Souris
Offre de prestation d’étude de pharmacocinétique et de tolérance chez le rongeur (rat, souris) après injection intra-articulaire
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Rats : 424
424 souris et 424 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modérés. Chaque animal reçoit une injection dans l'articulation du genou sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés, la boiterie et l'inflammation étant possibles si le produit est mal toléré, avant le prélèvement des tissus de l'articulation. Le projet teste la tolérance et la diffusion de candidats médicaments contre l'arthrose et la polyarthrite. Le porteur décrit une "offre de prestation" commerciale, qui relève aussi de la formation aux gestes techniques.
Objectifs
Les pathologies ostéoarticulaires sont des maladies caractérisées par une perte progressive de cartilage au niveau des articulations. Parmi ces pathologies articulaires, d’après l’OMS, l’arthrose concerne 343 millions de personnes dans le monde et la polyarthrite rhumatoïde 14 millions de personnes. La prévalence augmentant avec l’âge, une augmentation du nombre de patients. ayant besoin de traitements ou de soin de réhabilitation est attendue. Actuellement aucun traitement curatif n’est disponible, seuls des anti-douleurs et des anti-inflammatoires sont proposés, ainsi que la pose de prothèse en tant que traitement ultime de l’arthrose. De nouvelles stratégies thérapeutiques, comme l’utilisation de la thérapie cellulaire ou le développement de formulations à libération prolongée, pour augmenter la durée de l’efficacité des traitements représentent un intérêt croissant pour le traitement de ces pathologies. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet qui a pour objectif d’une part de tester la tolérance des nouvelles molécules développées pour le traitement de ces pathologies et d’autre part d’évaluer la cinétique de libération de nouvelles formulations après leur injection intra-articulaire. Les tests de tolérance et de distribution de ces candidats médicaments seront réalisés sur des animaux après injection intra-articulaire. Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement de traitements ayant montré un intérêt thérapeutique pour les patients souffrant de ces atteintes ostéoarticulaires.
Bénéfices attendus
Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement des composés et formulations ayant démontré une bonne tolérance et une biodistribution pertinente pour le traitement des pathologies ostéoarticulaires.
Procédures
Administration de composés à tester ou de produit de référence : L’administration de médicaments vétérinaires (anesthésiques/antalgiques) suivant les bonnes pratiques vétérinaires qui pourront être quotidiennes pendant 7 jours au maximum. Une administration intra-articulaire unique sous anesthésie générale dans un seul genou. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés : 1 à 2 par semaine (dans la limite des contraintes liées à la récupération des animaux et aux spécificités du site de ponction), jusqu’à la fin de l’étude.( 6 semaines maximum après l'injection intra articulaire) Pour les prélèvements sanguins nous pouvons prélever au maximum : Pour une ponction unique jusqu’à 10% du volume sanguin total suivi d’une période de récupération de 3 semaines. Pour des prélèvements répétés dans la limite de 20% du volume sanguin total sur une période de 14 jours. En fonction de la fréquence et du volume minimum nécessaire aux analyses nous adapterons le site de ponction et éventuellement la réalisation des prélèvements sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Stress/douleur : L’administration de médicaments (anesthésiques et/ou antalgiques) par voie parentérale suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires (introduction d’une aiguille) Douleurs post-opératoires : pour les techniques d’administration nécessitant un abord chirurgical qui sont réalisées sous anesthésie avec traitement antalgique pré et post opératoire. Boiterie et possible inflammation : consécutives à l’injection intra-articulaire si la tolérance du produit n’est pas bonne.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car la collecte des tissus de l’articulation du genou requiert l’euthanasie des animaux.
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthode alternative validée pour mimer la biodistribution et évaluer la tolérance d’un composé et d’une formulation en développement. Toutefois les composés qui rentrent en phase de test in vivo ont préalablement démontré une activité pharmacologique intéressante pour le traitement des pathologies articulaires.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé, à partir des données disponibles dans la littérature scientifique et en tenant compte de la variabilité des modèles et des techniques de dosage de pharmacocinétique. Ce nombre d’animaux nous permettra d’avoir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. L’étude statistique prévue sera l’analyse d’un grade obtenu à la suite de l’observation anatomopathologique de l’histologie des tissus en fonction des différents groupes de traitement. Un autre test statistique pourra être réalisé sur des comptages en analyse histologique des tissus. Dans ce projet il est prévu de réaliser 4 études chez chacune des 2 espèces chaque étude incluant 106 animaux au maximum par étude.
Raffinement
Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Nous intégrons également dans ce projet un soin particulier afin de prévenir toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. De l’aliment sera mis sur le sol des cages la veille et durant deux jours après l’injection intra-articulaire afin de faciliter l’accès à la nourriture. Afin de faciliter l’accès à l’eau des biberons adapté (tige longue pour souris) et/ou de l’hydrogel seront mis à disposition des animaux. Les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué lors des anesthésies. Une analgésie adaptée est mise en place (anesthésie locale) avant l’injection intra-articulaire.
Choix des espèces
Le choix des espèces a été fait sur la base des informations disponibles dans la bibliographie. Le choix entre le rat et la souris sera effectué en fonction du volume cible à injecter en intra-articulaire ainsi que des analyses à effectuer : évaluations histologiques et dosages du liquide synovial, la ponction du liquide synovial n’étant possible que chez le rat. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes en fin de croissance c’est-à-dire des animaux d’au moins 6 semaines d’âge.
Préparation de fractions microsomales de foies ou de reins de rongeurs
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 270
180 souris et 270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un inducteur d'enzymes, puis leur foie ou leurs reins sont prélevés sous anesthésie mais sans analgésie, le porteur jugeant l'absence d'analgésique "indispensable" pour éviter des interférences avec le produit. Ces organes servent à fabriquer le S9, un réactif utilisé dans les tests réglementaires de génotoxicité. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'équivalent de synthèse au S9 et que les animaux ne sont traités qu'en fin de stock.
Objectifs
Des tests reglementaires réalisés sur cellules et bactéries en culture, requis pour évaluer le potentiel génotoxique de produits en développement avant leur mise sur le marché, nécessitent l'utilisation d'un système biologique permettant de mimer les phénomènes de métabolisation par le foie ou le rein. Ce système est appelé S9. Il est fabriqué à partir de foies ou reins prélevés chez le rongeur (rat ou souris) après administration unique d'un activateur pour produire les enzymes du métabolisme et permet au laboratoire de constituer des stocks qui seront utilisés dans les tests reglementaires.
Bénéfices attendus
L'iutlisation de S9 dans les études réglementaires est obligatoire. La préparation de S9 permet permet de générer des stocks qui seront utilisés dans de telles études.
Procédures
Le produit n'est administré qu'une fois à des lots d'animaux (6 lots de 6 animaux chacun, rat ou souris) par voie intrapéritonéale. La substance n’a qu’une incidence légère sur l’animal (il s'agit d'une substances induisant la production d'enzymes du métabolisme) et les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Les animaux sont exposés au produit 5 jours avant prélèvement sous anesthésie des foie ou reins qui serviront à la fabrication du S9. les animaux sont mis à mort au moment du prélèvement des organes.
