Souris

1 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation puis de une à neuf injections, avec induction de tumeurs, pour étudier le rôle de sous-types de cellules dendritiques dans l'immunothérapie du cancer. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent entraîner une perte d'appétit et de poids et que l'irradiation peut causer amaigrissement et diarrhée. Il qualifie d'"indispensable" le recours à la souris et renvoie les retombées thérapeutiques pour les patients à un horizon futur.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un processus de mort cellulaire qui déclenche une réponse immunitaire. Lorsqu'une cellule meurt de manière immunogène, elle libère des signaux moléculaires qui attirent les cellules du système immunitaire, comme les cellules dendritiques qui jouent un rôle central. Actuellement, différents sous-groupes de cellules dendritiques ont été identifiées mais, à ce jour, leur rôle n’est pas encore clair. Les objectifs de ce projet sont : 1) Découvrir et comprendre quels sous-types de cellules dendritiques sont les plus importants pour garantir un meilleur effet avec la thérapie immunogène anticancéreuse. 2) Etudier comment les chimiothérapies immunogènes et l’immunothérapie affectent les bons sous-types de cellules dendritiques et montrent un meilleur traitement contre le cancer que les autres. Cette recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l'efficacité des approches thérapeutiques immunogènes contre le cancer par amorçage du potentiel des cellules dendritiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Les recherches dans ce projet peuvent avoir un impact significatif sur le développement de traitements plus personnalisés et efficaces contre le cancer en exploitant le potentiel des sous-populations spécifiques de DC dans la thérapie immunogène. Voici quelques-uns des avantages attendus de ce projet : 1) En étudiant comment la déplétion sélective de certaines sous-populations de DC affecte la réponse immunitaire, nous pourrions parvenir à une compréhension plus approfondie du rôle spécifique de ces cellules dans la thérapie immunogénique du cancer. Cela permettrait de mieux cibler les interventions thérapeutiques pour maximiser leur efficacité ; 2) En comprenant comment les différentes sous-populations de DC interagissent avec la chimiothérapie et l'immunothérapie, nous pourrions optimiser la combinaison de ces approches pour une meilleure réponse immunitaire et une plus grande efficacité dans le traitement du cancer ; 3) Ces recherches pourraient révéler des sous-populations spécifiques de DC qui sont essentielles pour une réponse immunitaire efficace. Cela ouvrirait la voie à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront une irradiation (durée 14 minutes) suivie d'une injection (durée 2 minutes) sous anesthésie locale. Suivant les lots, les souris pourront avoir entre 1 et 9 injections (durée 2 minutes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (préhension, injections) peuvent induire du stress chez l'animal. La croissance tumorale et les traitements (la chimiothérapie et l'immunothérapie) peuvent entraîner une perte d'appétit et une perte de poids. L’irradiation peut induire des atteintes modérées de la santé avec amaigrissement et diarrhée transitoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.

Remplacement

L'utilisation de la souris dans la recherche sur la chimiothérapie et l'immunothérapie est indispensable car les maladies traitées par perfusion et immunothérapie, particulièrement le cancer, sont des affections complexes impliquant des interactions entre de multiples voies biologiques et des cellules. Les souris sont des modèles animaux qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec les humains, permettant ainsi de comprendre les mécanismes biologiques et les réponses aux traitements dans un système vivant complet. Les DCs sont d'une complexité biologique considérable, et leur fonctionnement et leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires sont encore en cours de découverte. Donc l'utilisation de modèles in vivo dans la recherche sur la biologie des cellules dendritiques est indispensable pour obtenir des informations approfondies sur leur fonction, leur rôle dans la réponse immunitaire, leur contribution aux maladies et leur potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés ; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail comme expliqué dans chaque procédure. De plus, toutes les expériences reposant sur la reconstitution de la moelle osseuse seront réalisées avec des moelles osseuses cryoconservées au lieu de les extraire de nouveaux animaux donneurs, ce qui réduit de moitié le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront en environnement enrichi et stimulant pour les animaux en expérimentation, avec suffisamment d'espace, de matériel et d'interactions sociales, pour améliorer leur bien-être (sizzlenests, tunnels, maisons). Les protocoles expérimentaux sont rigoureux, optimisés et validés, et minimisent la souffrance animale et les manipulations inutiles, tout en fournissant des résultats scientifiquement valides. Le personnel de recherche est formé en continu afin de réduire le stress et l'inconfort des animaux. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Un suivi quotidien est mis en place pour s'assurer de la santé des animaux et mettre en place des mesures correctrices quand c'est nécessaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions seront réalisées sous anesthésie locale ou générale et raffinées (utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...).

