Souris
role du controle qualité des proteines mitochondriales dans le métabolisme hépatique et cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
208 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection dans la veine de la queue, suivie de séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être mis à mort pour prélever le foie et le cœur. Le projet étudie une voie de contrôle des protéines mitochondriales sur des souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas de méthode alternative" et que la souris est le seul modèle porteur d'une déficience pour sa protéine d'intérêt.
Objectifs
La mitochondrie est un organite intracellulaire semi-autonome qui est impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques essentielles comprenant entre autres, la production d'énergie, la régulation du stress oxydatif et la mort cellulaire programmée. Les dysfonctions mitochondriales sont responsables de plus de 120 syndromes. Ces pathologies sévères sont classées dans les maladies rares. Les fonctions mitochondriales reposent sur un protéome de 1500 protéines environ. Chez les mammifères, plus de 99 % des protéines mitochondriales sont synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseurs qui sont ensuite importés dans l'organite. La qualité de ces protéines néosynthétisées représente un enjeu crucial permettant d’éviter l'accumulation de protéines défectueuses dans l'organite et ainsi prévenir les dysfonctions mitochondriale. A ce jour, on ignore encore comment le contrôle qualité de ces précurseurs protéiques mitochondriaux est assuré avant leur import dans l'organite. Récemment, en utilisant des modèles cellulaires nous avons mis en évidence qu'une E3 ubiquitin ligase, FBXL6, est indispensable pour ce processus de contrôle qualité des protéines nouvellement synthétisées ou naissantes. L'objectif de notre projet est d'étudier les conséquences physiopathologiques de l’invalidation de cette voie sur contrôle qualité des protéines mitochondriales dans deux tissues, le foie et le coeur. Pour cela nous utiliserons un modèle de souris KO pour la E3 ubiquitine ligase.
Bénéfices attendus
La mitochondrie est une organelle intracellulaire jouant un rôle central dans plusieurs fonctions cellulaires et tissulaires. Entre autres, ces organelles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares sévères caractérisés par des perturbations généralisées du métabolisme (acidose lactique, obésité, déficits énergétique ...), encéphalopathie, cardiomyopathie etc... A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Notre projet vise à améliorer les connaissances concernant ces pathologies et réveler des nouvelles cibles therapeutiques pour ces pathologies.
Procédures
Pour chaque animal, une injection sera réalisée dans la veine de la queue grâce à une seringue. Cette étape durera moins d’une minute. Un premier groupe d’animaux sera analysé en imagerie à 1, 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Ces animaux seront anesthésiés par voies respiratoires, puis soumis à une injection par voie intrapéritonéale et enfin placé dans une chambre d’imagerie. La durée totale de cette approche est d’environ 15 min par animal et répétée, donc, à 1, 4 et 8 semaines post injection. En parallèle, deux groupes seront sacrifiés successivement, à 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Nous prélèverons les tissus d’intérêt et cette étape durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Notre procédure nécessite une l’injection intraveineuse dans la veine de la queue susceptible d’entrainer une douleur transitoire. Cette procédure est très rapide (
Devenir
Tous les animaux, incluant les animaux atteignant les points limites seront mis à mort, à des fins d’ analyses, conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'homme. Nos recherches préalables menées sur des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, ont permis d’obtenir un certain nombre de résultats et nous permettent de cibler/restreindre précisément les recherches à mener sur l’animal. En revanche, ces modèles ne peuvent pas reconstituer la complexité de la régulation des fonctions mitochondriales et de leurs conséquences physiopathologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 et les expériences seront répétées à deux reprises. Les tests statistiques afin de comparer les groupes d’animaux seront non paramétriques. Dans un premier temps, un test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test post-hoc de comparaisons multiples. Nous utilisons les souris males et femelles pour notre projet. De plus, nos études préliminaires réalisées sur des modèles complémentaires ont permis de réduire notre étude in vivo à une partie congrue.
Raffinement
1-Hebergement : Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique: - coton dentaire, que les souris dépiautent pour se faire un nid. -des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les injections intraveineuses sont réalisées sur des animaux par un personnel dument formé. Un suivi quotidien des animaux est réalisés post injection afin d’anticiper des éventuels inconforts et douleurs. En cas d’inflammation lors des 24h après la procédure, nous injecterons une dose d’anti-inflammatoire non-steroidien en sous-cutanée. 5. Les points limites : Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant. Les animaux présentant des signes moteurs anormaux après les injections, au réveil après l’anesthésie et l’imagerie seront observés de près et si aucune amélioration observée après 24h, ils seront euthanasiés. Les animaux ayant une perte de poids de plus de 20 % ou présentant des signes tels que piloérection, déshydratation, dos voûté, prostration, isolement pendant plus de 24h jour, seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utiliserons les souris adultes pour cette expérimentation. L’âge adulte correspond au stade durant lequel les effets biologiques que nous analysons sont modifiés. Par ailleurs, nous utilisons la souris car il s’agit de l’unique modèle animal existant présentant une déficience pour notre protéine d’intérêt.
Rôle de la sumoylation de la protéine du X-Fragile (FMRP) dans la communication neuronale normale et pathologique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 805 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. De jeunes femelles reçoivent des injections hormonales pour provoquer une superovulation, sont accouplées, puis mises à mort au 15e jour de gestation pour prélever les embryons, eux aussi tués pour cultiver leurs neurones. Les mâles reproducteurs sont tués à 35 semaines, jugés "trop âgés" pour les accouplements. Le porteur affirme que la culture de neurones à partir d'embryons reste une approche "indispensable" et "inévitable" pour le projet.
Objectifs
Le projet que nous menons utilise le modèle animal souris, et fait partie intégrante de la thématique du laboratoire. Il vise à améliorer les connaissances sur les fonctions neuronales de la sumoylation. Ce projet correspond également à une demande de renouvellement d’autorisation de projet utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
La superovulation (SOP) fait intervenir les procédures appropriées pour l'amorçage hormonal des souris femelles. L'amorçage hormonal est utilisé pour induire une superovulation, augmentant ainsi le nombre et la probabilité d'embryons fécondés dans les accouplements programmés. Ces travaux fournissent des incations sur le role de la SUMOylation dans des modeles animaux de maladies caracterisées par un dysfonctionnement synaptique. Ces données forniront des informations sur les stratégies susceptibles de déboucher sur des cibles ayant des objectifs thérapeutiques.
Procédures
De jeunes souris femelles, âgées de 4 à 6 semaines, sont traitées avec des hormones afin d'induire un développement folliculaire et une ovulation accrue. Deux hormones sont injectées par voie intrapéritonéale (IP) à intervalles réguliers avant l'accouplement de la femelle avec un mâle reproducteur éprouvé. Le but est la mise en accouplement des animaux en vue de produire des embryons nécessaires à des cultures de neurones dissociés pour des études in vitro.
