Souris
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 464 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime gras ou alcoolisé, des injections de CCl4 pour induire une fibrose du foie, des prélèvements sanguins et un gavage. Le porteur indique que la défaillance hépatique peut provoquer une perte de poids de plus de 20 %, seuil qui déclenche la mise à mort. Il affirme devoir étudier la protéine CD44 dans un "organisme entier", aucune approche in vitro ne tenant compte des interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines. Une mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. Comme conseillé dans la revue laboratory animals, le CCl4 sera administré par voie intra péritonéale (vs inhalation) avec alternance du point d’injection. Ce traitement est associé au développement de la fibrose hépatique sans perte de poids ni développement d’ascite ni trouble digestif attendus. Potentiellement, la conséquence la plus grave que les animaux pourraient subir serait une défaillance des fonctions du foie entrainant une difficulté pour s'alimenter et donc une perte de poids brutale de plus de 20% par rapport à la dernière pesée. Cependant, d'après nos expériences passées ainsi que celles de nos collaborateurs, ceci arrive rarement. Si une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente est observée mais sans signe de souffrance (dos voûté, poil non entretenu, indifférence au milieu extérieur…), l’animal sera surveillé et repesé tous les 2 jours. Les animaux auront à disposition dans la cage des croquettes ainsi qu'un boudin de réhydratation. Si aucune reprise de poids la semaine suivante, il sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la protéine CD44 dans les fonctions des cellules immunitaires impliquées dans divers aspects de la physiopathologie des NAFLD et ALD, notamment dans la stéatose, l'inflammation, les lésions hépatocellulaires, la fibrogénèse et l’hépatocarcinogénèse. Les études in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement nutritionnel et métabolique ou encore des interactions entre différents types cellulaires ou entre organes. Il nous est donc nécessaire d'étudier le rôle de cette protéine dans un organisme entier.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour les procédures 2, 3, 4 et 7(souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 5 (souris mâles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour la procédure 6 (souris mâles et femelles), l’isolation des cellules sera effectuée sur des souris adultes à partir de 7-8 semaines d’âge.
Etude de l’intérêt d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés chaque jour pendant quinze jours et une partie est rendue allergique par trois injections intrapéritonéales, le déclenchement de l'allergie provoquant une baisse de température et des douleurs abdominales. L'objet est d'évaluer l'ajout d'une composante microbienne proche du lait maternel dans des formules infantiles, avec en vue le développement de produits laitiers fermentés pour les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro.
Objectifs
Les allergies touchent 30 à 40% de la population mondiale et parmi elles, les allergies alimentaires (AA) affectent plus de 6% de la population Européenne. Il n'existe pas à ce jour de stratégie préventive efficace et validée. Elles sont liées à un dysfonctionnement du système immunitaire (SI) et à une diminution de la diversité du microbiote intestinal chez les nouveau-nés. Ce point suggère l’intérêt des stratégies au début de la vie pour induire un microbiote intestinal optimal et ainsi prévenir les allergies. Des études ont suggéré que l’administration de probiotiques (1 à 4 souches) en périnatal avaient un effet bénéfique pour la prévention de l’eczéma. Le microbiote du lait maternel fournit un apport en bactéries dans le tube digestif du nouveau-né. Il est très divers, riche en candidats probiotiques potentiels et représente un intérêt santé certain pour le futur enfant. Il serait potentiellement protecteur des allergies mais les études restent controversées. Aujourd’hui, les formules infantiles n’intègrent pas (ou très peu), de composante microbienne par rapport au lait maternel. L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt d’une composante microbienne issue du lait maternel dans les formules infantiles en comparant l’effet de différentes formules chez des souriceaux sur la prévention de l’allergie alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfiques pour des populations à risque de pathologies chroniques telles que les allergies. Ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.
Procédures
Les femelles reproductrices seront pesées tous les 2 jours après la fin de la reproduction pour déterminer la gestation. Gavages tous les jours pendant 15 jours chez la descendance. Lors de la récupération des fèces, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. Chez la descendance, les groupes rendus allergiques alimentaires reçoivent 3 injections intrapéritonéales (aiguille 22G) et 1 gavage, espacés chacun d’une semaine.
Impact sur les animaux
Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable SBEA et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendrons la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à l’euthanasie. Les souris sont hébergées avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches et servent de modèle pour l'allergie alimentaire. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses immunologiques des différentes populations cellulaires (lymphocytes T et B) seront réalisées et l’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles et males reproducteurs seront utilisés à 8 semaines de vie afin qu’ils soient matures sexuellement. Afin d’étudier s’il y a une action précoce d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires, nous utilisons des souriceaux en début de diversification alimentaire (sevrage) c’est-à-dire à 2 semaines de vie.