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, et pratiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

1 191 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse, quatre gavages, des prélèvements de sang et l'implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie, pour reproduire une myélofibrose que 100 % des animaux développent. Le porteur indique que la maladie provoque une splénomégalie, une perte d'appétit et un amaigrissement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut réunir ces paramètres et conclut à la nécessité de la souris pour étudier la maladie dans un "organisme dans sa globalité".

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération excessive des cellules myéloïdes tels que les globules rouges, les mégacaryocytes (donnant naissance aux plaquettes) et des granulocytes et peuvent aboutir au développement de leucémies, dont la plus grave est caractérisée par les mutations dans des gènes régulant la production de plaquettes. Elle conduit à une amplification anormale de plaquettes dans la moelle osseuse qui vont s’activer et libérer différents cytokines et facteurs de croissance. Ces derniers vont agir sur les cellules stromales de la moelle osseuse ce qui conduira à la production de collagène en excès et à une dégénerescence par fibrose. Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace dans cette maladie, à l'exception de la greffe de moelle osseuse. Chez les patients atteints de cette maladie, les meiilleurs traitements sont inefficaces.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace de la myélofibrose. Ici nous proposons un nouveau modèle préclinique au développement de la MF rapide et homogène (100% d'animaux développent la maladie contre 60% avec les modèles précédemment décrits) qui nous permettra non seulement de décrypter les mécanismes physiopathologies de la maladie mais aussi de tester des drogues identifiées pendant une pédiode courte et sur un nombre d'animaux diminué car ce nouveau modèle est très reproductible. Les bénéfices potentiels sont le développement de traitements pour cette pathologie grave.

Procédures

Gavages 4 fois, durée 1 minute. Irradiations: 1 fois (13 minutes) et greffes (durée 5 minutes), sous anesthésie générale. Prélèvements de sang (nombre 3), durée 2 minutes sous anesthésie générale. Injections des médicaments (1 ou 2 injections) durée 1 minute, anesthésie locale. Implantation de pompes osmotiques, durée 8 minutes, une fois, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le gavage induit une contrainte légère. Les irradiations suivies de greffe induisent une contrainte modérée pour les animaux: fatigue transitoire, possibilité de diarrhée transitoire. Les injections et les prélèvements de sang induisent une contrainte légère et transitoire du fait de la préhension des animaux. L'implantation de pompes osmotiques est une peite chirurgie légère qui est très bien tolérée. Le modèle proposé conduit au développement de la myélofibrose accompagnée de la diminution de cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse et leur augmentation au niveau de la rate (splénomégalie). Les animaux peuvent présenter des signes cliniques du fait de la perturbation de la formule sanguine, avec perte d'appétit et amaigrissement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les organes hématopïétiques.

Remplacement

Le développement de la myélofibrose survient dans un environnement qui nécessite la présence de différentes cellules, les cellules hématopoïétiques porteuses de la mutation causale de la maladie, différents types de cellules de l'environnement qui seront activées après la libération de cytokines par les cellules hématopoïétiques et le confinement de la moelle osseuse. Il est impossible de réunir ces paramètres in vitro. De plus, la maladie ne touche pas uniquement la moelle osseuse, on observe la splénomégalie et la fibrose au niveau de la rate. Seuls les traitements de souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de NMP permettront d’analyser leur efficacité dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot a été minimisé et s'est basé sur la littérature et l’expérience du laboratoire sur ce modèle de maladie. Le nombre indiqué ne sera atteint que si tous les médicaments présentent un effet sur la myélofibrose. Si un médicament n'a pas d'effet, le test sera arrêté précocément.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance clinique quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Une alimentation adaptée sera ajoutée dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites précoces seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...).

