Souris
Clearence du potassium par des astrocytes dans le cerveau de souris normale et épileptique.
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Une partie subit un état de mal épileptique provoqué par injection, maintenu trente minutes, que le porteur reconnaît douloureux et impossible à réaliser sous anesthésie, avant que le cerveau ne soit prélevé pour des analyses ex vivo. Les souris qui ne se réalimentent pas ou perdent plus de 15 % de leur poids sont exclues et tuées. Le porteur présente la modélisation informatique comme une piste future tout en concluant que seul l'animal permet aujourd'hui d'étudier l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet de recherche découle d'un projet plus vaste que notre équipe mène depuis cinq ans, visant à comprendre comment les rythmes naturels du corps influent sur le fonctionnement normal et anormal du cerveau. Cette question revêt une importance particulière pour la santé humaine, car toutes les fonctions de notre organisme suivent un rythme quotidien, et ces rythmes sont perturbés en cas de maladies telles que l'épilepsie, la deuxième maladie neurologique la plus répandue après la migraine. Environ 30% des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux actuels. Les recherches sur l'épilepsie ont traditionnellement ciblé les neurones, mais notre projet se concentre sur les cellules gliales, en particulier les astrocytes, qui jouent un rôle crucial dans le soutien métabolique du cerveau. Les études ont montré des fluctuations importantes dans les concentrations d'ions essentiels (sodium, potassium, chlorure) chez les sujets épileptiques, en particulier une augmentation du potassium. Notre objectif est de comprendre pourquoi cette régulation est perturbée, si elle est liée au dysfonctionnement des astrocytes, et quels mécanismes astrocytaires de la clairance du potassium sont affectés. Nous cherchons à répondre à ces questions pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Lors des crises épileptiques, on observe une augmentation temporaire du potassium à l'extérieur des cellules du cerveau, aussi bien chez les patients que dans des modèles animaux (rats, souris) et des préparations du cerveau de rongeurs en laboratoire. Cette élévation de potassium est ainsi un marqueur universel de la crise épileptique. Bien que les mécanismes précis de cette perturbation puissent varier entre différentes espèces, son origine commune semble être les astrocytes, des cellules gliales du cerveau. En étudiant comment les astrocytes éliminent le potassium dans les tranches du cerveau de souris, nous cherchons à comprendre comment cette fonction est normalement assurée dans le cerveau humain et comment elle est altérée lors de l'épilepsie. Actuellement, aucun traitement antiépileptique ne cible spécifiquement les astrocytes. Les résultats de notre projet ouvriront des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre collaboration avec l'équipe des Neurosciences Théoriques est essentielle. Ces chercheurs modélisent l'activité des réseaux neuronaux dans différentes parties du cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. La régulation du potassium extracellulaire est une variable clé dans leurs modèles. Pour que leurs simulations reflètent la réalité, elles doivent s'appuyer sur des données expérimentales. Les expériences que nous prévoyons dans le cadre du projet fourniront ces données, permettant d'améliorer la précision des modèles. Ces modèles améliorés offriront ensuite la possibilité de prédire le comportement du réseau neuronal dans différentes conditions, y compris en réponse à des médicaments, sans recourir à des expérimentations sur des animaux de laboratoire. Ainsi, notre projet contribuera à développer et exploiter une approche informatique (in silico) pour mieux comprendre et traiter l'épilepsie.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs injections intrapéritonéales : 1 à 3 injections d'une molécule pro-convulsante ou de sérum physiologique dans le cas des souris témoins, et une injection d'une molécule anti-convulsive.
Impact sur les animaux
Le projet s'appuit sur l'utilisation du modèle animal d'épilepsie généralisée qui reproduit les caractéristiques principales de l'épilepsie du lobe temporal (ELT) chez les humains, y compris les crises épileptiques et les problèmes de mémoire. Malheureusement, pour induire cette épilepsie, nous devons provoquer un état convulsif initial chez les souris non affectées, appelé "status epilepticus". Cet état est douloureux, mais nous ne le laissons durer que 30 minutes, puis nous l'arrêtons en administrant un médicament anti-convulsivant. Il n'est pas possible d'anesthésier les animaux pendant cette induction, car le status epilepticus est défini par des mouvements et des comportements spécifiques qui seraient complètement supprimés par une anesthésie. La classification de la gravité de cet état de mal est cruciale, car elle nous permet de déterminer précisément quand il commence, nous donnant ainsi un contrôle sur sa durée. L'induction de l'épilepsie en déclenchant cet état de mal est la seule méthode disponible pour créer un modèle animal de l'épilepsie du lobe temporal.
Devenir
Après le déclenchement du "status epilepticus" les souris deviennent épileptiques et elles seront utilisées pour les expérimentations ex vivo qui cible à étudier la clairance du potassium dans les tranches de cerveaux épileptiques et sains.
Remplacement
Les dernières décennies ont été marquées par d'importants progrès dans le domaine de la modélisation des fonctions cérébrales. Des projets internationaux tels que The Virtual Brain et le Human Brain Project ont considérablement enrichi nos connaissances sur les mécanismes de la mémoire et du traitement de l'information dans le cerveau humain. Les nouvelles procédures informatiques permettent aux médecins neurologues d'extraire davantage d'informations de l'EEG et de l'imagerie cérébrale. Les modèles mathématiques récents peuvent décrire certains aspects du fonctionnement d'une cellule nerveuse ou d'un réseau neuronal. Cependant, aucun outil informatique ne permet de modéliser l'ensemble du répertoire de l'activité cérébrale, qu'elle soit physiologique ou pathologique, car les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ne sont pas encore connus. La seule voie pour les découvrir passe par l'exploration du modèle animal. Le foyer de la crise épileptique est localisé dans une région du cerveau, mais une fois déclenchée, la crise peut se propager et envahir plusieurs régions, voire l'ensemble du cerveau. Étant donné que le cerveau contrôle toutes les fonctions de l'organisme, son dysfonctionnement peut affecter d'autres organes vitaux tels que le cœur ou l'estomac, qui à leur tour influent sur le fonctionnement du cerveau. Ainsi, l'épilepsie dépasse le cadre d'une pathologie purement neurologique, c'est pourquoi son exploration requiert l'accès à l'organisme entier, une possibilité que aucune autre approche ne nous offre pour l'instant.
Réduction
Un cerveau (une souris) sera utilisé pour la préparation de plusieurs tranches (4-6) qui seront ensuite utilisées simultanément sur deux postes expérimentaux ce qui permettra soit d'obtenir lors de la même session les données de deux types (deux protocoles expérimentaux différents, un par poste), soit de cumuler plus de données d'un type (le même protocole appliqué sur deux postes expérimentaux).
Raffinement
Ce projet présente des approches pertinentes visant à réduire la douleur, la souffrance, le stress et l'inconfort chez les animaux de laboratoire, en particulier les souris. Une procédure d'induction du statut épileptique individualisée a été mise en place. Après la première injection d'une substance épileptogène, ne représentant qu'un tiers de la quantité totale, le comportement de chaque souris est surveillé. La décision d'administrer les injections suivantes est basée sur la réaction individuelle de la souris à la première injection, réduisant ainsi le temps de souffrance et accélérant le rétablissement post-induction. Le suivi quotidien des animaux est également adapté à chaque individu. Les souris qui ne parviennent pas à se nourrir se voient fournir de la nourriture par l'expérimentateur jusqu'à ce qu'elles puissent le faire elles-mêmes. Si une souris n'est pas capable de se nourrir seule dans les deux jours suivant l'induction du statut épileptique, elle est exclue du projet et euthanasiée par inhalation de CO2. Le bien-être des animaux est privilégié en ce qui concerne leurs conditions d'hébergement. Ils sont regroupés par 3 à 5 selon la taille de la cage, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. L'environnement est enrichi de maisonnettes et d'objets divers. Des observations indiquent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu'ils sont hébergés en groupe (DOI: 10.1523/ENEURO.0179-18.2019). Pour minimiser le stress, les animaux sont manipulés et pesés 3-4 fois par semaine avant la procédure d'induction de l'épilepsie et pendant la phase latente. Cependant, une fois devenus épileptiques, toute manipulation non nécessaire est évitée, car elle peut augmenter leur niveau de stress et déclencher des crises épileptiques. Les animaux sont observés quotidiennement, leur état étant évalué à l'aide de la grille d'expression faciale (DOI: 10.1038/nmeth.1455). Une souris présentant des signes de souffrance de niveau 1 ou 2 est pesée. Si son poids a diminué de plus de 15 % par rapport à celui observé pendant la phase latente, elle est exclue du projet et euthanasiée. Si le poids reste constant mais que la souris montre des signes de souffrance de niveau 2 pendant plus de deux jours consécutifs, elle est également exclue du projet et euthanasiée.