Impact sur les animaux
Pourcentage approximatif de morbidité et de mortalité possibles en raison de la procédure décrite, y compris les causes probables et la façon dont elles seront traitées. La procédure d’injection intrapéritonéale utilisée pour l’amorçage hormonal des femelles donneuses d’embryons est bien documentée avec très peu de problèmes cliniques signalés. Nous prévoyons une très bonne tolérance des femelles donneuses à l’amorçage hormonal, avec moins de 1% de morbidité et de mortalité.
Devenir
Toutes les femelles gestantes seront mise à mort afin de prélever les embryons à E15 qui seront mis à mort afin de prélever les cerveaux. La mise à mort des géniteurs sera réalisée au bout de 35 semaines, car ils seront trop agés pour les accouplements.
Remplacement
Les neurones sont des cellules différenciées et complexes et qui ne se divisent pas, ceci leur donne une particularité physiologique unique. En l’absence de lignée cellulaire permettant d’adopter la complexité neuronale, l’utilisation de cultures primaires de neurones reste à ce jour inévitable. Le système de culture primaire de neurones que nous utilisons est standard et utilisé par tous les groupes de recherche à travers le monde. Ainsi, la culture primaire de neurones (réalisée à partir d’embryons de souris à 15 jours embryonnaires) reste une approche protocolaire indispensable pour la réalisation de notre projet. Elle constitue le meilleur système pour permettre la visualisation en temps réel des mouvements des protéines le long des prolongements du neurone, pour enregistrer électrophysiologiquement leur activité ce qui ne peut être réalisé dans des cultures de cellules immortalisées.
Réduction
En utilisant la technique SOP, nous pouvons réduire le nombre d’animaux lors de l’accouplement, il est necessqire de mettre en accouplememt uniquemt 1 femelle avec 1 male. La technique garantit 95% de probabilité de gestation sur 24h d’accouplement. La SOP nous permet de garantir une gestation sur une même durée d’accouplement et sur moins de femelles. Ce qui conduit a une reduction du nombre danimaux utilise.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés dans un local à température contrôlée. Les souris auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maîtrisant la technique, en prenant soin d’alterner chaque jour le site d’injection (cadran inférieur gauche et droit de l’abdomen). Les femelles en gestation seront également surveillés quotidiennement, afin de détecter tout signe de souffrance inopinée.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions normale et pathologique. En effet, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. De plus, l’homologue murin du gène FMR1 Humain a été manipulé pour générer des modèles animaux présentant des phénotypes très similaires à ceux observés chez les patients X-fragiles notamment au niveau de la morphologie neuronale et du comportement ce qui en font des modèles de choix de la maladie, mais aussi des modèles indispensables pour étudier et mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette pathologie. Les femelles gestantes souris (entre 3 et 6 mois) seront mise à mort au début du le 3ème tiers de la gestation (E15 pour la souris ). Les mâles reproducteurs maintenus pour générer des femelles gestantes, seront mis à mort à 12 mois. Les embryons seront mis à mort à 15 jours embryonnaires, afin de pouvoir faire des cultures primaires de neurones d’hippocampe et de cortex pouvant répondre au mieux aux exigences et aux contraintes de l’expérimentation. Ces protocoles de culture sont bien établis dans notre Centre de Recherche et sont les plus adaptés pour ce type de projet, ils font également objet de publication.
Modèle de cancer pancréatique par greffe orthotopique : mise au point et études d’efficacité
- Recherche appliquée
- Cancers
1 200 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur met au point une greffe de cellules de cancer du pancréas directement dans le pancréas, par chirurgie abdominale ou par injection échoguidée, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins répétés. Les souris sont euthanasiées lorsque la tumeur approche 1 500 mm3 ou en fin d'étude, pour prélever sang, tumeur et organes. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reconstituer in vitro les interactions de la tumeur avec son microenvironnement.
Objectifs
Le pancréas est un organe localisé à l’arrière de l’estomac. Il contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. Parmi les différents types de cancer du pancréas, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP), qui se développe dans le compartiment exocrine, représente 90-95% des cancers pancréatiques. L’ACP est un cancer très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (et seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les traitements classiques de l’ACP sont la chirurgie qui permet de retirer la partie tumorale tout en conservant la partie saine du pancréas, la chimiothérapie et l’irradiation, mais ces traitements ne permettent pas d’améliorer significativement les résultats cliniques. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs pour déterminer leur efficacité anti-tumorale. Les modèles les plus couramment utilisés sont des modèles de greffes de cellules tumorales sous la peau des souris. Mais ils ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral qui peut constituer une barrière physique aux traitements. La greffe de cellules tumorales pancréatiques directement dans le pancréas, (greffe orthotopique pancréatique), permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée d’intérêt pour la recherche de nouveaux traitements. Ce projet vise à mettre au point des techniques de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique chez la souris via une méthode dite classique de chirurgie ainsi que par une méthode d’échoguidage non invasive – les deux techniques seront réalisées en différents sites du pancréas pour déterminer quelle approche permet de générer un modèle le plus ressemblant à la tumeur humaine. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée.
Bénéfices attendus
Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre de l’ACP sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris immunocompétentes permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Bien que l’approche de la greffe orthotopique au niveau de la queue du pancréas soit la plus décrite, nous allons mettre au point l’injection orthotopique dans la tête du pancréas. En effet, ce site d’injection, bien que moins simple d’un point de vue de l’approche chirurgicale, est plus relevant scientifiquement vis-à-vis de la pathologie humaine. De plus, la greffe orthotopique dans le pancréas nécessite un acte de chirurgie dont nous allons essayer de nous affranchir par la mise en place d’une approche d’implantation per cutanée échoguidée. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la progression tumorale au cours des études permet de raffiner l’utilisation des animaux en les incluant progressivement dans l’étude. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme. Ce projet vise également à développer si possible ce modèle avec une méthode non chirurgicale moins invasive afin de favoriser le bien-être animal.
Procédures
- Puçage : afin d’identifier chaque animal, un dispositif sous cutané est implanté en vigile par trocart quelques jours avant l’étude (environ 10 secondes/souris) - Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Echoguidage sous anesthésie gazeuse pour l’implantation de cellules tumorales dans le pancréas : cette procédure sera réalisée une seule fois sur l’animal et durera 10-15minutes. - Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite de la chirurgie (7 à 10 jours), à raison de 1 mesure échographique par semaine. La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris et la mesure se fera sur une durée maximale de 8 semaines - « Microsampling » : prélèvements de sang, en cinétique, à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de marqueurs caractéristiques de la cachexie) (environ 20 secondes/souris) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction cardiaque.
Impact sur les animaux
-Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de de la mesure de la composition corporelle -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de l’administration des traitements en quotidien ou biquotidien ou triquotidien, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration) -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors des prélèvements sanguins par microsampling d’environ 20 secondes /souris -Douleur très légère lié à la piqûre lors des prélèvements sanguins par microsampling -Douleur légère due à la pathologie et possiblement associée à une perte de poids et/ou formation d’ascite et/ou cachexie -Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen
Devenir
Lorsque le volume tumoral total est proche de 1500 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.