Choix des espèces

L'utilsiation de souris nous permets dans un temps très court l'obtention d'un nombre d'animaux à expérimenter. Nos modèles miment parfaitement les pathologies humaines (Thrombocytémie Essentielle et Polyglobulie De Vaquez) qui mènent à la myélofibrose. Ce sont donc de bons modèles, statistiquement solides et probant pour les études proposées. Ces souris modèlisent au plus près les conditions pathologiques humaines. Le modèle conduit à un développement rapide de la myélofibrose et ceci de façon très homogène ce qui permet de réduire le nombre d'animaux et le temps de traitement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite de la leishmaniose viscérale par injection intrapéritonéale, puis reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours de molécules candidates. Le porteur indique que la voie d'administration peut provoquer des réactions au point d'injection et prévoit de tuer toutes les souris pour prélever leur foie et leur rate. Il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la leishmaniose dans sa complexité, ce qui rend selon lui l'expérimentation animale 'incontournable'.

Objectifs

Leishmania infantum est un de agents majeurs des leishmanioses viscérales (avec L. major). Les leishmanioses viscérales (LV), également appelées kala-azar, sont mortelles dans plus de 95% des cas en absence de traitement. Elles se caractérisent par des poussées irrégulières de fièvre, une perte de poids, une hépatosplénomégalie et une anémie. La plupart des cas sont observés au Brésil, en Afrique de l’Est et en Inde. On estime que 50 000 à 90 000 nouveaux cas de LV surviennent chaque année dans le monde et que seuls 25% à 45% de ces cas sont notifiés à l’OMS. Les LV demeurent l’une des principales maladies parasitaires à haut potentiel d’épidémie et de mortalité. En 2018, plus de 95 % des nouveaux cas signalés à l’OMS provenaient de 10 pays : Brésil, Chine, Éthiopie, Inde, Iraq, Kenya, Népal, Somalie, Soudan et Soudan du Sud. La leishmaniose viscérale est endémique dans la Région Européenne (au sens de l’OMS), en 2018, plus de 200 cas y ont été signalés (pour l’essentiel sur le pourtour méditerranéen). Ce nombre augmente, en parallèle aux pressions migratoires et au réchauffement climatique et par ailleurs une forte prévalence est retrouvée chez les canidés domestiques dans le pourtour méditerranéen. Le traitement de la leishmaniose dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels la forme de la maladie, les affections concomitantes et l’espèce parasitaire. La leishmaniose est une maladie qui peut être traitée et guérie, mais qui requiert un système immunitaire compétent car les médicaments n’éliminent pas entièrement le parasite de l’organisme, ce qui induit un risque de rechute en cas d’immunosuppression. Par ailleurs, les traitements de choix ont une forte toxicité. Des résistances aux traitements courants se développent progressivement dans les zones d’endémie. Les besoins pour de nouvelles molécules actives sont donc pleinement justifiés. Avant toute tentative de maturation de telles molécules vers un nouveau médicament à usage humain ou vétérinaire, il est indispensable, au-delà des essais in vitro, d’avoir des données de bases sur leur activité in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet envisagés à long terme sont de : - Permettre le développement d’un médicament vétérinaire capable de traiter les animaux de compagnie (leishmaniose canine en particulier), servant de réservoir parasitaire et présentant donc un risque zoonotique de transmission humaine opportuniste, particulièrement dans les départements français de l’arc méditerranéen. - Permettre le développement d’un médicament à usage humain permettant d’améliorer le traitement de maladies parasitaires rares et négligées. - Permettre de mettre à jour une molécule tête de série pour le développement de dérivés d’hémisynthèse (molécules naturelles modifiées par synthèse chimique afin d'améliorer leurs propriétés pharmacodynamiques et/ou pharmacocinétiques) encore plus actifs, à l’instar de la benzyl pénicilline, tête de série de toutes les pénicillines et céphalosporines utilisées comme antibiotiques humains et animaux depuis des décennies.

Procédures

Tous les animaux infestés recevront l'inoculum de parasites par voie intrapéritonéale (100 microL) en 1 seule injection sur environ 1 min d'intervention. Tous les animaux traités le seront par injection intrapéritonéale (100 microL) à raison d'1 injection par jour durant environ 1 min et ce, pendant 10 jours. Les animaux témoins, c'est-à-dire non infestés et non traités, ne subiront aucune intervention.