Choix des espèces
Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail. Ce projet utilise les souris comme modèle animal, qui, avec le rat, sont l'espèce le plus pertinentes car des nombreuses études montrent que les régions cérébrales impliquées dans l'épilepsie sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Parce que ce modèle reproduit les caractéristiques principales de l’épilepsie, les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cette pathologie chez l’Homme. Les modèles d'épilepsie chez les souris sont déjà validés par les travaux antérieurs de notre équipe (doi: 10.1126/sciadv.aat5979, doi: 10.1073/pnas.2013972118) Nous utiliserons les animaux adultes, à partir de 5 semaines. Nous allons étudier l'épilepsie de l’adulte, donc il nous faut utiliser les animaux qui ont passé la phase de croissance rapide qui dure, selon la documentation technique de Charles River les cinq premières semaines de vie (www.criver.com/products-services/find-model/fvb-mouse?region=29www.criver.com /products-services/findmodel/fvb-mouse?region=29). Donc nous allons utiliser les souris âgées de plus de 5 semaines.
Analyse moléculaire et histochimique du role de MLC1 à interface gliovasculaire du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection intracérébrale de virus par stéréotaxie, avec ouverture de la peau du crâne, avant une perfusion intracardiaque, le porteur reconnaissant des effets modérés liés à la chirurgie et une perte de poids transitoire. Le cerveau est prélevé pour les analyses histologiques. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne peut recréer les interactions entre astrocytes, neurones et vaisseaux.
Objectifs
Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une interface vasculaire qui consiste en des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de ces régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. L'intérêt d'étudier les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire est donc in fine de pouvoir comprendre les mécanismes de ces pathologies et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans une étude récente, nous avons montré que MLC1, une protéine des astrocytes très enrichie dans les pieds astrocytaires périvasculaires controle le développement postnatal de plusieurs fonctions vasculaires cérébrales. Le but de notre projet est de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu en comparant des souris transgéniques MLC1KO a des souris WT issues des mêmes portées (littermates). Nous avons identifié 50 marqueurs à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire à 15 jours postnatal (stade immature) 2 mois (stade intermédiaire) 4 mois (stade mature) et 1 an (stade âgé). Ces investigations seront réalisées sur des coupes histologiques de cerveau . Pour pouvoir étudier les marquages spécifiquement dans les astrocytes, nous avons prévu de les marquer par une protéine fluorescente telle que la GFP (Green fluorescent protein) qui sera induite par une approche virale administrée par stéréotaxie. Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de MLC1.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle de la protéine MLC1 dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentielles sur les modalités des régulations astrocytaires et apportera un éclairage essentiel sur denombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les interventions sous anesthésie générale (injection stéréotaxique puis perfusion intracardiaque) durent 30 minutes et ne sont réalisées qu’une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas de nuisance liée au génotype des animaux MLC1KO qui est une modification génétique non dommageable. Les animaux subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie pendant laquelle une ouverture de la peau du crane est pratiquée. L'opération peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire.
Devenir
L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Cependant, le nombre d'animaux utilisés (800 animaux au total) sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entreles différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la surutilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 5 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux en général que nous avons observée lors d’une étude précédente sur le modèle MLC1KO.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement (présence dans la cage de coton pour faire un nid et objets en carton) et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal en accord et en dialogue avec notre SBEA et notre vétérinaire référente. Nous n’attendons pas d’effet particulier lié au génotype des animaux MLC1KO qui est une modification génétique non dommageable (phénotype étudié dans une étude précédente). Dans nos expériences où une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte. Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie (ouverture de la peau du crane). Les animaux opérés feront donc l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. Une procédure avec des points limites gradés a été mise en place pour la surveillance des animaux post opération. Elle est basée sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux seront respectés évitant l'euthanasie des animaux. La cicatrisation de la peau sera surveillée par l'expérimentateur. La chirurgie peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire qui sera surveillée en pesant les animaux avant et après (pendant les 5 jours post chirurgie).
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 50 marqueurs à étudier (variation d'expression de gènes identifiés lors d'une étude transcriptomique issue de la littérature) à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire au jour postnatal 15, à 2 mois, à 4 mois et à 1 an. Ces stades ont été choisis sur la base de nos études préalables qui montrent que les pieds astrocytaires et les vaisseaux ont formés mais immatures à P15 et continuent leur maturation moléculaire entre P15 et 4 mois. Le stade d’un an correspond à un stade âgé pour comprendre les effets de l’absence de MLC1 dans le contexte du vieillissement.
Élevage de souris modèle d’une maladie neurodégénérative.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
950 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce projet est un élevage d'une lignée transgénique modèle d'Alzheimer à phénotype dommageable, dont les animaux développent une paralysie progressive entre sept et dix mois et une mortalité élevée, avec tatouage des phalanges et coupe de la queue pour le génotypage. 800 souris sont transférées vers un autre établissement pour d'autres projets, 150 étant tuées en fin de reproduction ou pour atteinte des points limites. Le porteur présente cet élevage comme le support d'une future méthode de diagnostic.
Objectifs
Le but du présent projet est de faire un élevage d’une colonie de souris modèle. Il s’agit d’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer à phénotype dommageable. La production de cette colonie servira ensuite à caractériser le phénotype rétinien chez ce modèle dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic précoce non-invasive de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Élevage de la colonie de souris modèle à phénotype dommageable. Cette colonie de souris servira par la suite à mettre en place une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer et aussi améliorer le parcours de soin des patients.
Procédures
Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 7ème jour après la naissance, les souris seront identifiées par tatouage au niveau des phalanges à l'aide d'une pince Aramis. Dans le même temps, un prélèvement caudal coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser ces actes. Tous les animaux naissants seront soumis à ces deux actes une seule fois dans leurs vies.
Impact sur les animaux
Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Une infection locale et une douleur pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage.
Devenir
Les 800 animaux produits dans le cadre de ce projet seront transférés dans un autre établissement et impliqués dans différents projets dédiés à la mise en place d’une nouvelle méthode de diagnostic de la maladie d’Alzheimer. En revanche, 150 animaux seront euthanasiés en fin de période de reproduction ou pour atteinte des points limites (estimation)
Remplacement
Les souris issues de cet élevage serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.
Réduction
La production d’animaux a été estimée à 950. Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes études scientifiques a été définis en tenant compte des éventuelles pertes dues à une atteinte des points limites.