Impact sur les animaux
Nuisance légère: injection unique par voie intrapéritonéale: les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au point d'injection. Nuisance légère: stress de l'anésthésie. Nuisance sévère: retrait du sang et prélèvement des organes sur animal anesthésié sans analgésie (indispensable pour éviter des interférences lors de l’utilisation du produit)
Devenir
Le foie ou les reins sont prélévés sur animaux anésthésiés pour préparer le S9. Les animaux sont donc mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Le S9 est une fraction de foie ou de rein servant de système d’activation métabolique pour les tests réglementaires in vitro qui sont requis pour évaluer le potentiel génotoxique des produits testés au laboratoire (médicaments, produits chimiques…), et établir les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités compétentes. Le S9 de rat/souris est le plus communément utilisé dans les études réglementaires et recommandé par les lignes directrices de l'OCDE des protocoles qui utilisent le S9. Il n'existe pas d'équivalent de synthèse (chimique par exemple) au S9 qui est alors fabriqué à partir de foie et/ou reins de rongeurs. La préparation de S9 permet au laboratoire de générer des stock qui seront utilisés dans les tests reglementaires.
Réduction
Le traitement d'animaux pour générer des stocks de S9 n'est réalisé qu'une fois le stock sur le point d'être épuisé afin que des animaux n'aient pas été mis à mort inutilement. Une estimation du stock nécessaire est faite avant toute mise en place de la procédure afin de traiter le minimum d'animaux possible
Raffinement
Les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Le traitement de nouveaux animaux pour générer le S9 n'est prévu qu'en fin de stock. La substance administrée n’induit pas de stress ou de douleur. Cependant, après traitement, un suivi comportemental et clinique est effectué. Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) fait l'objet d'une mise à mort. Pour retirer le sang et prélever les organes l'animal est anesthésié et il n'est pas possible d'utiliser un analgésique pour éviter les interférences quand le produit sera utilisé.
Choix des espèces
Le S9 de rat/souris est le plus communément utilisé dans les études réglementaires et recommandé par les lignes directrices des protocoles qui utilisent le S9. Au maximum, 90 animaux sont utilisés par an (54 rats, 36 souris) soit 450 animaux (270 rats, 180 souris) sur 5 années d’autorisation de projet. La préparation est décrite dans de nombreuses publications qui stipulent ques les animaux doivent être traités à l'âge de 5 à 10 semaines
Etude pilote pour le suivi par imagerie de lymphocytes T humains greffés chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des lymphocytes T humains, puis des médicaments sont testés pour activer un "gène suicide" censé détruire ces cellules en cas d'effet indésirable, avec injections, pesées et imageries sous anesthésie. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une atteinte de la peau et du poil, une perte de poids et une baisse d'activité, d'intensité modérée à sévère. Il s'agit d'une étude pilote sur douze animaux, et le recours à la souris est déclaré "indispensable" pour valider in vivo un résultat déjà obtenu in vitro.
Objectifs
Les lymphocytes T font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces lymphocytes T pour le traitement de certains cancer est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever des cellules immunitaires d’un patient (ici, les lymphocytes T), pour les modifier génétiquement et les lui réinjecter dans le but de reconnaître puis éliminer les cellules cancéreuses. Aujourd’hui de nombreux essais cliniques ont démontré l’efficacité des thérapies par ces cellules dans l’élimination des cellules tumorales chez l’animal et l’humain, particulièrement les leucémies et lymphomes. Cependant, leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tel que la production massive de substances toxiques suivie par un syndrome de neurotoxicité. Ces effets secondaires empêchent l’utilisation de ces cellules comme traitement de première intention chez les patients. Dans ce projet nous souhaitons démontrer la possibilité de pouvoir éliminer de façon contrôlée ces cellules génétiquement modifiés si des effets indésirables apparaissaient, élargissant ainsi les applications cliniques de ces cellules. Pour contrôler ces cellules en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvés. L’activation du gène suicide par le médicament va déclencher la mort du lymphocyte T. Nous avons démontré le concept in vitro en substituant le gène suicide par un gène luminescent et montré que le médicament permettait d’activer le gène luminescent en activant un signal luminescent dans la cellule. L’objectif de ce projet est de valider le concept in vivo, déterminer les médicaments et les doses efficaces, permettant d’activer la production du signal de luminescent dans des lymphocytes T humains greffés chez la souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude pilote préclinique est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des lymphocytes T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de ces cellules et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.
Procédures
Les souris seront soumises à une pesée hebdomadaire soit 8 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile). Si une perte de poids était observée, des pesées supplémentaires seront réalisées deux fois par semaine ou tous les jours. Deux à trois injections maximum sur animal anesthésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Deux à trois injections maximum sur animal vigile, d'une durée de moins de 15 secondes, seront réalisées. Chaque animal sera également soumis à 3 ou 4 imageries d'une durée de 5 minutes réalisées sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et des médicaments pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes). Des nuisances d'intensité modérée à sévère, sur une durée de un à plusieurs jours, en lien avec la greffe des lymphocytes T chez la souris pourront apparaitre. Ces manifestations se caractérisent par une atteinte de l'intégrité de la peau, du poil, une perte de poids, une modification de l'activité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus pour des analyses.
Remplacement
Des tests in vitro réalisés ont montré que les médicaments étaient capables d'activer la production d'un signal luminescent dans des lymphocytes T humains. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote sur petit effectif d'animaux, 12 animaux au total, 3 par groupes, 4 groupes d'animaux qui nous permettra de valider les médicaments, leur posologie et les manifestations cliniques de la greffe de lymphocytes T humains chez la souris.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.
Choix des espèces
Nous utiliserons comme modèle la souris. Cette souris n'a pas de cellules immunitaires ce qui évite le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-20 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.
Rôle de FAT10/UBD dans la fonction hépatocytaire et la progression de la NASH
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil, légers et modérés. Elles subissent une biopsie de la queue, des gavages et des injections, ainsi qu'un régime gras destiné à provoquer une stéato-hépatite, qui peut faire apparaître des nodules du foie évoluant vers un cancer, avant que le foie soit perfusé et prélevé sous anesthésie. L'objectif est d'étudier le rôle de la protéine FAT10 dans cette maladie du foie liée à l'obésité. Le porteur conclut que FAT10 pourrait être une cible thérapeutique, bénéfice renvoyé au conditionnel.
Objectifs
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est la maladie hépatique la plus courante qui affecte 80% de la population obèse. Initiée par une accumulation de graisse dans le foie (stéatose), la NAFLD évolue vers la stéato-hépatite non alcoolique (NASH), facteur de risque de comorbidités mortelles. Actuellement, aucun traitement médicamenteux n’est disponible. Ainsi, il est important de bien caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans cette pathologie afin d'apporter des solutions thérapeutiques. Les résultats préliminaires du laboratoire révèlent une implication de FAT10 dans la progression de la NASH avec une surexpression dans le foie de patients NASH, corrélé à une diminution de l'expression de PPARα, récepteur nucléaire contrôlant le métabolisme lipidique et l'inflammation. De plus, il a été constaté dans le foie de patients atteints de NASH, que l’expression de FAT10 corrèle également positivement avec l’expression des gènes de la sénescence. L'objectif de ce projet est d’étudier si la modulation de l'expression de FAT10 influence la sénescence prématurée et l’activation de PPAR-alpha dans les hépatocytes au cours du développement de la NASH grâce à l’utilisation de modèles murins.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence le rôle de FAT10 dans le développement des maladies du foie gras non alcoolique et son lien avec l’induction de la senescence de l’hépatocyte et l’activation de PPARa. La compréhension de ces nouveaux mécanismes pourrait permettre demontrer que FAT10 pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans l’objectif de soigner la NASH.