Remplacement
Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, fournissant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.
Réduction
- Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la capacité des designs de ces études à l’aide d’un test statistique. Un modèle statistique longitudinal sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. - Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. - Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris mortes issues d’autres projets afin de maitriser les voies d’abords et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur afin de réduire le nombre d’animaux - Afin d’inclure toutes les souris greffées dans les études, nous utiliserons l’échographie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure avec un volume tumoral similaire ainsi le taux d’inclusion sera maximisé. - Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés maximum 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.
Raffinement
- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. - La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie - L’analgésie post-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. - Une seconde méthode de greffe orthotopique « non chirurgicale » par échoguidage percutané sera évaluée, ceci en vue de s’affranchir de douleurs opératoires et réduire les risques de pertes lors de la chirurgie. L’implantation cellulaire s’effectuera sous échographie par injection échoguidée en percutanée ne nécessitant pas de pré ou post médication. Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sur des souris anesthésiées à l’isoflurane. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 1500 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. - La cachexie, signe clinique associé à la progression tumorale du cancer du pancréas, sera suivie via l’établissement d’une grille de scoring. La prise alimentaire, l’activité générale, la mesure de la composition corporelle par scanner non invasif EchoMRI (pourcentage de masse grasse, masse maigre et eau totale), de paramètres métaboliques (albumine, triglycérides) et hématologiques seront monitorés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.
Traitement de la polyarthrite rhumatoïde par inhalation de la peptidyl arginine deiminase
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dix-sept interventions, dont trois injections d'une protéine avec adjuvant, sept anesthésies gazeuses, quatre prélèvements de sang et trois inhalations, pour tester un traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les souris sont ensuite mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme qu'un "modèle murin est nécessaire" et que les cultures in vitro ou les organoïdes ne reconstituent pas tous les acteurs du système immunitaire.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Notre laboratoire a identifié la protéine (PAD4) responsable de la production des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde. Un nouveau traitement pour bloquer la réponse immunitaire contre la protéine PAD4 sera utile pour traiter la polyarthrite.
Bénéfices attendus
Développer un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Cette maladie bénéficie de traitements qui traitent les conséquences de la maladie (l'inflammation) mais pas la cause principale qui est la production d'autoanticorps.
Procédures
17 interventions : 3 injections de la protéine ou de la solution saline pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute
Impact sur les animaux
3 injections de la protéine ou de la solution saline avec l’adjuvant complet et incomplet pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute.
Devenir
Les 180 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.
Remplacement
L’objectif de cette demande est de tester l’effet d’un traitement qui pourra être utilisé chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde pour bloquer la production des autoanticorps. Chez les patients, il est difficile d’analyser les autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Un modèle murin est nécessaire car il permet d’induire les autoanticorps afin de comprendre comment ils sont produits et de développer des traitements pour bloquer leur production. D’autres alternatives à l’expérimentation animale comme la culture de cellules in vitro ou des organoides ne permettent pas de reconstituer tous les acteurs du système immunitaire pour analyser les mécanismes de production des autoanticorps et tester les effets d’un traitement.
Réduction
Nous allons suivre pendant 50 jours l’effet de la protéine PAD4 sur des souris de deux fonds génétiques différents. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Le nombre total de souris sera 180.
Raffinement
Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera réalisée pour chaque inhalation (3 par souris) et chaque prélèvement de sang dans la veine mandibulaire (4 prélèvements par souris) pour analyser leur sérologie. Les souris seront mises à mort pour analyser leur réponse lymphocytaire. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens deux fois par semaine. Les effets des procédures seront suivis selon une grille d’évaluation de la souffrance qui combine l’apparence générale, le comportement, la locomotion et les signes neurologiques des souris. Si une souffrance est observée, elle sera chiffrée par une grille de score. L’injection d’analgésiques sera faite si besoin. Chaque cage contenant au maximum 4 souris sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole.
Choix des espèces
Nous allons choisir les souris en fonction des facteurs de risque connus chez les patients atteints de la polyarthrite. Nous voulons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite touche l’homme ou la femme adulte, des femelles car la production d’autoanticorps est meilleure que chez les males, des souris qui ont certains gènes à risque de développer une arthrite. Nous allons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite rhumatoïde touche l’homme ou la femme adulte. Nous allons utiliser des souris agées de 6 semaines.
Rôle, impact et modulation des cellules myéloïdes immunosuppressives dans les cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 570 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales dans la glande mammaire ou le poumon, puis des injections d'hormonothérapie, de facteurs de croissance ou de lymphocytes, pour étudier des cellules immunitaires qui favorisent les cancers. La croissance tumorale provoque une asthénie et les souris sont tuées par dislocation cervicale avant d'atteindre les points limites, pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système in vitro ni non-vertébré ne peut mimer ces interactions immunitaires.
Objectifs
Le système immunitaire protège généralement contre l'apparition des cancers. Cependant, dans certains cas, les cancers peuvent échapper à protection par le système immunitaire. Des cellules immunitaires particulières, appelées « cellules myéloïdes suppressives (CMS) » contribuent à cet échappement. Ces cellules sont en partie responsables du manque d’efficacité des immunothérapies chez de nombreux patients. De nombreux sous-types de CMS ont été décrites, ce qui rend leur identification problématique. En dehors de leur capacité à bloquer le système immunitaire, les CMS participent à la mise en place de vaisseaux sanguins dans les tumeurs ou au processus métastatique. La notion que ces cellules pourraient s’associer avec les cellules tumorales circulantes (cellules tumorales présentes dans le sang, migrant depuis la tumeur primaire vers des sites distants métastatiques) est un concept récent sur lequel notre laboratoire travaille activement. Ce projet a pour objectifs de caractériser l’influence des CMS sur l’immunité anti-tumorale, la préparation des sites pré-métastatiques et la réponse aux thérapies en utilisant des modèles de cancer murins établis, représentatifs de cancers humains et avec lesquels notre équipe a précédemment publié. Les objectifs principaux sont les suivants : 1) Déterminer la cinétique d’apparition de différentes sous-types de CMS dans différents organes au cours du développement tumoral. En parallèle, une caractérisation précise d’amas cellulaires associant cellules tumorales et cellules immunitaires (dont ces CMS) dans le sang sera réalisée. 2) Déterminer l’influence de sous-types distincts de CMS sur l’apparition de micro-métastases dans des organes distaux ; 3) Evaluer si l’hormonothérapie, des facteurs de croissance ou des chimiothérapies utilisées dans le traitement de nombreux cancers modifient le nombre et les fonctions de ces cellules dans un modèle de cancer mammaire et pulmonaire ; 4) Evaluer le rôle de ces cellules dans la réponse aux immunothérapies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des informations nouvelles concernant les multiples rôles des cellules myéloides suppressives dans les cancers. 1) Les données obtenues devraient d'abord permettre de mieux définir les fonctions protumorales de sous-populations différentes de cellules myéloides suppressives. 2) de nouveaux résultats devraient être générés concernant la capacité de ces cellules à préparer les organes situés à distance de la tumeur primaire à l'arrivée de cellules tumorales migrantes (métastatiques). 3) Enfin, ces travaux apporteront des informations essentielles sur l’impact de l’hormonothérapie et de facteurs de croissance (utilisés cliniquement pour prévenir les risques d'infection) sur les différentes sous-populations myéloïdes et le développement tumoral.