Impact sur les animaux

La voie d'administration, intrapéritonéale, est susceptible d'engendrer des réactions au niveau du point d'injection (dépôts de fibrine).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leur foie et leur rate postmortem.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude est envisagé après de nombreuses études réalisées in vitro sur ces 2 molécules (tests sur lignée d'amastigotes axéniques de Leishmania infantum, modèle in vitro de leishmanies intramacrophagiques, tests sur macrophages, et lignées cellulaires cancéreuses (HepG2) et non cancéreuses (cellules VERO). Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la leishmaniose dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour l’analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Par ailleurs, uniquement 2 molécules (1 molécule naturelle et 1 molécule de synthèse) actives in vitro, sélectionnées à partir de 2 projets de recherche différents, seront testées afin de mutualiser les groupes de souris contrôle (1 groupe non traité non infesté, 1 groupe infesté non traité et 2 groupes infestés et traités par 2 doses de traitement de réference, soit au total une réduction de 20 souris comparativement à 2 essais in vivo indépendants). De plus, le fait de tester le traitement de référence sur ce modèle lors de la phase préliminaire, permettra, en cas d'inefficacité dudit traitement, d'avorter l'essai in vivo des molécules à tester.

Raffinement

Les méthodes d’analyses choisies permettent l’étude simultanée d’un grand nombre de paramètres (paramètres cliniques (scores de poids, et de comportement) et charge parasitaire mesurée par 2 techniques). Ceci conduit à réduire la variabilité expérimentale et le nombre de techniques à réaliser, donc le nombre d’animaux à utiliser. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit. Le bien-être animal sera donc une priorité mise en oeuvre par le suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de zootechnie qui évaluera l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, comportement, prostration, perte de poids, piloérection, présence de blessures). L'enrichissement et le développement de l'aspect social du groupe seront ménagés. L'expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé de l'animal selon les points limites et les critères d'arrêt définis dans les procédures afin de limiter la douleur, la souffrance ou l'angoisse de l'animal. Par ailleurs, le modèle proposé (évaluation de l’activité des molécules 18 jours après l’inoculation), permet de ne pas entrainer l’apparition de symptômes (hépato-splénomégalie, anorexie, asthénie) douloureux pour les animaux. En effet, en l'absence de traitement, les symptômes apparaissent 30 à 45 jours après inoculation, la leishmaniose étant une parasitose chronique. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours, ainsi que le matériel traité non consommé, seront conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible au collectif, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Par exemple, les prélèvements sanguins effectués pourront servir à l'évaluation pharmacocinétique des molécules testées.

Choix des espèces

Dans le cadre de la confirmation, in vivo, de l’efficacité de molécules actives sur les leishmanies, l’utilisation de souris, qui ne sont pas l’hôte usuel de ces parasites, est consensuelle dans la collectivité scientifique. Les souris utilisées seront des souris balb/c femelles en raison de leur moindre agressivité, diminuant ainsi le stress des animaux. Les souris sont utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge (ou environ 20-25 g pour une souris). C’est le meilleur compromis pour la qualité de l’inoculation et la présence d’un système immunitaire mature.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, elles subissent chaque jour un stress de contention, olfactif, social, environnemental ou une perturbation de leur rythme circadien, pour reproduire un état dépressif et tester des molécules. Le porteur présente le projet comme une prestation offerte à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques pour la validation in vivo de leurs molécules, et prévoit de tuer les souris par dislocation cervicale afin d'analyser leur intestin et leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire l'état dépressif.

Objectifs

Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte environ 12% des hommes et presque 20% des femmes. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables (troubles du sommeil par exemple). De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression est associée une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu'une dysbiose du microbiote intestinal. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.

Procédures

Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le groupe G2 subira ces stress pendant 8 semaines. Le groupe G3 subira le protocole de stress pendant 8 semaines associé à un traitement antidépresseur connu. Les souris du groupe G4 subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu sur le groupe contrôle (non-CUS - G1). Les souris des groupes CUS (G2, G3 et G4) seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Le groupe G3 aura en plus un traitement antidépresseur. Ce groupe devrait avoir un aspect du poil bien entretenu. Ce traitement antidépresseur chez la souris n'est pas connu pour engendrer d'effet indésirable quelconque. Les souris du groupes G4 qui seront traitées avec des molécules à tester seront des molécules de type probiotiques ou prébiotiques ou compléments alimentaires ne faisant pas l'objet d'une quelconque dangerosité pour l'animal.

Devenir

Les souris seront ensuite euthanasiées par dislocation cervicale afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.