Procédures
Les souris seront baguées à l’oreille afin d’être identifiées par la suite et une biopsie de queue (
Impact sur les animaux
La lignée C57BL6/J utilisée dans nos différentes procédures ne présente aucun probléme physique ou physiologique. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en œuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. Cependant, l’injection d’Adénovirus ou d’AAV par intra-veineuse permettant la surexpression ou la diminution d’expression de FAT10 sera réalisée et peut conduire à l’apparition d’un stress aigu sur l’animal qui peut se représenter par une douleur d’ordre légere pour l’animal. De plus, la mise en place de ce protocole entraine l’utilisation d’une cage chauffante à 37°C (permettant la dilation des veines pour l’injection en intra-veineuse) provoquant un stress thermique à l’animal. L’utilisation de régime induisant la NASH chez l’animal peut conduire à l’apparition de nodules hépatiques pouvant évoluer vers un carcinome hépatique pouvant causer des douleurs à l’animal au cours du protocole. La mise en place de régimes obésogènes dans un modèle murin peut également entrainer des problèmes de prise alimentaire et donc le développement de faim et de malnutrition de l’animal. L’ensemble des procédures vont également nécessiter la prise des animaux en contention, pouvant provoquer un stress léger à l’animal.
Devenir
A l’issus des différentes procédures mise en place dans ce projet de recherche, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Ce projet de recherche est mis en place à partir d’études préliminaires réalisée sur des lignées cellulaires. Ces études ont montré un rôle important de la protéine FAT10 dans les cellules du foie. Cependant, les maladies du foie gras non alcoolique sont des pathologies complexes impliquant de nombreux organes autres que le foie. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal (modèle murin) nous permettra de reproduire au mieux la maladie du foie gras non alcoolique et de mieux comprendre le rôle clé joué par la protéine FAT10 dans le développement et la progression de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum, sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. De plus, une analyse appronfondie de la littérature permet également d’éviter des répétitions d’expériences inutiles (exemple dose des agonistes de Ppar-alpha à utiliser).
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons. La définition précise des points limites précoces, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permet de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de la souris. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
Cette espéce est utilisée car les souris (mus musculus) peuvent être génétiquement modifiées soit par injections virales ou par transgénèse. De plus, de nombreuses données bibliographiques sont disponibles sur cette espèce dans la cadre des études sur les NAFLDs permettant d’affiner au mieux les conditions expérimentales mises en jeu dans le projet. De plus, elle présente de nombreux avantages : facilité d’élevage, possibilités d’utiliser des modéles favorisant la susceptibilité aux régimes spéciaux prédisposant au développement des NAFLDs. Les souris seront utilisées à l’âge adulte de 12 semaines. L’étude de l’implication de FAT10 dans la senescence des hépatocytes lors de la NASH nécessite que certaines expériences soient réalisées comparativement à des souris âgées (60 semaines).
Etude de l’effet du mir155 sur l’intégrité vasculaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
41 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs yeux, afin d'étudier le rôle du micro-ARN mir155 dans la formation des vaisseaux de la rétine. Le bénéfice avancé reste conditionnel, un futur médicament qui préserverait l'intégrité des vaisseaux si le mir155 les déstabilise. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'angiogenèse de la rétine et qu'aucune culture 3D n'est envisageable.
Objectifs
L'angiogenèse est un processus biologique qui consiste en la formation de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus est conduit par les cellules endothéliales. Il est fondamental pour la cicatrisation des tissus et le développement embryonnaire. Cependant, l’angiogenèse aggrave de nombreuses maladies telles que le cancer et les pathologies inflammatoires chroniques. Une dérégulation de ce processus est responsable des rétinopathies. Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures. L’accessibilité du réseau vasculaire à la surface de la rétine permet une quantification précise de différents paramètres comme la fraction de tissu vascularisé, la densité de vaisseaux et le niveau de ramification du réseau vasculaire, et cela sur l’intégralité de la surface de la rétine. Il existe déjà des protocoles standardisés pour la quantification de ces paramètres dans ce modèle. Ceci est réalisable en injectant d’une part, un inhibiteur (anti-miR-155 ou antagoMir) pour évaluer sa capacité à bloquer le processus, et d’autre part en injectant un activateur (miR-155 mimic) pour stimuler le processus. L’analyse des paramètres d’angiogenèse sera effectuée par microscopie confocale après immunofluorescence réalisée sur les rétines entières, à l’aide d’un protocole déjà établi.
Bénéfices attendus
Si le Mir155 déstabilise les vaisseaux sanguins matures, il sera possible d'utiliser un medicament qui l'inhibera pour que les vaisseaux restent intacts (intégrité vasculaire préservée)
Procédures
Nous souhaitons dans un premier temps, administrer localement (injections intraoculaires sous anesthesie générale par inhalation d'isofluorane ) deux doses différentes de ces molécules couplées à un fluorochrome afin d’évaluer la quantité de molécules que nous retrouverons dans les cellules endothéliales de la rétine. Dans un deuxième temps, nous administrerons ces deux molécules non marquées, à la concentration la plus efficace (d’un point de vue de la demi-vie et du ciblage des cellules endothéliales) , afin de déterminer leurs effets sur l’angiogenèse (ce qui nous permettra ensuite de réduire le nombre d’animaux). L'intervention dure 20 min. Le prélèvement de la rétine ne peut se faire sans éviter l'euthanasie de l’animal .
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir de la procédure d’injection intraoculaire. Il n’y pas d’inconfort ou d’effets indésirables connus causés par cette procédure comme déjà décrit dans la bibliographie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale . Il est impossible d'étudier l'angiogenese de la rétine sans euthanasier l'animal puisque nous devons prélever les yeux pour l'extraire.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier la croissance et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). La mise au point de certains paramètres (dose-réponse, toxicité, demi-vie du composé à injecter…) de l’expérience peut être réalisée sur cellules endothéliales d’origine commerciale mais il est impossible de « mimer » l’angiogenèse de la rétine et d’étudier son intégrité en culture 2D. Aucun protocole de culture 3D n’est envisageable.
Réduction
Basé sur notre expérience du modèle, nous devons prendre en compte que les étapes d’injection et dissection peuvent induire la perte de 10% des échantillons (1 œil) et que le traitement pourrait échouer sur 10% des animaux (1 œil). Par conséquent, nous avons pu réduire le nombre d’animaux à 5 animaux par sous-condition pour que l’analyse soit statistique ceci pour chacun des 3 groupes expérimentaux. D’autre part, l’avantage d’étudier l’œil est que chaque animal constitue son propre contrôle car nous étudierons aussi l’œil non injecté (contralateral) qui constituera un contrôle interne permettant d’évaluer les effets du composé injecté (animaux traités au miR ou antimiR) et également les effets de la procédure d’injection en elle-même (animaux injectés avec la version contrôle du miR ). Ceci permet de réduire le nombre d’animaux en évitant de sacrifier une autre série d’animaux juste pour collecter des yeux sains.
Raffinement
Les souris adultes sont hébergées en groupe sociaux, la plupart du temps entre frères ou entre sœurs dans un environnement approprié (litière, boisson et alimentation, dôme) L’élevage est supervisé par le personnel compètent de l’animalerie conventionnelle Pour limiter une éventuelle douleur liée à l’injection, un anesthésique local en gel ophtalmique sera appliqué sur la paupière avant et après l’injection. De plus, nous délivrerons un anti-inflammatoire non steroidien qui permettra une couverture de la douleur sur 24h, soit jusqu'à l'euthanasie des animaux Nous veillerons à ce que la phase de réveil se fasse dans les meilleurs conditions (surveillance accrue, température de la cage...). Nous veillerons à ce que les animaux s’alimentent et s’hydratent normalement. Nous surveillerons leur comportement et l’apparition d’éventuelles blessures.