Raffinement
Les animaux en provenance d’éleveurs agrées seront hébergés par trois (Un mâle reproducteur et deux femelles reproductrices) dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (papier kraft, bâton à ronger et éventuellement maisonnettes rouges). Les animaux seront stabulés dans un environnement avec une alternance jour (7h-19h) /nuit (19h-7h), une température de 22+/-2 degrés Celsius et une hygrométrie à 50 +/- 10. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Avec une mise en place d’étiquettes au niveau des cages pour un meilleur suivie (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance). Les animaux transgéniques développent une faiblesse des membres. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie entre 7 à 10 mois, associée à une posture voûtée. Suite à ce déficit, les souris peuvent souffrir de mal nutrition. Environ 80 pour cent de la mortalité survient au bout de 12 mois chez les souris à fond mixte, avec une survie médiane d'environ neuf mois. Un raffinement spécifique tel qu’un apport de nourriture à hauteur de la souris, un suivie du poids hebdomadaire à partir du 7 ème mois ainsi qu’une surveillance quotidienne par un personnel qualifié seront mis en place. Une infection locale pourrait survenir suite au prélèvement caudal pour le génotypage. Dans ce cas, les souris seront traitées par vétédine.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus cette souris présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les animaux seront étudiés à partir de 3, 6 et 9 mois dans une autre animalerie agrée. Les animaux seront répartis par âge. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature.
Modèle murin de syndrome de détresse respiratoire aiguë ( SDRA)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
575 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Toute la colonie subit une phalangectomie, ablation d'une phalange, et 280 souris reçoivent une instillation d'acide chlorhydrique ou de lipopolysaccharide dans la trachée pour provoquer un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Ces 280 souris sont tuées pour les prélèvements, tandis que 295 sont gardées vivantes pour la reproduction ou d'autres procédures. Le porteur affirme que seul le modèle animal permet une véritable translation vers la clinique.
Objectifs
Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une affection fréquente en réanimation et responsable d’une mortalité élevée. Il se caractérise par des lésions alvéolaires diffuses et une hypoxémie sévère. Actuellement, seule une approche protectrice de la ventilation mécaniques a permis de réduire la mortalité associée au SDRA au cours des derniers années. Le récepteur des produits avancés de la glycation (RAGE pour Receptor for Advanced Glycation End-products) est ubiquitaire et est largement retrouvé dans les cellules alvéolaires . Il a de nombreux ligands et son activation entraine divers mécanismes de régulation intra cellulaire : apoptose, inflammation ou prolifération. Nous avons participé à démontrer que RAGE joue un rôle dans la pathogénie du SDRA. D’autre part, notre équipe a pu mettre en évidence les effets bénéfiques d’une sédation inhalée par sévoflurane chez des patients présentant un SDRA à travers un essai monocentrique, contrôlé et randomisé. En effet, le sévoflurane, un agent halogéné largement utilisé pour l'anesthésie générale en salle d'opération, améliorait l’oxygénation, diminuerait les niveaux alvéolaires et plasmatiques de sRAGE, forme soluble de RAGE, par rapport à une sédation par agent intraveineux. Nos objectifs sont multiples et visent à mieux comprendre et caractériser l’utilisation de la sédation inhalée en réanimation au travers d'une approche translationnelle via des études de recherche clinique et de recherche fondamentale. Ce projet a pour but d'améliorer notre compréhension des mécanismes physio-pathologiques mis en jeu lors de l’utilisation de sévoflurane et de mieux caractériser le rôle de la voie de signalisation liée à RAGE. Les modèles murins de SDRA décrits dans ce projet ainsi que des modèles cellulaires in vitro d’agression épithéliale réalisés en parallèle, permettront de caractériser l’effet du sevoflurane lors de l’agression pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’instillation intra-trachéale d’acide chlorhydrique ou de lipopolysaccharide reproduit dans le modèle murin, les caractéristiques majeures du SDRA humain. Les concentrations des formes solubles de RAGE dans le plasma et le lavage brocho-alvéolaire (LBA) sont des bons marqueurs de l’atteinte pulmonaire et de sa résolution au cours du SDRA expérimental. L'utilisation de souris knock-out pour RAGE (déjà disponibles à l'animalerie) permettra de mieux décrire les implications de la voie RAGE au cours du SDRA et de sa résolution. L'exposition au sévoflurane pourrait mettre en évidence les effets de cet halogéné sur l'atteinte pulmonaire et pourrait ainsi être une possible stratégie thérapeutique pour les patients en réanimation.
Procédures
L'ensemble de la colonie subira une phalangectomie = 575 animaux. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à plusieurs procédures: -anesthésie générale pour l'ensemble des animaux constituant les groupes expérimentaux (140 animaux utilisés dans le modèle murin de SDRA par instillation d'acide chlorhydrique (HCl) et 140 dans un modèle murin de SDRA par instillation de lipopolysaccharide (LPS) = 280 animaux. Sur les 140 animaux pour chaque modèle, 80 animaux subiront chacun, une instillation intra-trachéale soit d'HCl, soit de LPS sous anesthésie générale afin de créer un SDRA expérimental. Un animal de chaque condition expérimentale sera imagé à j0-j1-j2 et j4 = 6 animaux pour chaque modèle de SDRA donc, un ensemble de 12 animaux seront imagés : injection en rétro-orbital sous anesthésie générale d'un agent de contraste couplé à une fluorescence. Ces 12 animaux seront soumis à une injection par jour donc ils subiront 4 injections. Ces 12 animaux seront euthanasiés à j4.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une détresse respiratoire aigüe à j0 après instillation d'HCl ou LPS.
Devenir
Dans le cadre de la procédure de phalangectomie, les animaux seront tous garder en vie car ils seront destinés aux autres procédures ou aux futures reproductions. Dans les 2 procédures d'instillation, les animaux seront euthanasiés par injection de penthobarbital afin de réaliser les prélèvement post-mortem.
Remplacement
Des alternatives non animales sont disponibles au sein de notre équipe. L'axe de recherche translationnelle de notre équipe sur les implications du récepteur membranaire RAGE au cours du syndrome de détresse membranaire aigüe (SDRA) comporte des investigations cliniques et des expérimentations sur modèles cellulaires. Pourtant, seule l'utilisation de modèles animaux nous permet d'envisager une véritable translation entre les données obtenues in vitro et les données cliniques.
Réduction
En accord avec les principes éthiques des 3Rs, il a été convenu de considérer un nombre minimal d’animaux pas groupe pour réduire le nombre total d’animaux utilisés mais permettant d'établir la significativité statistique. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles pour nos expériences. En prenant en compte ces considérations, le nombre d'animaux nécessaires à ce projet sera de 575 souris.
Raffinement
La douleur sera réduite au minimum. En effet, les souris seront sous anesthésie générale tout le long de l'expérimentation. L'utilisation d'hypnotiques à action analgésique permet de couvrir l'analgésie per- et post-procédurale. Les animaux non sacrifiés à j0 seront replacés dans leur cage de stabulation avec nourritue et boisson à volonté, sur tapis chauffant en salle de réveil. Ils seront remis en salle de stabulation dès qu'ils seront en mesure d'exprimer les comportements normaux de leur espèce. Les animaux seront examinés 1 fois/jour (comportement global, paramètres vitaux, détresse respiratoire) jusqu'à leur sacrifice à j1; j2 ou j4. Quoiqu'il en soit, la procédure d'anesthésie engendrera un stress dû à la contention de l'animal que l'on ne peut pas éliminer.
Choix des espèces
Par rapport à d'autres modèles animaux, notre Choix du modèle murin est justifié d'une part car ce modèle est translationnel, qui permet à la fois l'étude de la phase aigüe d’agression alvéolaire et la phase de résolution de l'atteinte, n'est à ce jour décrit et validé que chez la souris (Patel B et al, Eur Respir J 2012; Jabaudon M et al, Am J Respir Crit Care Med2015), ensuite, il s'agit de l'espèce la plus appropriée pour l'étude des effets d'une absence d'expression du gène de RAGE au cours du SDRA. En effet, notre projet comporte à la fois l'étude de souris sauvages et celles de souris knockout pour RAGE.
Caractérisation de modèles murins d’autisme et développement de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'autisme, elles reçoivent des injections répétées, certaines une chirurgie stéréotaxique pour implanter une fibre optique ou une canule, puis passent des tests de comportement social, moteur et d'anxiété, le porteur reconnaissant des douleurs post-opératoires et des risques d'hémorragie ou d'infection. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" et présente les bénéfices thérapeutiques comme une perspective.