Procédures
Model de souris de cancer du sein : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Model de cancer du poumon : injection intrapulmonaires de cellules tumorales (~2min). Des injections intrahépatiques, intraspléniques et intrapulmonaires de cellules myéloïdes seront effectuées (
Impact sur les animaux
Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la préhension et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une asthénie générales. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puis les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux.
Devenir
A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires
Remplacement
L'utilisation de modèles de souris de cancers est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives: en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permet pas la génération de résultats interprétables puisque ne prenant pas en compte les multiples interactions cellulaires et facteurs solubles jouant un rôle à distance dans l'organisme impliqués dans la régulation du système immunitaire. Il n'est pas possible de mimer in vitro les influences réciproque entre les très nombreuses populations de cellules présentes in vivo. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules myéloïdes suppressives in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs lorsque possible les groupes contrôles seront communs à différentes expériences. Les animaux sont hébergés e à raison de 5 souris par cage. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu.
Raffinement
La procédure majeure commune à toutes les expériences proposése consiste en l’implantation orthotopique de cellules tumorales syngénéiques. Cette procédure est largement reconnue et adaptée à l’étude des cancers in vivo. Elle présente les avantages suivants : • une mise en œuvre aisée ne nécessitant pas d’acte chirurgical. • un suivi longitudinal simple donc sans manipulation engendrant une douleur ou un stress important de l’animal D’un point de vue éthique cette méthode permet de : • restreindre le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal. En effet il n'y aura pas besoin de mettre à mort des animaux pour obtenir le suivi de points intermédiaires dans l'évolution tumorale, tout sera fait sur les mêmes animaux qui iront jusqu'au point final avant d'être mis à mort. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. Les animaux seront anesthésiés comme indiqué lorsque requis, lors de procédures spécifiques.
Choix des espèces
Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle (limité a des endpoints partiels, au niveau du compartiment sanguin). L'impact du microenvironnement tumoral sur le système immunitaire, et les modifications dynamiques de la fonction et du phénotype des cellules immunitaires étudiées sont impossibles éthiquement et techniquement à mettre en évidence chez l'homme. L'étude chez la souris (6-8 semaines) est la seule approche permettant une analyse spatio-temporelle de la régulation des réponses immunitaires antitumorales. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro (absence des complexes réseaux d'interraction cellulaire et cytokinique régulant l'immunité antitumorale) et sans l'utilisation de souris immunodéficientes. Des systèmes non-vertébrés ne sont en outre pas adaptés puisque ne possèdant pas de système immunitaire équivalent à celui des mammifères. La souris comme animal modèle est Sources: PubMed, CEVMA.
Evaluation de l’efficacité d’un nouveau traitement dans un gliome pédiatrique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe des cellules tumorales dans le tronc cérébral au deuxième jour après la naissance, puis suit la croissance de la tumeur sous anesthésie trois fois par semaine et administre des agents anticancéreux, pour un cancer pédiatrique incurable. Les souris sont euthanasiées pour prélever et analyser les tumeurs cérébrales. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité de la tumeur in vivo.
Objectifs
Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Nos études récentes ont mis en évidence une nouvelle combinaison de deux composés chimiques validée chez la souris, mais nos données sur les lignées cellulaires montrent que certaines cellules tumorales résistent à ce traitement en se transformant en cellules souches tumorales. Le projet vise à mieux comprendre ce phénomène afin d’optimiser l’efficacité de notre combinaison médicamenteuse. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux drogues et de la combinaison sur la pourcentage de cellules souches cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.
Bénéfices attendus
Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seules ou en association, sur la proportion de cellules souches tumorales aau sein des tumeurs. Mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs continuent de se développer en présence de ces composés, même si elles se développent moins vite que les tumeurs chez les souris contrôles.
Procédures
Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress termique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.
Devenir
Les 120 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.
Réduction
Nos effectifs seront déterminés de façon adéquate et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
AMENDEMENT : Rôle des lymphocytes T non conventionnels dans des modèles murins de diabète de type 1
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
6 194 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection virale intra-péritonéale, un transfert de flore intestinale par gavage d'eau fécale et un suivi de glycémie, pour étudier le rôle de certains lymphocytes dans le diabète de type 1. Les souris devenues diabétiques développent une hyperglycémie et sont mises à mort dans les huit jours suivant sa détection, puis disséquées pour l'analyse du pancréas, du foie et de l'intestin. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" parce que ces cellules immunitaires ne s'étudient pas in vitro.
Objectifs
Notre projet porte sur le rôle des lymphocytes T non conventionnels dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune qui se caractérise par la destruction des cellules productrices d’insuline par le système immunitaire. Les cellules immunitaires infiltrent les îlots pancréatiques en déclenchant une inflammation qui aboutit à la destruction des cellules productrices d’insuline principalement par des lymphocytes T auto-réactifs. Cependant, les mécanismes de recrutement et d’activation de ces cellules par les îlots ne sont pas encore connus. Certaines infections virales et le microbiote sont impliqués dans la destruction des cellules productrices d’insuline mais aussi dans les altérations intestinales dont souffrent les malades atteints d’un diabète de type 1. Les lymphocytes T invariants associés aux muqueuses sont fortement perturbés chez les enfants et les modèles murins à l’apparition du diabète. De manière intéressante, ces cellules répondent à la fois face au microbiote, mais également aux infections virales.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes d'action par lesquels les cellules MAIT participent à l'apparition du diabète de type 1 et des complications associées aux infections virales.
Procédures
L'infection virale est induite par une injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Les différents traitements de molécules inhibitrices sont réalisés par injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Le transfert de flore intestinale est réalisé par gavage d'eau fécale (durée 1 minute). Certains animaux subirons une anesthésie de 5 minutes pour permettre une injection intraveineuse pour limiter le stress. Pour le suivi de la glycémie, une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent développer une hyperglycémie, mais cette hyperglycémie reste modérée car les animaux sont suivis quotidiennement et sacrifiés dans les huit jours après la détection d'une hyperglycémie. L'infection virale peut induire un état fébril modéré et transitoire. Les injections intra-péritonéales ainsi que la mesure de la glycémie sont une nuisance pour l'animal.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses des tissus implliqués dans le diabète (pancréas, foie, intestins) : histologie, cellules immunes présentes dans les tissus, cytokines.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas et l'analyse de leurs interactions dans l’organisme au cours du développement de la maladie ne peut être faite in vitro. Néanmoins ce projet est associé à de multiples manipulations in vitro visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.
