Souris

313 souris génétiquement modifiées pour modéliser le syndrome NARP vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à quatre âges, des tests de force musculaire, de motricité, d'équilibre et d'endurance, ainsi que des IRM et échocardiographies sous anesthésie, le porteur attendant un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire. L'objectif est de caractériser cette lignée avant de tester des candidats médicaments, une étape que le porteur décrit comme "jamais faite auparavant de manière détaillée". Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent "incomplets" et que le recours à l'"organisme tout entier" est une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une toxine bactérienne reproduisant le syndrome hémolytique urémique, ainsi que des prises de sang répétées, pour tester une molécule censée améliorer la survie. Le porteur décrit une asthénie, une diarrhée et des tremblements marquant le point limite, et s'appuie sur l'article 14 de la directive pour réaliser certaines injections sans anesthésie. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", cette pathologie systémique ne pouvant s'étudier sur un modèle uniquement cellulaire.

Objectifs

Le syndrome hémolytique urémique (SHU) est une maladie infectieuse grave le plus souvent d’origine alimentaire. Elle est une forme de microangiopathies thrombotiques (MAT), un ensemble de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. Chez l’enfant, ce syndrome est le plus souvent causé par une infection due à une bactérie appartenant à la famille des Escherichia coli (E. coli) producteurs de toxines, appelées les Shiga-toxines (STx1 et 2). Ces toxines entraînent l’inflammation et la mort cellulaire massive. Le traitement de première intention repose sur les échanges plasmatiques. Actuellement, il n’existe pas d’options thérapeutiques ayant fait leurs preuves pour le traitement d’un SHU autres que des soins supports. La mise au point d’une véritable thérapie afin de traiter le SHU est nécessaire et primordiale afin de diminuer la mortalité et la morbidité. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires : le déficit en CLU était associé à une mortalité accrue et la supplémentation en CLU a amélioré la survie des souris. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de la CLU dans la physiopathologie du SHU et son rôle protecteur potentiel afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.

Bénéfices attendus

Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance renale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.

Procédures

1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner 182 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 3/ L’Injection intra veineuse est utilisée dans 2 procédures du projet. Elle concerne 116 animaux, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. A une dose plus importante de Stx-2, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie, selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.

Réduction

Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (244) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront agées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse un vecteur de thérapie génique, une prise de sang et un jeûne de seize heures, avant le prélèvement de leur foie auquel elles ne peuvent pas survivre. Le projet vise à faire exprimer une protéine modifiée pour la rendre reconnaissable par un anticorps du commerce et faciliter son étude. Le porteur situe les bénéfices dans la biologie fondamentale et affirme que le foie ne peut être reproduit fidèlement en culture cellulaire.

Objectifs

L'utilisation d'anticorps pour purifier une protéine d'un fluide biologique est une stratégie bien connue et qui a fait ses preuves. Cependant, pour certaines protéines, il s'avère impossible d'obtenir un anticorps spécifique. Il est donc ici envisagé d'utiliser des souris transgéniques n'exprimant pas une protéine d'intérêt, et de réintroduire par thérapie génique la même protéine très légèrement modifiée afin qu'elle soit reconnue par un anticorps du commerce. Les souris obtenues exprimeront alors une protéine modifiée, ce qui rendra son étude possible. L'étude de protéines purifiées permet des avancées significatives dans le domaine de la biologie fondamentale, mais aussi des médecines humaine et vétérinaire. Il sera par exemple possible d'isoler la protéine d'intérêt afin de caractériser les autres molécules avec lesquelles elle entre en interaction.

Bénéfices attendus

La purification spécifique d'une protéine permettra son étude approfondie (liaison à l’ADN, interaction protéine-protéine, identification de ligands). Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront une contribution aux domaines de la médecine, de la pharmacologie et de la nutrition.

Procédures

Les animaux recevont une injection intraveineuse sous anesthésie locale (2 minutes de contention dans un dispositif prévu à cet effet), et il sera pratiqué une prise de sang (30 secondes de contention manuelle), ainsi qu'une mise à jeun de 16h, dont seulement 4h pendant la période nocturne.

Impact sur les animaux

L'injection au niveau de la veine de la queue du virus pour la thérapie génique demande une contention de l’animal stressante, et l’injection engendre éventuellement une inflammation temporaire. La mise à jeun peut entrainer une légère hypoglycémie, mais qui ne devrait pas chuter en-dessous d'un seuil mettant en péril la santé de l'animal.