Objectifs
La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques nécessite le développement de nouveaux traitements pharmacologiques visant à soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objectif (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques, et (3) l'évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, le tout à des fins strictement scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager la pathologie.
Procédures
Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudier des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subira une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés, soit via la canule d’injection, soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implantées avec une fibre optique. Nous allons évaluer les compétences sociales des animaux ainsi que leurs compétences motrices et leur niveau d'anxiété. Chaque test sera réalisé une fois, avec une durée maximale de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pour le groupe d’animaux soumis à des administrations répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connu pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’à un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie, et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).
Devenir
À la fin de chaque expérience, les animaux seront euthanasiés et les tissus seront prélevés en vue d'expériences ex-vivo ultérieures.
Remplacement
La compréhension des mécanismes causaux de l'autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du comportement des animaux modèles permet de valider l'existence de la pathologie autistique et, le cas échéant, l'efficacité d'une approche thérapeutique. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental : en effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Nous avons ajusté nos effectifs de manière à les réduire au maximum sur la durée totale du projet, tout en assurant la significativité des résultats.
Raffinement
Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes subies par les animaux au cours des expériences. En ce qui concerne l’hébergement, les souris seront regroupées en sociaux de 2 à 4 individus, avec mise à leur disposition du matériel nécessaire pour construire un nid (ouate et cabane en carton), et manipulation quotidienne par le même expérimentateur. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Tout au long des expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d'injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous administrerons un traitement anti-inflammatoire aux animaux pour réduire la douleur et effectuerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des points limites appropriés seront définis pour éviter de causer des souffrances inutiles aux animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal, car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.
Etude de l’effet de faibles doses chroniques par contamination interne de type gamma (Césium) et d’un régime riche en lipides sur la microvascularisation cérébrale et cardiaque chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
104 souris vont être utilisées, réparties en groupes de 26, pour mesurer l'effet d'une eau de boisson contaminée au césium radioactif, à 500 kBq par litre, et d'un régime riche en graisses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune peut passer jusqu'à sept échographies de 30 minutes au plus sous anesthésie, avant d'être tuée pour le prélèvement du cœur et des poumons. Le projet étudie l'effet de ces faibles doses sur les petits vaisseaux du cœur et du cerveau, pour "alimenter le système de radioprotection" des personnes vivant en territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que ni le césium ni le régime gras n'entraînent "de douleur ni d'effet secondaire", puis rapporte une "légère diminution de la fonction cardiaque" observée à long terme.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une contamination interne chronique à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition interne unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), et permettra l’apport de nouvelles connaissances sur l’effet de faibles doses sur la microvascularisation cérébrale très peu étudié auparavant sur un modèle pré-clinique.
Procédures
Les animaux seront exposés en chronique à des faibles doses internes de rayonnements ionisants (Césium à une concentration de 500 KBq/L déjà utilisés dans des projets passés). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour tous les animaux, les échographies sont non invasives et effectuées sous anesthésie (au maximum 7 échographies par animal, durée maximale par échographie de 30 minutes). L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.
Impact sur les animaux
L’exposition à de faibles concentrations de Césium dans l’eau de boissons (débit de dose 6µGy/h), de même que le régime gras (modérément riche en lipides) n’entrainent pas de douleur ni d’effet secondaire pour les animaux. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impacte pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 104 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 à 5 souris par cage) et l’isolement est évité. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature.
Transplantation d’organoïdes dans la capsule rénale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
128 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie transplantant des organoïdes sous la capsule du rein gauche, que leur croissance rend non fonctionnel, le porteur reconnaissant que ce développement peut provoquer une douleur. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Ce projet vise à mettre au point la technique chirurgicale en vue d'un projet ultérieur de plus grande ampleur sur le cancer de l'estomac.
Objectifs
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). Il y a deux types de cancer de l’estomac chez l’homme : distal (partie basse) et proximal (ZT). L'incidence du cancer de l'estomac distal a diminué, tandis que celle des cancers de la ZT a connu une augmentation rapide. Dans le laboratoire nous avons mis en place la culture de ‘’mini-organe’’ ou organoïdes de ces zones de transition gastrique à partir de tissus de souris. Ces organoïdes en culture ont une taille ne dépassant pas 1-2mm. L'objectif du projet est de mettre au point une technique chirurgicale de transplantation de ces organoïdes sous la capsule rénale de souris immunodéficientes afin de permettre à ces structures tridimensionnelles de se développer de façon plus importante (>10 mm) et de se différencier. La capsule rénale a été choisie comme site de transplantation pour sa localisation proche de la surface au niveau dorsal, ce qui rend son accès facile et la récupération de l’animal plus rapide, ainsi que pour son innervation importante et le rôle de son microenvironnement dans la croissance et maturation des organoïdes. En effet, la transplantation d’organoïdes intestinaux dans la capsule rénale montre une maturation complète au bout de 6 semaines dans la littérature. L’objectif est de reproduire cette maturation avec nos organoïdes de zone de transition gastrique. Des études préliminaires de différenciation in vitro ont été effectuées et la différenciation obtenue est partielle. En effet, à la zone de transition gastrique se trouve une glande protectrice qui sécrète du mucus in vivo. Les organoïdes dérivés de ces zones de transition conservent cette glande, cependant le milieu de différenciation ne permet pas la production de mucus d’où la nécessité de différencier les structures in vivo, grâce au microenvironnement présent. L'objectif est de mettre au point les conditions expérimentales qui seront utilisées, après autorisation, dans un futur projet de plus grande ampleur de l’équipe.
Bénéfices attendus
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). L'incidence des cancers de la ZT a connu une augmentation rapide. Dans le laboratoire nous avons mis en place la culture de ‘’mini-organe’’ ou organoïdes de ces zones de transition gastrique à partir de tissus de souris. Ces organoïdes en culture ont une taille ne dépassant pas 1-2mm. L'objectif du projet est de mettre au point une technique chirurgicale de transplantation de ces organoïdes sous la capsule rénale de souris immunodéficientes afin de permettre à ces structures tridimensionnelles de se développer de façon plus importante (>10 mm) et de se différencier. Notre modèle d’organoïdes nous permettra de comprendre les mécanismes de transformation à l’origine des cancers de la ZT et donc dans le futur développer des traitements ciblés. De plus, l’utilisation d’organoïdes permet de réduire de façon notable l’utilisation de modèles animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale visant à transplanter des organoïdes (mini-organes) dans le rein. La procédure chirurgicale dure environ une heure en prenant en compte le temps nécessaire pour que l'analgésique soit effectif, le temps nécessaire pour anesthésier l'animal, la durée de la procédure (30 minutes au maximum) et le temps de réveil. Chaque animal sera soumis à la procédure une seule fois. Les animaux seront également pesés et évalués selon une grille de score (durée de la manipulation entre 5 et 10 minutes par animal) le jour de la chirurgie, 24h et 48h après ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie, ce qui peut générer un stress.