Choix des espèces
En se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait que le modèle de rétine postnatale de souris C57Bl6J est le plus approprié pour l’étude de l’angiogenèse in vivo. Ce modèle présente l’avantage d’être peu invasif . Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures.
Impact d’un des composants de la matrice extracellulaire sur la progression des hépatopathies métaboliques et leurs complications
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée pour prélèvement de tissus et de sang, une autre conservée pour l'élevage. Chaque animal subit une biopsie de la queue, un régime destiné à provoquer une stéatose du foie avec inflammation et fibrose, et des prélèvements de sang répétés sous anesthésie. Le porteur indique que le régime peut entraîner une prise de poids et que le tamoxifène administré peut provoquer une perte de poids et des atteintes des testicules chez les mâles. L'étude porte sur le rôle d'un composant de la matrice du foie comme cible thérapeutique et biomarqueur de la maladie du foie gras.
Objectifs
Les hépatopathies métaboliques, telles que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et le stade avancé stéatohépatite non alcoolique (NASH), sont en forte progression dans les pays développés et atteignent à ce jour 25% de la population mondiale, devenant la première cause de maladie chronique du foie. La surconsommation d'aliments hautement transformés, pauvres en nutriments et riches en graisses et en sucres contribue largement au développement de la NAFLD/NASH. Les complications liées à la NAFLD/NASH comprennent principalement l'inflammation et la fibrose qui peuvent être suivies par le développement d'une cirrhose et/ou d'un carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables du développement de la NAFLD/NASH et de la progression vers le CHC restent à élucider. À ce jour, il n'existe aucun médicament cliniquement approuvé pour traiter ou limiter la progression de la NAFLD/NASH. Il existe également un besoin non satisfait de développer des tests non invasifs pour le dépistage, le diagnostic, la stadification et le suivi de la réponse thérapeutique à ces maladies. La matrice extracellulaire (MEC) joue un rôle majeur dans la progression de la maladie en étant notamment impliquée dans l'établissement et la chronicité de l'inflammation et la fibrose de divers tissus. Inflammation et fibrose sont deux caractéristiques des hépatopathies métaboliques et sont clairement liées à la progression vers le cancer. Notre laboratoire se focalise principalement sur l’étude d’un des composants spécifiques de la MEC et notre équipe, entre autres, a montré que ce composant favorise l'inflammation et la fibrose dans le cancer et dans d'autres pathologies. Cependant, son rôle dans la progression de la NAFLD/NASH n'est pas encore connu. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle de ce composant spécifique de la MEC dans le développement de la NAFLD/NASH, son utilisation en tant que biomarqueur potentiel et d'évaluer l'effet de nouveaux agents ciblant cette nouvelle cible thérapeutique de la MEC en tant que thérapies potentielles de la NAFLD/NASH.
Bénéfices attendus
En élucidant le rôle d’un composant spécifique de la matrice extracellulaire (MEC) dans les hépatopathies métaboliques à l'aide d'animaux transgéniques, nous espérons pouvoir établir le rôle de cette molécule comme biomarqueur de la maladie pour aider au diagnostic et/ou identifier la progression ainsi que pour le pronostic des patients susceptibles de développer des NAFLD/ NASH. Cette étude établira également si ce composant peut être une cible thérapeutique dans la NAFLD/ NASH et l'utilisation potentielle de nouveaux agents inhibiteurs de cette nouvelle cible thérapeutique comme médicaments anti-fibrotiques.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie au niveau de leur queue faite sous anesthésie (durée 5 minutes). Un groupe d’animaux éveillés recevra une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Un second groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 4, 8 ou 12 semaines. Les animaux éveillés recevront une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Des échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 3, 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 4, 8 ou 12 semaines respectivement). Les animaux anesthésiés seront imagés une fois par semaine (3 fois au total). La durée de l'imagerie est d'environ 5 minutes. Un troisième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. Des échantillons de sang seront prélevés sur des animaux anesthésiés (durée de 5 minutes) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. En outre, les animaux éveillés recevront une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Le schéma d'injection de 5 jours sera répété à un intervalle de 4 semaines (3 ou 4 séries d'injections au total). Des échantillons de sang seront prélevés sur des animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). Un cinquième groupe d’animaux, éveillés ou anesthésiés, recevront une injection (30 secondes). Des micro-échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) 7 fois sur une durée totale de 48 heures. Les animaux anesthésiés seront imagés (durée 5 min) 4 fois sur une durée totale de 48 heures. Un sixième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. En outre, les animaux éveillés ou anesthésiés recevront une injection une fois par jour tous les deux jours pendant une durée totale de 4 semaines. Des échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). L’ensemble de ces animaux sera soumis à un jeûne de 5 heures (une fois).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un régime spécial (CDAHFD) pour induire le développement d'une stéatose hépatique avec inflammation et fibrose, des pathologies majoritairement silencieuses – sans symptômes – mais qui pourraient entraîner une prise de poids. Il a été indiqué que l'administration de tamoxifène entraînait une perte de poids. Il a également été rapporté que l'administration de tamoxifène provoque certaines altérations cellulaires dans les testicules des souris mâles pouvant conduire à des péronites, oedèmes du testicule ou hernies. Des prises de sang répétées peuvent dans certains cas entraîner des ecchymoses ou des hémorragies. Il existe également un risque inférieur à 5% d'inflammation et d'infection du site de prélèvement sanguin ou d'injection. Un prélèvement unique effectué au niveau de leur queue (biopsie) pourra entraîner une douleur de courte durée.
Devenir
Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement de tissus et de sang et une partie sera conservée pour le maintien de l’élevage.