Remplacement

Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris C57BL/6J est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. L'accumulation de ces stress qualifie cette procédure de modérée. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.

Choix des espèces

La souris C57BL/6J est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).

Selon les lots, des souris reçoivent deux fois par semaine dans l'abdomen un agent qui provoque une fibrose du foie, un régime gras de 4 ou 12 semaines, une injection de bactéries, une injection de virus pour rétablir l'expression d'un gène ou une chirurgie pour injecter des cellules dans un vaisseau, et presque toutes une prise de sang de 500 microlitres sous anesthésie, "avec ouverture de la souris". 5 235 souris vont être utilisées, dont des souris de 20 à 24 mois, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la déclaration les classe toutes en souffrance modérée, y compris le lot opéré "sans réveil". Le porteur cite une prise de poids qui peut limiter la mobilité des souris soumises au régime gras et une perte de poids sous l'agent qui agresse le foie, puis affirme que la fibrose, la cirrhose et le foie gras ainsi provoqués sont "indolores" et "n'affectent pas l'état général des souris". Pour les infections bactériennes, il juge les périodes d'observation "trop courtes pour causer des souffrances".

Objectifs

Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.

Procédures

Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : * Pour les modèles d'infections bactériennes, il est important de noter que les périodes d'observation sont trop courtes pour causer des souffrances aux animaux, comme cela a été démontré dans de récentes études. Cependant, en cas d'effets indésirables, ils se manifestent généralement par une légère fièvre. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.

Réduction

Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.

1566 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules cancéreuses par voie sanguine ou sous-cutanée sous anesthésie, puis elles reçoivent divers traitements par injection ou gavage et des prélèvements de sang à la joue, pour évaluer un traitement sur cinq types de cancers. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement et un isolement, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme que seul un modèle vivant entier permet d'étudier l'évolution tumorale et les récidives.

Objectifs

Pour traiter leucémie et tumeurs solides, il est important de trouver de nouvelles façons de soigner les patients tout en minimisant les effets secondaires. Récemment, il a été développé un médicament spécifique des cellules qui prolifèrent rapidement (comme les cellules cancéreuses). Aujourd’hui, ce traitement est testé en essai clinique sur des patients atteints de leucémie, et nous souhaitons élargir l’utilisation de notre traitement à d’autres cancers agressifs, comme celui du poumon, du sein, du pancréas et le mélanome. Dans des expériences préliminaires de laboratoire, ces cellules cancéreuses sont tuées efficacement par le médicament. L’utilisation de la souris nous permet de confirmer l’efficacité du médicament dans un environnement physiologique et vivant avant de tester le produit en clinique, chez l'homme. Dans une seconde partie du projet, comme il est souvent difficile de traiter totalement le cancer avec un seul médicament, nous souhaitons combiner notre traitement avec d’autres agents couramment utilisés en cliniques aujourd’hui. Ces combinaisons de plusieurs thérapies sont de plus en plus utilisées en clinique pour augmenter l’efficacité de traitement, réduire le risque que le cancer se redéveloppe et surtout réduire les effets secondaires. Nous avons déjà testé ces combinaisons en laboratoire et avons obtenus de résultats prometteurs. Avant de pouvoir appliquer notre traitement chez les patients atteints de cancers, seul ou en combinaison, il est nécessaire de valider nos résultats sur des modèles animaux qui récapitulent fidèlement ce que l'on observe chez l’homme. Ce projet nous aidera à mieux comprendre comment le cancer peut développer une résistance, comment notre traitement interagit avec le corps humain et d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Le processus de développement d’un nouveau traitement, de sa conception initiale jusqu’à son autorisation de mise sur le marché, peut nécessiter en moyenne entre 15 et 20 années. Il est donc impératif d’optimiser au maximum l’utilisation de chaque avancée thérapeutique. Ce projet permettra d’une part d’optimiser le développement de notre traitement en l’appliquant sur différents modèles de cancer agressifs, notamment sur un modèle de cancer de pancréas pour lequel seules la chirurgie et la chimiothérapie conventionnelle existent. D’autre part, ce projet apportera une meilleure compréhension de la résistance thérapeutique, et dans la récidive du cancer. Cette compréhension favorisera la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques, qui permettront de réduire la dose administrée de chaque traitement, et par conséquent réduire le coût, les effets indésirables, et surtout la résistance au traitement. En effet, ces bithérapies permettront d’offrir une alternative thérapeutique aux patients résistants à un agent, et donc cibler une plus large partie de la population. Ainsi, ce projet ouvrira de nouvelles perspectives dans le traitement des leucémies aiguës, de cancers solides, et offrira une alternative aux patients en quête de traitements plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des greffes de différentes cellules cancéreuses pour développer la maladie, par voie sanguine ou sous cutanée. Avant et pendant chaque greffe, les souris sont endormies. Les responsables du projet suivront l’évolution de la maladie 2 fois par semaine. Pour une des procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau de la joue pour surveiller l’évolution de la maladie. Ces prélèvements seront effectués sur des animaux endormies une fois par semaine au maximum, soit un total de 3 à 12 prélèvements totaux selon la procédure. Les animaux seront divisés en plusieurs groupes pour leur administrer différents traitements par voie sanguine, sous-cutanée ou par gavage. L’administration de traitements ne nécessite pas le recours à l’anesthesie. Selon les procédures, les différents traitements seront administrés par voie orale, par injection sous-cutanée ou par injection sanguine. Toutes interventions sur la souris (injections de cellules tumorales en sous cutanée, gavages, injection du traitement et prélèvements) effectuées par des membres qualifiés dureront 1 à 5 minutes maximum par souris. Le temps de developpement de la maladie (en sous cutanée ou par voie sanguine) est estimé à deux semaines. Au moins 2 fois par semaine, les responsables du projet observeront les animaux pour détecter tout inconfort ou signe de douleur.