Devenir

Comme les animaux ne peuvent pas survivre au prélèvement de leur foie, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L’utilisation de l’animal entier est envisagée car le foie est un environnement complexe, qui ne peut pas être mimé avec fidélité en culture cellulaire. Cet organe est constitué d’une grande diversité de cellules et est affecté par des signaux hormonaux et nutritionnels provenant de tout l’organisme. Cependant, la phase animale n’est engagée que si des tests préliminaires sur des cellules en culture des différents transgènes utilisés sont concluants (gène rapporteur, reconnaissance par un anticorps du commerce). Ces tests ont déjà été fait sur des lignées cellulaires du commerce puis sur des cellules isolées d’un animal, et sont concluants.

Réduction

L’utilisation de lignées de grande proximité génétique permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, les tests de puissance statistique pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé au cours du projet

Raffinement

Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les 2 heures le premier jour puis 2 fois par jour pendant 1 semaine) après l'injection à la veine de la queue et après le prélèvement sanguin à la joue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection. Une méthode d'évaluation du stress et de la douleur est prévue. Pour être la moins pénible, la période de jeûne est planifiée ainsi : 12h pendant toute la période de jour durant laquelle les souris dorment et ne mangent que 10% de leur bol alimentaire quotidien, et 4h en période de nuit. Ce jeûne permet d’arriver au pic d’activité de la protéine d'intérêt, tout en évitant une période de privation de nourriture trop longue.

Choix des espèces

Les modèles d’invalidation de gène que nous utilisons ne sont disponible que chez la souris. Les animaux qui sont utilisés sont de jeunes adultes, dont le foie est arrivé à maturité. Comme l'étude porte sur le métabolisme et que la race de souris utilisée développe des troubles métaboliques spontanément avec l'âge, les animaux trop vieux sont à éviter.

108 souris, jeunes et âgées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le muscle de leur patte est lésé par injection de venin de cobra afin d'étudier le rôle de deux protéines dans la régénération musculaire. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il indique léser les deux pattes de chaque animal pour diviser par deux le nombre de souris, et conclut que des lignées cellulaires ou modèles 3D ne reproduisent pas le muscle en régénération.

Objectifs

Des souris saines seront utilisées pour ce projet. Des études préliminaires dans le laboratoire ont montré la diminution avec l'age de protéine présente au sein du muscle et qui pourrait impacté le bon fonctionnement de la régénération musculaire. Le processus de lésion et régénération musculaire sera induit par une injection de toxine (venin de cobra). La toxine déclenche le processus de régénération musculaire sans affecter le comportement de l'animal. Cette technique permet une lésion de l'ensemble du muscle injecté de façon reproductible. L'injection de toxine sera utilisée pour suivre les différentes étapes de la régénération musculaire et voir l'effet de nos deux protéines d'intérêt sur le processus de régénération musculaire. Pour ce faire, nous allons effectuer l'extinction de ces protéines au sein des muscles de souris jeunes puis nous allons ajouter ces protéines au sein de muscles de souris agées afin d'observer si cela améliore leur régénération musculaire.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats du projet permettront de mettre en évidence le rôle de deux protéines d'interêt dans le processus de régnération musculaire dans la muscle squelettique, et cela dans le muscle jeune et plus agé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules qui participent à la réparation du muscle squelettique, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative par la mise en évidence de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Trois injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Deux injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée avant et après la lésion musculaire.

Impact sur les animaux

Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de stress chez l'animal et n'est utilisé que pendant un court temps, non nuisible pour l'animal. De plus, l'injection d'analgésique avant et après l'injection permet de réduire au maximum la douleur chez l'animal et donc le stress. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.

Remplacement

Les paramètres d'auto-renouvellement des cellules souches musculaires et leur potentiel de fusion avec les fibres musculaires sont essentiels pour comprendre la physiopathologie musculaire. Notre projet s'intéresse aux interactions entre les différents types cellulaires au sein du muscle en régénération, et nécessite donc des modèles murins. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ni de modèle 3D qui ne reproduisent pas fidèlement la diversité et l'organisation des types cellulaires au sein du muscle en régénération.