Réduction
Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisés in vivo pour valider ces donnés est calculé sur la base d'un plan expérimentale stéréotypé permettant d'obtenir la puissance statistique nécéssaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Notre stratégie vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant des tests staistiques appropriés à chaque procédure expérimentale, de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. De plus, en amont des procédures expérimentales, des expériences in vitro seront réalisées afin de mieux sélectionner les échantillons à tester in vivo. Chaque procédure fait l'objet d'analyses complètes qui permettent d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants et un panel large d’informations.
Raffinement
Pour chacune de ces procédures, le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement (maison et coton) est ajouté dans leurs cages de façon systématique. L’expertise des responsables de projet avec les procédures permet également de limiter le stress et l’inconfort des animaux. Pour les procédures necessitant une injection par intraveineuse, les souris subirons une anesthésie isoflurane d'une durée de 5 minutes. Toute souris diagnostiquée diabétique aura une attention plus poussée ainsi qu’un change de biberon d’eau et de litière plus fréquent. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les procédures expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Le modèle murin du diabète de type 1 est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : -Sa physiopathologie est très proche de la maladie humaine avec notamment une destruction auto-immune progressive des cellules productrices d’insuline de manière spontanée; -Ce modèle est une souris, ce qui permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour pouvoir isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie ; -Le système immunitaire de la souris est très proche de l’homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune, et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines d’âge (jeunes adultes), stade auquel on observe les premières anomalies du système immunitaire chez ce modèle de souris. AMENDEMENT : Les souris sous fond B6 permettent de déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections virales au delà du diabète.
Impératifs d’Élevage (génotypage et isolement) dans le cadre de projets de recherche chez le rongeur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 2560
45 260 souris et rats vont être utilisé·es, la grande majorité tuée à l'issue et 500 souris réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces animaux forment des lignées élevées pour fournir leurs tissus après mise à mort à des équipes de neurosciences travaillant sur Parkinson, Alzheimer ou la schizophrénie. Chaque petit subit un prélèvement de l'extrémité de la queue à 10 jours pour le génotypage, et certains mâles peuvent être isolés jusqu'à six mois pour caler les dates d'accouplement. Le porteur affirme que l'expérimentation animale est "nécessaire" en neurosciences et que ces techniques d'élevage couvrent les "besoins" des chercheurs.
Objectifs
Cette demande couvrira les lignées élevées pour l’utilisation de leurs tissus en post-mortem dans le cadre de projets en neurosciences pour réaliser des cultures, du développement de lignées cellulaires, d’organoïdes…. Les recherches associées à l’établissement utilisateur portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur pour développer nos connaissances sur le sujet et trouver des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Nous produirons des modèles pour nos équipes de recherche avec des caractéristiques génotypiques précises.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont d’apporter des modèles animaux (souris et rats) à nos équipes de recherche possédant le bon génotype et au bon stade de développement de manière, à ce que les connaissances progressent en neurosciences, et qu’in fine de nouveaux axes thérapeutiques puissent émerger, pour améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies neurodégénératives, troubles autistiques, dépressions qui sont au cœur des recherches menées dans notre établissement utilisateur.
Procédures
Il y aura la réalisation d’un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours, période où l’animal est moins sensible à la douleur et cicatrise rapidement. Cet acte n'est réalisé qu’une seule fois et dure environ 1 minute par animal. Rarement un reprélevement à l’oreille ou sanguin (1 seule fois, moins d’une minute) aura lieu sur un animal adulte si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal. Chez le Rat, ce prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie pour faciliter la manipulation de l’animal. Dans le cadre de mise en accouplement pour obtenir des souriceaux à des dates précises, certaines souris mâles pourraient être isolées de manière intermittente et pour une durée de 6 mois maximum avec une mise en accouplement au minimum une fois toutes les deux semaines.
Impact sur les animaux
Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage (ou du pavillon de l’oreille chez les souris adulte). L’identification et le prélèvement pour génotypage ont lieu au même moment. Dans les rares cas où le prélèvement sanguin sera préféré pour vérifier le génotypage, il y aura une légère douleur à la piqure, un risque d’hématome ou de saignement sur le site de prélèvement (veine sous mandibulaire (souris) ou saphène externe (Rat)). Chez le Rat, le prélèvement sanguin est réalisé sous anesthésie avec les risques inhérents à celle-ci (hypothermie, dépression cardio-respiatoire, recouvrement de la vigilance). Lors de l’isolement, les souris mâles qui sont des animaux grégaires, peuvent ressentir du stress.
Devenir
Exception faite des animaux n’ayant pas un génotype d’intérêt qui pourraient être inclus pour de la formation aux gestes techniques dans un projet autorisé dans notre animalerie, tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure : les reproducteurs sont maintenus pour un temps donné, et les animaux produits sont euthanasiés pour des raisons expérimentales pour permettre l’analyse de leurs tissus ou la culture cellulaire en utilisant les prélèvements réalisés en post-mortem. Il n’y aura pas d’utilisation continue de ces animaux en les incluant par la suite dans d’autres projets de recherche.
Remplacement
Malgré l’élaboration de projets in vitro en amont, l’utilisation d’animaux utilisés à des fins scientifique est nécessaire dans de nombreux projets de recherche en Neurosciences. De plus, les techniques d’isolement et de prélèvement sont nécessaires à la production d’animaux pour couvrir les besoins des chercheurs. L’utilisation des animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet car ils sont à la base de travaux sur tissus ou la production de lignées cellulaires sur lesquels pourront être réalisés un bon nombre d’expériences.
Réduction
Le maintien de 32 lignées différentes (souris et rats confondus) sera nécessaire pour répondre à l’ensemble des projets de recherche. D’après le cumul du nombre d’animaux maximum utilisés dans tous les projets de recherche à l’année, nous estimons que nous prélèverons un maximum de 43200 souriceaux et 2560 petits rats. Les projets de recherche associés à l’élevage seront conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en s’assurant de résultats scientifiques robustes. Etant donné la nature du projet, aucun test statistique n’a été réalisé en dehors de ceux utilisés dans les projets de recherche associés. Un maximum de 900 souris mâles pourra être isolées au cours du projet afin de définir précisément la date d’accouplement, ces animaux étant issus de notre élevage et donc inclus dans le nombre de petits générés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont agréées et les animaux reçoivent des enrichissements correspondants à leur besoin : matériel de nidification, maisonnette, bâtonnet à ronger. La quantité de ces enrichissements pourra être adaptée pour les animaux isolés. A la moindre anomalie qui est observée un suivi et des conseils sont données par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) de manière à assurer une prise en charge rapide et optimale de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux notamment en ce qui concerne la durée d’isolement des mâles, le nombre de portée par femelle et le temps de reproduction des géniteurs. Les animaux isolés sont identifiés par des cartes spécifiques pour qu’ils puissent bénéficier d’une surveillance adaptée (présence de comportements anormaux, durée de l’isolement). Le prélèvement tissulaire est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulation des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprèlèvement est nécessaire à l’oreille ou sanguin sur un animal, il n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien être animal.
