Souris

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage pour une transplantation de microbiote fécal, des prélèvements de fèces et des tests comportementaux de recherche compulsive d'alcool incluant des impulsions électriques aux pattes. Le porteur indique un risque de lésions mécaniques lors du gavage et prévoit de tuer les souris pour analyser leur cerveau et séquencer leur microbiote. Il affirme que modéliser ces troubles compulsifs in vitro ou in silico n'est pas possible et que le recours à l'animal est 'nécessaire'.

Objectifs

Ces dernières années, des efforts scientifiques croissants ont été consacrés à l'étude de l'axe microbiote-intestin-cerveau, une voie bidirectionnelle complexe reliant notre intestin au cerveau. Le microbiote regroupe l'ensemble des microorganismes, bactéries et levures qui peuplent notre tube digestif et qui participent à la santé de l'hôte. Ce domaine en pleine expansion suggère que le microbiote pourrait jouer un rôle potentiel dans l'apparition et/ou le développement de troubles psychiatriques dont les addictions. Parmi ceux-ci, nous nous intéressons à la consommation d’alcool. En effet, différentes études chez l'homme ont montré une altération du microbiote intestinal chez les patients alcooliques. Notre hypothèse est que le microbiote intestinal peut jouer un rôle central dans le développement de la psychopathologie de l'addiction à l'alcool et donc être une cible intéressante pour améliorer l'abstinence face à l’alcool. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons un modèle de souris qui repose sur la recherche compulsive d'alcool, qui est une caractéristique pathologique essentielle de l'alcoolodépendance.

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse est confirmée, elle ouvrira la possibilité d'un rôle causal du microbiote dans les aspects psychopathologiques de la consommation d'alcool. Nos données permettront, à long terme, de transposer les résultats à une cohorte clinique et potentiellement développer de nouvelles stratégies ciblant le microbiote intestinal, telles que des prébiotiques ou probiotiques, pour la gestion des addictions.

Procédures

Toutes les souris (N=185) recevront un gavage. Nous effectuerons des prélèvements fécaux sur animal vigil (3 crottes) le matin vers 9h. Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux afin d’evaluer le comportement de type compulsif lié à la consommation d’alcool.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont modérées. La punition sous forme de impulsions électriques au niveau des pattes est très faible et de courte durée et le gavage pour la transplantation de microbiote fécal sera fait par des chercheurs expérimentés, réduisant donc le risque d’une fausse route ou de lésion mécanique. Néanmoins, bien que le geste technique soit maitrisé par les expérimentateurs, il peut y avoir exceptionnellement des lésions mécaniques.

Devenir

Suite au dernier test comportemental, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux et le séquençage du microbiote.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico les mécanismes biologiques des troubles compulsifs n’est pas possible. En effet, il s’agit de relier, une consommation compulsive aux désordres centraux qui peuvent associés. Par ailleurs, dans le cadre de ce présent projet, il s’agit d’évaluer également la participation des bactéries intestinales et de la barrière digestive dont le système nerveux entérique. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier les interactions entre ces différents organes, le microbiote intestinal et le comportement compulsif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique, en se basant sur la littérature précédente dans le même domaine. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisations des mêmes animaux pour faire une cross-transplantation fécale.

Raffinement

Au cours des semaines une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien-être des animaux (quantité de boisson et de nourriture adéquats). Un suivi du poids des animaux, de la qualité de la fourrure des animaux et de la quantité de boisson ingérée sera pratiqué de façon hebdomadaire (poids, fourrure) ou tous les trois jours (prise de boisson). Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie compulsive sont proches de ceux observés chez l’homme. Cette espèce est largement utilisé dans la littérature comme modèle de consommation d’alcool liée à un comportement compulsif. Dans un premier temps, les souris seront reçues à 5 semaines et seront inclues dans le protocole à 6 semaines, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte. Dans la deuxième partie du projet, les souris seront reçues à l’âge de 3 semaines, comme il a été démontré que la transplantation fécale est plus efficace lorsqu’elle est réalisée chez des jeunes souris.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue, puis subissent un prélèvement de sang, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue et à mesurer le sang perdu pendant 30 minutes, ou une provocation de thrombose dans l'artère carotide, la journée finale se déroulant sous anesthésie sans réveil. Le porteur étudie l'effet de deux mutations d'une protéine de la coagulation sur le risque de thrombose. Il affirme que la coagulation 'nécessite absolument un organisme vivant entier' et qu'il n'existe pas de test adapté évitant le recours à l'animal.