Réduction

L'injection de cardiotoxine dans les deux pattes présente une nuisance supplémentaire pour les animaux mais reste tolérable et tout sera mis en œuvre pour limiter la souffrance des animaux. Cette double injection nous permettra de diviser par deux le nombre de souris nécessaire en utilisant chaque souris pour deux analyses différentes. Les expériences seront effectuées sur un lot expérimental réduit de 6 souris afin de garder suffisamment d’individus pour effectuer des analyses statistiques robustes et fiables tout en réduisant le nombre d’animaux au strict minimum. Nous utiliserons comme test statistique le test de Student pour comparer la moyenne des différentes conditions biologiques expérimentales entre elles (groupe contrôle versus traité)

Raffinement

1)L es animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine à leur arrivée au sein de l'animalerie. 2) En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés par nos soins 2 fois par semaine. Cela va permettre de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d'interaction sociale, tout changement pourrait refléter une souffrance, douleur ou stress même minime chez l'animal. Les douleurs dues à la lésion musculaire et le mécanisme de régénération se mettant en place dans les premières 24h, l’animal sera particulièrement surveillé pendant cette période. L'animal sera mis à mort en cas de douleurs trop importantes pour éviter toute souffrance inutile. 3) Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. 4) La procédure est peu invasive (injection intramusculaire simple sans chirurgie) pour permettre d'induire le processus de régénération musculaire et l'injection des molécules. 5) Des anesthésiques (isoflurane 3-4%) et analgésiques seront utilisés au cours de la procédure afin de prévenir au maximum le stress des animaux. L'analgésique sera utilisé avant et après l'induction de la lésion musculaire et l'anesthésique au cours de l'induction de la lésion musculaire ainsi que durant les injections des molécules d'intérêt. 6) Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Afin d'observer si nos protéines ont un rôle dans le processus de régénération musculaire physiologique, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées afin de découvrir le rôle de nos deux protéines d'intérêt. Dans un second temps, afin d'observer si nos protéines peuvent avoir un effet sur la régénération musculaire dans un contexte de vieillissement, des experiences sur souris agées de 24 mois seront effectuées. Seules des souris mâles seront utilisées pour cette étude comme les hormones femelles peuvent impactées le processus de régénération musculaire, et que les mâles sont principalement touchés par les maladie du muscle comme la dystrophie.

1755 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le travail porte sur des embryons pour étudier le rôle de récepteurs d'un facteur de guidage neuronal, les femelles gestantes recevant une injection destinée à bloquer l'action d'hormones sexuelles et les animaux étant identifiés par prélèvement d'un fragment d'oreille. Le porteur affirme que ces souris génétiquement modifiées ne développeront pas de douleur, ce qui contraste avec la gravité modérée déclarée pour l'ensemble. Il conclut que la complexité du développement cérébral ne peut être reproduite in vitro et que la souris partage 98 % de son patrimoine génétique avec l'humain.

Objectifs

Dans le monde animal, la plupart des espèces possèdent un axe de symétrie avec des extrémités avant/arrière et des faces ventrale/dorsale. Le système nerveux central (SNC) de ces espèces est composé de 2 hémisphères qui sont reliés par des neurones particuliers, les neurones commissuraux. Ces neurones projettent leur fibre sur des neurones cibles situés du côté opposé. Au début du XXième siècle, S. Ramon y Cajal avait déjà décrit en détail ces connexions reliant les deux moitiés du cerveau, et observé que les fibres nerveuses croissent en direction d’une structure ventrale et médiane, la plaque du plancher. Des études biochimiques ont identifié la protéine responsable de cette croissance. Enfin, des études ultérieures identifièrent plusieurs récepteurs à ce facteur de guidage neuronal. Toutefois, ces études sont contradictoires et sont soumises à controverse. Ce projet vise à trancher définitivement quant aux rôles de ces différents récepteurs à l’aide de modèles murins permettant de « casser » spécifiquement des gènes avec un contrôle spatial (tissu spécifique) et temporel (au moment voulu).

Bénéfices attendus

Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle de différents récepteurs à un facteur de guidage neuronal pendant le développement du système nerveux central. Une meilleure compréhension des mécanismes développementaux impliqués dans la mise en place du système nerveux central pourrait faciliter la compréhension de troubles psychiatriques comme l’autisme ou l’épilepsie ou des problèmes moteurs (strabisme). En effet, ces pathologies sont associées à des défauts de connexions neuronales qui mettent en jeu les gènes étudiés dans ce projet.

