de Nikolsky, pression du doigt sur la peau pour voir si l'épiderme se détache, est pratiqué chaque jour sous anesthésie, les oreilles étant mesurées sous anesthésie cinq jours sur sept pendant 21 jours au plus, et le porteur prévoit œdème, perte de poids, atteintes des muqueuses et conjonctivites possibles. Les souris qui présentent un décollement de l'épiderme, qu'il compte parmi les "premiers symptômes cliniques" de la maladie, sont mises à mort aussitôt, et la peau de toutes est ensuite analysée.
Objectifs
Les réactions d’allergie médicamenteuse sont des effets secondaires fréquents chez les patients hospitalisés (1‐3%), dont la prise de médicament est l’élément déclencheur. Ces réactions allergiques peuvent être de sévérité très variée mais la plus sévère est la nécrolyse épidermique toxique. Il s’agit d’une réaction rare (2-4 patients/million d’habitants/an) mais extrêmement sévère, avec décollement et nécrose de la partie supérieure de la peau. Ces réactions sont potentiellement mortelles (~30%) ou entraînent fréquemment de graves séquelles (>50% des patients). L’un des premiers symptômes de la nécrolyse épidermique toxique est une douleur cutanée perçue par des neurones sensoriels spécialisés dans la peau. Des recherches récentes ont mis en évidence que les interactions entre les neurones sensoriels et le système immunitaire participent activement au développement des maladies de la peau. Pour mieux comprendre la sévérité de cette maladie, un modèle très récemment mis au point par l'équipe et mimant les symptômes chez la souris sera utilisé. L’objectif de ce projet sera dans un premier temps de mieux caractériser la réponse immunitaire dans la peau et dans un deuxième temps, d'évaluer le rôle potentiel des neurones sensoriels dans le développement de la nécrolyse épidermique toxique dans ce modèle de souris.
Bénéfices attendus
1/ Caractérisation de la dynamique de la réponse immunitaire d’un modèle de souris de nécrolyse épidermique au cours du temps 2/ Existence d'interactions entre les neurones sensoriels et les cellules immunitaires qui participent au développement de la nécrolyse épidermique toxique.
Procédures
Les souris sont génotypés avec une biopsie de queue de 1mm entre 10 et 15 jours. Les souris seront rasées sur le dos et le ventre, cette procédure est réalisée sous anesthésie à l'isoflurane et dure 30s. Le test à la chaleur réalisé avec un bain marie chauffé à 52°C pendant 15s est perçu comme sensiblement douloureux par la souris mais n'induit aucune brûlure ou douleur persistante chez l'animal. 1ère partie des animaux : Les animaux seront injectés en vigiles par injections à plusieurs reprises (selon les animaux = entre 2 et 7 injections au total, durée 30sec). La déplétion chimique des neurones sensoriels sera faite par injection sous cutanée (3 injections, 30sec). La déplétion des CD4 sera faite par injection intra-péritonéale (1, 2 ou 3 injections, 30sec). Le transfert des cellules sera fait par injection sur des animaux anesthesiés (1 injection, 40sec). Des tests de Nikolsky (legère pression de la peau avec le doigt) seront réalisés sur les animaux quotidiennement sous anesthésie (30 sec). Les animaux seront pesés quotidiennement et la température rectale sera prise de manière bi-hebdomadaire (45sec). Les oreilles des animaux seront également mesurées quotidiennement 5jours/7 sous anesthésie (durant 21 jours maximum, durée 30 sec). 2ème partie des animaux : Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre au début des procédures. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles et le dos, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 1h.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue réalisé pour le génotypage peut entrainer une douleur légère de courte durée. Les souris seront rasées sur le dos et le ventre pour observer les atteintes cutanées, ce qui n'entraine pas de douleur mais un léger inconfort durant la procédure. Les anesthésies peuvent entrainer du stress chez les animaux. Les injections génèrent un stress et une légère douleur. La déplétion des neurones sensoriels entraine une baisse de la température et de faibles démangeaisons lors de la première injection dans les 60min suivant l'injection. Sur le long terme, elle entraine une perte de sensibilité mais pas de changement de comportement des animaux, possible dépigementation du poil (taches blanches). Pour les animaux qui vont développer une réaction mimant les symptômes de la nécrose épidermique toxique avec des atteintes cutanées : on s'attend à ce que les premiers symptômes arrivent 9 jours après le début de la procédure, et a ce que les animaux développent dans un premier temps un léger œdème cutanée (qui sera suivi par l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille) ce qui pourra engendrer de l'inconfort, peux être des grattages chez ces animaux. On pourra aussi observer une perte de poids. Puis dans un deuxième temps on devrait observer un détachement de l’épiderme par endroit. Celui-ci sera suivi quotidiennement par la réalisation d’un test de Nikolsky sur des animaux anesthesiés (en exerçant avec un doigt une très légère pression / frottement sur la peau afin de voir si l’épiderme se détache). A noter que des atteintes des muqueuses, et des conjonctivites sont possibles ainsi qu’une modification significative de l’activité. Le modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en vue de réaliser des analyses sur la peau. Ces analyses permettront d'analyser les populations de cellules qui infiltrent le tissu au cours du temps afin de caractériser la réponse immunitaire de notre modèle et également d’évaluer l’implication des nocicepteurs dans le développement de la nécrolyse épidermique toxique.