Objectifs

La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Il s'agit donc d'un processus vital mais qui malheureusement peut aussi avoir des conséquences négatives lorsqu'il se produit en absence de toute blessure puisque dans ce cas, il aboutit à l'obstruction d'un vaisseau sanguin, ce qu'on appelle une thrombose. Les protéines qui sont importantes pour la coagulation "normale" sont également potentiellement impliquées dans les phénomènes de thrombose. Nous étudions l'une de ces protéines et en particulier comment des altérations génétiques sur cette protéine peuvent favoriser la survenue de thromboses. Le but du projet va consister à prouver dans un modèle souris que des mutations sur cette protéine d'intérêt conduisent à une protéine anormale, qui va avoir tendance à provoquer des thromboses

Bénéfices attendus

A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur une des protéines importantes pour la coagulation en montrant que certaines mutations génétiques entraînent la formation d'une protéine hyper active et par conséquent davantage pro-thrombotique. A long terme, le projet contribuera à identifier un nouveau biomarqueur familial de risque thrombotique. Des stratégies thérapeutiques visant à cibler cette protéine pourraient en découler afin de diminuer le risque de développer un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 4 jours maximum. Le premier jour, les souris recevront une injection dans la veine de la queue pour qu'elles puissent produire les protéines portant les mutations désirées. L'injection dure une dizaine de secondes au maximum. Trois jours plus tard, un prélèvement sanguin de petit volume sera effectué sur les souris anesthésiées, ce prélèvement ayant une durée de 3 secondes. Puis le lendemain, les souris seront de nouveau anesthésiées par injection dans la cavité abdominale (geste de 2 secondes). Un groupe de souris anesthésiées sera soumis à un test de saignement. Ce test consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes. Pour le second groupe de souris anesthésiées, nous évaluerons leur capacité à développer des thromboses dans l'artère de la carotide, pendant une durée de 30 min au maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après l’injection intra-veineuse et après le prélèvement sanguin. La journée finale de la procédure se fait entièrement sous anesthésie et sera sans réveil.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car la procédure finale n'est pas compatible avec un réveil et une reprise d'activité.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.

Réduction

Ce projet a déjà bénéficié d'une stratégie de réduction puisque seul l'effet de deux mutations sera étudié chez l'animal alors qu'une vingtaine de mutations potentielles ont été identifiées. Une analyse informatique de modélisation a permis de sélectionner ces deux mutations, basée sur leur plus grand potentiel pro-thrombotique. D'autre part, une analyse mathématique a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne sont pas en souffrance (visibles par leur aspect et comportement). Des points limite précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui a prouvé sa pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui ont l'avantage de ne pas exprimer la protéine étudiée et donc chez lesquels il est aisé de pouvoir tester des mutants sans être gênés par la protéine naturelle non mutée. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine, susceptible d'expérimenter des évènements de thrombose.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

1359 souris vont être utilisées dans un élevage impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire une lignée modèle de la maladie d'Alzheimer à phénotype dommageable. Sur ce total, le porteur indique que 990 seront transférées vivantes vers un autre site pour y être utilisées dans des expériences, tandis que 270 reproductrices et 99 souris à phénotype dommageable seront tuées. Les souriceaux sont identifiés par tatouage des phalanges et génotypés par un prélèvement au bout de la queue au septième jour de vie. Le porteur décrit que ces souris transgéniques peuvent développer des crises d'épilepsie et devenir agressives avec l'âge, et affirme qu'aucun modèle cellulaire n'est assez complexe pour se substituer à l'étude de la rétine menée ensuite.