Procédures

Tous les animaux seront marqués par la pose d'une bague auriculaire et un prélevement d'un bout d'oreille sera réalisé à l'aide d'un poinçon. Ce geste d'identifcation/genotypage est réalisé en moins de 10 secondes. Les femelles gestantes de la procédure 2 et 3 recevront une injection intrapéritonéale d’un produit dont l’activité prévient l’interaction entre des hormones sexuelles et leurs récepteurs.Il n’est pas connu de nuisances associées à ces injections et ce geste est bref (5 secondes). Pour les animaux de la procédure 1 seul un geste réalisé (identifaction/prélevement pour génotypage) et pour les animaux des procédure 2 et 3 un second geste est réalisé (injection intrapéritonnéale).

Impact sur les animaux

Les animaux génétiquement modifiés utilisé dans cette demande de projet ne développeront pas de problèmes pouvant être à l’origine de douleur. En effet, nous utilisons un système génétique permettant d’invalider spécifiquement les gènes étudiés dans un tissu et à un temps voulu. Ce modèle murin permet de définir la localisation où les gènes sont invalidés et le moment désiré. Il permet de contourner les problèmes associés à la perte total du gène

Devenir

Ils seront tous mis à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

La compréhension du développement du système nerveux central ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du tissu cérébral est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions cellulaires et de la communication intercellulaire. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur une analyse en microscopie et ne fera pas intervenir de tests statistiques. Les tissus seront techniqués de manière à pouvoir analyser de nombreuses caractéristiques sur un individu. Les analyses ex vivo seront réalisées sur un nombre défini d’échantillons déterminé par l’utilisation d’un test de puissance statistique.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Les modèles murins utilisés dans cette demande de projet permettent un contrôle spatial et temporel de l’invalidation des gènes. Grâce à ces modèles génétiques, nous restreignons l’effet de la perte de ces gènes aux structures étudiées. De plus, les embryons sont analysés avant que les structures responsables de la douleur soient mises en place.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Nous travaillerons sur les embryons car c’est à ce moment-là que le système nerveux central se développe.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique d'un vecteur délivrant de l'ARN par différentes voies, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis est tué pour prélever ses organes. Le porteur présente cette étude de biodistribution comme exigée par les autorités réglementaires en vue d'un usage futur chez l'humain. Il cite des modèles alternatifs comme les organoïdes ou les organes sur puce, mais conclut qu'aucun ne renseignerait sur la dissémination de l'ARN dans un "organisme complet".

Objectifs

La caractérisation du profil de biodistribution d'un produit après administration in vivo est un élément majeur du programme de développement préclinique. Les études de biodistribution, exigées par les autorités réglementaires, ont pour objectif de déterminer la dissémination du matériel biologique dans les tissus et les fluides ciblés et non-ciblés, ainsi que leur transmission dans les lignées germinales. Ce projet a pour objectif d’évaluer la biodistribution d’un vecteur non intégratif délivrant de l’ARN chez l’animal, nécessaire pour comprendre la pharmacologie du produit. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. Plusieurs voies d’injection vont être testées, avec un ensemble d’organes analysés post mortem, en relation avec la voie d’injection en question.

Bénéfices attendus

Cette étude de Biodistribution chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en déterminant comment il se répartit dans les différents organes et tissus de l’organisme; - de valider l’expression transitoire de l’ARN distribué sans évènement(s) d’intégration dans le génome; - d’évaluer son efficacité de dissémination pour optimiser les doses et les schémas posologiques pour maximiser son efficacité thérapeutique; - de conceptualiser la thérapie adaptée à l’utilisation du produit en termes de contenu du vecteur et de méthodes d’administration appropriées pour atteindre les cibles biologiques.

Procédures

Les animaux recevront 1 seule injection, soit par voie intraveineuse, ou intramusculaire, ou sous-cutanée, ou intradermique (durée 2-3 minutes). On réalisera un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) sous anesthésie gazeuse, avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Dans le cadre d’une étude de biodistribution, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. Dans cette étude, l’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN se fera par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. Ces injections peuvent entrainer un stress ou une douleur chez l'animal. Par ailleurs, ces souris subiront une anesthésie pouvant induire un stress lors de la contention.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal pour une étude de biodistribution peut se faire selon : - L’utilisation de modèles alternatifs tels que la culture de cellules adaptées, les modèles bio-informatiques ou les organoïdes; - l’utilisation d’organes sur puce qui permettent de modéliser la biodistribution dans un environnement plus proche de la réalité. Cependant, aucun de ces outils ne pourra apporter de réponses précises sur la biodissémination des ARN dans un modèle d’organisme physiologique complet nécessaire à la validité scientifique requise. La fonctionnalité du vecteur de transfert d’ARN prévu pour cette étude est systématiquement validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont.