Remplacement
La finalité du projet est de mieux comprendre la réponse immunitaire qui se met en place et qui aboutit au développement des symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique. Cette compréhension au niveau du modèle murin pourra permettre de mieux comprendre l’origine de cette sévérité et ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies. Le signe clinique clé de la pathologie est le détachement de la membrane basale suite à l’activité cytotoxique de cellules spécifiques qui vont infiltrer le tissu. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour caractériser cette pathologie.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience. Il a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Le contrôle d'une pathologie moins sévère où les acteurs cellulaires sont les mêmes (eczéma de contact), ne sera réalisé qu'une seule fois.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront maintenus à 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, pour prévenir tout stress et limiter la survenue de symptômes douloureux ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 7jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dès l’apparition des premiers symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique (décollement de l'épiderme), les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour explorer les maladies immunologiques, telles que l’allergie ou l’inflammation cutanée, en raison des nombreux outils qui ont été développés pour caractériser les réponses immunitaires. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. Les souris entrent dans les procédures à l’âge de 5-22 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.
Identification des mécanismes compensatoires du Csf1 dans la survie des macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue à la naissance et des administrations de tamoxifène par gavage, une partie d'entre elles étant en outre irradiées aux pattes avant une greffe de moelle osseuse et un prélèvement sanguin rétro-orbital. L'objectif est de comprendre comment les macrophages survivent lorsque les fibroblastes produisent moitié moins de Csf1, une question de recherche fondamentale sur l'immunité. Les retombées thérapeutiques annoncées, de nouvelles cibles contre des maladies comme l'ostéopétrose, restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés qu'in vivo et juge la souris "cruciale".
Objectifs
Les macrophages sont des cellules immunitaires présentes dans divers tissus, tels que la peau et le pancréas. Ils ont pour rôle d'ingérer les débris cellulaires et les agents pathogènes. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, une cytokine produite par les cellules environnantes. Sans Csf1, le macrophage n'est pas capable de survivre et disparaît de manière permanente et complète du tissu ciblé. Des résultats préliminaires du laboratoire ont montré que la survie des macrophages pancréatiques et cutanés dépend du Csf1 produit par les fibroblastes. En effet, lorsque les fibroblastes ne produisent plus de Csf1, tous les macrophages pancréatiques et cutanés disparaissent. Cependant, si nous bloquons seulement la moitié de la production de Csf1 par les fibroblastes (ce qui signifie qu'ils produisent seulement la moitié de la quantité habituelle de Csf1), les macrophages pancréatiques et cutanés survivent normalement. L'objectif de ce projet sera donc de comprendre les mécanismes compensatoires mis en place au sein du pancréas et de la peau pour permettre la survie des macrophages avec seulement la moitié de Csf1 produit par les fibroblastes. Ce projet nous permettra ainsi d'approfondir notre compréhension des interactions entre les fibroblastes et les macrophages dans les tissus, ainsi que des mécanismes permettant aux macrophages de survivre dans des conditions de carence en Csf1.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à comprendre comment les macrophages parviennent à survivre avec une quantité réduite de Csf1. Cela pourrait permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, les souris avec une mutation dans le gène Csf1 ont une quasi-absence de tous leurs macrophages. Ces souris présentent des symptômes tels que nanisme, surdité, infertilité, ostéopétrose et une mortalité élevée quelques semaines après la naissance. Cependant, l'injection de Csf1 à ces souris permet de rétablir en grande partie le nombre de macrophages présents dans les tissus ainsi que les pathologies associées. De plus, chez des souris de 2 mois avec des fractures fémorales, l'administration de Csf1 perturbe la cicatrisation et semble induire une ostéopétrose. En revanche, la régénération osseuse chez les souris âgées a pu être ramenée à des niveaux normaux uniquement en stimulant l'activation des cellules souches du squelette et bloquant le Csf1. Ces résultats mettent en évidence l'importance de réguler finement les niveaux de Csf1 dans les tissus. Ce projet permettrait ainsi d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies liées à une perturbation de la signalisation du facteur Csf1, comme l'ostéopétrose. De plus, ce projet vise à développer des outils pour manipuler les macrophages que ce soit au cours de contexte physiologiques et pathologiques.