Choix des espèces
Il existe de nombreuses lignées génétiquement modifiées chez la souris pour apporter des modèles aux équipes de recherche. Nous avons également des équipes qui travaillent chez le Rat, pour des raisons génétiques et de la taille des rats qui permet d’accéder à un cerveau plus grand, à des embryons de taille supérieure et en nombre important, et de réaliser ainsi certaines expériences plus aisément. Les animaux produits seront tatoués et prélevés à l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours (pour limiter la douleur et permettre une cicatrisation rapide) pour connaitre leur patrimoine génétique et pouvoir les reconnaitre. Exceptionnellement, Il pourra être nécessaire parfois de prélever une nouvelle fois sur les adultes mais cela sera fait à l’oreille ou par prélèvement de sang avec une demande justifiée par l’équipe et évaluée par la structure chargée du bien-être animal. Les reproducteurs sont utilisés à l’âge de 6 semaines pour les femelles et 8 semaines pour les mâles jusqu’à l’âge d’environ 8 mois pour les souris et 12 mois pour les rats. Les mâles souris susceptibles d’être isolés seront donc des adultes.
Étude du rôle de la variation comportementale, génétique et épigénétique dans l’adaptation aux environnements urbains et sauvages chez la souris domestique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
150 souris domestiques sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées sur place. Elles sont piégées vivantes et gardées une nuit, soumises à trois tests comportementaux, la latence à quitter un tube sombre, un test de champ libre et un test de mobilité dans un sac sombre, puis marquées à l'oreille avec prélèvement d'un échantillon de peau. Le porteur indique un stress lié à la capture et à la manipulation et un risque de prédation lié aux pièges, limités par un temps court dans le piège. Le projet compare des populations urbaines, rurales et sauvages pour étudier leur adaptation à l'urbanisation.
Objectifs
Tous les êtres vivants existent dans un monde qui change. Alors que certains organismes s’adaptent facilement ou même prospèrent dans des environnements nouveaux ou difficiles, d’autres succombent même à de légers changements dans leurs conditions environnementales. Pourquoi certains animaux réussissent-ils là où d’autres ne réussissent pas ? Pour répondre à cette question, il faut comprendre les mécanismes phénotypiques, génétiques et épigénétiques qui aident une population à s’adapter à de nouveaux environnements. Ce domaine de recherche a longtemps été au cœur de l’écologie évolutive, mais il est maintenant encore plus important que jamais étant donné la menace urgente du changement climatique induit par l’homme. Les contrastes entre les populations urbaines et rurales sont un moyen puissant d’aborder la façon dont différents traits phénotypiques et (épi)génétiques influencent l’adaptation des organismes : les populations vivant en milieu urbain font face à une variété de conditions environnementales que les populations rurales ne subissent pas, ex. pollution et fragmentation de l’habitat. L’objectif de ce projet est de déterminer comment les traits comportementaux, génétiques et épigénétiques diffèrent entre les populations sauvages, rurales et urbaines de la souris domestique (Mus musculus domesticus). La souris domestique sauvage est un modèle d’étude particulièrement intéressant pour aborder ces questions: espèce commensale avec une forte capacité d’adaptation, elle est aussi un organisme très étudié sur le plan comportemental et génomique: on sait que les souris présentent une variation comportementale quantifiable répétable et héréditaire de la proactivité, et nous disposons d’une variété d’outils génomiques, y compris un génome bien annoté, chez cette espèce modèle. Nous faisons l’hypothèse que les environnements urbains induisent des réponses comportementales adaptatives, répétables et quantifiables. Deuxièmement, nous faisons l’hypothèse que les phénotypes comportementaux adaptatifs reposent à la fois sur des adaptations génétiques et épigénétiques (méthodes non décrites ici).
Bénéfices attendus
Ces travaux fourniront un aperçu des mécanismes sous-jacents à la capacité de tolérer et de s’adapter à de nouveaux environnements. Ils nous permettront de mieux comprendre les capacités d’adaptation des espèces envahissantes, mais aussi de mieux comprendre et prédire la vulnérabilité des espèces à l’extinction face aux changements environnementaux induits par l’homme. Parce que ce travail concerne la souris domestique, une espèce hautement commensale — à la fois un vecteur de maladie et un ravageur agricole — les données de ce projet pourront être utilisées pour éclairer les programmes de lutte contre les rongeurs qui ont une incidence directe sur la santé publique et l’économie. Enfin, les résultats de cette étude aideront à relever les défis en suspens dans les domaines de l’écologie comportementale et de la biologie évolutive.
Procédures
Capture-vivant (N=150). Les souris seront piégées et maintenues toute la nuit pendant la phase nocturne de pose du piège dans la nature et relâchées au lever du jour. Nous passerons jusqu'à 14 nuits consécutives sur un site de piégeage et y retournerons après un mois. Ainsi, il est possible que chaque souris subisse plusieurs piégeages. Tests comportementaux (N=150). Chaque souris sera équipée à trois tests comportementaux consécutifs : latence pour quitter un tube sombre, champ libre et test de mobilité dans un sac sombre. Marquage auriculaire et prélèvement d'échantillons auriculaires (N=150). Chaque souris recevra une étiquette auriculaire sur l'oreille droite et aura un échantillon de peau prélevé sur l'oreille gauche. Ces procédures durent moins de 2 minutes et sont réalisées avec des outils sanitaires appropriés.
Impact sur les animaux
Les pièges peuvent attirer les animaux sauvages (comme les sangliers) ou les prédateurs domestiques (comme les chiens ou les chats) et ainsi augmenter le risque de prédation. La capture et la manipulation des animaux peuvent également engendrer un stress. Toutefois notre protocole a pour objectif de réduire au maximum ces nuisances potentielles : en réduisant la durée de séjour dans le piège d’un animal, en ajoutant dans le piège du coton permettant la construction d’un nid, en manipulant l’animal le plus rapidement possible et en utilisant des objets sombres (tunnel, sac) lors du passage d’un test à un autre.
Devenir
À la fin de l’échantillonnage comportemental et tissulaire, les souris seront relâchées sur place (souris en milieu naturel).
Remplacement
Ce projet de recherche s’intéresse au comportement de la souris et à la variation génétique des animaux sauvages. Les questions précises que nous posons au sujet de l’adaptation aux environnements urbains n’ont pas d’analogie directe dans les modèles de culture cellulaire ni dans les modèles non vertébrés. De plus, il s’agit de questions empiriques auxquelles on ne peut répondre en utilisant des approches théoriques.
Réduction
Nous aimerions avoir un échantillon uniforme de souris dans nos différentes catégories environnementales. Notre but est d’étudier 10 souris adultes par site de piégeage et d’avoir 5 sites de piégeage par type d’environnement. Cette stratégie assurera une représentation égale pour chaque type d’environnement et une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Ce projet se limite à la capture, à l’observation comportementale, aux mesures morphologiques et à l’échantillonnage de tissus. Le temps passé dans les pièges sera aussi réduit que possible car les pièges seront placés juste avant le coucher du soleil et relevés au lever du soleil. Les pièges comprennent de la nourriture, un abri, et un morceau de coton, permettant une protection du froid et de la chaleur ainsi que la construction d'un nid. S’il y a beaucoup de souris à traiter en même temps, les souris resteront dans leurs pièges avec une tranche de pomme pour prévenir la faim et la déshydratation. Être dans un piège ne nuit pas aux animaux capturés lorsque le piégeage est fait de façon responsable, par exemple, si les pièges ne sont pas exposés à des températures extrêmes. Ici, nous ne prévoyons pas de piéger en hiver, et tous les pièges contiendront du coton, qui fournit une bonne isolation. Nous limiterons l’exposition des pièges aux températures trop chaudes en installant des pièges au coucher du soleil et en les vérifiant au lever du soleil. La mortalité dans les pièges devrait donc être très faible. L’observation comportementale et les mesures morphologiques ne nécessitent pas des gestes invasifs et n’induisent pas des dommages aux animaux. Les tests comportementaux ne durent pas plus de 15 minutes. L’échantillonnage des tissus se fera au moyen de poinçons auriculaires, une procédure courante qui ne nécessite pas de sédation. Au total, les souris seront manipulées et testées pendant au plus 30 minutes, ce qui minimisera le stress sur les animaux. Nos critères de mauvaise santé pour l’euthanasie seront une fourrure mate et/ou une posture voûtée.
Choix des espèces
La souris domestique (M. m. domesticus) est le seul mammifère non domestique qui a récemment été introduit dans un large éventail d’habitats (rural, urbain, feral), c’est donc une espèce de choix pour les travaux proposés. De plus, la souris domestique dispose d’une abondance inégalée d’outils génomiques disponibles, y compris des bases de données génétiques nombreuses et un génome bien annoté qui seront utiles pour nos études génétiques à partir des prélèvements réalisés ici. Enfin, des nombreuses études indiquent que les souris présentent des variations quantifiables et héréditaires dans les traits comportementaux que nous étudions ici dans le contexte particulier d’un gradient d’urbanisation. Toutes les souris utilisées dans ce projet sont des adultes car nous nous intéressons uniquement au comportement des animaux sexuellement matures. Les souris juvéniles, gravides ou allaitantes seront libérées immédiatement sur le lieu de capture.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur associés à différents tests chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3770 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 800 d'entre elles étant réutilisées pour de la formation et les autres tuées. Différents modèles de douleur inflammatoire, post-opératoire et neuropathique leur sont induits, avec stimulations douloureuses thermiques ou mécaniques des pattes, mise à jeun et prélèvements de sang, pour tester environ 80 candidats-médicaments analgésiques. Le porteur indique que les animaux des procédures sévères ne peuvent être réutilisés à cause de la douleur persistante et sont mis à mort. Il affirme que l'efficacité d'un analgésique ne peut être démontrée que chez l'animal vigile, la douleur associant une composante sensorielle et émotionnelle.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur (inflammatoire, post-opératoire, neuropathique) chez la souris et pour différent type de douleurs (mécanique, aigue, chronique). L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus (80 composés estimés). Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. De plus selon les tests, les animaux sont soumis à la contention, isolés dans des compartiments (durée de 3minutes à maximum 2h30 selon le test) et une stimulation douloureuse thermique ou mécanique des pattes arrière est réalisée (durée de 1minute à 1.5 minutes selon le test). Les tests peuvent être réalisés sur plusieurs jours et peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans limite de 6 points de mesures. Les animaux pourront subir des nuisances liées à l’administrations de composés (durée de quelques secondes à 3 minutes maximum). Ils pourront être réalisés une seule fois ou plusieurs fois par jour. Les administrations répétées peuvent causer des lésions superficielles. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé. Les prélèvements durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne l’apparition de symptômes douloureux. Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. Ces nuisances sont modérées à sévères. Pour une procédure , les animaux subissent une mise à jeun d’une durée maximale de 20h (nuisance modérée). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisances légères < 1minute). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère
Devenir
Les animaux des procédures sévères sont mis à morts, ils ne peuvent être ni replacés ni réutilisés à cause de la douleur persistante liée à leur pathologie. De plus, certains tests peuvent induire des douleurs intenses a posteriori. Enfin bien que les animaux ne présentent plus d’effets post-test, nous ne connaissons pas les impacts potentiels que les administrations de composés en systémique ou non ont pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. C’est pourquoi, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité. Dans le cas de certaines procédures les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein de notre structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en plastique rouge, briquettes en bois, sizzle nest) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux de 3 à 8 ou 10 souris (selon le poids final attendu) dans des cages de dimensions appropriées selon la directive 2010-63. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines au début de toutes les procédures. Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Production d’ascite de souris en vue de l’obtention d’anticorps monoclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
12 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce sont des femelles âgées réformées de l'élevage, qui reçoivent une injection de pristane provoquant une inflammation douloureuse du péritoine, puis un hybridome, pour produire un liquide d'ascite riche en anticorps destinés à des tests de diagnostic du D-Dimère. Le porteur indique que les animaux ne restent que 24 heures en état ascitique avant mise à mort et prélèvement. Il affirme que 83 pour cent des anticorps ont été transposés in vitro mais qu'un clone doit encore être produit sur souris, en invoquant aussi la "souveraineté nationale".
Objectifs
Le D-Dimère est un marqueur biologique de la formation et de la dégradation de la Fibrine, qui peut être mesuré sur sang total ou dans le plasma. Le D-Dimère a été largement étudié pour le diagnostic de la maladie thromboembolique veineuse (VTE), et est utilisé en routine pour cette indication. Il a également été évalué pour déterminer la durée optimale du traitement anticoagulant chez les patients souffrant de VTE, pour le diagnostic et le suivi de la CIVD (Coagulation lntraVasculaire Disséminée), ainsi que pour l'identification des patients à haut risque de VTE. Donc, la quantification du taux en D-Dimères joue un rôle important dans les décisions thérapeutiques. En France grâce à ces tests, ce sont près de 50000 à 100000 cas de phlébite qui peuvent être dépistés et traités par an. Plus récemment, il a été démontré que les patients infectés par la COVID-19, et présentant une forme grave de la maladie, présentaient un état de profonde inflammation conduisant à des taux élevés de complications thrombotiques comme la Thrombose Veineuse Profonde (DVT), l'Embolie Pulmonaire (PE), et la thrombose microvasculaire. Le marqueur le plus typique chez les patients avec COVID-19 et coagulopathie est une élévation de la concentration en D-Dimères. Ces trousses de diagnostics sont des kits I.V.D (In Vitro Diagnostic) enregistrés officiellement et marqués CE sous la réglementation « ISO 9001-2008 » et « 13485 ». Certains sont également FDA Approved. Les clones ont été développés et sélectionnés pour leurs spécificités et leurs rendements il y a plus de 25 ans. Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production d’une quantité suffisante d’ascite à une concentration importante d’anticorps monoclonaux, de qualité, afin de pourvoir les quantités nécessaires à la confection des kits de dépistage des pathologies recherchées, et ce afin de limiter le nombre de souris utilisées. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages de D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines.