Objectifs

Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d'Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez le modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir d’épilepsie à l’âge précoce et devenir agressive avec l’âge. Au 7ème jour de vie, un prélèvement caudal sera réalisé pour le génotypage. La procédure ne dure que quelques secondes mais peut générer un stress pour l’animal du fait de la contention ainsi qu’un saignement au niveau de la biopsie. Tous les animaux de l'élevage seront prélevés pour le génotypage une seule fois.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques développant la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des troubles épileptiques à l’âge d’environ 3 mois, cela représente moins de 5 pour cent des cas. Aussi ces souris transgéniques peuvent devenir agressifs avec l’âge. Le prélévement caudal pour le génotypage peut générer un stress pour l’animal du fait de la contention ainsi qu’un saignement au niveau de la biopsie. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour génotypage.

Devenir

Gardé en vie et transféré vers un autre site agrée pour les 990 souris pour expérimentation. Euthanasie des 270 souris reproductrice. Euthanasie ou mort des 99 souris à phénotype dommageable.

Remplacement

Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de ces études concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la fonction rétinienne.

Réduction

Compte tenu de la nature de ce projet d’élevage, il ne nécessite pas d’approche statistique. Néanmoins, les projets dans lesquels seront affectés les animaux par la suite (utilisation continue) feront quant à eux l’objet d’un calcul de puissance et d’une analyse statistique adapté. Les élevages seront adaptés afin de produire le nombre adapté d’animaux dans le respect des 3Rs. La production d’animaux a été estimée à 1359.

Raffinement

Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développant la maladie d’Alzheimer peuvent présenter des troubles épileptiques à l’âge d’environ 3 mois. Cela représente moins de 5 pour cent des cas. Si l’animal présente des crises d'épilepsies une euthanasie sera effectuée. Aussi, ces souris transgéniques peuvent devenir agressifs avec l’âge. Dans ce cas, l’isolement des souris est envisagé ou une euthanasie au cas de blessure grave. Aucun autre effet indésirable n’est décrit ou connu d’après notre expérience. Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h)/nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris modèle présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les souriceaux de 7 jours seront identifiés par tatouage au niveau des phalanges. Dans le même temps, un prélèvement caudal d’environ 1 mm sera réalisé pour le génotypage. Les animaux seront étudiés à l’âge de 3, 6, 9,12, 15 et 18 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par lot. Age de 3 mois : stade de début de perte synaptique. Age de 6 mois : stade de début d’apparition des protéines amyloïdes et de gliose. Age de 9 mois : stade de début de mort cellulaires. Age de 12 mois : stade de perte cognitif. Age de 15 à 18 mois : stade ou les symptômes sont exacerbés. Ces âges ont été bien définis dans la littérature.

368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une déficience génétique en lipase acide lysosomale, elles subissent un génotypage par biopsie de la queue, une destruction de leur moelle osseuse par deux injections de Busulfan ou une irradiation létale, puis une greffe de cellules souches et jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur indique que la destruction de la moelle peut provoquer une perte de poids et des plaies cutanées, et que les souris seront tuées pour prélever leur moelle osseuse et leur rate. Sur le remplacement, il affirme que les cellules de patients disponibles in vitro ne suffisent pas à reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Le déficit en enzyme (=protéine) : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras (=lipides) au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La transplantation de cellules souches de la moelle osseuse d’un donneur sain peut être bénéfique après déplétion au préalable des cellules du patient. Les cellules saines du sang produisent la protéine manquante et corrige l'accumulation de gras. Le manque de donneur compatible et le risque de rejet de greffe limitent le recours à cette procédure. Nous souhaitons développer un traitement curatif à long terme de la déficience en LAL (LAL-D) en utilisant une traitement génétique pour corriger les cellules souches de la moelle osseuse du patient. Les cellules corrigées du patient pourront à nouveau produire la protéine manquante et corriger l'accumulation de gras sans risque de rejet de greffe. Pour mettre au point cette stratégie, nous souhaitons tester différents méthodes de déplétion de cellules souches de la moelle osseuse afin de garantir une greffe de cellules souches optimales chez notre modèle de souris LAL-D.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de raffiner la méthode de déplétion des cellules souches de la moelle osseuse dans notre modèle de souris LAL-D afin de développer à terme un traitement génétique de la maladie. Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre de développer un traitement curatif pour les patients souffrant de LAL-D.

