Souris
Rôle de l’interleukine 28 dans le rejet aigu d’allogreffe sous CTLA4-Ig
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe de peau sous anesthésie, puis des injections répétées et des prélèvements de sang, l'isolement en cage après la chirurgie ajoutant un facteur de stress. Le porteur présente une étude pilote sur l'effet d'une molécule intestinale sur le rejet de greffe et mentionne, parmi les retombées attendues, le dépôt d'un brevet. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'observer la complexité du rejet à partir des seuls échantillons de patients.
Objectifs
La transplantation d’organes est le seul traitement de certaines pathologies, elle augmente de plusieurs années la durée de vie des patients. Cependant, le système immunitaire du patient reconnaît l'organe greffé comme étranger ce qui provoque un rejet de l'organe. Plusieurs traitements sont utilisés pour contrer le système immunitaire et donc le rejet. Les traitements historiques de prévention du rejet de greffe présentent de nombreux effets secondaires, ils réduisent l'espérance de vie des patients. Un des derniers traitements développés présente moins d'effets secondaires que les traitements historiques, mais il est moins efficace pour prévenir certains rejets spécifiques. Le risque de subir un rejet avec ce traitement semble relié à l'environnement des patients et leur microbiote. Le microbiote est l’ensemble des bactéries présentent naturellement sur et dans le corps humain. Il influence la fonction des organes et cellules, il peut provoquer la production de certaines molécules. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'effet d'une de ces molécules sur le rejet de greffe. Cet effet étant totalement inconnu, cette étude sera une étude pilote. Dans un modèle de greffe de peau de souris, nous analyserons la durée de greffe et l'effet de cette molécule sur les systèmes immunitaire et digestif.
Bénéfices attendus
Les informations obtenues permettront de préparer une étude sur l’effet d’une molécule, produite par l’intestin sous l’influence de bactéries. L'influence de cette molécule sur le rejet de greffe n'est, à ce jour, pas connue. A partir du sang de patients, nous avons obtenu des résultats montrant un lien entre ces bactéries, une molécule produite par l’intestin et le risque de rejet. Il nous est nécessaire d'obtenir des informations sur ; la durée de greffe en présence de cette molécule, l’effet de cette molécule sur l’intestin, les globules blancs et sa persistance dans le sang selon la façon dont elle est donnée aux souris. Ces informations nous permettront de construire d’autres expériences s’intéressant à l’effet de la modification des bactéries de l’intestin sur le rejet de greffe et à l’effet de l’absence de cette molécule sur le rejet. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les causes du rejet de greffe des patients traités par un nouveau traitement ayant moins d’effet secondaire que les traitements historiques. Ces résultats permettront de mettre au point un test pour déterminer quels patients feront plus probablement un rejet de greffe avec ce nouveau traitement et ne donner ce traitement qu’aux patients les moins à risque. Ces résultats pourraient aussi permettre de mettre au point des traitements, qui ajouté au traitement du rejet, limiterait le rejet de greffe. Enfin ces résultats nous permettraient de déposer un brevet.
Procédures
Nous réaliserons une greffe de peau sur 42 souris, la chirurgie durera 30 min par animal. Les animaux recevront un ou deux traitements dans l'abdomen ou sous la peau ; tout les 2 jours pendant une semaine puis deux fois par semaines pendant 2 semaines (7 souris) ou tous les jours pendant 3 semaines (21 souris) ou recevront les deux types d'injection (14 souris). Les injections dureront moins d'une minute chacune. Les 42 souris seront soumises à deux prélévements de sang, à une semaine d'intervalle. Chaque prélévement durera entre 3 et 5 minutes.
Impact sur les animaux
La réalisation d'une greffe de peau peut provoquer une douleur et un stress. Les animaux seront également seuls en cage après la chirurgie ce qui peut provoquer un stress. La répétition des injections est un autre élément de stress pour les animaux. Les traitements utilisés dans cette étude ne sont pas décrits comme toxique ou douloureux.
Devenir
Mise à mort pour analyse.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats à partir du sang de patients. Mais il n'est pas possible d’observer toute la complexité du rejet de greffe à partir de ces échantillons. Le rejet de greffe est le résultat des échanges entre de nombreuses molécules et cellules. Des expériences de greffe de peau sur des souris permettront de valider les observations faites sur le sang des patients greffés. Ces expériences permettent de donner aux souris le même traitement que celui reçu par les patients et d’observer les effets de la molécule, ajoutée au traitement, sur les organes et les cellules des animaux. Nous pourrons aussi observer la durée de vie de cette molécule dans le corps.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisé dans cette expérience au maximum. Nous avons calculé que 42 souris seront nécessaire pour nos observations et nous avons réduit le nombre d'animaux contrôles. Cette étude est une étude pilote, car aucune expérience de greffe de peau n'a été réalisée avec ce traitement jusqu'à présent. Grâce à cette étude pilote nous obtiendrons des données qui serviront à calculer le nombre d'animaux nécessaire pour de prochaines expériences. Nous prélèverons du sang aux souris toutes les semaines en même temps que l'observation de la greffe, pour limiter le nombre d'animaux utilisé. Nous ferons l’expérience sur la moitié des souris pour chaque groupe dans un premier temps. Puis nous analyserons les résultats avant de faire l’expérience sur le restant des souris uniquement si nécessaire.
Raffinement
L'environnement des souris sera enrichi par des refuges, de la cellulose, des cylindres de coton tout au long de la vie des animaux. Les animaux seront en groupe jusqu'à la greffe de peau puis ils seront isolés. Les souris seront anesthésiées pour la greffe de peau et elles recevront un anti-douleur au moment de la greffe. De l'alimentation humide sera mise au fond de la cage après la greffe. La douleur sera estimée tous les jours après la greffe grâce à une grille de notation de la douleur et du stress. Si les animaux montrent des signes de douleur, ils recevront un anti-douleur plusieurs fois par jour et une alimentation humide au fond de la cage si besoin. Toutefois si une douleur se poursuit plus de deux jours ou si la souris perd plus de 20% de son poids ou si la greffe est rejetée, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de greffe de peau de souris est utilisé par de nombreux groupes de recherche depuis de plusieurs années. Ainsi nos résultats pourront être utilisés par d'autres groupes de recherche. Nous pourrons également les utiliser comme contrôles dans de futures expériences. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois car le traitement du rejet est plus efficace sur les animaux jeunes.