Remplacement
Des échantillons cliniques provenant de patients atteints de NAFL/ NASH sont très limités notamment ceux provenant des étapes initiales de ces maladies du foie. De plus, la génération d’organoïdes de foie à partir de biopsies de ces patients est un véritable challenge du fait de la capacité très limitée de réplication des cellules de ces tissus. Contrairement aux cellules cancéreuses, les altérations cellulaires dans les tissus affectés par les NAFLD n’amènent pas de bénéfice de réplication des cellules. Il existe aujourd’hui différents organoïdes hépatiques utilisés en recherche. Des organoïdes issus d’hépatocytes de patients atteints de NASH ont permis d’élucider des éléments clés de la biologie de la maladie. Cependant, aucun organoïde à ce jour ne permet de reproduire la progression totale depuis l'établissement de la stéatose jusqu'aux stades de l'inflammation, de la fibrose et du cancer. Seul l’animal dans sa globalité, avec l’ensemble des systèmes impliqués dans la pathologie (cytokines des tissus adipeux et muscles, hormones, cellules immunitaires, molécules de la matrice extracellulaire etc.) peut être utilisé. Le projet est complété au maximum par des études effectuées en parallèle in vitro sur des cultures cellulaires.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux dans l'étude, des échantillons de sang répétés mais de faibles volumes, seront prélevés sur le même animal au cours de la procédure. Les procédures comportant plusieurs points dans le temps seront optimisées pour réduire le nombre d'animaux requis. Le nombre minimal d'animaux pour le projet est calculé en fonction des données de la littérature, et tient compte tenu de la variabilité entre les individus, des groupes expérimentaux et de la complexité de la procédure. Le nombre d'animaux (n) a été évalué en utilisant un test de puissance statistique basé sur des études publiées précédemment et portant sur des questions de recherche similaires. Nous avons également tenu compte de la grande variabilité observée entre les souris mâles et femelles dans maladies hépatiques induites par l'alimentation. Les résultats seront analysés par différents tests statistiques appropriés afin de dégager les résultats significativement différents. Les tissus et coupes histologiques seront également partagés entre les collaborateurs du projet pour ne pas reproduire inutilement les procédures sur les animaux entre les laboratoires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages avec une surface supérieure à la surface règlementaire minimale, avec de l’enrichissement supplémentaire (maisonnette, tunnel, buchette à ronger, frisure de papier, rouleaux de coton) pour promouvoir l’activité et permettre aux animaux de se cacher, réduisant le stress associé aux procédures. Les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé, weekend et jours fériés inclus, et un suivi plus poussé (poids et alimentation) est réalisé minimum 3 fois par semaine pour détecter au plus tôt tout signe de détresse/ souffrance/ douleur. Lorsqu’elle n’interfère pas avec le protocole expérimental, l’anesthésie est systématiquement utilisée pour réduire au maximum le stress/ douleur des animaux. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur une semaine avant les expériences afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris reste aujourd’hui le seul animal qui combine la possibilité d’étudier des changements histologiques, biochimiques, morphologiques (animaux génétiquement modifiés) avec un modèle reproductible d’hépatopathie métabolique induite (régime CDAHFD) très proche de la maladie humaine (progression NAFL-NASH-fibrose-cancer hépatique). L’utilisation de la souris est donc indispensable pour décrypter les mécanismes mis en jeu dans ces maladies qui sont aujourd’hui et pour les années à venir, un problème majeur de santé publique. Pour mimer la situation chez l’être humain, les animaux seront utilisés au stade "jeune adulte" (i.e., âgés de 8 à 14 semaines) pour permettre leur suivi longitudinal jusqu'à 3 mois de régime.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte: impact d’un stress chimique sur l’homéostasie de la barrière intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
5 928 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées dès la vie in utero à des additifs alimentaires (dioxyde de titane, dioxyde de silice, silicate d'aluminium) et à un pesticide au cuivre, elles subissent des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés et des mesures de perméabilité intestinale. Le porteur indique un stress et un inconfort liés aux administrations orales et aux prises de sang, atténués par une crème anesthésiante. L'étude doit fournir des données sur les risques de ces substances, utilisables par les instances réglementaires.
Objectifs
L'intestin est la voie principale de passage des additifs alimentaires vers l'organisme et une pertubation de la perméabilité intestinale pourrait être un facteur prépodérant dans l'augmentation de leur concentration circulante dans l'organisme. Une altération de la perméabilité intestinale est retrouvée dans de nombreuses pathologies comme le syndrome de l’intestin irritable (10-15% de la population dans les pays développés) ou encore l'anxiété et la dépression. Le but de ce projet est d'étudier si une augmentation de perméabilité intestinale concécutive à un stress chimique, durant la période critique qu'est la gestation, sera associée à un passage plus important de 3 additifs (dioxyde de titane, dioxyde de silice, silicate d'aluminium) ou contaminants alimentaires de type pesticide (nanopesticide de cuivre) vers le foetus. Les impacts sur la descendance seront évalués par l'analyse du microbiote et des fonctions intestinales et métaboliques.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en evidence l’impact des 3 additifs et des contaminants de type pesticide consécutive à un stress, sur la réponse la mise en place du microbiote et des fonctions intestinales et métaboliques Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques des populations à risque.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose, de la glycémie, de l'insulinémie et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 10 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue (1 prélèvement pour la mesure de perméabilité, 8 prélèvements pour la glycémie-insulinémie), après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fécès seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera attenué par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Ensuite la réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à l'administration orale de glucose ou du marqueur de perméabilité intestinale et aux prélèvements de sang. Une prise en charge de la douleur liée à aux prélevements sanguins sera réalisée par application d'une crème anesthésiante locale.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter les échantillons tissulaires pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique du projet.
Remplacement
Le projet étudie l'impact d'une exposition, dès la période in utero et jusqu'à l'âge adulte, à des nanomatériaux alimentaires et des contaminants de type pesticide (TiO2, Alu, SiO2, Cu(OH)2). L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les impacts des nanomatériaux et des pesticides sur les axes microbiote-intestin. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues entre organes et entre microbiote et intestin..
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé en se basant sur des résultats antérieurs d'études similaires. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Pour les analyses des données récoltées, des tests statistiques adaptés seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront en hébergement collectif (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris de type maisonnette en inox. Les femelles gestantes seront isolées une par cage avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin de réduire l'angoisse des animaux. L'angoisse sera également atténuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente ou une diminution de la prise alimentaire seront identifiés et écartés de l'étude afin de pratiquer des soins adaptés.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
FXR et Tau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau, subit une biopsie de la queue et des tests de mémoire en labyrinthe, pour étudier le lien entre un récepteur et les lésions de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique des douleurs liées à la biopsie et aux injections stéréotaxiques et un stress lié aux tests. Il qualifie de "stricte nécessité" le recours à des animaux vivants pour relier comportement cognitif et lésions du cerveau.
Objectifs
L’objectif général de ce projet et de la présente demande vise à mieux comprendre le lien entre le récepteur FXR (et son rôle dans l'insulinosensibilité centrale) et les mécanismes physiopathologiques de la maladie d'Alzheimer et ce, en appréhendant les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement des lésions dans la maladie d'Ahzheimer et les tauopathies (pathologies caractérisée une agrégation intraneurale de la proteine Tau) et pouvant être influencer par le récepteur FXR. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA pouvant in fine aboutir de nouvelles startégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre projet va apporter la preuve de concept selon laquelle le récepteur FXR pourrait influencer la pathlogie Tau physiopathologie de la MA et des tauopathies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de vecteurs viraux (voies intracraniale: 1x, moins de 5min,procédure entière moins de 60 min). Nous réaliserons également des tests de comportement afin d’évaluer les performances cognitives des animaux (actimétrie: 1x, 10 min; labyrinthe: 1x, 10min, 130 moin en cage d'hébergement (phase de retention) et 5 min soit 45 min). Les animaux subiront une biopsie de queue (moins de 5 min, 1X).
Impact sur les animaux
Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue (douleur modéré; 1x) -Stress associé aux investigations comportementales -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiquesdouleurs/infections post-opératoires
Devenir
En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés; à savoir mettre en lien le comportement cognitif et les lésions histopathologiques et l'insulinosensibilité centrale. Ce lien nécessitant l amise à mort de tous les animaux pour pouvoir réaliser des marquages histologiques, immunomarquages et/ou western blot. De ce fait, aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de ce projet sur les 5 ans à venir est estimé à 360. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout enpermettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombred’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.