Impact sur les animaux
La greffe se fera dans la capsule rénale du rein gauche, ce qui, après croissance et différenciation des organoïdes, rendra le rein non fonctionnel. La chirurgie implique une anesthésie qui présente un risque d’hypothermie ainsi qu’une incision entrainant la réalisation de points de suture au niveau dorsal, ce qui peut créer une gêne ou une douleur chez l'animal. Les animaux seront manipulés pour pesées et évaluations du bien-être le jour de la chirurgie, 24h et 48h après, ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie, manipulation susceptible de générer un stress. La chirurgie dure environ 30 minutes, et l’animal sera anesthésié pendant environ 45 minutes. La pesée et l’évaluation du bien-être dure environ 5 à 10 minutes par animal. La croissance des organoïdes dans le rein peut également induire une douleur chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). A la ZT gastrique se trouve une glande protectrice qui sécrète du mucus in vivo. Les organoïdes dérivés de ces zones de transition conservent cette glande. Des études préliminaires de différenciation in vitro ont été effectuées et la différenciation obtenue est partielle, en effet, la production de mucus n’est pas conservée in vitro, d’où la nécessité de différencier les structures in vivo grâce au microenvironnement présent. Il est également nécessaire à la croissance des organoïdes jusqu'à la taille requise, la taille maximum étant limitée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au maximum pour ce protocole. Tout d’abord, nous n’utiliserons que 4 souris par condition, nombre minimum nécessaire afin de confirmer la reproductibilité des résultats. Ensuite, les organoïdes utilisés pour la transplantation ne seront pas produits avec de nouvelles souris mais proviendront de stock congelés. Afin de déterminer la quantité d'organoïdes la plus efficace pour la transplantation, et de connaître la durée de croissance pour établir les temps d'analyses les plus intéressants pour notre projet futur, nous allons tester plusieurs combinaisons. Nous testerons 4 quantités d'organoïdes (en se basant sur la littérature) ainsi que 4 temps d'analyse différents pour ces 4 quantités. Pour ces temps d’analyse, nous nous basons sur le fait que la transplantation d’organoïdes intestinaux dans la capsule rénale montre une maturation complète au bout de 6 semaines dans la littérature. Le type d’organoïdes transplanté dans notre protocole étant différent, le temps nécessaire à la différenciation peut varier.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/ heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Les normes les plus strictes en matière de soin et de surveillance des animaux seront appliquées. Toutes les manipulations sont réalisées dans un environnement stérile afin de maintenir le statut sanitaire exigeant (particulièrement pour des animaux immunodéficients) et tout le matériel utilisé est stérile. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’administration d’un analgésique) en fonction d’une grille de score de bien-être adaptée à notre modèle, comprenant des points limites entraînant l'arrêt de la procédure pour les animaux concernés. Les animaux seront hébergés en groupe pour un enrichissement social et afin de respecter l'instinct grégaire de cette espèce. La nourriture et l'eau sont fournies ad libitum. Du matériel de nidification (dôme, coton, copeaux compressés) est mis à disposition des animaux. Les locaux d'hébergement sont séparés des locaux d'expérimentation. Les animaux destinés aux procédures expérimentales feront l’objet d’une phase d’acclimatation dans les locaux dédiés au suivi de l’expérimentation. Cette phase sera de 7jours pour les animaux produits sur site. Les animaux seront pesés et évalués à l’aide d’une fiche de score le jour de la chirurgie, 24h et 48h après ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie. Si nous observons une déshydratation nous administrerons une solution saline. Nous utiliserons des analgésiques pour réduire la douleur due à la chirurgie. L’analgésie sera effectuée à 24H et 48H après la procédure chirurgicale. L’administration se fera par voie sous cutanée pour une diffusion plus longue. Une analgésie préopératoire sera effectuée en voie sous cutanée 30 minutes minimum avant l'intervention. La transplantation des organoïdes dans la capsule rénale est préférable qu’une transplantation au niveau gastrique car cela permet d’effectuer une chirurgie moins invasive et donc d’avoir une récupération plus rapide des animaux.
Choix des espèces
La réalisation de greffe demande l'utilisation de modèle immunodéficient, et ce modèle est disponible chez la souris. De plus, les organoïdes transplantés proviennent de tissus murins, l'espèce doit donc rester consistante. Des animaux adultes (6-12 semaines) seront analysés à 4, 5, 6 ou 8 semaines après la procédure chirurgicale pour suivre le développement et la différenciation des organoïdes. L’âge a été déterminé pour avoir un poids équivalent entre les animaux et pour s’assurer de la maturité. C’est également l’âge qui sera utilisé dans le projet futur dans lequel s’inscrit cette mise au point de protocole.
Etude chez la souris du ciblage de cellules immunitaires dans la fibrose pulmonaire, une maladie causée par une cicatrisation excessive altérant les fonctions respiratoires.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, la trachée est disséquée puis suturée pour y injecter une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, avant des prélèvements sanguins et des injections de cellules et de molécules thérapeutiques, le porteur reconnaissant des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort. Des cultures de cellules humaines sont utilisées en parallèle, mais le porteur conclut qu'aucune alternative ne modélise l'"organe entier" et qualifie la souris d'animal "incontournable".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, évolutive et mortelle caractérisée par le remplacement du tissu pulmonaire normal par un tissu cicatriciel (fibrose) ne permettant plus les échanges gazeux au niveau des alvéoles pulmonaires. Les patients atteints souffrent d’une dyspnée (difficulté à respirer) qui peut s’aggraver dramatiquement au décours d’une maladie infectieuse respiratoire (exacerbation). Il n’existe actuellement aucun traitement pour stopper la progression de la maladie. Les mécanismes aboutissant à la FPI ne sont que partiellement connus. La FPI résulte d’un processus de cicatrisation excessive des alvéoles pulmonaires en réponse à des agressions répétées (tabac, infections virales, pollution…), et sa progression est probablement favorisée par un dérèglement des cellules immunitaires présentes dans les poumons (inflammation). Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules X qui participent en temps normal à la lutte contre les infections bactériennes et virales. Cependant, ces cellules X constituent une arme à double tranchant car elles sont également capables d’amplifier l’inflammation et la fibrose. Nos résultats préliminaires chez l’homme et chez la souris montrent qu’il existe un lien entre ces cellules X et la progression ou la sévérité de la fibrose pulmonaire. En outre, des publications récentes ont montré leur rôle délétère dans la fibrose du foie. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser le comportement des cellules X dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence des cellules X sur la progression de la fibrose, et 3) d’étudier le potentiel thérapeutique de trois molécules capables de bloquer ou activer les fonctions des cellules X. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider les cellules X comme nouvelle piste thérapeutique dans la FPI.
Bénéfices attendus
La FPI est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions fonctionnelles multi-directionnelles entre tissu pulmonaire et cellules immunitaires. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle d’un type de cellules immunitaires dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.
Procédures
En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes) sur animaux vigiles. Entre J9 et J20, les souris recevront deux doses d’une molécule thérapeutique dont on veut évaluer l'action sur la fibrose pulmonaire. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’oesophage au lieu de la trachée. Avant l’administration de la molécule thérapeutique, les souris recevront à l’état vigile une injection de cellules X par voie intraveineuse (veine caudale, durée 30 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids (entre le 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection). Une mise à mort est prévue en cas d'atteinte des points limites inférieur à 10% des effectifs selon notre expérience).
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.
Remplacement
Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des cultures ex-vivo de cellules pulmonaires humaines et une lignée de cellules X humaines. Cependant, ces méthodes alternatives ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ces modèles n’intègrent pas 1- la complexité de la physiopathologie de la fibrose pulmonaire, 2- le système immunitaire dans sa globalité et 3- ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement cellulaire vers d’autres tissus/organes via la circulation sanguine. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires issues.
Réduction
D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal tout en respectant l’hypothèse scientifique. Le nombre d’animaux, calculé par un test statistique, est de 24 en moyenne par groupe. Ce chiffre tient également compte du risque d'atteindre les points limites définis selon notre grille de score amenant à la sortie précoce des animaux du protocole (habituellement entre 0% et 10% des effectifs entre les jours 7 et 14 après traitement). D’autre part, dans le but de réduire le nombre d’animaux élevés, nous prévoyons d’utiliser non seulement les souris transgéniques portant le gène d’intérêt (enrichies en cellules X), mais également les souris issues des mêmes portées mais ne portant pas le gène d’intérêt (ces dernières seront incluses dans des groupes contrôles). De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules d’intérêt ex vivo
Raffinement
Les contraintes induites par les conditions expérimentales seront réduites par plusieurs approches. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment du sacrifice. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur afin de détecter précocément et réduire toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux . Cette surveillanve clinique évalue l’apparence de l’animal, son comportement, la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Afin de prévenir une douleur légère, détectée par l’un de ces critères (moindre déplacement ou mauvaise posture ou toilettage excessif ou état défensif ou plissement des yeux) un analgésique sera administré aux animaux. Les souris seront mises à mort dès la détection de points limites.