Procédures

Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance. Les animaux subiront soit 2 injections de Busulfan par voie intra péritonéales réalisé 48h avant la transplantation et espacée de 24H ou une irradiation létale réalisée 3h avant la transplantation de cellules. Pour l’irradiation, les souris seront disposées dans un irradiateur Faxitron (Rayon X, débit : 0,8Gy/min) pendant environ 12 min. Les animaux subiront une injection de cellules souches et des prélèvements de sang (au maximum 4 prélèvements) sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de queue, les injections des cellules ou Busulfan et les prélèvements de sang sont des procédures rapides, et ne devrais pas prendre plus de 10 min par souris.

Impact sur les animaux

Le maintien de la colonie LAL-D correspond à une nuisance légère car bien que les animaux LAL-D souffrent d’hépatosplénomégalie, il n’y a pas de modification de leur comportement (mobilité et alimentation). Les animaux seront génotypés par une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance ce qui est une nuisance légère de courte durée et seront sacrifiés à 8 mois pour éviter toutes souffrances. La nuisance lors des procédures de transplantation sera modérée et dura 16 semaines, en effet, les souris subiront une déplétion de cellules souches hématopoïétiques et seront transplantées par des cellules souches pour reconstituer la moelle osseuse. La déplétion peut entrainer une perte de poids des animaux et d’éventuelle plaies cutanées mais la transplantation de cellules souches permettra aux souris de se développer normalement.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les souris seront euthanasiées afin de récupérer la moelle osseuse et la rate pour faire les analyses de prise de greffe.

Remplacement

Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches hématopoïétiques de patient pour la LAL-D, nous devons d’avoir étudier la transplantation des cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à comparer nos valeurs de prise de greffe à nos valeur observée de référence à savoir 80% de prise de greffe en utilisant l’irradiation létale. Nous souhaiterions atteindre un pourcentage de prise de greffe similaire, à savoir 80% en moyenne, avec un minimum de prise de greffe de 50% plus ou moins 25% (variance). Nous avons utilisé test statique calculé par le logiciel G Power et conclut que 10 animaux par groupe sont nécessaires.

Raffinement

Les souris LAL-D sont plus petites que les souris saines, mais sans souci de motricité ou de douleur donc pas de condition particulière d’hébergement. Lors de la réalisation des procédures expérimentales, l’état général des souris (apparence, posture, comportement...) et leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours, puis toutes les semaines. En cas de plaies cutanées, une pommade sera appliquée tout au long de la cicatrisation. Toutes les procédures potentiellement douloureuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse. En cas de plaies oculaires, les prélèvements de sang seront suspendus et une application locale de gel cicatrisant sera effectuée. Si les plaies oculaires ne cicatrisent pas (infection, œil blessé) dans la semaine après traitement, les souris seront euthanasiées. De plus, afin de raffiner nos études, nous allons évaluer une méthode de myéoablation ayant moins d’effets d’indésirables pouvant ainsi améliorer la survie des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris LAL déficiente car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. Afin d’étudier la prise de greffe, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées ou greffées par chirurgie dans la glande mammaire, puis une partie des animaux est irradiée sous anesthésie, le porteur reconnaissant des risques de nécrose, d'ulcération tumorale et d'érythèmes cutanés. Les tumeurs et organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le microenvironnement tumoral et présente une protéine comme cible thérapeutique potentielle.