Impact sur les animaux

Les transplantations de cellules, les prélèvements de sang, et les administrations de traitement par voie intraveineuse se feront sous anesthésies gazeuses, ce qui peut occasionner un stress de courte durée à l’induction et au réveil. Certains traitements sont administrés par voie orale avec une technique appelée gavage qui peut entrainer une gêne physique en cas d’administration quotidienne. Comme attendu dans ce projet, les greffes de cellules vont aboutir à un développement tumoral, qui, à un certain stade, peut occasionner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement, une isolation, une perte d’activité.

Devenir

A l'issue des expérimentations, tous les animaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses sur les organes et évaluer la présence éventuelle de cellules cancéreuses résiduelles.

Remplacement

Nous avons déjà effectué plusieurs tests de laboratoire (qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux) qui ont confirmé l’efficacité antitumorale de notre anticorps seul et en combinaison avec d’autres médicaments. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier en profondeur l’évolution tumorale, les récidives, et la réponse de l’organisme au traitement. De plus, il est important d’évaluer consciencieusement les potentiels effets secondaires de notre traitement et s’assurer de la non-toxicité avant son application chez l’homme. Enfin, nous souhaitons étudier l’effet de notre traitement sur la survie des individus. Pour ces raisons, seul un modèle vivant entier pourra répondre entièrement à notre projet. La souris reste donc aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Grâce à des études déjà réalisées au sein de notre laboratoire et à des tests statistiques réalisés on sait que pour interpréter les résultats obtenus, il faut utiliser au moins 8 animaux par conditions. Ces calculs sont confirmés aussi par d’autres laboratoires, et sont également présents dans la littérature. En plus, nous utiliserons les mâles et les femelles pour généraliser la réponse au médicament chez les deux sexes.

Raffinement

Toutes les procédures seront soumises au respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupe pour privilégier leurs interactions sociales, dans des cages propres et contrôlées, contenant des jouets. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et 2 fois par semaine par les responsables du projet. Les protocoles ont déjà été optimisés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les injections et prélèvements dures 5 minutes et sont réalisés par des membres qualifiés, sur les animaux endormis permettant la réduction du stress et douleur. En cas de douleur qui peut se développer à cause de l’évolution du cancer, des anti-douleurs leur seront administrés. Un score de douleur sera établi 2 fois par semaine selon une grille très spécifique. En cas de non-réponse aux antidouleurs, les animaux seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est considérée aujourd’hui comme un modèle pertinent pour étudier et comprendre l’évolution du cancer et la réponse aux traitements observée chez l’homme, notamment du fait de la similarité biologique. Pour ce projet nous utiliserons des souris adultes (>6 semaines) pour refléter l'âge de développement de ces tumeurs chez l'homme.