Validation de l’efficacité anti-tumorale d’un CAR-T cell IL-1RAP en traitement des syndromes myélodysplasiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
300 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intra-osseuse et un myélogramme transtibial, gestes que le porteur décrit comme provoquant une douleur importante justifiant l'anesthésie, avant d'être tuées à trois semaines. Le porteur teste des lymphocytes CAR-T contre un état préleucémique et indique le développement possible d'une anémie. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro cette maladie avec tous ses composants.
Objectifs
Ce projet vise à valider in vivo l’efficacité d’une approche par immunothérapie (CAR-T cells) pour traiter les syndromes myélodysplasiques (état préleucémique) en utilisant un modèle murin humanisé de syndromes myélodysplasiques. Il s'agit d'un projet multi-site qui se déroulera dans 2 animaleries différentes. Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.
Procédures
1) Injection intratibiale des cellules tumorales sous anesthésie et analgésie (30 s). 2) Entre 1 mois et 3 mois post greffe : Confirmation prise de la prise de greffe par mesure de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min). Réalisation d'un myélogramme par voie transtibiale sous anesthésie et analgésie (30 s) si absence de bioluminescence. 3) Injection intracaudale à J0 du traitement et des différents véhicules (5 min). 4) J7 et J15 prise de sang par ponction veine mandibulaire pour monitoring in vivo par CMF de l'expansion des CAR-T cells (2min) 5) Mesures de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min) à J7, J10, J14 et J21. 6) A J21 post injection du traitement les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins vont engendrer une douleur légère et de courte durée. La ponction et l'injection médullaire transtibiale va engendrer une douleur importante le temps du geste justifiant une anesthésie générale avec analgésie. Le développement du syndrome myélodysplasique peut entrainer un inconfort en rapport avec l'anémique.
Devenir
Certains animaux issus de la procédure d’élevage entreront dans la procédure d’expérimentation s’ils ont l’âge requis pour la procédure de xénogreffe au moment de la disponibilité du matériel biologique nécessaire à la xénogreffe. Tous ces animaux atteignant le point-limite et/ou maintenus aprés la dernière imagerie seront finalement mis à mort pour les analyses biologiques invasives nécessaires à l'exploitation optimale des résultats. Les autres animaux (surnuméraires, ayant dépassé l’âge pour la réalisation de la xénogreffe ou vieux reproducteurs) seront euthanasiés.
Remplacement
Il est impossible, à l’heure actuelle, de reproduire de manière in vitro une hématopoïèse clonale complète d'un syndrome myélodysplasique avec tous ses composants et leurs interactions pourétudier l’efficacité anti-tumorale de lymphocytes T modifiés. Par ailleurs, aucun modèle mathématique ou informatique ne permet actuellement d’évaluer également cette réponse.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été réduit au minimum sur la base des besoins imposés par les tests statistiques que nous utiliserons. De fait, un nombre de 300 souris sera nécessaire.
Raffinement
L'ensemble des procédures pouvant s'accompagner d'une douleur/angoisse modérée, tous les efforts seront entrepris pour réduire au minimum de douleur, souffrance ou angoisse ressentie par les animaux. C'est pourquoi nous surveillerons l'état de santé des animaux tout au long des expériences afin de pouvoir intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de douleur, de souffrance ou d'angoisse. La greffe des cellules souches humaines sera réalisée par voie transtibial de même que les myélogrammes sous anesthésie générale injectable. Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. Les personnels impliqués ont des compétences validées pour les manipulations des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement stérile (isolateur) dans un environnement enrichi et contrôlé et observés quotidiennement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. Les différents gestes chirurgicaux et les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie générale. La méthode de mise à morts des animaux est réglementaire. Les animaux seront transportés dans des cages stériles prévues pour cet usage avec enrichissement de l’environnement et tout sera mis en œuvre pour limiter la durée de transport entre les 2 sites.
Choix des espèces
Il a été démontré que les souris avec ce profil particulier d'immunodépression permettent une meilleure prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques humaines. Autre avantage de ces souris, elles n'ont pas besoin d'être préparées à la greffe par un conditionnement par irradiation ou une chimiothérapie. Ce conditionnement peut augmenter la létalité de la procédure. Souris entre 8 à 10 semaines de vie. Du fait du délai de prise de greffe (entre 1 à 3 mois), l'injection doit se faire précocement.
Thérapie génique pour la maladie de Willebrand
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections et des prélèvements de sang répétés, une partie subissant un test de saignement par section des trois derniers millimètres de la queue avant la mise à mort. Ces souris génétiquement modifiées expriment très peu du facteur étudié pour reproduire la maladie de Willebrand, le porteur cherchant à raccourcir la protéine pour une thérapie génique. Il affirme qu'il est "indispensable de faire appel à un organisme vivant entier".
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines et l'absence de l'une ou l'autre de ces protéines va conduire à des pathologies hémorragiques congénitales. La plus fréquente de ces pathologies est causée par l'absence d'une protéine circulant dans le sang et qu'on pourrait tout à fait envisager de remplacer par une approche de thérapie génique. Le problème principal est que la séquence d'ADN qui permet de produire cette protéine est trop grande pour rentrer dans les vecteurs biologiques actuellement disponibles pour aller livrer la protéine au site cellulaire désiré. Le but de notre projet va donc consister à tester s'il est possible de retirer ou remplacer des parties de notre protéine d'intérêt tout en préservant sa fonction normale. Cette approche permettrait ainsi de faire rentrer l'ADN de cette protéine dans un vecteur standard et donc de pouvoir enfin proposer une approche de thérapie génique aux patients.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur le facteur Willebrand en déterminant quelles régions/domaines de cette protéine sont les plus importantes pour sa fonction. A long terme, le projet contribuera à rendre la thérapie génique possible pour les patients souffrant de la pathologie hémorragique congénitale la plus fréquente.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs interventions pendant la durée de la procédure: 1) 1 injection qui dure 5 secondes 2) 1 ou plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. En cas de plusieurs prélèvements ceux-ci seront espacés de 2 mois et leur nombre maximum sera de 4. Ces prélèvements durent entre 5 et 10 secondes. 3) 1 injection finale qui va durer 5 secondes pour anesthésier les animaux. Les deux gestes suivants seront réalisés sur ces souris anesthésiées: 4) Soit un prélèvement sanguin terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires ou un test de saignement consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent expérimenter une douleur transitoire de courte durée pendant et après l’injection intra-veineuse et après le prélèvement sanguin.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. La ré-utilisation des animaux n'est pas possible du fait de la procédure subie dans le présent projet .
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Il est donc indispensable de faire appel à un organisme vivant entier.
Réduction
Nous avons séparé le projet en deux procédures successives afin de pouvoir identifier rapidement les protéines les plus efficaces et donc n'en tester que quelques-unes (ou même pas du tout) dans une la seconde procédure bien plus longue. D'autre part, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. Les souris seront surveillées 3 fois/semaine pendant la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne sont pas en souffrance (visible par leur aspect et comportement). Des point limite précoces ont été anticipés et mis en place et seront appliqué en cas de signes évidents de douleurs importantes. Si ces points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui a prouvé sa pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui expriment seulement une quantité très faible de la protéine étudiée et chez lesquels il sera donc aisé de voir une augmentation de cette protéine après traitement. Pour une des procédures nous utiliserons des animaux adultes des deux sexes. Par contre, pour l'autre procédure, nous serons limités à des animaux adultes de sexe mâle exclusivement car chez les rongeurs, la thérapie génique est 5-10 fois moins efficace chez les femelles. Des souris adultes (8 - 16 semaines) seront utilisées.
Évaluation de l’effet thérapeutique d’un facteur régulateur de l’immunité innée dans le cancer oral.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans la langue puis des traitements répétés, la tumeur linguale provoquant une perte de poids et des difficultés à s'alimenter, avant leur mise à mort pour analyses. Le porteur teste une molécule d'immunothérapie contre le cancer oral et prévoit une hydratation systématique pour limiter la déshydratation. Il affirme que l'étape animale est "indispensable" et qu'un "organisme vivant intégré" est nécessaire avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
L’immunothérapie est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. Dans le cas du cancer, elle ne s’attaque pas directement à la tumeur, mais stimule les cellules immunitaires impliquées dans sa reconnaissance et sa destruction. Dans certains cas cette thérapie n’est pas suffisante pour induire des réponses antitumorales et traiter la totalité des patients. Cependant, d’autres voies du système immunitaire peuvent jouer un rôle critique dans le traitement du cancer. La compréhension des mécanismes activés dans ces voies ainsi que la détermination des cellules immunitaires impliquées est nécessaire. Dans notre équipe, nous avons travaillé sur les mécanismes de stimulation d’une voie de signalisation, récemment identifiée, de l’immunité innée. Cette voie induit des réponses antitumorales efficaces en synergie avec l’immunothérapie et potentiellement avec la chimiothérapie pour détruire les tumeurs. Dans ce projet, nous évaluerons l’effet thérapeutique, d’une molécule qui active cette voie de signalisation, dans différents types de cancer oraux. Cette étape de développement préclinique est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement afin d’envisager une application thérapeutique en clinique chez l'homme.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie par activation de notre voie d’intérêt permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler tous les types de tumeurs, ii) elle induit des effets toxiques chez les patients. Nous proposons donc une stratégie pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, tout en limitant les effets secondaires. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action sous-jacent peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie intra-linguale aux animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Puis certaines de ces souris recevront ensuite le traitement par voie intra-tumorale ou sous-cutanée dans le palais de la bouche sous anesthésie (3 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Deux prélèvements de sang seront réalisés, le premier 3h après l’administration des traitements puis le second, 17 jours après (durée du geste inférieur à 30 secondes). Certaines souris recevront également un traitement directement dans l’abdomen à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines (durée du geste inf à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non toxique et non douloureux dans un site sensible sur des animaux anesthésiés. L’un des effets attendus de ces essais est la perte de poids due au développement de la tumeur dans la langue et aux difficultés à s’alimenter Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux dans un site sensible sur animaux anesthésiés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur de courte durée) Lors des prélèvements sanguins, une légère douleur liée à la piqure est attendue. Cette douleur sera de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet découlent de résultats obtenus in vitro à l’aide de lignées cellulaire en culture. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action de nos molécules d’intérêt Néanmoins, malgré les méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en immunothérapie. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de ce traitement.
Réduction
Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous suivrons la croissance des tumeurs dans la bouche à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Les analyses des populations de cellules immunes ou la comparaison des tailles de tumeurs à des points de cinétiques précis seront évaluées à l'aide des tests non paramétriques Anova et Kruskal Wallis. Si les résultats de la procédure 1 ne sont pas concluants, tout sera arrêté et donc les autres procédures ne seront pas réalisées.
Raffinement
Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés spécifiquement au moins deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur et appliquer les points limites décrits dans la procédure correspondante et selon la grille de score fournie en annexe. Si besoin, les souris seront surveillées quotidiennement en fonction de l’évolution tumorale. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Une hydratation systématique par injection de Ringer Lactate sera mise en place pour prévenir toute déshydratation induite par le développement de tumeurs dans la bouche. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques. Des compléments alimentaires seront mis à disposition dès la greffe des tumeurs pour habituation et afin de faciliter la prise alimentaire. Toutes les souris seront anesthésiées lors des manipulations et recevront des analgésiques pour les gestes douloureux.
Choix des espèces
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Après la démonstration in vitro et avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse, l'évaluation préclinique de ces traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Cette étape est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques, permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Par ailleurs, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées qui sont disponibles. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 semaines et 6 mois) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique. Enfin, l’âge adulte permet d’étudier un système immunitaire mature.
BIOEQ : Etude de bioéquivalence chez le rongeur après exposition subaiguë à un produit chimique.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 250
300 rongeurs, surtout des rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée et une autre réutilisée. Ils reçoivent un produit chimique par la nourriture ou par gavage quotidien, suivi de prélèvements de sang répétés, pour mesurer la biodisponibilité selon la taille des particules. Le porteur indique que les animaux exposés à des substances non homologuées sont tués, quand cent rats et vingt souris pourront être réutilisés. Il présente ces essais comme un préalable réglementaire au choix des doses des études de toxicologie.
Objectifs
Ce projet permet de vérifier l’impact de la taille des particules sur la biodisponibilité du produit à tester. Cette étude est nécessaire pour le bon choix des doses des études de toxicologie si la taille des particules du produit varie d’un lot à l’autre. La voie de synthèse peut évoluer au cours du développement d’une molécule en fonction des quantités synthétisées et faire varier la taille des particules formées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ces études sont de déterminer la biodisponibilité du produit en fonction de la taille des particules. Ainsi les études menées pourront répondre à la question suivante : l’exposition interne déterminée par les concentrations plasmatiques varie-t-elle en fonction de la taille des particules ? Ces études apporteront des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures en fonction de la taille connue des particules du produit à tester.
Procédures
Les animaux seront exposés au composé par la nourriture (durée maximale 15 jours) ou le cas échéant par gavage journalier (procédure inferieure à 1 minute) à l'aide de sonde souple adapté à leur taille. En fin d'exposition: prélevements de sang (microprelevements de 20 ou 50µL exceptionnellement 100µL) sur animal vigile à la veine saphène ou la cas échéant caudale (durée maximale de la contention et du prelvement 2 minutes; au maximum 6 prises de sang le premier jour de l'évaluation, puis une prise de sang par jour jusqu’à la fin de la période de réversibilité (8 jours maximum).
Impact sur les animaux
Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet, la forte dose choisie ne devant pas excéder la dose maximale tolérée chez l’animal (et définie au préalable). Les animaux peuvent être soumis à des gavages journaliers à l'aide de sonde souple qui peuvent induire une gène légère lors de la contention. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d’une période de 24h. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement.
Devenir
Les animaux exposés à des substances chimiques non encore homologuées sont euthanasiés.
Remplacement
Des essais in vitro sont utilisés dans l’unité d'expérimantation pour déterminer le profil toxicocinétique des molécules suivis par des études in vivo de toxicocinétique après administration unique. Ces études permettent de définir la période d’administration et de réversibilité de cette procédure mais ne répondent pas à la question de l’impact de la taille des particules sur la biodisponibilité du produit.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux par groupe (6) définit par l'experience du laboratoire et permettant une analyse statistique et deux doses testées par produit. Un total estimé d’environ 60 rats pourront être utilisés chaque année pour tester environ 2 molécules différentes, pour un total d’environ 300 rongeurs sur 5 années pour ce projet. Exceptionnellement, des souris pourront être utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés tous les jours (week-ends compris). Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Les échantillons de sang prélevés sont faits par la veine saphène (50 µL/prélèvement pour le rat et 20 µl pour la souris - volume ne dépassant pas le volume de 7.5% du volume circulant sur 24h). Pour les rats, la veine caudale peut également être utilisée avec 100 µl par prélèvement. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés par le laboratoire, qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées : la forte dose sera définie sur la base des résultats observés dans des études de 14 ou 28 jours avec administration quotidienne du produit par voie orale. On retiendra donc des doses inférieures à la dose maximale tolérée chez l’animal utilisé.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites dans ce document sont réalisées chez le rongeur (mâle ou femelle) pour permettre d’avoir le bon niveau d’information pour le choix de doses des études ultérieures. Le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées sur ces espèces. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes (à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.
Etude de l’impact de l’utilisation des biomatériaux dans la greffe de neurones corticaux issus de cellules souches humaines dans le traitement de lésions corticales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une lésion du cortex moteur et une greffe de neurones humains associés à un biomatériau, puis des pesées et des tests moteurs sur plusieurs mois, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique appliquer un jeûne de quinze heures avant le test de préhension de nourriture pour motiver les animaux. Il affirme qu'il n'est "pas encore possible" de modéliser un cerveau de mammifère in vitro et présente le recours aux modèles animaux comme "essentiel".
Objectifs
Du fait de la très faible capacité du cerveau à s’autoréparer, les traumatismes craniens sont dévastateurs. La lésion du cortex moteur est une caractéristique commune de nombreuses conditions neuropathologiques telles que les tumeurs, les lésions (traumatisme, accident vasculaire cérébral) ou les maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique, ataxies scérébeleuses, maladies de Huntington, d'Alzheimer...). Afin de pallier les capacités de régénération limitées du cerveau adulte, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques. La transplantation neuronale a été explorée comme une approche potentielle permettant de rétablir les fonctions cérébrales en remplaçant les neurones perdus par de nouveaux neurones. Il est déjà démontré que des neurones issus de cellules souches, transplantés dans des cerveaux de souris, peuvent efficacement rétablir des connexions spécifiques après une lésion corticale. Une réparation des réseaux neuronaux est donc possible chez la souris, mais l'efficacité de cette approche doit encore être améliorée avant de pouvoir être envisagée chez l'Homme. Dans cette étude, nous souhaitons coupler la greffe de neurones humains avec l'utilisation d'un biomatériau naturellement présent dans l'organisme: l'acide hyaluronique. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet du biomatériau sur la réparation du cerveau.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d'étudier l’effet d’un biomateriau sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones chez le rongeur. Ce biomatériau peut être utilisés pour fournir un support structurel, libérer des facteurs de croissance, ou encore promouvoir la régénération tissulaire dans la zone lésée du cortex cérébral. Les potentiels effets du biomatériau incluent la réduction de l'inflammation, la promotion de la cicatrisation, la restauration des connexions neuronales et la récupération des fonctions altérées à la suite de lésions du cerveau. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie clinique chez l'Homme autour de la transplantation cellulaire combinée à des biomateriaux, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions cérébrales suite à des traumatismes crâniens ou des AVC.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : -intervention 1 : chirurgie craniale : 1 fois (10 minutes par animal, 160 animaux); -intervention 2 : chirurgie craniale avec greffe de neurones : 1 fois (10 minutes par animal, 120 animaux); -intervention 3 : chirurgie craniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 40 animaux). Sur animaux vigiles : - au maximum une soixantaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois à 2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 160 animaux); -au maximum 10 sessions de 2 tests de comportement moteur (15 minutes par souris et par test, 160 animaux).
Impact sur les animaux
Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, les effets indésirables attendus sont la douleur liée à la chirurgie minimisés par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie, ainsi qu'une légère perte de poids transitoire. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieur gauche. L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire. Un jeûne de 15 heures sera réalisé avant le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.
Remplacement
L’impact de la composition du biomatériau utilisé dans cette étude a été testé au préalable dans un modèle in vitro. Ceci permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumas crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation d'un test statistique approprié. Ceci a permis de déterminer un nombre de 10 animaux avec la moitié de mâles et la moitié de femelles.
Raffinement
Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les souris ont un phénotypes dommageable (immunodéficience), mais ce phénotype ne s'exprime pas dans nos conditions d'hébergement. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle. De plus, elles seront réalisées par un binôme compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) à l'aide d’une grille de score. Des points limites adaptés et gradés et un arbre décisionnel comprenant des critères d'arrêt de souffrance ont été définis en amont de la réalisation du projet.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, AVC...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler sur des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.
Barrière immunitaire aux produits de thérapie génique : mécanismes et nouvelles stratégies d’évitement chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injectées de cellules immunitaires puis d'un vecteur de thérapie génique dérivé d'un virus adéno-associé, 4 610 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Selon les parties du projet s'ajoutent une injection sous la peau ou dans le derme, des injections intrapéritonéales répétées d'agents immunomodulateurs, jusqu'à 15 pour le méthotrexate, et des prises de sang répétées, jusqu'à 9 en six mois dans la première partie. Le projet vise à comprendre la réaction immunitaire contre ces vecteurs, que le porteur dit "bien tolérés chez l'homme" et dont plusieurs ont déjà reçu une autorisation de mise sur le marché, et à mettre au point des co-traitements pour l'atténuer. Les prises de sang, mandibulaires, se font "sur animal vigile", sauf exception rétro-orbitaire sous anesthésie générale, et le porteur range l'"anesthésie préalable" parmi ses mesures de raffinement pour ces prélèvements.
Objectifs
Les vecteurs dérivés de virus adéno-associés (AAV) sont les plus utilisés en thérapie génique dans le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont bien tolérés chez l’homme, et leur bénéfice thérapeutique est tel que plusieurs d’entre eux ont reçu des autorisations de mise sur le marché. Cependant, quelques barrières subsistent et viennent limiter leur efficacité et leur utilisation. L’une d’entre elles est la barrière de la réponse immunitaire. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de l'organisme en éliminant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration du vecteur de thérapie génique d’origine virale, puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer le produit injecté. Fort heureusement, certaines stratégies basées sur la modification des composants du vecteur ainsi que sur l’utilisation de médicaments immunomodulateurs visant à réduire la réponse immunitaire, peuvent atténuer ces effets immuns délétères en induisant une tolérance immune permettant ainsi un bénéfice thérapeutique pour le patient. Toutefois, ces stratégies sont encore mal maîtrisées. Afin d’élargir l’application de ces traitements au plus grand nombre de patients et de maladies génétiques différentes, notre projet vise, chez la souris, à caractériser certains paramètres impliqués dans l’établissement d’une tolérance immune à l’encontre des vecteurs AAV et à développer des co-traitements immunomodulateurs plus efficaces et moins toxiques pour le patient. Plus spécifiquement, nous étudierons à l’aide de différents modèles de souris les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T et B, et le rôle du ciblage par les vecteurs AAV de certains tissus tels le foie ou le muscle dans la balance immunité/tolérance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier certains aspects de la tolérance immunitaire vis à vis des vecteurs AAV en disséquant les réponses lymphocytaires qui sont induites de manière différentielle en fonction du tissu et des cellules ciblées par le vecteur. Il permettra aussi de définir les caractéristiques du vecteur AAV qui peuvent diminuer la réponse immunitaire, et idéalement, induire une tolérance robuste. Enfin, il permettra de proposer de nouveaux traitements immunosuppresseurs adaptées à ces traitements AAV innovants. Comme nous l’avons fait depuis 20 ans, les résultats que nous obtiendrons seront rapidement publiés dans des revues internationales afin de renforcer la connaissance de la communauté scientifique sur le sujet et, le cas échéant, d’accélérer le passage en phase préclinique de certains vecteurs AAV développés par notre institution ou par d’autres.
Procédures
__ Partie 1 du projet : Les souris receverons deux injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie après 24 heures par 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire). Les souris seront ensuite suivies sur une période allant de 2 semaines (avec 2 prélèvements de sang), à 6 mois (avec 9 prélèvements de sang). __Partie 2 Les souris receverons trois injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, 1x injection du vecteur médicament AAV après 24 heures (intraveineuse ou intramusculaire), et 1x injection après quelques semaines (voie sous-cutanée ou intradermique). Les prélèvements de sang seront bimensuels pour le 1er mois (2x); ensuite mensuels. Leur nombre total sera défini par le temps de suivi qui sera choisi en fonction des résultats de la partie 1. __Partie 3 Les souris receverons trois injections : 1x Injection de cellules immunitaires au niveau de la veine caudale, 1x injection du vecteur médicament AAV (veine caudale ou voie intramusculaire), 1x Injection de cellules à tolériser au niveau de la veine caudale. Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois (4x), puis plus espacées jusqu’à la fin. __Partie 4 Les souris receverons d’abord deux injections : 1x Injection de lymphocytes (intraveineuse), 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire) Avant ou après l’injection du vecteur, injections répétées par voie intrapéritonéale d’agents immunomodulateurs. Le nombre de ces injections variera en fonction des agents. Par exemple : 3 à 5 fois/ semaine pendant 1 à 3 semaines pour le methotrexate (3 à 15x en tout). Prélèvements de sang mensuels sur 6 mois (6x). __Partie 5 Mêmes interventions que les parties 1 à 4, mais réalisés sur des males.__ Injections intraveineuses (veine caudale), intrapéritonéales et sous-cutanées effectuées sur animal vigile, durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques pratiqués (injections intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, prélèvement de sang) pourraient conduire à de faibles nuisances pour l’animal, tel qu’un stress léger et une douleur aigue de très courte durée. Les administrations intramusculaires et intradermique, sous anesthésie légère, seront sans douleur. Lors de nos études précédentes, aucun effet indésirable ou toxicité n’ont été observés chez les animaux traités par les vecteur-médicaments AAV ou des cellules immunitaires
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des populations lymphocytaires dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement par rAAV (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement mis à mort. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, sur les mêmes individus, nous analysons le maximum de tissus des animaux post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal. (4) Dans la plupart des procédures, nous avons évité de répliquer les groupes contrôles en testant les vecteur-médicaments AAV deux par deux. Ceci réduit le nombre total de souris contrôles d’un facteur 2. Il n’est pas possible de tester plus de 2 vecteurs à la fois pour des raisons pratiques de lourdeur expérimentale.
Raffinement
De manière générale, les expérimentateurs qui travailleront sur ce projet ont en plus de leurs formations plusieurs années d’expériences quant à la manipulation des souris. Ils sont donc très sensibilisés au bien-être animal, ce qui permet de facto de limiter stress et angoisse des animaux afférents par exemple aux simples gestes de contentions. Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques préalable pour les injections intramusculaires et intradermiques, suivi vigilant de l’état des animaux). Il est à noter que ces types d’injection classiques sont pratiquées chez l’homme sans anesthésie, ni administration d’analgésique. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront quand même observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Chez la souris, le système immunitaire est considéré comme adulte à partir de 6 semaines d’âge. Nous utiliserons donc majoritairement des souris jeunes adultes de 6-12 semaines pour étudier les réponses immunes d’organismes adultes. Les souris seront analysées et/ou euthanasiées entre 6 semaines et 6 mois afin d’évaluer les réponses immunitaires précoces et tardives, respectivement. Le cas échéant, des évaluations à plus long-terme pourraient être menées.
Plaquettes synthétiques dans les maladies hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, près de la moitié étant opérée sous anesthésie sans réveil. Une partie subit un test de saignement consistant à sectionner les trois derniers millimètres de la queue sous anesthésie et à mesurer le sang perdu pendant trente minutes, avant la mise à mort. Ces souris génétiquement modifiées reproduisent des maladies hémorragiques, le porteur voulant tester des plaquettes synthétiques. Il affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test disponible ne peut l'éviter.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines, appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Bien que des traitements efficaces soient d'ores et déjà disponibles, l'amélioration de ces traitements et l'amélioration de la qualité de vie des patients reste d'actualité. Nous proposons de tester un nouveau traitement basé sur la transfusion de plaquettes sanguines synthétiques, ce qui représenterait un traitement universel quel que soit le facteur de la coagulation qui fait défaut. Le but du projet est donc de démontrer l'efficacité thérapeutique de différentes sortes de plaquettes synthétiques dans des modèles souris reproduisant trois types différents de pathologies hémorragiques.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur le type de plaquettes sanguines synthétiques qui seraient les plus efficaces pour pallier à l'absence des facteurs de coagulation. A long terme, le projet contribuera à améliorer l'arsenal thérapeutique pour les patients souffrants de pathologies hémorragiques, permettant une approche plus personnalisée des traitements adaptés à chacun(e).
Procédures
Les souris seront soumises à 5 interventions maximum mais la plupart des animaux ne subiront qu'une partie de ces gestes: 1) 3 injections espacées d'au moins 2 jours. Chaque injection va durer 5 secondes. 2) 1 prélèvement sanguin deux semaines après la dernière injection. Ce prélèvement va durer 10 secondes 3) Trois semaines plus tard: 1 injection qui va durer 5 secondes pour anesthésier les animaux. Les deux gestes suivants seront réalisés sur ces souris anesthésiées: 4) 1 injection qui va durer 5 secondes 5) Soit un prélèvement sanguin terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires ou un test de saignement consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les 3 injections répétées espacées de 2 jours peuvent être associées à une légère douleur transitoire, de courte durée. Le prélèvement sanguin peut être associé à une douleur moyenne et une légère hémorragie, nécessitant d'exercer un point de compression. Au cours du test de saignement qui est réalisé sous anesthésie pendant 30 minutes, il se peut que des souris montrent des signes de réveil. Une nouvelle dose d’anesthésiant sera alors injectée (20% de la dose initiale au maximum).
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires et le constat de mort sera établi par des signes évidents de mort. La ré-utilisation des animaux n'est pas possible puisque les animaux sont euthanasiés en fin de procédure en raison du volume sanguin prélevé ou perdu. De plus, des tissus seront recueillis après l'euthanasie pour analyse.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Une partie des tests sera fait sur du sang prélevé à partir des souris traitées par les plaquettes synthétiques. Ces tests nécessitent moins d'animaux car ils sont plus reproductibles que ceux conduits directement chez l'animal. Seul le test de temps de saignement sera fait chez les animaux, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. D'autre part, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne montrent pas de signe de réveil ce qui se traduirait par un renforcement immédiat de l'anesthésie.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui ont prouvé leur pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui sont déficients pour différents facteurs de la coagulation, reproduisant ainsi les pathologies humaines. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine susceptible de souffrir de ces pathologies.
Evaluation pharmacologique et pharmacodynamique d’anticorps innovants en cancérologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'anticorps expérimentaux puis de nombreux prélèvements de sang à la queue étalés sur plusieurs jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une douleur modérée liée aux injections et aux prélèvements, encadrée par une grille de points limites. Il affirme qu'"aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet" et rend donc "indispensable" le recours aux animaux.
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents mécanismes entrant en jeu lors d’une réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements anticancers, de plus en plus ciblés, visent des gènes spécifiques de l’immunité ayant pour but de faire pencher la balance dans un sens ou dans un autre pour moduler cette réponse antitumorale. Des essais cliniques, avec notamment des molécules ciblant une voie impliquée dans l'inhibition de la réponse immunitair, ont permis d’avoir de réelles avancées dans les thérapies anticancers. Cependant les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons thérapeutiques. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements tout en limitant les effets secondaires. Dans ce projet, nous proposons de tester in vivo de nouvelles thérapies combinatoires ciblant un récepteur inhibiteur bien connu et de nouvelles molécules du système immunitaire, dans le but d’induire une réponse antitumorale efficace et durable. Nous avons généré de nouveaux formats d’anticorps dit « bispécifiques » capables d’interagir avec deux molécules en même temps. Nous avons déjà des résultats préliminaires in vivo nous permettant de montrer que ce format améliore l’effet de la monothérapie. Nous développons sans cesse de nouveaux formats, nouvelles mutations et/ou nouvelles molécules fusionnées afin de trouver l’anticorps le plus efficace possible, et pour cela nous devons réaliser (en plus des modèles in vitro) des études chez la souris. Cette étude nous permettra d’établir tous les paramètres nécessaires pour justifier les doses et voies d’administration de ces molécules lors d’essais cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra d’établir tous les paramètres en termes de dose, voie et schéma d’administration de molécules novatrices dans le domaine de l’immunothérapie antitumorale. Ces résultats pourront ensuite servir de base pour les essais cliniques réalisés chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés à J0 pour permettre l’injection de nos molécules. Du sang au bout de la queue sera ensuite prélevé (2µL) à différents temps T0, 15min, 30min, 1h, 4h, 8h, J1, J2, J3, J6, J8 voire J11 et J15 après l’injection de nos molécules en vigile, par simple pression de la queue sur animal vigile.