Raffinement
LES ANIMAUX SERONT OBSERVES TOUS LES JOURS, PESES REGULIEREMENT, PAR DU PERSONNEL SPECIALEMENT FORME. DURANT LES DIFFERENTS PROTOCOLES, TOUT SERA MIS EN OEUVRE POUR MINIMISER LE STRESS AUQUEL LES ANIMAUX SONT SOUMIS. LES ANIMAUX SERONT HEBERGES EN GROUPE, ET DES ELEMENTS D'ENRICHISSEMENT DU MILIEU SERONT MIS A DISPOSITION, PAR EXEMPLE COTON POUR LA CONFECTION DE NIDS... LES ANIMAUX SERONT SUIVIS PRECISEMENT POUR CHAQUE PROTOCOLE, POUR LESQUELS DES POINTS LIMITES ADAPTES ONT ETE DEFINIS. TOUTE SOUFFRANCE, ANGOISSE OU COMPORTEMENT INHABITUEL SERA PRIS EN CHARGE PAR DES APPROCHES APPROPRIEES. LES PROCEDURES EXPERIMENTALES DE CHIRURGIES SERONT REALISEES SOUS ANESTHESIE GENERALE PAR VOIE INTRAPERITONEALE. EN CAS DE DOULEUR, UN ANALGESIQUE SERA ADMINISTRE. LES ANIMAUX PRESENTANT UN DES POINTS LIMITES SPECIFIES POUR CHAQUE APPROCHE EXPERIMENTALE SERONT SACRIFIES DANS UNE SALLE DEDIEE; LE TOUT EN LIEN AVEC LE RESPONSABLE DU BIEN ETRE ANIMAL.
Choix des espèces
Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (pathologie Tau). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’expression cérébrale de FXR via l'usage de vecteurs viraux et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire.
Impact de l’électrostimulation spinale sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
843 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 462 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 381 opérées sans réveil. Selon les groupes, chaque animal subit une chirurgie puis l'injection d'une endotoxine bactérienne ou l'induction d'une arthrite ou d'une atteinte du système nerveux proche de la sclérose en plaques, avant des séances d'électrostimulation. Le porteur reconnaît que ces inductions peuvent provoquer une douleur sévère et que les impulsions électriques peuvent créer un inconfort. L'étude vise à mettre au point un électrostimulateur contre la polyarthrite et la sclérose en plaques, qu'il présente comme un "besoin" faute de traitements curatifs.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) et la sclérose en plaque (SEP) sont des maladies inflammatoires, caractérisées par une atteinte articulaire ou nerveuse respectivement évoluant vers la déformation et la destruction des articulations ou du tissu nerveux. La PR et la SEP sont une maladie autoimmune reconnue pour présenter un nombre anormal de cellules immunitaires dans les articulations ou le cerveau respectivement qui produisent des molécules inflammatoires, activant la destruction des tissus. Des études ont montré que le système nerveux pouvait réguler le système immunitaire via la libération des molécules (tels que l’acétylcholine, l’adrénaline ou la noradrénaline) lors de la stimulation de nerfs qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire. Dès lors, l’intervention sur l’activité des nerfs dans le but de modifier l’activité du système immunitaire est envisageable. Ainsi, chez l’homme la stimulation de nerfs est déjà utilisée pour le traitement de maladies comme l’épilepsie ou la dépression. De nos jours, plus de 50000 patients dans le monde sont implantés avec des micro-stimulateurs. Les effets de ces électrostimulations sont actuellement recherchés dans des maladies inflammatoires comme la PR. Deux modèles ont été développés chez la souris qui permettent d'induire des pathologies proches de la PR et de la SEP. Le but à long terme de notre projet est de développer un électrostimulateur visant à traiter la PR et la SEP. Dans un premier temps, notre objectif sera d’évaluer l’impact de l’électrostimulation des certaines nerveuses sur un modèle simple d’inflammation afin d’optimiser les paramètre de stimulation électrique. Dans un second temps nous recherchons à évaluer l'effet de l'électrostimulation de ces nerfs sur le développement de la PR et de la SEP dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’arthrite rhumatoïde ni la sclérose en plaque. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds, non curatifs et qui génèrent de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre les maladies auto-immunes.
Procédures
La procédure 1 est une procédure chirurgicale terminale de moins de 3H sous anesthésie à l'isoflurane. Pour la procédure 2 : les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn. Une semaines après cette chirurgie les animaux recevrons une injection intrapéritonéale infra létale d'endotoxine bactérienne puis seront mis à mort 90mn après. Un prélèvement sanguin sous anesthésie est prévu 90mn après injection de LPS en fin de procédure. Pour la procédure 3 et 4 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn chacune. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront immunisés par injection d'adjuvant complet de Freund et d'une protéine (soit le collagène pour la procédure 3 soit la myéline pour la procédure 4) par voie sous-cutanée puis électrostimulés (ou non) selon différents protocoles pendant 21 jours au maximum à raison de 12, 6, 3 et 2 sessions d’électrosimulations de 2 mn par jour. Aucun prélèvement n’est prévu durant ces procédures.
Impact sur les animaux
La procédure 1 de ce projet est sans réveil. Les nuisances seront donc inexistantes pour cette procédure sous réserve du respect des bonnes pratiques d'anesthésie. Les autres procédures seront réalisées sur des animaux ayant subi une chirurgie ce qui générera les nuisances suivantes : - Douleur associér à l’injection sous cutanée d’analgésique préopératoire ; - stress lié à la phase d’induction de l’anesthésie (isolement de l’animal dans une boite d’anesthésie) et à la phase post-anesthésique dans la cage de réveil ; - une inflammation au niveau des plaies chirurgicales et de la zone d’implantation ; - perte de poids dans les 2 à 3 jours suivants la chirurgie. Par ailleurs pour les procédures 2, 3 et 4 une douleur sévère pourra être observée soit suite à l'induction d'une inflammation systèmique par injection de molécule bactérienne (procédure 2), soit suite à l'induction d'une inflammation des articulations (procédure 3), soit suite à l'induction d'une inflammation du système nerveux central (procédure 4). Enfin, les impulsions électriques quant à elles pourraient également induire un inconfort transitoire ou des douleurs chez l'animal lors de la procédure.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène d’inflammation par l’arthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et ne pouvant être étudié que chez l’animal, en intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un pré-requis à la phase de développement clinique.
Réduction
Pour la procédure 1, le nombre de paramètre d’électrostimuation possible étant quasiment infini et, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu’au maximum 381 souris seront nécessaires à cette procédure. Ce nombre total de souris représente un nombre maximum sachant que nous ne pourrons mettre en expérimentation que des lots de 10 animaux étant donné les contraintes spatiales de notre animalerie et que des bilans seront réalisés tous les 20 souris à partir de la 50ième souris. Ainsi, si 10 paramètres électriques satisfaisants sont trouvés (activation des fibres splénique sans modifier la pression artérielle) avant la fin de la procédure, nous interromprons les expérimentations pour le procédure 1 et passerons à la procédure 2 pour tester ces 10 paramètres. Pour les procédures 2, 3 et 4, nous avons déterminé le nombre d’animaux par une approche statistique reconnue. En effet, notre stratégie d’expérimentation reposant sur la comparaison entre scores cliniques des animaux électrostimulé ou non, le test de puissance réalisé avec le logiciel G*power 3.1 nous donne le nombre d’animaux minimal pour obtenir des résultats significatifs en fonction des hypothèses avancées.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). Une période d’acclimatation de 7 jours minimum aura lieu pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les chirurgies seront réalisées par du personnel ayant les compétences requises et les animaux seront sous anesthésie et analgésie ce qui évitera toute souffrance. Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués pour qu'il soit mis un terme à l'électrostimulation au plus tôt si des signes douloureux apparaissent. Les effets sur la le score clinique seront évalués sur un nombre d'animaux strictement suffisant pour évaluer les effets de l'électrostimulation à long terme (procédure 3 et 4). Enfin, des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux anesthésiés ou conscients et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du responsable de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce souris sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique sur l’inflammation sur ce modèle. Il est également utilisé car il existe des modèles bien établis des pathologies auto-immunes (arthrite rhumatoïde et encéphalite) induits par immunisation. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 10 semaines)
Effet sur la progression des leucémies aiguës myéloïdes en ciblant une molécule hyperactivée dans ce type de cancer du sang.