Procédures
Procédure 1 : 846 souris seront tatouées, et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. 162 souris seront réutilisées pour les procédures 2 et 3. Procédure 2 : 90 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : 72 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront irradiées pour dépléter la moelle osseuse endogène puis injectées par voie intra-veineuse avec des cellules de moelle osseuse exogène pour reconstitution, puis mises à mort 2 mois après la greffe. Ces mêmes souris seront prélevées par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration de tamoxifène par voie orale, à l'aide d'une canule à embout flexible peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes ( nuisances légères). - Les animaux subiront une irradiation partielle des pattes arrières ainsi qu'une injection intraveineuse pour transplantation de moelle osseuse. Pendant toute la durée de l'irradiation ainsi que l'injection de moelle osseuse, les animaux seront maintenus sous anesthésie (envrion 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après l'irradiation, les aimaux se retouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées.
Devenir
A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.
Remplacement
La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, telles que la peau et le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment les macrophages peuvent s'adapter en présence de niveaux réduits de Csf1 produits par les fibroblastes ne peut être réalisé qu'in vivo puisque les facteurs compensatoires mis en place pour la survie des macrophages peuvent provenir non seulement des fibroblastes, mais également d'autres types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans le maintien des macrophages pancréatiques ou cutanés. De même, l'étude du renouvellement des macrophages au sein des tissus requiert l'utilisation de modèles animaux, car les signaux permettant la migration des monocytes à travers les tissus et leur différenciation en macrophages ne peuvent être reproduits in vitro
Réduction
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Dans le cadre de cette étude, les accouplements seront faits pour permettre que toutes les femelles soient utilisées pour les expériences concernant ce projet, et que les mâles puissent être utilisés pour d’autres projets du laboratoire. Ceci permettra d’utiliser tous les animaux générés dans les élevages.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines puisque nous nous intéressons au rôle compensatoire du Csf1 sur les macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.
Mise au point et utilisation d’un modèle expérimental d’inflammation cérébrale dans des souris immunodéficientes humanisées.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
358 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intraveineuses, une injection dans le cerveau et des injections répétées dans l'abdomen, ainsi que des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour analyser les organes touchés. Le porteur met au point un modèle d'inflammation cérébrale médiée par des lymphocytes humains, présenté comme une alternative à l'usage de primates. Il affirme que cette étude animale est "la seule" à pouvoir valider son hypothèse.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mettre au point un modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par des lymphocytes T humains. Une fois le modèle mis au point, nous pourrons questionner le rôle d’une autre population lymphocytaire présentant in vitro un caractère cytotoxique et que nous avons trouvé accumulé dans le sang, le liquide céphalorachidien et les zones inflammatoires de patients atteints de maladie neurodégénérative. In fine, nous évaluerons une thérapie à base d’anticorps pouvant spécifiquement cibler cette population lymphocytaire agressive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront doubles : (1) mise au point d’un nouveau modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par les lymphocytes T humains qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant particulièrement les cellules humaines. (2) évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant une population lymphocytaire exacerbant les signes d’inflammation cérébrale chez l’homme.
Procédures
Les souris anesthésiées seront injectées en intraveineuse (i.v.), cet acte est rapide (
Impact sur les animaux
Effet de l’injection en i.v. et de la prise de sang sur les souris=> stress lié à l’anesthésie. Effet de l’injection i.p. =>stress lié à la contention. Effet lié à l'induction de l'anesthésie profonde pour l’injection intracérébrale sur les souris => stress lié à la contention. Douleurs post-opératoires potentielles minorées par des antalgiques =>stress lié à la contention pour l'injection d'antalgiques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cibles de la maladie induite.
Remplacement
In vitro, nous avons observé une accumulation de cellules immunitaires particulières dans des d’échantillons biologiques de patients atteints de sclérose en plaque (sang, liquide céphalorachidien, coupe de cerveau). Cette observation nous amène à émettre l'hypothèse qu’elles pourraient avoir un rôle délétère dans la maladie. Cette étude chez l’animal est la seule à pouvoir nous permettre de répondre à l’hypothèse dans sa complexité et à valider la stratégie thérapeutique envisagée sans avoir recours aux grands animaux.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Deux études pilotes sont envisagées afin d'établir le protocole expériemental dans lequel seront évaluées nos hypothèses. Les procédures de cette DAP ne seront envisagées que si (1) les études pilotes sont validées et si (2) les GO/No GO inclus à la fin des expérimentations conduisent à des GO permettant de continuer l'étude pour vérifier les hypothèses. Enfin, les groupes ont été constitués grace au travail récent de scientifiques ayant présentés leurs résultats dans des journaux spécialisés et sujets à une évaluation par les paires. Les expériences pilotes et les GO/No GO permettront ainsi de réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur un certain nombre d’actes se feront sous anesthésie, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général, administration d'antalgique) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. On parle alors de souris humanisées. Le modèle expérimental proposé ici : l’humanisation de souris immunodéficientes (mâles et femelles) de 8-12 semaines de vie par l'injection de lymphocytes T CD4 +/- T CD8 humains est le seul qui nous permette de confirmer in vivo le pouvoir aggravateur des cellules CD8-NK-Like. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques.