Souris
Étude la fonction cardiaque de souris ayant des modifications post-traductionnelles de la tubuline
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie porte une cardiomyopathie génétique et reçoit des injections hebdomadaires dans l'abdomen ainsi que des échocardiographies mensuelles sous anesthésie sur trois mois, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique que l'anesthésie gazeuse peut provoquer un stress thermique et, rarement, un arrêt cardio-respiratoire. Il affirme que le recours à la souris est "indispensable" et que le développement de ces stratégies "ne peut se faire que sur un modèle animal".
Objectifs
Ce projet a pour but l’évaluation des modifications de la tubuline sur la fonction cardiaque puis d'evaluer l’effet bénéfique de petites molecules touchant ces modifications chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Nous venons de démontrer que cette approche était un moyen de corriger le la pathologie cardiaque ches des souris.
Bénéfices attendus
Ce projet peut aboutir à la première description du role des modification de la tubuline dans le developement de pathologies cardiaques. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible. En effet, tout impact positif sur la fonction cardiaque avec ces traitements, sera etudié pour une utilisation en clinique.
Procédures
1) Injection dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en quelques secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 3 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris. Les souris seront des animaux controles non genetiquement modifiés et des souris presentant une cardiomyopathie génétique (modele murin d'étude). les injections intra-peritoneales (abdomen) se font toutes les semaines, sur la duree du traitement. Les souris seont euthanasiees en fin de protocole par methode reglementaire en vue des prelevements tissulaire pour analyse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dus à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée qui développe une pathologie cardiaque induisant une insuffisance cardiaque (10 mois pour les mâles et 12 mois pour les femelles). L'injection intrapéritonéale peut entraîner chez l'animal un stress de courte durée (contention et piqûre). La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie gazeuse. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive mais l’anesthésie peut induire un stress thermique et dans de rares cas des complications (arrêt cardio-respiratoire).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire. Nous allons effectuer le projet sur 10 groupes de 10 souris (non genetiquement modifiée et souris modeles de la pathologie), en etudient l'effet sur les deux sexes ( 10 souris pour groupes pour un total de 100 souris)
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier des cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de nécroses ou escarres). L'état de santé des animaux aisi que la survenue de points limitres sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. Les effets indésirables attendus par les traitements sur les animaux peuvent survenir suite à l'anesthesie (risques d'hypothermie our d'arret cardio-respiratoire). Notre connaissance approfondie de l'histoire naturelle du developpement du phenotype chez le modele souris (plus de 20 ans avec cette lignee de souris), permet de determiner precisement la progression de l'atteinte cardiaque et en particulier l'age. Dans notre experience, nous n'avons jamais observé de tels effets mais nous allons les surveiller avec la plus grande attention. Lorsque les points limites sont atteints pour des animaux, nous procederons a une euthanisie par methode reglementaire.
Choix des espèces
La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie . Les premiers symptômes sont détectés dès 3 mois chez les souris homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque (vers 10 mois d'âge).Nous allons etudier le benefice des traitements sur des souris entre 3-6 mois, lorsque la pathologie cardiaque apparait.
Etude de l’efficacité des nouvelles cellules porteuses d’un récepteur antigénique chimérique dans le traitement des tumeurs hématologiques et solides dans un modèle murin immunodéficient. Établissement utilisateur 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
120 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines puis des injections de lymphocytes modifiés, la croissance des tumeurs étant suivie par imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre une grande taille, provoquer une détresse respiratoire ou une paralysie des membres arrière avant l'application du point limite. Il affirme que les études précliniques sur animaux sont "incontournables" et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité in vivo.
Objectifs
L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers agressifs. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre des antigènes de la tumeur (ou Adoptive Cell Transfer). Malgré son efficacité dans le traitement de cancers hématologiques, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Nous avons développé des cellules qui présentent une activité anti-tumorale supérieure aux cellules CAR classiques dans nos modèles in vitro. Nous hypothétisons que ces cellules CAR seront plus efficaces dans les tumeurs hématologiques mais aussi contre les tumeurs solides. Ce projet vise donc à étudier : L’efficacité anticancéreuse des nouveaux lymphocytes humains T activés in vitro et exprimant des récepteur CAR (Chimeric Antigen Receptor) dans un modèle de xénogreffe humaine de lymphome et deux modèles de cancer solide du poumon) et du pancréas. Nous étudierons l’effet de l’injection des lymphocytes T humains (issus des donneurs sains) et exprimant un récepteur chimérique (CAR) dans des souris immunodéprimées supportant une xénogreffe des cellules humaines de cancer du pancréas, lymphome ou de cancer du poumon et qui expriment le gène de la luciférase. Nous suivrons la croissance tumorale par imagerie luminescente.
Bénéfices attendus
La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.
Procédures
Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.
Réduction
Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.
Albinisme et développement du système visuel de modèles murins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1833 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, une partie étant opérée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans le cerveau ou dans l'œil, une électroporation in utero sur les embryons, puis des tests visuels comme le test de la falaise visuelle et l'électrorétinogramme, avant d'être tuées pour prélever leurs yeux et leur cerveau. Le porteur étudie des mutations responsables de déficits visuels congénitaux et renvoie les retombées thérapeutiques au "long terme". Il décrit un recours à des cellules et des organoïdes pour une partie des expériences, mais indique que la souris reste "le modèle de choix" pour reproduire ces mutations.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre quelles sont les altérations structurelles et fonctionnelles du système visuel dans différents modèles murins de maladies génétiques causant des déficits visuels provenant d’un mauvais développement de l’œil aux stades embryonnaires. Ce projet a l'avantage de combiner des approches variées de génétique de la souris ou permettant l'expression de molécules d'intérêt dans la rétine ou dans le cerveau, des méthodes histologiques et de traçage neuronal permettant d’observer les projections visuelles.
Bénéfices attendus
L’étude de ces souris modèles murins de pathologies visuelles héréditaires permettra de caractériser précisément les défauts visuels (anatomiques, structurels et fonctionnels) et de déterminer ainsi l’impact de chaque mutation afin de comparer leur effet délétère. Ceci nous permettra notamment d’établir des liens de cause à effet et de déterminer un ordre hiérarchique de ces différentes mutations dans les mécanismes à l’origine des divers défauts visuels. De plus, ce projet nous permettra d’identifier les conséquences de ces mutations et de trouver les mécanismes impliqués afin de pouvoir proposer des nouvelles voies thérapeutiques à long terme.
Procédures
1833 animaux seront soumis aux différentes interventions suivantes : - Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux - une injection stéréotaxique cérébrale (procédure chirurgicale, 45 min) ou une injection intraoculaire (procédure chirurgicale, 20 min) - une électroporation in utero (procédure chirurgicale, 30 min) suivie d’une injection intraoculaire (procédure chirurgicale, 20 min) - des tests comportementaux : test de la taille relative (5x5min en 1 jour), test de la falaise visuelle (10x5min en 3 jours) à suivre, puis 3 jours au moins après au test optomoteur (animal vigile, 2,5 min) et à nouveau 3 jours après au moins à un electrorétinogramme (procédure chirurgicale, 30min) -Pour tous les animaux, une euthanasie sous anesthésie et analgésie générale est réalisée pour prélèvement de tissus (yeux et cerveaux). -Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie générale avec une prise en charge analgésique post-opératoire.
Impact sur les animaux
Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur. Suite à l’anesthésie, il peut survenir de manière rare une réaction de détresse respiratoire ou de mort immédiate. Suite aux actes chirurgicaux, les plaies (crâne ou abdomen) ou site d’injection (œil) peuvent être inflammés ou infectés. Suite à l’électroporation in utero, des problèmes au niveau de la mise bas pourraient survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure. Après tous les actes chirurgicaux, une douleur post-opératoire est possible. Les tests comportementaux peuvent induire un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques sur les tissus.
Remplacement
Certaines des expériences pour étudier la fonction des gènes impliqués dans ces maladies congénitales visuelles seront réalisées sur des lignées cellulaires ou des cellules rétiniennes ou organoïdes issus de cellules souches pluripotentes induites afin de remplacer l’utilisation de modèles animaux par des modèles cellulaires.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés est 1833. L'électroporation in utero pour marquer les axones rétiniens et également inactiver ou surexprimer des gènes a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaires par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris mutantes. Les différentes procédures comportementales pour mesurer la vision binoculaire et l’acuité visuelle ainsi que l’enregistrement des cellules rétiniennes seront faites sur les mêmes animaux afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Ces mêmes animaux seront utilisés pour des prélèvement de cerveau et de rétine afin de diminuer le nombre d'animaux utilisés pour le prélèvement de tissu fixé. La taille des effectifs a été établie grâce à des tests statistiques sur des lignées similaires. Plus spécifiquement sur la procédure d’électroporation in utero, des femelles gestantes additionnelles sont utilisées comme mères adoptives car les femelles s’occupent moins bien de leur portée après un contexte d’opération au niveau de l’abdomen. Aucune procédure expérimentale ne sera réalisée sur ces mères adoptives, mais cela permet d’augmenter la survie des petits électroporés et donc de réduire le nombre de souris sur lesquelles des procédures chirurgicales seront effectuées.
Raffinement
Les expérimentateurs sont formés par des personnes compétentes en respectant les réglementations en vigueur (formation d’expérimentation animale et de chirurgie). La Structure chargée du Bien Etre des Animaux et les personnels de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne, ainsi que le maintien du statut sanitaire. Les animaux sont hébergés selon la législation en vigueur. Les animaux provenant d’un autre établissement utilisateur auront une période d'acclimatation d’au moins 5 jours avant le début des procédures expérimentales. Un suivi post-opératoire ainsi que des points limites ont été définis pour chaque procédure (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration) conduisant à l’euthanasie après consultation du SBEA ou d’un vétérinaire. Toutes les procédures chirurgicales sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie générale. L’anesthésie gazeuse est privilégiée car elle permet un réveil quasi immédiat après chirurgie, ce qui permet à l’animal de récupérer plus vite. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur un coussin chauffant. Pour l’électroporation in utero, des femelles gestantes sont utilisées comme mères adoptives car les femelles s’occupent moins bien de leur portée et encore plus après un contexte d’opération au niveau de l’abdomen. Aucune procédure expérimentale ne sera réalisée sur ces mères adoptives, mais cela permet d’augmenter la survie des petits électroporés.
Choix des espèces
L'organisation des voies visuelles est bien conservée entre la souris et l'humain. Le développement de la rétine et du cerveau est bien caractérisé chez la souris, permettant d’étudier les anomalies dans des modèles de souris de pathologies visuelles congénitales. La souris reste le modèle de choix pour la génération de lignées transgéniques et la plupart des mutations humaines à l’origine des différentes pathologies que nous étudions n’ont été reproduites que dans des modèles murins. Plusieurs stades seront analysés: nous nous intéressons au développement du système visuel en étudiant majoritairement les stades postnataux et adultes pour étudier la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau. Les âges étudiés, jour de naissance (P0), puis 3ème jour postnatal (P3) et 7ème jour postnatal (P7), correspondent différentes étapes de développement du système visuel et il est important de savoir à quel moment les défauts apparaissent chez les modèles murins de maladies. Quand ce n’est pas nécessaire, notamment pour étudier la fonction visuelle, nous utiliserons des souris adultes.
Jêune aigü et jeûne répété : des mécanismes identiques ou différents ?
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des cycles de jeûne de 24 heures alternés avec 24 heures d'alimentation pendant quatre semaines, des piqûres répétées de la queue pour mesurer la glycémie et un prélèvement de sang terminal, avant la mise à mort pour prélever le foie et d'autres organes. Le porteur étudie le rôle d'une protéine du foie chez des souris modifiées pour ne plus la produire, les bénéfices annoncés se limitant à comparer ces effets avec ceux d'un jeûne unique. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire ce processus par des méthodes sans animaux et conclut que le recours à la souris est "approprié".
Objectifs
Chez les animaux, des épisodes de jeûne sont fréquemment observés en cas de blessure ou de manque de nourriture ou encore lors de l'hibernation, dans le but d'économiser l'énergie et de s'adapter aux différents environnements. Les mammifères sont ainsi capables de tolérer de longues périodes de jeûne grâce à une réponse adaptative de l'organisme. Le foie joue un rôle majeur dans cette adaptation aux situations de jeûne car il permet la production de carburants, nécessaires au fonctionnement du cerveau et du coeur notamment. Cette production de carburants par le foie est primordiale et controlée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARα. De nombreuses études examinent les effets sur la santé de différentes stratégies nutrtionnelles qui impliquent des périodes de jeûne. Ces stratégies qui alternent des périodes de jeûne et des périodes d'alimentation ont montré des effets bénéfiques sur plusieurs pathologies, notamment chez la souris. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer le rôle de PPARa dans la réponse au jeûne lorsqu'il est alterné avec des périodes d'alimentation à volonté. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles qui n'ont pas la protéine PPARa dans le foie et leur contrôle, que nous soumettrons à des alternances de jeûne de 24h et d'alimentaion à volonté de 24h sur une période de 4 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes dont le foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir si PPARa spécifiquement dans le foie joue un rôle dans les réponses induites par des jeûnes répétées. Nous pourrons également comparer les effets avec le rôle connu de PPARa lors d'un jeûne unique.
Procédures
Les animaux seront nourris avec un régime standard à volonté ou soumis à des cycles jeûne de 24h/alimentation à volonté pendant 4 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Chaque pesée prend environ 20 secondes par animal. La glycémie sera mesurée chaque semaine par prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Le jeûne unique et le jeûne répété peuvent induire une perte de poids, une baisse de la glycémie et de la température corporelle. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et un épanchement au niveau de la joue.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus physiologique qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie, notamment le foie et le tissu adipeux, et plusieurs hormones qui agissent à distance. Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car elle permet d'étudier le rôle d'une protéine spécifique.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie) Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure, renourri et replacé en conditions d’hébergement standard après examination par la vétérinaire référente.
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Etude de l’effet de l’harmaline sur le développement de l’organisation modulaire du réseau olivo-cérébelleux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
563 souris vont être utilisées, les souriceaux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 60 mères étant réutilisées pour l'élevage. Les souriceaux reçoivent deux injections intrapéritonéales d'harmaline par jour pendant cinq jours, ce qui provoque des tremblements aigus et une phase d'hyperactivité gênant la prise alimentaire. Le porteur indique un retard de poids inférieur à 4 % et signale que la manipulation peut conduire les mères à rejeter leurs petits. Il étudie le rôle de l'activité neuronale dans le développement d'un réseau du cervelet et affirme qu'une telle étude n'est pas possible en culture cellulaire.
Objectifs
Dans le cerveau, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit différents types de connexions, dont celles des fibres grimpantes, axones des neurones de l’olive inférieure. L’activité neuronale régule la formation et le maintien des synapses entre fibres grimpantes et cellules de Purkinje, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. De plus, le réseau olivo-cérébelleux présente une organisation en modules, traitant différentes informations sensorielles et motrices, et permettant un contrôle précis de différentes fonctions et en particulier la motricité. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de l’organisation modulaire de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.
Procédures
Nous injecterons les souris en intra-péritonéal, 2 fois par jours pendant 5 jours. Chaque injection prend moins d'une minute. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du dos, légère contention permettant l’insertion de l’aiguille très fine dans l'abdomen. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris seront toutes anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant puis euthanasiées.
Impact sur les animaux
Chez la souris, la dose de produit injectée conduit à des tremblements aigus et temporaires des muscles axiaux et a un effet de type anxiolytique. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Lorsque les souris sont en âge de se nourire, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrisage. La manipulation des souriceaux peu parfois amener les femelles à rejeter leurs petits. Pour éviter cela, les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 563 animaux injectés seront euthanasiés en fin de procédures. Les 60 mères seront réutiliées à des fins d'élevage dans notre animalerie. Après les injections, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement.
Remplacement
La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. De même, les injections intrapéritonéales chez le souriceau seront réalisées avec des aiguilles très fines afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection qui provoque des tremblements temporaires. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. La topographie du réseau olivo-cérébelleux s’établit en plusieurs étapes, dont une étape de raffinement qui est dépendante de l' activité et qui se produit entre P5 et P21. Le stade auquel l’activité joue un rôle majeur n’est pas connu et sera défini en réalisant plusieurs séries d’expériences avec plusieurs groupes de souris entre P5 et P21. Nous utiliserons également des souris plus agées (P45) comme contrôles, car à ce stade la carte topographique est établie et l'activité neuronale continue de contrôler la connectivité.
Utilisation de l’imagerie in vivo pour l’évaluation des candidats vaccins et l’amélioration des vaccins existants
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 200
Hamsters dorés : 300
Autres rongeurs : 200
Lapins : 100
Cochons : 100
Macaques à longue queue : 80
8 980 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée et les autres réutilisés, adoptés ou renvoyés à l'élevage. L'effectif comprend 8 000 souris, 300 hamsters dorés, 200 rats, 200 autres rongeurs, 100 lapins, 100 porcs miniatures et 80 macaques à longue queue, infectés par des bactéries ou virus modifiés puis suivis par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les produits sont "en général bien tolérés" et n'attend que des réactions locales, sans détailler les effets de l'infection sur chaque espèce. Cette société décrit un service d'évaluation de vaccins destiné aux dossiers réglementaires et affirme que l'imagerie in vitro ne peut se substituer aux "organismes entiers".
Objectifs
Ce projet a pour objectifs d’évaluer la qualité de nouveaux vaccins (exemple à la base de l’ARNm) ou de vaccins existants grâce à l’imagerie par fluorescence et/ou par bioluminescence, ou par mesure du poids moléculaire des lipides grâce au MALDI-MSI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization as a Mass Spectrometry Imaging). Les critères d’évaluation sont : - La protection des vaccins développés en traitements préventifs et/ou thérapeutiques de maladies infectieuses grâce au suivi des pathogènes (bactéries/virus génétiquement modifiées) ou marqués par des molécules fluorescentes - La biodistribution et le mécanisme d’action des différentes molécules (ex : cellules, antigènes, adjuvants, anticorps, nanoparticules). Le suivi de certaines molécules d’intérêt par fluorescence est possible grâce à un fluorochrome (molécules assez petite) pouvant se greffer sur des molécules biologiques avec une perturbation nulle ou minimale de leurs propriétés physico-chimiques. Ainsi, la fluorescence peut par exemple être utilisée pour un suivi de biodistribution effectué par exemple sur des anticorps, des peptides, ou bien des acides nucléiques. L’imagerie par bioluminescence est une modalité faisant appel au génie génétique. Son principe repose sur l’intégration du gène codant pour la luciférase qui est une enzyme présente, à l’état naturel, dans des organismes tels que la luciole ou l’anémone de mer. Si ce gène est correctement intégré, les cellules vivantes exprimeront la luciférase qui, au contact de son substrat, la luciférine, donnera lieu à une réaction enzymatique émettrice de photons. Ces photons seront détectés par la caméra à haute sensibilité. Il sera alors possible de localiser et de quantifier in vivo les cellules ayant intégrées la construction luciférase.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont multiples : i) Sélection des antigènes et des adjuvants constituant le vaccin, ii) Évaluation de la biodistribution et des mécanismes d’action du vaccin, iii) Évaluation de la performance du vaccin au niveau préclinique avant les essais cliniques chez l’homme, iv) Support au développement des procédés des antigènes et des adjuvants. Ces différentes données précliniques ont pour but de supporter des essais cliniques et l’enregistrement du candidat vaccin ou l’amélioration de vaccins existants. Ces données sont généralement incluses aux différents dossiers réglementaires.
Procédures
En plus des paramètres mesurés par imagerie in vivo, des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques (écouvillonnages nasaux, vaginaux, lavages broncho-alvéolaires, liquide cérébro-spinal, etc.) peuvent être réalisés afin d’étudier la virémie ou la bactériémie à des temps intermédiaires. Occasionnellement, différents organes et fluides physiologiques sont prélevés en fin d'étude après euthanasie des animaux pour déterminer des charges virales, bactériennes, parasitaires, l'expression d'antigènes in vivo, réponses immunes pré et post-infection etc. Occasionnellement, des animaux infectés peuvent être euthanasiés avant la fin de l'étude pour répondre à des questions particulières (imagerie ex vivo, réponses immunes précoces à l'infection contre une charge infectieuse, etc.) Concrètement, les animaux sont soumis à : - Des observations cliniques quotidiennes (observation de l’état général des animaux, des sites injectes, gonflements des ganglions, mobilité, etc.) - Des pesées quotidiennes ou hebdomadaires (contention pour mesurer l’évolution du poids corporel) - Des anesthésies volatiles quotidiennes ou hebdomadaires ou chimiques, - Des injections par différentes voies d’administration, intramusculaire de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, intranasale de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, sublinguale de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, intraveineuse , intrapéritonéale - Des prélèvements de sang, d’organes (1 fois en prélèvement terminal), de fluides corporels (urine, salive), fèces etc. - Des euthanasies en phase terminale effectuées sous anesthésies par du personnel spécifiquement formé et selon la procédure en vigueur.
Impact sur les animaux
Le projet consiste en l’administration d’un ou plusieurs antigènes marqués ou non et si nécessaire d’un adjuvant marqué ou non. Les produits sont en général bien tolérés. Aucune réaction systémique n’est attendue. Quelques réactions locales (rougeur, nodule, abcès froid) sont possibles.
Devenir
Certaines procédures nécessitent de l’imagerie ex vivo sur des organes spécifiques ce qui implique une euthanasie des animaux. Les autres animaux peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Des essais in vitro sont également utilisés pour déterminer les seuils de détection in vitro et ex vivo des appareils d’imagerie, ils apportent des données complémentaires mais, à ce jour, ne peuvent se substituer aux essais in vivo sur des organismes entiers.
Réduction
Les schémas expérimentaux de ce projet feront l’objet d’une revue par des biostatisticiens, afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire. Il est à noter que l’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sur une durée définie de chaque animal qui est par conséquent son propre témoin, ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux par étude. En effet, en se basant sur les études effectuées au cours des 5 dernières années, maximum 1000 souris par an seront dédiées aux études de biodistribution et de criblage des molécules, antigènes etc. Environ 50 souris par groupe avec 2 à 4 groupes par étude et 4 à 5 études par an. De plus, maximum 600 souris par an seront utilisées pour les autres études, par exemple, mécanisme d’action et la formation et preuve de concept. Maximum 60 hamsters et 40 rats par an seront dédiés à des études avec des agents pathogènes. Pour ces études 4 à 6 animaux par groupe seront utilisés avec 3 à 4 groupes par étude. Maximum 2 à 3 études par an seront réalisées. Maximum 20 lapins par an seront utilisé pour des recherches spécifiques d’inflammation. Pour ces tests 3 à 5 animaux par groupe avec 1 à 2 groupes par étude sont prévus. Une à deux études par an seront effectuées pour ces recherches spécifiques. Concernant les miniporcs et les PNH, nous allons effectuer deux études maximums par an et par espèce. Ces études rares seront dédiées pour étudier les mécanismes d’action de certaines molécules spécifiques ainsi que l’immunogénicité de ces molécules chez ces espèces. Quatre à six animaux par groupe avec 1 ou 2 groupes par étude sont prévus.
Raffinement
Pour les procédures ou d’effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d’enrichissement. Les locaux utilisés sont conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. De plus, le raffinement réside dans deux caractéristiques principales. Tout d’abord, dans la majorité des cas, cette technique est non invasive puisque les souris sont simplement anesthésiées pendant une courte durée lors des acquisitions d’images et réchauffées grâce à un plateau chauffant afin d’éviter les risques d’hypothermie. D’autre part, la sensibilité des appareils d’imagerie in vivo permet de diminuer les doses de pathogènes administrées aux animaux par rapport aux modèles classiques.
Choix des espèces
L’imagerie préclinique in vivo est une technique initialement adaptée au petit animal (principalement la souris et les rats/hamster avec un poids inférieur à 200g). Ceci est dû à la détection difficile du signal lumineux dans les tissus profonds des animaux de plus grande taille. Néanmoins, de nouvelles techniques semi-invasives permettent d’étendre le champ d’application de l’imagerie in vivo à des espèces plus grandes (ex : lapin, miniporc, macaque) et font l’objet d’une procédure spécifique. Le modèle animal utilisé est sélectionné également en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. D’autre part, certaines espèces animales sont sensibles aux pathogènes d’intérêt et d’autres non. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement…), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent dans certains cas une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire.
Etude de la cardioprotection du coeur de souris diabétique de type 2 au cours de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un diabète de type 2 d'origine génétique, reçoivent un médicament hypoglycémiant par gavage ou injection et passent des échographies cardiaques sous anesthésie, avant une injection létale pour prélever le cœur. Le porteur indique que les gavages, injections et prélèvements provoquent douleur et stress, aggravés par la pathologie diabétique. Il teste une molécule censée protéger le cœur diabétique lors d'un infarctus et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible.
Objectifs
Nous avons récemment développé une molécule inhibant la mort cellulaire et protègeant le coeur au cours de l’attaque cardiaque (infarctus). Les expériences, pour faire cette preuve d’efficacité, ont été réalisées chez des souris saines. Cependant, parmi les patients qui font un infarctus, un grand nombre ont un diabète de type 2 qui est un facteur d’aggravation de l’infarctus augmentant leur risque de décès. De plus, en clinique humaine, les patients diabétiques de type 2 sont traités par un médicament diminuant le taux de glucose sanguin (traitement hypoglycémiant). Notre projet vise donc à explorer l’effet thérapeutique de notre molécule dans le cœur de souris diabétiques de type 2 ayant subi un infarctus et traitées par le médicament hypoglycémiant afin de mimer la situation clinique.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucune thérapie pharmacologique disponible pour protéger le cœur des patients diabétiques ayant un infarctus. Développer une molécule permettant de protéger le cœur diabétique est donc un enjeu majeur surtout en considérant l’épidémie de diabète qui sévit dans le monde actuellement. Ce type de traitement permettra de diminuer le risque de décès mais également de faire des économies sur les dépenses de santé publique. Nos résultats devraient également apporter une meilleure connaissance des aspects de la cardiopathie liée au diabète, en particulier les mécanismes de mort cellulaire.
Procédures
Un lot recevra le médicament hypoglycémiant par gavage (durée : 2 minutes; une fois /jour pendant 15 jours) et les souris seront pesées 4 fois. Le 2ème lot recevra 1 injection du médicament hypoglycémiant dans le péritoine (durée: 1 minute; une seule fois) et les souris seront pesées 3 fois. Les souris diabétiques ont un fonctionnement du coeur modifié sur le long terme. Cette pathologie sera évaluée par échographie sur animal anesthésié (durée: 35 min; une fois avant le gavage avec le médicament hypoglycémiant et une fois au jour 11 du traitement). Les animaux sont euthanasiés par une injection d’un composé létal dans la cavité abdominale pour prélever le cœur.
Impact sur les animaux
- douleurs et stress des gavages et injection intrapéritonéale (IP) - douleurs et stress des prélèvements sanguins - stress de l’anesthésie pour l’échographie - pathologie du diabète
Devenir
Euthanasie pour prélever le coeur qui sera analysé (coeur perfusé isolé).
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. La cardioprotection par notre molécule se mesure sur cœur entier ex vivo¸ résultant à la fois d’effets vasculaires et musculaires après un traitement au long cours avec un hypoglycémiant (Metformine) pour mimer au mieux la situation in vivo.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : poids, mesure du taux de glucose sanguin (glycémie), échographie, analyse de la taille d’infarctus et de la mort cellulaire. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (prévision réalisée grâce à un logiciel statistique).
Raffinement
Les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient les moins invasifs possibles, gavage et injection unique du médicament hypoglycémiant, échographie, puis une seule injection létale pour prélever le coeur et réaliser une expérience ex vivo (infarctus sur cœur isolé). Des points limites, une grille de score ont été établis afin de prendre en charge les nuisances. De plus, l'utilisation d'anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures modérées. Raffinement des conditions d’hébergement : Les souris seront hébergées par 3 dans une cage et la litière sera changée fréquemment car ses souris urinent beaucoup. De plus le milieu des cages sera enrichi (maisons en carton) afin de réduire au minimum les nuisances (stress) et favoriser le bien-être des animaux. Concernant le modèle diabétique, il s'agit d'un diabète génétique spontané dans une lignée mutante à la place d'une souris alimentée durant une longue période avec une nourriture riche en graisse et riche en sucre pour induire le diabète.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus a été choisie pour utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées reconnu internationalement comme modèle de diabète de type 2. Ce sont des souris déficientes pour le récepteur à la Leptine (hormone de la satiété). Ces souris développeront spontanément un diabète de type 2 par augmentation de la prise alimentaire (hyperphagie) présentant l'avantage de ne pas leur faire subir un régime riche en gras et en sucre sur plusieurs semaines. -Petite taille des animaux. -Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. -l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes similaires donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera appliquée en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à 9 semaines et 10 semaines selon les protocoles appliqués.
Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées et biopsies pour leur génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
12 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et environ 200 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un millimètre de queue sous anesthésie locale pour son génotypage, avant le sevrage. Le porteur indique que les souris au génotype recherché rejoignent d'autres procédures, tandis que celles sans intérêt sont réutilisées ou tuées. Il reconnaît qu'aucune méthode de génotypage moins invasive, comme la PCR sur poils, ne donne à ce jour de résultats exploitables dans son établissement.
Objectifs
Le projet consiste à produire des souris génétiquement modifiées qui nécessitent un prélèvement d'un petit bout de la queue (1mm maximum) afin de connaitre leur génétique et savoir si elles seront utilisables pour les projet de recherche ou non.
Bénéfices attendus
Raffiner la production de souris génétiquement modifiées en prenant en charge la douleur ressentie lors de l'acte de biopsie pour génotypage.
Procédures
Identification et prélèvement d'un petit bout de la queue pour caractérisation des souris (moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Lors de l'acte de prélèvement d'un bout de queue les animaux peuvent ressentir de la douleur. C'est pourquoi nous réalisons cet acte sous anesthésie locale.
Devenir
Les animaux présantant un génotype d'intérêt seront utilisés dans des procédures expérimentales de notre établissement en utilisation continue. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux seront soit réutilisés pour d’autres projets expérimentaux quand c’est possible, soit euthanasiés.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur-même des projets des utilisateurs. Pour le moment, aucune autre méthode de biopsie pour génotypage moins invasive fonctionne. En effet, les protocoles de génotypage par PCR sur des poils ne nous ont toujours pas permis d'obtenir des résultats exploitables pour déterminer le génotype de nos animaux. Mais nous sommes toujours dans le recherche d'un nouveau protocole et nous ne manquerons pas de changer pour une méthode de biopsie moins invasive dès que possible.
Réduction
La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (batonnets de coton, maison en carton, mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / cage). Immédiatement avant l'acte de prélèvement du bout de la queue (1mm maximum), la pulvérisation d'un anesthésique sera effectuée sur la queue de l'animal afin de réduire au maximum toute douleur pouvant être ressentie. Une infection au niveau du site de biopsie serait le point seul point limite pouvant être atteint. Il s'agit ici d'une anticipation d'une potentielle infection car le cas ne nous est jamais arrivé, bien que nous réalisons ce geste sur un grand nombre d'animaux. Si cela devait nous arriver, nous désinfecterions la plaie avec de la povidone iodée (Vétédine) dans un premier temps et si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors nous euthanasierons l'animal afin de stopper ses souffrances.
Choix des espèces
La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. L'acte de biopsie d'un bout de queue est réalisé sur les nouveau nés, ceci afin de pouvoir les génotyper avant le sevrage dans une optique de réduction.
Etude des mécanismes de rejet après tranplantation d’organe
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.
Objectifs
La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés
Procédures
Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.
Nouvelles molécules impliquées dans le dialogue entre intestin et son microbiote : rôles dans le maintien de la santé intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 680 d'entre elles et léger pour 220. Une colite est provoquée par du dextran sulfate de sodium ou des injections d'anticorps, puis les animaux, y compris des souriceaux, reçoivent des gavages répétés de micro-ARN, d'anti-inflammatoire ou de microbiote. Le porteur indique que la colite entraîne diarrhées et perte de poids et que les gavages stressent les animaux, notamment les nouveau-nés. Il affirme que la dynamique des maladies inflammatoires de l'intestin ne peut être imitée in vitro ou in silico.
Objectifs
Le côlon est un organe qui héberge une communauté complexe de microorganismes que l’on appelle microbiote. Des modifications du microbiote, sont observées et impliquées dans de nombreuses pathologies et notamment les MICI (Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin qui comprennent la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique), caractérisées par une inflammation chronique de la paroi du tube digestif. C’est pourquoi, un dialogue permanent entre l’hôte et le microbiote est essentiel dans le maintien de l’équilibre fonctionnel de l’intestin (homéostasie intestinale). En plus de la présence du microbiote, le contenu intestinal recèle d’autres éléments dont les micro-ARN (ou miARN, petites molécules présentes dans les cellules et qui freinent l’expression des gènes). Les miARN circulants (sanguins) ont récemment été étudiés pour leur rôle de marqueur de l’inflammation dans la colite expérimentale chez la souris et dans les MICI chez l’homme. De plus, des données nouvelles de la littérature scientifique ont mis en évidence que les niveaux d’accumulation de certains miARN contenus dans les selles (miARN fécaux) étaient affectés par la présence et la nature du microbiote. Le rôle déjà établi des miARN au niveau de nombreuses fonctions physiologiques dans l’organisme et la proximité des miARN fécaux avec les bactéries du microbiote laissent penser que les miARN et les bactéries du tube digestif peuvent interagir et influencer l’état de santé intestinal. L’objectif principal de notre projet est d’étudier le rôle des miARN présents dans le contenu intestinal, leur rôle comme intermédiaire entre l’hôte et le microbiote et leur potentiel anti-inflammatoire. Nous chercherons à comprendre le dialogue entre miARN et microbiote et les rôles respectifs de chacun dans l’inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Nos travaux contribueront à la compréhension des mécanismes par lesquelles les miARN et le microbiote interagissent et nous permettrons de mettre en évidence de nouveaux outils thérapeutiques, les miARN, pour le traitement des maladies humaines associées à l'inflammation chronique, en particulier les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI).
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou plusieurs de ces interventions ayant pour but soit de créer de la colite chez les souris soit de la traiter, ou alors de suivre l’évolution de la colite et du microbiote chez chaque animal : - Les fèces seront récoltés en disposant les animaux dans des petites boîtes en plastique pendant 30 à 60 min. Après que les animaux aient fait naturellement leurs besoins, ils seront replacés dans leur cage d’origine. - Un ou des gavages (selon la procédure : de miARN, de l’anti-inflammatoire 5-ASA ou de microbiote) seront effectués à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur animal éveillé soit une fois par semaine pendant 10 semaines soit une fois par jour pendant 1 semaine. Chaque gavage dure environ 10 secondes. - 1 gavage par jour sera effectué à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Chaque gavage dure environ 20 secondes. - Des injections d’anticorps anti-IL10, dans le but d’induire une colite, seront réalisées dans l’abdomen (4 injections au total : 1 par semaine pendant 4 semaines) des animaux éveillés. Chaque injection dure environ 10 secondes. - Les prélèvements de sang seront réalisés uniquement sur des animaux anesthésiés juste d’être euthanasié soit un seul prélèvement par animal. Ce geste dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront générées chez les animaux soumis à un traitement Dextran Sodium Sulfate, qui induit la colite. Les effets de la colite chez la souris sont l’apparition de diarrhées et une perte de poids. Il est aussi reconnu que les gavages utilisés par ailleurs dans certaines procédures, peuvent induire un stress chez les animaux. Le gavage des souriceaux est reconnu comme pouvant occasionner un stress supplémentaire aux souriceaux lié à la manipulation et la contention de nouveaux nés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de collecter les organes en post-mortem pour analyse ultérieure.
Remplacement
Les modèles cellulaires ou la modélisation informatique ne permet pas d’imiter la dynamique de la progression des MICI. Les conséquences liées à la maladie peuvent être validées uniquement dans des modèles qui présentent la véritable pathologie dans des conditions identiques/similaires à celles qui surviennent chez l'homme ou l’animal. Les expériences exploratoires ne peuvent pas être réalisées directement sur les sujets humains en raison des méthodes et procédures invasives et de l'incertitude des résultats. L’utilisation de l’animal permet d'analyser les mécanismes des MICI au niveau de l'organe et des cellules, de tester l'efficacité des traitements et d’évaluer leur risque relatif avant qu'ils ne soient testés sur des sujets humains. Comprendre comment les miARNs peuvent moduler l'inflammation intestinale permettra à terme le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques au bénéfice des patients atteints de MICI.
Réduction
Ces travaux s’inscrivent dans la continuité d’un projet de recherche et de travaux précédemment publiés. Des précedents travaux ainsi que des expérimentations préliminaires, ont donc permis d’établir un nombre optimal d’animaux par groupe et réduit au maximum pour obtenir des résultats interprétables. De plus, l’utilisation d’un logiciel, a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour avoir des résultats reproductibles et significatifs. Les données obtenues seront traitées en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur potentielle des souris avec colite seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être avant et après le traitement). Les effets du traitement seront contrôlés par une surveillance selon un score standardisé. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence externe, les signes cliniques mesurables et le changement de comportement) correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'antalgiques pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux. L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Des souris qui présentent des colites ou des lésions similaires aux MICI humaines de façon à imiter le développement, les symptômes et les complications de la maladie sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Notons que les miARNs sont les mêmes chez la souris et l'Homme et que des travaux antérieurs de la littérature scientifique ont validé l'utilisation de souris comme modèle animal pour l'étude de la colite, et l'inflammation. Enfin, de nombreux réactifs et outils de recherche, nécessaires à cette recherche, sont spécifiques et ont été validés dans cette espèce. Les souris utilisées pour les expériences auront de 7 jours à 112 jours de vie. Ceci correspond à l’âge optimal pour obtenir la meilleure reproductibilité de la colite et a été décidé en fonction de travaux antérieurs utilisant des modèles de colite murine.
Modulation du microbiote digestif : effets sur la motivation alimentaire et la réactivité neuronale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection intracérébrale, une déplétion du microbiote par un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques dans l'eau pendant douze jours, puis un test de motivation alimentaire. Le porteur indique que la chirurgie peut causer douleur, infection et perte de poids et que le traitement peut induire une inflammation intestinale modérée. Il présente cette étude comme une "preuve de concept" préalable à des travaux chez l'humain et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ces mesures neuro-comportementales.
Objectifs
L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmente chez la souris la consommation d'aliments appétents. Néanmoins, les substrats et mécanismes neurobiologiques sous-jacents ne sont pas bien connus. Dans cette étude nous nous intéressons à l'insula, une structure cérébrale responsable de la perception du goût et des saveurs qui reçoit également des signaux viscéraux permettant l'interoception (perception de l'état interne). Les résultats issus de ce projet nous permettrons de tester l'hypothèse selon laquelle le microbiote et les signaux associés influencent le comportement alimentaire à travers des mécanismes dépendant de l'activité de l'insula.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal sur l’activité cérébrale (en particulier celle de l'insula) en réaction à des stimuli alimentaires. Cette étude « preuve de concept » chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire ou chez l’Homme.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections intracérébrales sous anesthésie générale par chirurgie stéréotaxique (au maximum 1 chirurgie par animal). Le microbiote intestinal des souris sera déplété par prise volontaire dans l'eau de boisson (prise quotidienne) d'un cocktail d'antifongique/antibiotiques pendant 12 jours. La motivation alimentaire des animaux sera testée lors d'un test comportemental dédié (au maximum 2 tests d'1h par animal).
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique peut engendrer de la douleur pendant la chirurigie et en post-opératoire ainsi que des infections ou une perte de poids. Ces effets indésirables sont prévenus par une couverture analgésique appropriée en péri- et post-opératoire et le respect des conditions d’asepsie. L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. La durée de ce traitement a été limitée à une durée minimale permettant une dépletion efficace du microbiote intestinal.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. L'analyse de l'expression du traceur neuronal et du marqueur de réactivité neuronale nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
L'activité cérébrale peut être étudiée dans divers modèles incluant par exemple des modèles cellulaires complexes récapitulant une partie de son organisation et de ses fonctions comme les organoïdes. Néanmoins, cette étude comprend des mesures neuro-comportementales et ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, l'activité cérébrale qui sous-tend les comportements émerge d'une organisation anatomo-fonctionnelle cérébrale complexe et de l'intégration de signaux provenant d'organes périphériques que seul le modèle animal permet d'explorer. Aucun autre modèle à l'heure actuelle ne peut récapituler ces processus et permettre ces mesures neuro-comportementales. Cette étude nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point et de détecter des différences neuro-comportementales entre les groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages contenant un objet leur permettant de se mettre à l’abri et des carrés de cotons ou des sticks en papier pour réaliser un nid. Afin de limiter la douleur et l’inconfort pouvant être générés par la chirurgie stéréotaxique, l’asepsie sera respectée lors de la chirurgie pour limiter le risque d’infection et un protocole adapté de gestion de la douleur sera utilisé en péri- et post-opératoire. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Pour limiter le stress des animaux, l’administration du cocktail d’antibiotiques/antifongiques est réalisée dans l’eau de boisson (prise volontaire). Les prélèvements pour l’analyse histologique et la densité du microbiote sont post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
ONCO-Métastases cérébrales : Evaluation de thérapies anti-cancéreuses sur des modèles de métastases au cerveau
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 200
2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les cellules tumorales sont injectées par voie carotidienne pour provoquer des métastases cérébrales, suivies de traitements par diverses voies, de rayons ionisants, parfois d'un implant hormonal et de prélèvements répétés. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte de poids, faiblesse musculaire et troubles de la coordination, la perte de poids servant de point limite. Cette société de recherche préclinique décrit une "demande de plus en plus importante" pour ces modèles et affirme que les méthodes 3D restent marginales et difficilement transposables.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie (Centre international de recherche contre le cancer). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, les cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. D’énormes progrès ont été réalisés en clinique sur les tumeurs dites primaires. En revanche, le pronostic vital des patients peut être énormément dégradé en cas de métastases. On parle de métastases cérébrales lorsqu’un cancer d’un autre organe (cancer primitif) s’est propagé au cerveau. Des métastases s’y développent fréquemment en cas de cancer du sein, de la peau ou du poumon. Parmi les cancers chez les femmes, celui au sein est le plus répandu dans les pays développés. Environ 20 % des cancers du sein développent des métastases cérébrales. Malheureusement, les traitements actuels, par radiothérapie, chimiothérapie et chirurgie, sont majoritairement vains. La présence de métastases au cerveau entraîne un mauvais pronostic de survie (6 mois en moyenne), même si le cancer primitif répond bien aux traitements. En effet, le diagnostic est généralement tardif. Pour répondre à ce besoin de nouvelles approches thérapeutiques l’objectif de ce projet est d’induire directement des métastases dans le cerveau en mimant le cheminement des cellules tumorales jusqu’au cerveau par la voie carotidienne. Ces modèles, permettront de refléter la pathologie humaine et d’évaluer des nouveaux médicaments destinés à traiter les métastases cérébrales chez l’homme. Nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison chez l’animal avant de les tester chez l’homme. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale. Nous estimons le nombre de projet à 5 par an soit 25 projets sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Notre société, spécialisée en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Une demande de plus en plus importante se fait pour le traitement des métastases. Plus particulièrement ces demandes sont accès sur les métastases cérébrales qui reste à ce jour sans traitement. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grace à ces modèles, il sera possible d’étudier les mécanismes d’expansion ou de nidification des métastases avec des traitements prophylactiques ou de croissance des métastases avec des traitement de deuxième ligne dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Il sera possible aussi, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre la progression des métastases.
Procédures
L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (
Impact sur les animaux
La greffe des cellules nécessitera une chirurgie qui pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une perte de poids, des difficultés à se mouvoir, une faiblesse musculaire et des soucis de coordination. La perte de poids sera le premier symptôme observé et constituera un point limite. Pour les expériences d’activités antitumorales, les animaux recevront des traitements et/ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1 jour. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress pendant 1-2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.
Devenir
Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme pour étudier les modèles de métastases.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie (risque inférieur de 5% de mortalité chirurgie par des personnels entrainés) et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. En fonction du succès des études pilotes et une fois le modèle totalement acquis, ce nombre d’animaux surnuméraire sera réduit. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 6 à 15 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement relevant. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).
Raffinement
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront maintenus dans leurs cage avec un enrichissement adapté et dans les conditions standard d’hébergement en terme de surface de cage et de nombre. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et un suivi adapté (observations, pesées, signes cliniques) sera mise en place post chirurgie avec évaluation des lésions neurologiques 1h post chirurgie et soins post opératoire et antalgie pendant 48h post chirurgie. Cette fréquence sera augmentée pour tous les animaux dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès qu'une perte de poids de plus de 10% sera observée sur certains animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, la pose d’implants hormonaux seront réalisés sous anesthésie avec incision cutanée et Injection locale d'antalgique. Pour la greffe, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau de l’incision de la peau sera réalisée et les animaux recevront un opiacé et un anti inflammatoire non stéroïdien. Le lendemain, les animaux seront traités avec un antiinflammatoire). En fonction du suivi clinique et sous avis vétérinaire, le traitement à l’antiinflammatoire pourra être prolongé. La greffe sera réalisée en conditions d’asepsie. Les points limites définit par la SBEA seront appliqués.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.