Choix des espèces
L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules X sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.
Mise au point d’un modèle d’endométriose chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
20 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ovariectomie, l'implantation d'une capsule hormonale et des injections destinées à induire une endométriose, avec des douleurs post-chirurgicales et abdominales attendues. Les tissus sont prélevés après la mise à mort. Ce projet pilote vise seulement à mettre au point le modèle, le porteur affirmant qu'aucune méthode in vitro ou ex vivo n'existe et envisageant, en cas de succès, de tester ensuite une molécule sans refaire "toutes les étapes de toxicité".
Objectifs
L'endométriose est une affection gynécologique peristante qui se caractérise par la présence anormale de glandes endométriales et de tissu conjonctif en dehors de l'utérus. Ces lésions sont accompagnées d'une inflammation chronique. L'endométriose touche principalement les jeunes filles et les femmes en âge de procréer. Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Récemment, le rôle dans l’endométriose d’une protéine impliquée dans le développement du système nerveux central a été suggéré. Ce projet pilote qui utilisera au maximum 20 animaux a pour objectif de mettre en place un modèle murin d’endométriose afin d'étudier dans un prochain projet le rôle de cette protéine dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Il existe actuellement peu de solution thérapeutique pour les patientes souffrant de formes sévères de l’endométriose. En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Cette demande d’expérimentation a pour objectif la maitrise d’un modèle murin d’endométriose permettant de tester des nouvelles thérapies. Ainsi, nous devrions à terme être capables de tester un candidat médicament ciblant une protéine impliquée dans l’endométriose. A terme, nous proposerons un projet visant à tester l’effet d’une molécule thérapeutique ayant déjà montré un rôle prometteur dans une pathologie gynécologique : le cancer de l’endomètre. Il est important de noter que beaucoup de mécanismes cellulaires décrits dans l’endométriose rappellent ceux observés dans le cancer (multiplication cellulaire, migration à distance). Par conséquent, si nous montrons un effet de cette molécule dans un modèle murin d’endométriose, nous pourrons rapidement prévoir de faire des tests cliniques chez l’homme sans avoir à réaliser toutes les étapes de toxicités.
Procédures
Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Ils subiront une ovariectomie qui visera à retirer les ovaires pour éviter la production d’hormones sexuelles. Les animaux seront également implantés avec une capsule délivrant des hormones. Enfin, les animaux recevront des injections sous-cutanées et une injection intrapéritonéale lors de l’induction de l’endométriose
Impact sur les animaux
Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les douleurs post-chirurgicales. En effet, chaque animal subira l’ovariectomie. Ensuite, les animaux qui développeront l’endométriose pourraient être soumis à des douleurs abdominales liées à la pathologie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose.
Remplacement
L’endométriose est une maladie multifactorielle qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence d’un tissu anormalement localisé. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie chez l’animal en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou ex vivo.
Réduction
Afin de réaliser ce projet de mise au point de ce modèle murin d’endométriose, nous avons décidé de réaliser 5 expériences avec 4 souris par expérience. La taille de l’échantillon testé ne repose sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la difficulté expérimentale. C'est une procédure pilote. Dans le cas où nous maitrisons le geste au bout de 3 essais, nous ne réaliserons pas les essais supplémentaires.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, nous réaliserons l’intégralité des opérations chirurgicales sous anesthésie avec injection pré et post opératoire d’anti-douleur. Nous réaliserons les interventions de chirurgie dans des conditions d’antisepsie (application d’un produit antiseptique sur la région incisée. Avant de commencer la réalisation des chirurgies, il est important de noter que nous nous entrainerons pour la réalisation de ces gestes chirugicaux sur des cadavres (animaux mise à mort surnuméraires ou avec un mauvais génotype).
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement, c’est un organisme modèle en biologie. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de ceux observés chez les patientes touchées par l’endométriose. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.
Rôle thérapeutique de la voie hème oxygènase/monoxide de carbone (HO-1/CO) au cours de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 64
192 souris et 64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une thoracotomie puis une ligature de l'artère coronaire pendant soixante minutes provoquant un infarctus, avant de recevoir des composés libérant du monoxyde de carbone. Le cœur est prélevé après la mise à mort. Le porteur décrit une procédure "bien maîtrisée" et justifie le recours à deux espèces par la comparaison avec la littérature, les bénéfices thérapeutiques restant annoncés au conditionnel.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IM) reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité. Les lésions tissulaires au cours de l'IM provoquent la libération de molécules toxiques connues sous le nom de "Danger Associated Molecular Pattern". (DAMP), qui aggravent les lésions cardiaques et stimulent l'inflammation. Nous faisons l’hypothèse que l’hème agisse comme un DAMP important dans l'IM car des quantités importantes d'hème présentes dans le tissu cardiaque, peuvent être libérées pendant l’infarctus, et pourraient favoriser les dommages cardiaques s'il n'est pas correctement neutralisé ou dégradé. Bien que le tissu cardiaque ait la capacité de neutraliser l'hème dans des conditions normales, ces systèmes de protection intrinsèques ne suffisent pas lorsque la quantité d'hème devient excessive comme dans le cas de l’IM. Cependant, une stratégie thérapeutique nécessite de nouvelles approches pharmacologiques car les mécanismes responsables des lésions myocardiques après un infarctus sont multiples et encore mal définis. Le but principal de ce projet est donc d’étudier non seulement le rôle de l'hème en tant que DAMP mais également de vérifier si l'hème peut stimuler certains facteurs de protection dans le cœur pendant l'infarctus du myocarde. De plus, nous évaluerons l'effet pharmacologique de nouvelles molécules (HYCOs) qui pourraient être très efficaces pour neutraliser les effets délétères de l'hème et favoriser la protection contre l'inflammation et les lésions tissulaires pendant l’IM. Pour ce projet, la plupart des expériences sur l'IM seront réalisées sur des souris afin que nous puissions 1) comparer nos résultats avec des données antérieures publiées dans la littérature avec le même modèle et 2) avoir la possibilité de tester l'effet spécifique des HYCOs. Néanmoins, certaines expériences clés seront répétées dans le modèle du rat comme "preuve de concept", une étape essentielle pour vérifier que l'efficacité de nos molécules est reproduite dans différentes espèces. Les objectifs finaux seront de déterminer le rôle de l'hème et les effets bénéfiques des HYCO dans l'IM.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du CO et capable d'activer le facteur de transcription Nrf2 dans l'infarctus du myocarde. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique de la voie HO-1/CO dans les maladies ischémiques.
Procédures
Dans le modèle d'infarctus du myocarde chez la souris et le rat, chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie complète. La chirurgie consiste en une thoracotomie suivie d'une ischémie par ligature de l'artère coronaire gauche pendant 60 minutes et d'une reperfusion. La procédure chirurgicale complète nécessite environ 90 minutes, moment auquel les animaux seront placés dans une chambre de réveil pour maintenir la température corporelle et l'oxygénation et pour se remettre de la chirurgie. Après l'infarctus, les souris seront traitées avec les composés par injection intrapéritonéale (i.p.) ou voie orale tous les 3 jours jusqu'au jour 7 ou jour 30. Chaque administration (i.p. ou orale) ne durera pas plus de 5 secondes. A 7 ou 30 jours après l'infarctus, l’effet thérapeutique des composés sera monitoré au niveau fonctionnel par échographie qui durera qui ne durera pas plus de 30 min. A la fin des expériences les animaux seront placés sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera effectué et le coeur sera excisé.
Impact sur les animaux
Le degré de sévérité de la procédure de l'IM, bien maîtrisée, est quand même considéré de classe sévère. Nous prendrons donc toutes les précautions pour éviter tous les nuisances indésirables de cette procédure. L' IM est exécutée sous anesthésie générale et des analgésiques seront injectés après la procédure pour réduire la douleur, l'effet indésirable le plus important causé par cette procédure. Les animaux seront gardés dans une chambre dédiée et suivi pour s'assurer de son bien-être jusqu'à leur réveil et rétablissement complet de la chirurgie.