Procédures
2 inoculation sous cutanée de buprénorphine sur animal vigile : 5 sec/animal Inoculation intrapéritonéale de pristane sur animal vigile : 2.5 sec/animal Inoculation hybridome sur animal vigile : 2.5 sec/animal Aucun prélèvement sur animal vigile
Impact sur les animaux
Aujourd’hui la production de ces anticorps sur ascite de souris, est réalisé ans des établissements européens et français selon le protocole préconisé par la CNREEA. L’injection d’adjuvant de type pristane (huile) provoque une inflammation du péritoine et active le système immunitaire. Cette inflammation est douloureuse dans les premières heures après l’injection. Afin de diminuer cette douleur et pour que l’animal récupère plus rapidement, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) préalable à celle du pristane est réalisée. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Les animaux sont donc observés et reçoivent une seconde injection de buprénorphine 4 heures après la première. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avant le prélèvement.
Remplacement
Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Malheureusement, la production en bioréacteur pour les différents clones, dont cette DAP fait objet, a modifié certaines caractéristiques de l'anticorps pour un clone et ne permet pas, à ce jour, de valider l'équivalence entre l'anticorps monoclonal "in vitro" et l'anticorps monoclonal "in vivo". Cette perte de qualité n’est pas acceptable ni autorisée par les autorités compétentes en raison du marquage CE et de la finalité diagnostic des produits. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies. Ces productions sont également réalisées dans des pays hors Union européenne, capables de produire la totalité des volumes nécessaires qui pourraient ainsi faire perdre en partie la souveraineté nationale et européenne ainsi que le contrôle du bien-être animal propre à la CNREEA.
Réduction
Le clone de cellules est sélectionné afin d’obtenir un volume d’ascite important à une concentration importante en anticorps dans le but de limiter le nombre de souris. La quantité d’ascite produite est en moyenne de 2.8mL/souris. Les animaux utilisés sont des souris anciennes qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Raffinement
Les souris sont hébergées sur un lit de sciure avec des enrichissements de type lanières de cartons et tunnels afin qu’elles puissent se cacher, créer un nid afin de répondre à leurs besoins physiologiques. Elles sont soignées quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation A tout moment l’opérateur peut décider de l’arrêt du protocole s’il juge que l’animal est en détresse. Pour diminuer la douleur liée à l’inflammation provoquer par l’adjuvant, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) est effectuée avant et après l’adjuvant. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité. La raison de l’utilisation de la buprénorphine est bibliographique. En effet il s’agit de l’anti-douleur préconisé dans cette production. Plusieurs essais d’optimisations ont été apportées : - Essais avec des AINS (Anti-inflammatoire Non Stéroïdien) n’ont pas été concluants et n’ont pas montrés une amélioration significative de l’état de l’animal car ce qui est recherché par l’injection de l’adjuvant, est une inflammation du péritoine et une activation du système immunitaire de manière à obtenir une grande quantité d’anticorps. - Essais menés pour éviter la manipulation et l’injection de buprénorphine aux souris : des gels aromatisés contenant un morphinique ont été placés dans la cage des souris ou dans l’eau des biberons. Ces deux essais n’ont pas été concluants car ils ne garantissaient pas que toutes les souris étaient correctement traitées avec l’anti-douleur : certaines étant sous-dosées et d’autres à l’inverse sur-dosées. Les souris sont mirées quotidiennement. Dès lors qu’une réaction est détectée par mirage de l’abdomen l’ascite de la souris est prélevée sur animal mort. Cette façon d’opérer permet aux animaux de ne rester que 24 heures en état ascitique et limiter la mortalité du fait d’une production exponentielle d’ascite. Des points limites prédictifs sont mis en place suivant une grille de scoring.
Choix des espèces
La souris est l’animal idéal pour la production d'anticorps monoclonaux et est, de ce fait, l'animal le plus utilisé. La souche utilisée est la lignée de souris consanguine BALBc, sur laquelle ont été développés tous les essais liés aux techniques d’obtention d’anticorps monoclonaux . Cette lignée permet d’obtenir un volume plus important d’ascite avec une concentration en anticorps supérieurs aux autres souches de souris. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes. Elle produit des volumes satisfaisants d’antisérum présentant un titre élevé et une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines. Les animaux utilisés sont des souris BALBc femelles, anciennes reproductrices réformées chez l’éleveur. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure( multiplié par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Rôle de FGF21 hépatique dans le comportement alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 d'entre elles étant ensuite replacées en élevage et les autres tuées. Elles subissent un jeûne pouvant durer 24 heures, un hébergement isolé lors des tests de comportement alimentaire et des prélèvements de sang à la queue et à la joue, pour étudier le rôle de l'hormone hépatique FGF21 dans l'appétence au sucre et à l'alcool. Le porteur indique que le jeûne peut abaisser la glycémie et la température corporelle et que l'isolement peut stresser les animaux. Il affirme que ces mécanismes, faisant intervenir plusieurs organes, ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives.
Objectifs
Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle de différents types de comportements alimentaires. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie (hepatokine), exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et l’alcool. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. La majorité des recherches sur cette hormone a été réalisée grâce à l’utilisation de souris déficientes pour FGF21 dans tout l’organisme et avec des souris transgéniques surexprimant FGF21. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie lors du jeûne et dans le comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider notre modèle de délétion spécifiquement hépatique de FGF21. De plus, ce projet permettra de démontrer ou réfuter que FGF21 d’origine hépatique contrôle la préférence au sucre et à l’alcool. En effet, les résultats décrits jusqu’alors dans la littérature ont été obtenus à partir de souris délétées pour FGF21 dans tout l’organisme ou surexprimant FGF21 dans tout l’organisme. Ces modèles sont peu physiologiques et ne permettent pas de définir l’origine tissulaire de FGF21 dans ces effets.
Procédures
Dans la procédure 1, les animaux seront mis à jeun pendant 24h maximum. Pour la mesure de la glycémie, un prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle. La consommation d’eau sucrée et d’alcool peut entraîner une augmentation de la glycémie. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des tests de comportement alimentaire et des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. La piqûre pour mesure la glycémie ainsi que le prélèvement de sang peuvent entraîner une douleur.
Devenir
A la fin de la procédure 1 de jeûne, les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure 2, les animaux seront replacés en élevage après examination par la vétérinaire référente.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente, déshydratation) avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée).
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement des organes métaboliques est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.