Impact sur les animaux
L’administration de nos molécules et les procédures effectuées peuvent induire une douleur modérée au moment de l’injection ou des prélèvements, limitée par l’administration d’analgésique local. Une grille d’observation de points limites a été établie permettant d’évaluer régulièrement l’état général des animaux et d’intervenir rapidement si une douleur survient.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique de ce genre nouveau de médicaments et ont donc orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo des différentes molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux à chaque étape a été calculé pour limiter la quantité, tout en conservant un nombre suffisant pour une évaluation statistique fiable. Ce nombre pourra également être réduit dans les phases #2 et #3 si certaines molécules ne montrent pas d’intérêt in vitro.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Ce protocole n’induit qu’une douleur modérée le temps de l’injection. Si jamais une douleur plus intense survient, les animaux sont surveillés régulièrement et nous pouvons donc agir rapidement pour limiter la douleur. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis de papier sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Après l’injection de nos molécules, les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Des adultes de 7 à 12 semaines seront utilisés, car ce sont généralement l’âge des souris dans nos modèles de cancers pour lesquels la prise tumorale est la plus homogène, contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Evaluation de la réponse inflammatoire suite à l’injection d’un vecteur délivrant de l’ARN dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux injections intraveineuses à trois semaines d'intervalle, d'un vecteur lentiviral non intégratif conçu pour délivrer de l'ARN, d'un vecteur intégratif ou du seul véhicule pour les 4 témoins, et subit six prises de sang pour doser les cytokines de l'inflammation. Le porteur prévoit de possibles réactions allergiques ou effets toxiques, présente l'étude comme "un requis pour l'utilisation future de ce vecteur in vivo", chez l'humain notamment, et affirme qu'elle permettra de "prédire les réponses immunitaires humaines possibles". Il énumère lui-même organes sur puce, organoïdes, biobanques de tissus humains et simulations informatiques, avant d'affirmer qu'aucun de ces outils ne rendra compte de la réponse inflammatoire dans un "organisme physiologique entier".
Objectifs
L’étude de la réponse inflammatoire dans un modèle de souris est essentielle pour évaluer la sécurité, l’efficacité et la faisabilité de l’utilisation d’un produit à visée thérapeutique. Elle contribue à orienter son développement, optimiser les protocoles d’administration, et à garantir la sécurité de ce type de thérapie. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer la réponse inflammatoire pouvant survenir après l’injection d’un vecteur non intégratif pouvant délivrer de l’ARN chez l’animal. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. L’injection intra veineuse sera testée, avec un rappel d’injection 3 semaines plus tard. Les analyses consisteront en un dosage de la sécrétion de cytokines dans le sang.
Bénéfices attendus
Cette étude de la réponse inflammatoire chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en évaluant la réaction du système immunitaire; - d’identifier les caractéristiques du produit pouvant provoquer une réponse inflammatoire; - de prédire les réponses immunitaires humaines possibles.
Procédures
Les animaux recevront 2 injections par voie intraveineuse (durée 2-3 minutes). On réalisera 6 prélèvements sanguins (durée 2-3 minutes)
Impact sur les animaux
Dans le cadre d’une étude de la réponse inflammatoire, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. L’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN par voie intraveineuse peut entrainer un stress ou une douleur chez l'animal, Par ailleurs, ces souris subiront des prélèvements sanguins pouvant également induire un stress.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales. Etant donné que ces souris seront injectées avec un vecteur lentiviral, on ne pourra pas les ré-utiliser. Les animaux seront ainsi euthanasiés en fin de procédure expérimentale, pour ne pas les maintenir en vie inutilement.
Remplacement
Le Remplacement du modèle animal pour une étude de de la réponse inflammatoire peut se faire selon l'utilisation : - de modèles in vitro, avec des cellules du système immunitaires; - d’organes sur puce qui permettent de créer des modèles miniatures d’organes ou tissus humains; - de modèles bio-informatiques et de simulation; - de biobanques de tissus humains; - des organoïdes, version miniature et simplifiée d'un organe fabriqué in vitro et qui présente une anatomie et une fonction proches de la physiologie. La fonctionnalité du vecteur de transfert prévu pour cette étude est ainsi validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont. Cependant, aucun de ces outils ne pourra générer l’ensemble des données attendues sur la réponse inflammatoire induite par l’injection d’un vecteur viral dans un modèle d’organisme physiologique entier. La réponse inflammatoire étant la somme d’une cascade de réponses physiologiques, elle est impossible à évaluer de façon exhaustive sans le modèle animal et doit donc s’étudier in vivo.
Réduction
La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe (sauf pour le groupe controle où un effectif de 4 souris sera suffisant), cet effectif constituant un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux, en comparant les animaux ayant eu un vecteur non-intégratif, un vecteur intégratif ou le véhicule. Des études similaires antérieures ont notamment permis de réduire le nombre d’animaux tout en garantissant des données interprétables et statistiquement utilisables. Le nombre de contrôles peut ainsi être limité à 4 souris. Par ailleurs, 4 femelles et 4 males permettront d’évaluer la réponse inflammatoire potentielle après injection des vecteurs lentiviraux. Nous ne nous attendons notamment pas à un dimorphisme sexuel dans cette réponse.
Raffinement
Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors des prélèvements sanguins, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray d'un antiseptique seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires
Choix des espèces
La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans ce type d’étude pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 14 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.