- Recherche appliquée
- Cancers
3 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal est irradié puis reçoit une greffe de cellules leucémiques, avec des prélèvements de sang répétés, parfois une ponction dans le fémur, et un traitement quotidien par gavage ou injection. Le porteur indique que la leucémie provoque, comme attendu, un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs et une prostration avant la mise à mort. L'étude vise une thérapie ciblant une enzyme dans la leucémie aiguë myéloïde, présentée comme une "ambition" d'être efficace et bien tolérée.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est la leucémie aiguë la plus fréquente chez l’adulte. Bien que des progrès récents aient permis de mieux comprendre les événements qui aboutissent au développement de ce cancer, ils n’ont pas conduit à une amélioration significative de la survie globale des patients. Le taux de survie à cinq ans est à ce jour de seulement 28,9 %. Contrairement aux patients atteints de LAM, la survie de ceux atteints d'autres types de leucémie, a été améliorée grâce à l'utilisation de substances ciblant des molécules spécifiques des cellules cancéreuses. Ces traitements que l'on appelle "thérapies ciblées" présentent généralement peu d’effets secondaires et peuvent donc être utilisés de manière chronique afin de contrôler la maladie sur le long terme. L’enzyme PI3Kgamma est une molécule particulièrement importante pour les cellules cancéreuses de LAM. Sa suppression par modification génétique ou par traitement médicamenteux entraîne une diminution de la prolifération des cellules cancéreuses. Le but de notre projet est de faire progresser notre compréhension sur le rôle de PI3Kgamma dans la survie des cellules de LAM afin de développer des traitements plus efficaces. Nous caractériserons dans un premier temps l'impact de l'élimination de PI3Kgamma sur la progression des cellules leucémiques murines et humaines dans des modèles murins dédiés. Dans un deuxième temps, nous travaillerons avec des chimistes pour développer des inhibiteurs spécifiques de PI3Kgamma. Ainsi, nous pourrons étudier la pertinence clinique du ciblage de PI3Kgamma, seul ou en combinaison avec des chimiothérapies déjà utilisées dans les LAM, pour améliorer le traitement de cette maladie. Nous utiliserons pour cela des modèles murins de LAM et des échantillons de patients atteints de LAM.
Bénéfices attendus
Nos travaux précliniques devraient permettre de mettre en évidence une nouvelle stratégie thérapeutique dans les LAM, grâce au développement d'une thérapie basée sur l’inhibition du marqueur PI3Kgamma. Ce nouveau traitement a pour ambition d'être à la fois efficace et bien toléré pour améliorer le pronostic des patients atteints de LAM.
Procédures
Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormi) seront tout d’abord préconditionnés par irradiation afin de remplacer les cellules normales de la moelle osseuse des souris par les cellules leucémiques qui seront injectées en une seule fois par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue (caudale). Au maximum deux prélèvements de sang par semaine au niveau de la veine de la joue (en mandibulaire) de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine seront réalisés pour évaluer la prise tumorale et obtenir du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang, nous ferons une ponction de cellules en intra-fémoral d’environ 5 minutes ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage, par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal, ou par la veine de la queue. Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il peut y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe, les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses. Dans le cas où le traitement testé améliore la survie des animaux, alors ceux-ci seront gardés en vie post-traitements et ils ne seront euthanasiés que lorsqu’ils présenteront plusieurs points limites cumulés.
Remplacement
Bien que certains modèles cellulaires manipulés in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de récapituler toutes les conditions pathologiques de croissance de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et d’établir d’une liste de différents points limites (un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie) qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé tous les 15 jours, 4 semaines après la greffe des cellules leucémiques permettent de recenser les différents points limites.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Rôle de modulateurs de l’expression de gènes dans la fibrose hépatique et la cicatrisation du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 053 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les groupes, chaque animal reçoit un régime gras, des injections répétées d'un agent qui provoque une fibrose du foie, une ligature chirurgicale de la voie biliaire ou l'ablation des deux tiers du foie. Le porteur indique que ces interventions peuvent causer douleurs post-opératoires, gêne à la mobilité et stress lié aux prélèvements. L'étude cherche des cibles thérapeutiques contre la fibrose du foie, pour laquelle il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la progression de la maladie.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie sont en constante augmentation en particulier la maladie du foie gras (encore appelée NASH) , souvent associée au diabète et à l’obésité, consécutive à notre sédentarité et à notre excès d’alimentation en graisses. La fibrose du foie est une cicatrice créée lorsque le foie est attaqué par des agents toxiques comme l’alcool ou la suralimentation en graisses. A terme, la fibrose aboutit à une cirrhose, son stade terminal. La cirrhose touche environ 200 000 personnes en France et ses complications sont sévères (cancer du foie). De plus, elle s’accompagne d’un blocage des capacités régénératives du foie. Il n’existe actuellement aucun traitement connu pour réduire la fibrose en dehors de l’arrêt de l’agent causal. Nous nous intéressons en particulier à l’inflammation qui est un mécanisme essentiel dans la progression de la maladie. Le projet spécifique qui fait l’objet de la présente demande est d’étudier le rôle de certains modulateurs de l’expression des gènes, au cours de la régénération du foie et de la mise en place et de la progression fibrose. Le but est de savoir si ces gènes modulateurs jouent un role sur la fibrose et la régénération. Nous allons tester les conséquences de l’inactivation de ces gènes sur la fibrose chez la souris, soit dans toutes les cellules de l’organisme soit spécifiquement dans certaines cellules du sang. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le développement de la fibrose et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques pour permettre la régénération du foie et la régression de la fibrose.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques de la fibrose du foie
Procédures
Les interventions visent à induire une cicatrice donc une fibrose ou une régénération du foie. Pour induire une fibrose et étudier sa régression, 3 différentes approches classiques seront entreprises : - régime gras pendant 10 semaines (induction de la fibrose) suivi d’une remise en régime normal pendant 2 semaines (procédure de régression de fibrose) - Injection répétée d’un agent fibrosant dans l’abdomen 2 fois par semaines pendant 6 semaines sur animaux vigiles (induction de la fibrose) suivi d’un arrêt des injections (procédure de régression de fibrose) - Ligature chirurgicale de la voie biliaire principale sous anesthésie générale et euthanasie après 2 semaines. L’intervention dure une dizaine de minutes. Pour induire une régénération hépatique qui est un processus normal, 2 procédures seront menées - injection unique d’un agent pharmacologique dans l’abdomen induisant une prolifération des cellules du foie - intervention chirurgicale sous anesthésie générale enlevant 2/3 (hépatectomie) du foie. Le foie dans ces conditions régénère complètement en une semaine sans jamais perdre sa fonction. L’intervention dure une quinzaine de minutes. Des prélèvements sanguins seront pratiqués soit sous anesthésie générale en fin de procédure, soit sur la queue sur animal vigile par ponction locale sur la veine latérale de la queue ne nécessitant pas d’anesthésie pour recueillir une goutte de sang dans un capillaire.