Devenir
Comme nous avons besoin de collecter les coeurs pour une analyse metabolique, génique et biochimique à la fin de chaque protocole expérimental, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles du projet, nous avons initialement synthétisé 20 composés et testé leurs effets bénéfiques sur les cardiomyocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. L’ensemble de ces 20 composés avait la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer une activation de Nrf2 mais seulement 2 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs composés, en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Malgré la réduction du nombre de composés à tester in vivo, l'utilisation de souris et de rats est nécessaire car c'est le seul moyen d'évaluer l'action pharmacologique et l'efficacité de nos composés spécifiques contre l'infarctus du myocarde (IM) (voir "Reduction"). Le modèle d'IM est standard et fortement utilisé par les chercheurs de différents laboratoires afin d'évaluer les actions protectrices de nouveaux médicaments.
Réduction
Les tests in vitro (Remplacement) nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs composés et nous a ainsi permis de réduire significativement le nombre de composants qui seront testés in vivo. Pour chacun des groupes étudiés (groupes "sham" vs. groupes traités) dans les 3 procédures proposées, nous utiliserons 8 animaux en raison de leur variabilité, pour obtenir des données significatives et afin d'avoir une puissance statistique suffisante. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d'autres molécules aux mêmes propriétés. Après avoir collecté des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d'un post test de type Bonferroni. Les résultats seront jugés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05 et si la différence entre les lots témoin et traité est inférieure ou égale à 2 avec une puissance de 0.9, comme publiée déjà, et ceci avec des effectifs de 8 animaux dans chaque groupe. A noter que la procédure 1 (souris C57/BL6) nous permettra de définir le mode d'administration le plus efficace des notre composés permettant ainsi de réduire le nombre de souris dans la procédure 2 (souris Nrf2KO) ainsi que le nombre de rats dans la procédure 3.
Raffinement
Pour minimiser la douleur et la souffrance des animaux, nous mettrons en place les points limites décrits dans chaque procédure. Pendant leur séjour à l’animalerie, les animaux auront à leur disposition des balles de coton pour nidifier ainsi que des feuilles de kraft pour jouer/se cacher et des bâtons de bois pour jouer/se cacher et feront l'objet d'une surveillance quotidienne. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (induction de l’IM et examens à J7 ou J30). La douleur chirurgicale est prise en charge par des antalgiques. Un antalgique (buprénorphine, 0.1 mg/kg en sous-cutané) sera administré avant la chirurgie ainsi q’un anti-inflammatoire (kétoprofen 5 mg/kg en sous-cutané) après la chirurgie (IM). En cas de fortes hémorragies ou de troubles cardiaques, l’animal sous anesthésie sera mis à mort par injection de doléthal (150 mg/kg, i.p.).
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l'effet de nouveaux composés thérapeutiques et leur efficacité dans les maladies cardiovasculaires. De manière analogue, les modèles d'infarctus du myocarde chez la souris et le rat ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris Nrf2KO ont été largement utilisées ces dernières années pour déterminer l'effet protecteur spécifique induit par divers composés capables d'activer le facteur de transcription Nrf2. Le choix de ces espèces de souris et rat se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles de IM. Nous utiliserons à la fois des souris et des rats au stade de jeunes adultes (8-10 semaines). Les procédures utilisées pour provoquer l’IM sont couramment effectuées sur des souris et des rats âgés de 8 à 10 semaines, ce qui nous permettra de comparer nos propres résultats avec des études antérieures déjà publiées sur le même sujet.
Evaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques dans un modèle d’épilepsie néonatale liée au gène Kcnq2.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 reproduisant une épilepsie infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt molécules candidates par gavage, injection ou alimentation, certaines étant implantées d'une puce sous anesthésie, et le porteur indique que des crises spontanées peuvent provoquer leur mort. Le système nerveux central est prélevé en fin de procédure. Le porteur revendique un modèle "premier et seul" disponible pour tester des traitements sur "organisme entier", les bénéfices pour les enfants restant renvoyés à une éventuelle demande d'essai clinique.
Objectifs
Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.
Procédures
Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Les animaux qui passent dans le test LMT seront anesthésiés et implantés avec une puce RFID. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.
Impact sur les animaux
Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des animaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.
Devenir
Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 (5 souris maximum), avec 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant l'implantation des puces RFID. Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.
Impact de la carbamylation des protéines matricielles sur le remodelage de la paroi vasculaire au cours de l’athérosclérose chez la souris. (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une alimentation enrichie en cyanate de sodium, des injections d'une sonde fluorescente dans la veine de la queue, des épilations à la crème dépilatoire et des séances d'imagerie sous anesthésie, pour étudier le rôle du vieillissement des protéines dans l'athérosclérose. Le sang et l'aorte sont prélevés après la mise à mort. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un modèle in vitro ne suffit pas à représenter l'"organisme entier" et conclut qu'il n'a "pas d'autre choix" que la souris.
Objectifs
Avec 17,7 millions de décès en 2017, les pathologies cardio-vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. C’est donc un enjeu de santé publique de mieux comprendre et caractériser les causes de ces maladies. L’athérosclérose est une maladie complexe touchant principalement les artères de moyen et gros calibre marquée par une modification importante de la structure des vaisseaux sanguins et caractérisé par la formation de plaques. Au cours du temps, ces plaques s’épaississent et gênent la circulation sanguine. Elles peuvent également se rompre, entraînant alors la formation d’un caillot provoquant des accidents vasculaires cérébraux, des infarctus du myocarde, ou des ischémies périphériques. En vieillissant, les protéines subissent des modifications pouvant affecter leurs structures et leurs fonctions. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle du vieillissement des protéines présentes au niveau des vaisseaux sanguins. En effet, les vaisseaux sanguins sont principalement composés de cellules et de protéines. Lors du processus athérosclérotique, ces cellules vont se déplacer autour de la plaque afin de l'isoler. Notre projet vise à déterminer si le vieillissement des protéines joue un rôle dans le remodelage du vaisseau et sur le déplacement des cellules permettant d'isoler la plaque de la circulation sanguine au cours du développement de l'athérosclérose. Ce projet est multisite et se déroulera dans deux étuablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet d'expérimentation animale permettra de faire progresser les connaissances scientifiques sur les pathologies cardiovasculaires et de mieux comprendre l’impact du vieillissement des protéines sur le remodelage de la paroi des vaisseaux dans le développement, l’évolution et les complications de l’athérosclérose afin de trouver, in fine, de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but de mieux diagnostiquer et donc mieux traiter les pathologies cardiovasculaires.
Procédures
Voici toutes les interventions auxquelles les animaux seront soumis : - Anesthésie générale : Lors de l’injection de la sonde fluorescente et lors des acquisitions d’imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. L’état d’anesthésie sera obtenu par inhalation d’isoflurane à 4% et maintenu par inhalation d’isoflurane 2%. - Injection au niveau de la veine de la queue : Injection d’une sonde fluorescente pour l’acquisition des images au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette injection se fera sur animal anesthésié par isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (9 souris X 3 groupes X 1 intervention = 27 fois) et deux fois pour chaque souris pour la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 interventions = 42 fois). - Épilation : L’épilation est nécessaire pour l’acquisition des images à l’échographe et au tomographe moléculaire de fluorescence. Cette intervention rapide se fera à l’aide d’une crème dépilatoire pour peaux sensibles sur le thorax et l’abdomen de la souris. Ce geste sera réalisé sur animal anesthésié par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%) sur une plateforme chauffante afin de maintenir la température de l’animal. Ce geste sera réalisé trois fois pour chaque souris de la procédure 1 (c’est-à-dire : 9 souris X 3 groupes X 3 épilations = 81 fois) et deux fois pour chaque souris de la procédure 2 (c’est-à-dire : 7 souris X 3 groupes X 2 épilations = 42 fois) - Injection intrapéritonéale : L’euthanasie nécessite l’injection d’un agent anesthésique. Ce geste sera réalisé sur les animaux anesthésiés par inhalation d’isoflurane (induction à 4% et maintien sous masque à 2%). Ce geste sera réalisé une fois pour chaque souris pour la procédure 1 (c’est-à-dire 27 fois au total) et une fois pour chaque animale pour la procédure 2 (c’est-à-dire 21 fois au total). Par souris : Chaque souris de la procédure 1 subira : 1 injection au niveau de la veine de la queue, 3 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2. Chaque souris de la procédure 2 subira : 2 injections au niveau de la veine de la queue, 2 épilations, 1 injection intrapéritonéale. Tout ces gestes seront réalisés dans l’établissement utilisateur 2.