Caractérisation du rôle neuroprotecteur des cavéolines dans les atteintes consécutives à un traumatisme crânien léger chez la souris juvénile.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance, elles reçoivent une injection dans le cerveau, puis subissent à 21 jours un traumatisme crânien provoqué par un impact sous anesthésie, suivi de séries de tests comportementaux et d'IRM, avant d'être tuées par perfusion d'un fixateur. Le porteur présente ce modèle comme reproduisant un traumatisme crânien pédiatrique et renvoie les retombées thérapeutiques à un potentiel futur. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ou informatique" ne permet cette étude et que le projet "ne peut pas se passer de l'expérimentation animale".
Objectifs
Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place au sein du cerveau à la suite d'un traumatisme crânien léger et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Ce projet unique va explorer le potentiel thérapeutique d’une protéine d’intérêt, la cavéoline, en étudiant son rôle protecteur dans le cerveau. Notre équipe utilisera un modèle léger de traumatisme crânien chez la souris, nous permettant d'étudier sur le long cours, à l'aide de tests comportementaux et d'outils d'imagerie innovants, les processus induits sur le système nerveux central avec une définition encore inaccessible chez l'homme. Ces processus chroniques seront étudiés par l’utilisation de souris ayant reçu une injection permettant l’augmentation de notre protéine d’intérêt. Suite à l’induction du traumatisme crânien, ces animaux seront soumis à une évaluation comportementale permettant d’évaluer leurs capacités locomotrices, leur niveau d’anxiété et leur mémoire et nous réaliserons également un suivi au cours du développement par imagerie IRM. Notre étude sur le rôle de cette protéine d’intérêt pourrait nous permettre d’établir la pertinence de cette protéine dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 (CAVéoline-1) représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.
Procédures
1. injection unique dans le cerveau le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. Réalisé une seule fois. 2. trauma crânien léger juvénile (TC): 21 jours après leur naissance, les animaux subiront une anesthésie générale courte (5 minutes) pendant laquelle il recevront un impact léger au niveau du crâne. Animaux contrôles soumis uniquement à l’anesthésie générale. Réalisé une seule fois. 3. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes, 2 tests de coordination motrice d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux de 5 minutes et 2 tests d’apprentissage spatial qui nécessitent des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale s’étalera sur 2 semaines, avec 11 jours où l’animal sera testé sur une durée de 5 min par jour. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers, un jour après le dernier test comportemental. 5. Fixation du tissu cérébral. Anesthésie générale profonde et adaptée. Perfusion d’un fixateur pendant 5 minutes jusqu’à l’arrêt du cœur. Prélèvement des tissus.
Impact sur les animaux
Notre modèle repose sur une injection dans le cerveau à la naissance sous anesthésie très courte. Ce geste peut entraîner une réduction de la température du corps ou un retard de croissance. De plus, nous utiliserons un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Les conséquences possibles incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Chaque série comportementale peut entraîner du stress et de la fatigue. L’anesthésie réalisée lors de l’imagerie par IRM peut aussi entraîner une dépression respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 348 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.
Réduction
Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes lors des tests comportementaux / IRM.
Raffinement
Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie et d'analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés.
Choix des espèces
Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.
Evaluation de l’expression de différentes structures d’ARNm par imagerie non-invasive (Bioluminescence).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de formulation d'ARNm puis des injections d'un substrat luminescent et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour mesurer l'expression de l'ARNm dans leurs organes. Le porteur revendique l'optimisation de vaccins à ARNm et la réduction de leurs coûts, et signale la douleur liée aux piqûres intramusculaires. Il affirme que les modèles cellulaires ne sont "pas prédictifs" et qu'"aucune méthode de remplacement fiable" n'est disponible.
Objectifs
Le projet a pour objectif l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARNm. Les ARNm ne rentrent pas seuls dans les cellules et ont besoin d’être vectorisés pour résister aux nucléases extracellulaires. Les nanoparticules lipidiques (LNP) permettent de délivrer l’ARNm dans les cellules dendritiques pour exprimer l’antigène et induire une réponse immune. Dans le cas de la régénération osseuse, ce sont des cellules ostéoprogénitrices qui sont transfectées. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. Dans ce projet, nous cherchons à optimiser à la fois l'internalisation cellulaire des ARNm en sélectionnant différentes formules de LNP et leur traduction en protéines en sélectionnant différentes structures d'ARNm. Dans les deux cas l'objectif est de maximiser l'expression de l'ARNm thérapeutique, ce qui est quantifié dans cette demande en mesurant l'intensité du signal bioluminescent. Ces optimisations serviront aux deux applications thérapeutiques de l'équipe, la vaccination par ARN et la régénération tissulaire par ARN. Nous avons synthétisé une bibliothèque de lipides permettant de faire des LNP. Les tests sur modèles cellulaires nous ont permis de retenir 8 types de lipides pour évaluation in vivo. Cette évaluation in vivo est nécessaire car les modèles cellulaires ne sont pas prédictifs de l'activité des LNP dans un organisme. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins chez l’homme.
Procédures
Les souris vont recevoir 1 seule injection de formulation ARNm soit en intramusculaire dans chacun des muscles des cuisses (1 injection par cuisse), soit en intraveineuse dans la queue (1 injection unique sur souris).L'injection des formulation se fait sous anesthésie gazeuse. Aucune formulation ne sera injectée dans le lot témoin. Au temps 6h, 24h, 48h et 96h au maximum après l’injection de la formulation (LNP-ARNm), les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase (4 fois au maximum durant l'étude), puis elles seront imagées en imagerie de bioluminescence.( 4 séances de 1 minute au maximum). Les souris seront anesthésiées sous isoflurane (2%) durant le rasage ( 1 fois 5 minutes) et les injections des formulations (1 fois 3 minutes maximum) mais seront vigiles durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à une douleur suite au rasage et à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de la piqure liée à l'aiguille et à l’injection de la solution en intra musculaire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort puis des prélèvements seront réalisés pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.
Remplacement
L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.
Réduction
L’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques ANOVA.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée. Ils seront hébergés dans une animalerie confinée dans des cages de type 2 à cinq souris par cage avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les cages contiendront un enrichissement qui sera soit un tube en carton, soit un cylindre opaque soit une petite maison transparente pour souris. Les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive (imagerie de bioluminescence) chez la souris.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.