Impact sur les animaux
- Le régime gras peut induire une prise de poids avec une gene à la mobilité due à l'accumulation de graisse abdominale - Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner une douleur au point d'injection - Les interventions chirurgicales peuvent induire une douleur en post-opératoire et une irritation ou une inflammation au niveau de la cicatrice de laparotomie. Celles-ci seront atténuées par injection systématique d’analgésiques pré et post-opératoires. - Les prélèvements de sang répétés peuvent induire un stress - Un des modèles de souris utilisé est connu pour induire une prolifération des cellules sanguines s’apparentant à un cancer du sang qui débute uniquement après 6 mois et pas chez toutes les souris. En conséquence, toutes les procédures prévues interviendront avant l’apparition de la maladie, soit avant 6 mois. Les autres modèles ne sont pas connus pour donner d’effets indésirables particuliers
Devenir
euthanasie par une méthode réglementaire en fin de chaque procédure
Remplacement
La maladie du foie gras (NASH) et la fibrose sont des maladies chroniques du foie induite par une inflammation soutenue et un dialogue entre les différents types de cellules qui composent le foie. Les modèles animaux non vertébrés comme le nématode ou la drosophile ne présentent pas de " foie". Les organoïdes ou les sections de foie, qui représentent la structure miniature hépatique en 3 dimensions, ne modélisent pas la complexité du dialogue entre les différents types cellulaires et ne permettent pas d’étudier la régénération qui impliquent d’une part d’autres organes comme le tissu adipeux, l’intestin et son microbiote et d’autre part les interactions entre les cellules inflammatoires, et les principales cellules fonctionnelles du foie qui sont hétérogènes. Les modèles de culture cellulaire ne peuvent pas reproduire la dynamique de progression de la maladie chronique du foie de la fibrose à la cirrhose, de même que la régénération hépatique qui sont deux processus dynamiques. Enfin, nous disposons de modèles animaux permettant de comprendre le rôle de gènes dans un type cellulaire donné grâce à des invalidations conditionnelles, c’est à dire une inhibition de certains gènes limitée à certains types de cellules.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et valorisables ou publiables. Un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Selon notre expérience acquise sur des tests de prédiction antérieurs ainsi que ceux rapportés dans la littérature, 12 souris (expériences à court terme de 2 semaines au maximum) ou 20 souris (expériences de plus de 2 semaines) seront nécessaires par groupe pour obtenir une puissance statistique suffisante. Quand les expériences le permettent les mêmes animaux contrôles seront utilisés pour différentes lignées conditionnelles ou différents protocoles. Un seul prélèvement servira pour l’analyse de plusieurs paramètres (ARNs, protéines, marquages sur coupes de tissu).
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et l’angoisse des animaux, nous avons inclus dans les procédures des grilles d’observations et de score des animaux et de points limites détaillés et adaptés à chaque procédure qui serviront de support décisionnel. En particulier, l'administration d'antalgiques pré et post-opératoires sera systématique en cas d'intervention chirurgicale. Les animaux se réveillent sur une plaque chauffante et sont surveillés 6 heures en post-opératoire puis quotidiennement. Toute chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Les animaux seront placés dans des cages enrichies en bâtonnets en bois et en coton et seront suivis cliniquement par les expérimentateurs quotidiennement en cas de chirurgie et deux fois par semaine avec pesée des animaux pour les autres procédures. En cas d’obésité, le nombre d’animaux sera diminué par cage (3 animaux maximum au lieu de 5 habituellement). Ils seront également observés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie tout au long de la procédure. En cas d’atteinte d’un point limite, un antalgique sera administré, la surveillance sera quotidienne pour suivre l’évolution clinique, scorés et euthanasiés si le score limite indiqué dans les grilles détaillées est atteint.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris comme modèle car nous disposons d’outils permettant de casser un gène spécifiquement dans un type cellulaire donné et lorsqu’on le souhaite (modèle conditionnel). De plus, les outils nécessaires à l’analyse (anticorps, facteurs de croissance… ) adaptés à la souris sont facilement disponibles. Nous travaillerons uniquement sur des souris adultes majoritairement mâles et femelles entre 8 à 24 semaines (fin de procédure), car nous souhaitons mimer la fibrose chez l’homme qui se développe chez l’adulte
Caracterisation pharmacocinetique d’une molecule innovante administree par les voies intraveineuse, intraperitoneale et orale chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit le composé étudié puis un mélange anesthésiant avant la mise à mort et le prélèvement d'urine, de sang et d'organes, pour décrire le devenir d'un candidat médicament contre le glioblastome dans l'organisme. Le porteur indique un stress et une douleur légère de courte durée lors des administrations. L'étude sert à déterminer la meilleure voie d'administration, l'efficacité antitumorale ayant déjà été testée dans des greffes antérieures.
Objectifs
Depuis plusieurs années, nous développons une molécule innovante pour le traitement d'une forme très agressive et incurable de cancer du cerveau, le glioblastome. Son efficacité anti tumorale a été mise en évidence dans des souris chez lesquelles nous avions greffé des cellules cancéreuses provenant de patients. La demande actuelle a pour objectif d'identifier les caractéristiques pharmacocinétiques de ce candidat médicament dans le modèle murin selon différents modes d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer la manière dont le candidat médicament se distribue dans l'organisme, la vitesse à laquelle il est éliminé ainsi que le mode d'administration le mieux adapté. Ces caractéristiques sont importantes pour optimiser le traitement contre un type de tumeur cérébrale chez l'humain.
Procédures
Chaque animal subira deux gestes techniques qui conduiront à l'administration du composé étudié puis d'un mélage analgésique et anesthésiant. Ces gestes ne dureront pas plus de quelques dizaine de secondes. La mise à mort sera donnée sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
La molécule innovante a fait l'objet d'études préalables de toxicité aïgue et chronique. A la dose utilisée, aucun effet indésirable n'a été observé. Chaque animal aura toutefois à subir un stress et une douleur légère de courte durée lors de l'administration du composé à l'étude et du mélange analgésique et anesthésiant. La mise à mort sera donnée sans réveil préalable.
Devenir
La procédure comporte le prélèvement de l'urine, du sang et des organes. Les animaux seront donc mis à mort.
Remplacement
Au cours du développement du projet, nous avons utilisé des modèles cellulaires in vitro 2D et 3D pour optimiser la concentration efficace et déterminer la gamme de toxicité du principe actif.
Réduction
Le design expérimental en pharmacocinétique est variable. Nous avons choisi de limiter le nombre d'animaux nécessaires à l'étude en adoptant comme comparateur un groupe unique de souris traitées par du sérum physiologique et identifié t=0. Cela a permis de réduire de moitié le nombre d'individus. Les réplicats biologiques pour chaque temps de la cinétique ont été limités à trois individus. Un test de student sera utilisé pour vérifier la réalité statistique dans et entre chaques groupes expérimentaux.
Raffinement
Pendant le temps de la procédure expérimentale, les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Nous apporterons un soin particulier lors de l'acclimentation à habituer les animaux à la présence de l'expérimenteur et à être manipulés (contention). Ainsi le niveau de stress sera diminué lors de la procédure. De plus, la prise en compte de point limite et l'utilisation d'analgésique permettra de prévenir l'appartition de toute souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
A ce stade du développement pré-clinique du médicament, la souris est le modèle de référence le plus proche de l'humain pour obtenir les résultats nécessaires. La pathologie visée affecte les adultes. Aussi nous utiliserons des souris adultes (2 mois)