Impact sur les animaux
L’alimentation supplémentée en cyanate de sodium et l’injection de la sonde fluorescente ne produisant pas d’effet toxique chez les animaux. Voici la liste des nuisances attenus : -Stress au moment du transport (5,3km pour 11 minutes de trajet) - Stress au moment de l’anesthésie et de son réveil, le stress d’une anesthésie dure en général quelques minutes avant l’endormissement et au réveil de l’animal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Après la mise à mort des animaux, le sang sera prélevé au niveau de l’aorte afin d’évaluer la quantité d’homocitrulline (produit de carbamylation) retrouver, les aortes thoraciques seront récupérées afin d’étudier la rigidité des vaisseaux via l’utilisation d’un microscope à force atomique, puis les compositions cellulaire et protéique des aortes et des plaques d’athéromes seront étudiées via des techniques histologiques et immunohistochimiques. La queue des animaux sera également prélevée afin d’en analyser le taux de carbamylation du collagène.
Remplacement
Nous travaillons actuellement sur un modèle in vitro avec des cellules provenant d’aortes humaines et murines cultivées sur du collagène carbamylé ou non, mais une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques mis en jeu au niveau d’un organisme entier et les approches informatiques in sillico ne permettent pas à ce jour de mimer le fonctionnement de l’organisme entier et sa réaction face au traitement. Ainsi, nous n’avons pas d’autre choix que d’utiliser le modèle animal, puisque les résultats obtenus avec cette approche globale in vivo seront complémentaires à nos résultats in vitro et permettront d'apporter une réponse complète à notre hypothèse. Nous sommes actuellement les seuls à utiliser ce modèle animal (modèle carbamylation + athérosclérose), nous ne pouvons donc pas faire de projet commun afin de réutiliser des animaux inscrits dans une procédure d’un autre projet.
Réduction
Nous avons décidé de faire deux procédures, dont une 1ère en étude préliminaire avec peu de souris (9 par groupes) avec une approche de « Go/no go » pour notre seconde procédure. En effet, la première procédure servira à confirmer une bonne démarche expérimentale et définir plus précisément les différents temps d’acquisitions pour la seconde procédure. Nombre de souris totales pour la procédure 1 : 9 souris X 3 groupes = 27 souris. Pour la seconde procédure, nous n’avons aucune donnée préliminaire nous permettant de calculer la puissance statistique de notre expérience via le logiciel GPower. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire en 1ère procédure, afin d’avoir la possibilité de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en évitant d’utiliser beaucoup d’animaux pour affiner la cinétique de la procédure. De plus, les données issues de la seconde procédure viendront compléter les données issues de la première aux points de la cinétiques les plus intéressants pour atteindre une puissance statistique suffisante. Après avoir analysé les données issues de la 1ère procédure, nous pourrons alors calculer la puissance statistique afin de définir le nombre optimal d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Nous utiliserons au maximum 10 souris par groupe pour la seconde procédure (avec une potentielle diminution du nombre de souris en fonction des résultats issus de la 1ère procédure). Nous nous engageons à analyser les résultats de la première procédure et de calculer notre puissance statistique avant de commander les animaux de la deuxième procédure afin d’en utiliser le moins possible. Nombre maximal de souris au total pour la procédure 2 : 7 souris X 3 groupes = 21 souris. L’utilisation de souris exclusivement mâles, nous permet également de réduire le nombre d’animaux nécessaires puisqu’utiliser des animaux du même sexe permet de s’affranchir d’une variable biologique supplémentaire et de limiter l’hétérogénéité de nos résultats.
Raffinement
Quotidiennement : Les cages transparentes seront équipées de divers équipements d’enrichissement (tubes de jeu, niche, papier, bâton à rogner, coton …) afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal. Une surveillance quotidienne sera mise en place par une collaboration étroite avec les animaliers afin de prévenir et de traiter toutes manifestations de douleur ou de stress chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages de 30x40cm à raison de 5 souris par cage au maximum. Les animaux seront séparés selon leur groupe dans différentes cages (2 par groupe). Nous identifierons les animaux à l'aide de traces réalisées au marqueur indélébile au niveau de la queue. Le tableau présenté en Annexe 3 présente une grille de score adaptée qui sera suivie afin d’identifier des douleurs potentielles. Étape 1 : Le traitement ne produira pas de nuisance à l’animal. Afin de vérifier la bonne hydratation des souris, les biberons seront pesés tous les jours ouvrés et changés tous les deux jours. Étape 2 & 3 : L’utilisation du tomographe moléculaire à fluorescence (FMT) et de l’échographe nécessite un transport des animaux sur le campus Moulin de Housse (où se trouvent les appareils). Une surveillance accrue sera effectuée pendant le trajet et un morceau de pomme sera placé dans les cages afin de permettre aux animaux de continuer à s’hydrater et s’alimenter. L’utilisation ces appareils nécessite également une anesthésie générale de l’animal avec de l’isoflurane (4% pour l’induction et de 2% pour le maintien), une surveillance accrue sera effectuée pendant l’anesthésie, et l’état d’endormissement de l’animal sera confirmé par pincement des espaces interdigitaux. Enfin pour un réveil optimal des animaux concernés, l’animal sera placé sous lampe chauffante puis surveillé. Afin d’éviter le stress des animaux aux changements d'environnement, les souris seront emmenées sur le site Moulin de la Housse 24h avant l’acquisition pour qu’elles découvrent et qu’elles s’habituent aux salles de manipulation, afin que le jour de la manipulation il n’y ait pas de biais sur nos résultats. Lors de l’analyse à l’échographe, les animaux seront placés sur une plateforme chauffante composée de capteurs permettant de suivre les paramètres vitaux. Ces paramètres (fréquence respiratoire, électrocardiographie et la température corporelle de l’animal) seront surveillés pendant toute la durée de l’acquisition.
Choix des espèces
Le modèle choisi est le modèle murin dont le gène de l'apolipoprotéine E est non fonctionnel. Ce modèle est un modèle de référence pour l’étude de l’athérosclérose qui est très bien caractérisé. En effet ces souris développent la maladie sans avoir besoin de leur apporter un régime gras (non compatible avec l’utilisation du FMT puisqu’il faut un régime sans chlorophylle et qui rajouterait une variable supplémentaire à nos expériences et donc un groupe témoin supplémentaire). Nous commanderons des souris à l’âge de 4 semaines, c’est-à-dire des jeunes sevrés. Nous sommes obligés de commander des souris non adultes puisque ces souris mâles développent spontanément des plaques d’athéromes à partir de 7 semaines de vie. Nous n’avons pas le choix de commander des animaux au stade « jeunes sevrés » puisque nous voulons étudier l’impact de la carbamylation des protéines sur le développement des phases précoces de l’athérosclérose, il faut donc induire la carbamylation des protéines avant le développement de la pathologie. Toutes les expérimentations et les mises sous anesthésies se feront sur un animal adulte (âgé de 9, 13 et 16 semaines pour la procédure 1 et âgé de 9 et 13 ou 16 semaines pour la procédure 2).