Réduction

La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe, en comparant les résultats des études moléculaires et histologiques entre animaux ayant eu le vecteur non-intégratif amenant un ARN et les controles ayant eu le véhicule. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d'animaux, les mêmes organes seront utilisés pour l'ensemble des analyses, moléculaires et histologiques, évitant ainsi de doubler le nombre de souris.

Raffinement

Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans les études de biodistribution pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 12 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.

844 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 Gy puis greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes, pour développer une maladie du greffon contre l'hôte et chercher des cibles contre la leucémie. Le porteur décrit une perte de poids, un pelage terne et des atteintes cutanées, les souris atteignant 20 % de perte de poids ou un score clinique de 5 étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients restent générales, et les souris qui n'atteignent pas les points limites sont tuées deux à trois mois après l'irradiation faute d'évolution attendue.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles dans le traitement des rechutes de leucémie aigue myéloblastique ainsi que dans la maladie du greffon contre l'hôte (maladie induite par la greffe de cellules souches hématopoïétiques lors de traitement des hémopathie malignes). Tout d'abord dans la mise en place du modèle murin de leucémie aigue myéloblastique. Ensuite dans l'identification de nouvelles cibles avec des outils technologiques innovants. Par la suite, nous tenterons de traiter les animaux avec des traitements visant les nouvelles cibles identifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider une ou plusieurs molécules thérapeutiques qui auront été identifiés via différents processus autant chez la souris que chez l'homme.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Le temps total d'irradiation est de 10 minutes par souris. L'irradiation s'effectue dans une pièce adjacente à l'animalerie. Les animaux sont installés par 11 dans une cage à irradiation avec couvercle filtant. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seule ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses (+ ou - cellules leucémiques) pour un total de 100µl par souris. Le temps d'injection des cellules en comptant l'anesthésie est d'environ 1 minute par animal. Dans un second temps, les souris seront traitées selon le schéma adapté à la molécule avec des injections de 100µL de solution diluée dans une solution saline administrée par voie intrapéritonéale. Le temps d'injection des traitements est d'environ 30 secondes par animal. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois par expérience. Le temps de prélèvement est d'environ 1 minute par animal. Le volume maximale prélevé sera de 100µL. Le nombre d'intervention par souris est de minimum 2 à maximum 6.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pelage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi t. Ce score a été évalué par nos pairs spécialistes de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale. Concernant les souris simplement irradiées qui servent de validation de l'expérience, elles meurent d'aplasie. Elles auront de l'anémie et de la perte de poids. Lorsque le poids de ses souris atteint moins 20% du poids initial, ces souris seront mises à mort.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteint 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront mis à mort ainsi que les animaux qui n'auront pas atteint les points limites deux à trois mois après l'irradiation. Pour les procédures 1, 2 et 3, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus. Pour la procédure 4, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 3 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de molécules thérapeutiques sur le développement de la maladie du greffon contre l’hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l’utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l’hypothèse émise. Toutefois, toutes les expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo seront réalisées sur des cellules in vitro.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupées le plus possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été calculé par une approche statistique à l'aide du document « Estimation du nombre d’animaux nécessaires » de Hugues Jacobs.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 4 ou une perte de poids de 20% seront mises à mort. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établir le score clinique associé à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute souffrance. L'enrichissement et l'hébergement des animaux dépend entièrement des conditions imposées par l'animalerie. Ce qui consiste à déposer 3 enrichissements différents dans les cages comme les Nestlets, un smart home, ainsi que des Bed-r’nest. Le nettoyage des cages a lieu une fois toutes les deux semaines par les zootechniciens, mais les souris étant contrôlées tous les 2 jours par l'expérimentateur, les cages souillées sont changées rapidement.Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront mis à mort quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane et un anesthésique local type collyre d'oxybuprocaïne sera utilisé.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudiée depuis des décennies dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, ils possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doses d'irradiations auxquelles ils seront soumis.