Objectifs

Le cancer, dont les cancers du sein et des voies aérodigestives supérieures, reste un problème majeur de santé publique. La radiothérapie est actuellement appliquée dans plus de 70% des traitements contre le cancer et fait partie de l’arsenal antitumoral incontournable. Cependant, la radiothérapie possède comme effets secondaires l’augmentation de l’immunosuppression du microenvironnement tumoral, en ciblant notamment un composant de ce microenvironnement, ce qui a pour conséquence de diminuer les chances de rémission complète chez les patients. Ce composant, une protéine de la matrice extracellulaire produite non seulement par les cellules cancéreuses mais également et majoritairement par des cellules fibroblastiques appelées FRC, joue un rôle primordial dans la genèse d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur favorisant la progression et la malignité des tumeurs. Il est suggéré que ce composant lorsqu’il est produit par les cellules FRC contrecarre la mort des cellules cancéreuses induite par la radiothérapie et empêche une rémission tumorale complète. La présente étude s’attachera à analyser dans des modèles d’expérimentation in vivo l’impact de cette protéine, présente dans le microenvironnement tumoral, sur le traitement par radiothérapie de tumeurs mammaires et des voies aérodigestives supérieures et à définir l’effet de la protéine produite par les cellules cancéreuses par rapport à celui de la protéine produite par les cellules FRC sur le développement d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. Il est attendu qu’en diminuant l’expression de cette protéine, et donc son effet immunosuppresseur, on améliore l’efficacité de la radiothérapie et ainsi qu’on puisse atteindre une rémission complète de la tumeur.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de cette étude est d'évaluer et caractériser, grâce à des modèles d'expérimentation in vivo, l’impact d'une protéine cible fortement produite dans les tissus tumoraux, et du traitement par radiothérapie sur le développement des cancers mammaires et des carcinomes de la tête et du cou. Le but in fine étant de déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentielle en santé humaine. En effet, nous prévoyons qu’une réduction ou absence de cette protéine dans les tissus tumoraux entraînera une diminution de l’aspect immunosuppressif du tissu tumoral et de ce fait améliore la rémission des tumeurs induite par le traitement de radiothérapie.

Procédures

Un groupe d’animaux subira une injection unique en sous-cutanée et sous anesthésie générale pendant 10 minutes maximum, de cellules au niveau de la nuque. Un second groupe subira une greffe par chirurgie sous anesthésie générale pendant 15 minutes maximum, de cellules au niveau de la glande mammaire. Une partie de ces animaux subiront également une irradiation soit à faible dose soit à forte dose (5 minutes maximum) sous anesthésie générale d’une durée maximum de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables que nous pourrions observer sur nos modèles murins de tumeurs mammaires et de tumeurs des voies aérodigestives supérieures (VADS) sont : inflammation, nécrose ou ulcération tumorale, problème d’alimentation ou de déplacement dû au développement de tumeur, infection ou mauvaise cicatrisation post-chirurgie, perte de poids, variation de la fréquence respiratoire. L’irradiation peut induire des érythèmes cutanés et des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des différentes procédures pour effectuer un prélèvement et une analyse des tumeurs et de différents organes.

Remplacement

Le modèle animal est nécessaire car il n'existe pas de modèle in vitro pour reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans la tumeur, comme l'environnement tumoral, la réaction du système immunitaire, les mécanismes physiologiques impliqués et l'impact sur la survie de l'animal, entre autres exemples. Un des objectifs de notre étude est de développer et valider un modèle 3D in vitro et le modèle animal est indispensable à l’obtention d’échantillons tumoraux issus d’animaux irradiés et non irradiés qui serviront de base à la caractérisation et à la validation de modèles tumoraux 3D in vitro en cours de développement dans le laboratoire..

Réduction

Un outil de calcul de la taille des échantillons biologiques a été utilisé afin de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire, mais néanmoins suffisant, pour pouvoir atteindre les objectifs et réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés et maintenus en groupes sociaux dans des cages agrémentées avec de la litière, de maisonnette et rouleaux de coton (nidification), de frisures de papier kraft et tunnel (cachette) et de bâtons à ronger pour diminuer leur stress et favoriser leur activité. Les protocoles expérimentaux seront réalisés par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement une semaine avant de démarrer les procédures expérimentales. L’implantation des cellules tumorales et l’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien des souris sur un tapis chauffant et avec du gel ophtalmique sur leurs yeux pour les protéger. Une analgésie pré- et post-opératoire ainsi qu’une analgésie locale seront effectuées lors des greffes par chirurgie. Pour les trajets entre le site d’hébergement et le site d’irradiation (effectués en voiture, < 5 min), les souris seront mises dans des boites de transport dédiées avec un filtre sanitaire, de la nourriture et de l’eau gélifiée, de la litière, de la frisure de papier kraft et des rouleaux de coton. Des chaufferettes seront ajoutées sous les boites pour éviter tout risque d’hypothermie des souris. Des points limites ont également été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront pesées et leur état général évalué tous les jours durant les trois premiers jours post-greffe (ou jusqu’à cicatrisation complète) et post-irradiation puis au minimum 3 fois par semaine. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans une grille d’évaluation de la souffrance/points limites permettant la surveillance des animaux. Tout signe anormal (points limites : perte de poids excessive, comportement ou apparence/état de l’animal anormal, respiration anormale, etc.) sera signalé aux responsables. De plus, si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs, une injection d’un analgésique sera effectuée. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chercheurs. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car celui-ci possède de multiples avantages dont celui d'être un modèle animal déjà validé dans le laboratoire depuis de nombreuses années. De plus, la souris récapitule de manière très similaire à l’homme l'ensemble des mécanismes moléculaires et des paramètres impliqués dans le développement tumoral : microenvironnement, réaction du système immunitaire, dissémination des métastases, mécanismes physiologiques impliqués et/ou associés, impact sur la survie. Les souris seront utilisées adultes à partir de 8 semaines d'âge minimum, ceci afin de mimer la pathologie chez l’homme adulte. L’utilisation de souris plus jeune n’est pas pertinente car les mécanismes physiologiques impliqués seraient potentiellement différents, le jeune individu étant encore en cours de développement.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie métabolique, elles reçoivent des injections d'un peptide antimicrobien et développent une faiblesse musculaire progressive, avec une biopsie de la queue pour le génotypage. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que seuls les modèles in vivo reflètent la complexité de la maladie et annonce des expériences sur cellules pour limiter le recours à l'animal.

Objectifs

Certaines myopathies héréditaires sont causées par un déficit en une enzyme conduisant à une accumulation progressive d'un sucre et à une dégénérescence des muscles (myopathie métabolique). Le seul traitement spécifique à ces maladies est la thérapie substitutive avec l'enzyme manquante qui vise à stopper l'évolution naturelle de la maladie. Cependant, les limites de la thérapie incitent la communauté scientifique à approfondir ses recherches sur la maladie. Nous souhaitons explorer si une molécule antimicrobienne joue un rôle dans la physiopathologie de la maladie. Nos études préliminaires et la littérature montrent que cette molécule est exprimée dans le muscle sans que son rôle soit connu. Notre projet a pour but de comprendre ce rôle dans un modèle préclinique de la maladie.

Bénéfices attendus

mise en évidence du rôle thérapeutique d’une molécule antimicrobienne dans une myopathie métabolique.

Procédures

-Injections intrapéritonéales de cathélicidine (douleur de quelques secondes) -Développement de la maladie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive sans paralysie invalidante. -Risque d'aggravtion du phénotype dans la lignée nouvellement générée. -Biopsie de queue pour génotypage.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéales d'un peptide antimicrobien (douleur de quelques secondes) -Développement d'une myopathie caractérisée par une faiblesse musculaire progressive. Douleur légère pour la biopsie de queue.

Devenir

-Mise à mort à la fin de la procédure pour collecte des tissus post-mortem.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie de la maladie de Pompe, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre le systéme immunitaire et le muscle. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Des expériences in vitro sur des cellules primaires seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences in vivo.

Réduction

L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses biologiques et extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Concernant spécifiquement les souris présentant les symptômes de la myopathie (faiblesse musculaire) : nourriture humide (gel nutritif) en fond de cage.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Les souris C57BL/6 mutantes seront utilisées à 4, 12 et 24 semaines pour étudier les différents stades de développement de la myopathie.