Thérapie pour les myopathies de type BIN1 & Dynamin 2 par ajout de tamoxifène dans l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des tests comportementaux répétés chaque semaine, des mesures de force musculaire sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour évaluer le tamoxifène comme traitement de myopathies congénitales. Le RNT ne précise pas lesquels de ces tests comportementaux sont pratiqués. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la contractilité musculaire sur l'"organisme entier" et décrit une application clinique comme rapide.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 semaines ou 15 semaines. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile ou sous anesthésie légère pendant un maximum d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal sous anesthésie générale sur une durée maximale de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une perte de masse corporelle. Les animaux seront mis sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques qui pourra provoquer une douleur ou une inflammation au point d’injection. Lors du prélèvement de sang, l’animal pourra ressentir un stress lors de la manipulation et un inconfort au niveau du point de piqure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par groupe (i.e. 10 animaux par groupe), basé sur de précédentes études, a été déterminé à l’aide d’une analyse statistique mettant en évidence une différence phénotypique entre les animaux malades non traités et les animaux contrôles. Les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Enfin, les groupes d’animaux ne recevant pas d’agent pharmacologique serviront de groupe contrôle pour les différentes doses d’agent pharmacologique testées. Ces points sont importants car ils sont à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide système permettant la circulation d'eau chaude et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées.
Choix des espèces
Le modèle murin est privilégié car il s’agit de l’espèce la plus proche de l’Homme physiologiquement et structurellement pour laquelle les manipulations génétiques permettent de reproduire les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le traitement des souris mères débutera 14 jours après la naissance des animaux ce qui permet aux animaux nés de recevoir le traitement via le lait maternel dès les premiers jours de vie, et ainsi de traiter au plus tôt la maladie qui est présente dès la naissance. Les mâles et les femelles seront utilisées car la maladie se développent indépendamment du sexe. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 ou 15 semaines, i.e. à partir du sevrage et pendant toute la durée du traitement.
Evaluation de l’activité antitumorale des perturbateurs de la liaison cIAP1 – TRAF2 (cITIn)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis trois injections intrapéritonéales par semaine pendant trois semaines, de la chimiothérapie et des injections d'anticorps, pour tester six molécules censées bloquer la liaison cIAP1-TRAF2 dans les cancers. Une partie de ces souris immunodéficientes subit aussi une vaccination avec réinjection de cellules tumorales vivantes. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à un éventuel essai chez l'homme, tandis que le porteur affirme que l'analyse des tumeurs dans leur environnement rend l'usage des souris nécessaire.
Objectifs
La thérapie ciblée des cancers est une stratégie thérapeutique très prometteuse permettant de cibler spécifiquement les anomalies des cellules tumorales. En gagnant en spécificité par rapport aux traitements conventionnels, cette stratégie thérapeutique réduit considérablement les effets secondaires et améliore la qualité de vie des patients. La protéine cIAP1 est promotrice de tumeur et a été retrouvée surexprimée dans de nombreux échantillons tumoraux humains de différente origine. Elle constitue une cible thérapeutique pertinente. Il a été montré que l’association de la protéine cIAP1 avec son partenaire TRAF2 était absolument nécessaire à son activité oncogénique. Une recherche de perturbateurs de liaison cIAP1 – TRAF2 en vue d’une utilisation en thérapie anti-cancéreuse a été entreprise. Une première génération de molécules a été obtenue et une seconde génération est en cours d’élaboration. Le présent projet a pour but d’évaluer les propriétés antitumorales des molécules élaborées. Six molécules seront testées en monothérapie ou associées à de la chimiothérapie conventionnelle et/ou immunothérapie.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’une étude préclinique d’évaluation de nouvelles molécules à finalité thérapeutique anti-cancéreuse. L’objectif est de sélectionner au moins une molécule qui pourra ensuite faire d’objet d’une optimisation et d’une étude pharmacologique en vue d’essai thérapeutique chez l’homme.
Procédures
Dans la procédure 1, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane et subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans du sérum physiologique. Dans la procédure 2, les souris porteuses de tumeurs recevront trois injections intra-péritonéales par semaine des molécules à tester ou de son contrôle, et ceci pendant 3 semaines. Une injection unique de chimiothérapie sera réalisée en intra-péritonéale. Dans la procédure 2 et 3, l’injection d’anticorps aura lieu 3 fois par semaine pendant 3 semaines à partir du 14ème jour post-injection des cellules tumorales, en même temps que les molécules à tester. Ces injections seront réalisées en intra-péritonéale. Dans l’expérience de vaccination de la procédure 3, des cellules tumorales mortes seront injectées en sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Une semaine après la vaccination, des cellules tumorales vivantes seront injectées en sous-cutané (100 µL, 10 secondes) dans le flanc opposé et l’apparition d’une tumeur au deuxième point d’injection sera évaluée.
Impact sur les animaux
- Les molécules testées pourraient occasionner une réaction inflammatoire modérée au moment de l’injection. - Les souris sont immunodéficientes et donc plus sensibles aux infections - Le développement de grosses tumeurs pourrait gêner le mouvement de la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées selon les pratiques recommandées pour les souris par l’union Européenne
Remplacement
L’objectif du projet est de vérifier si les molécules en développement peuvent exercer une activité anti-tumorale en agissant directement sur les cellules tumorales ou/et en stimulant la réponse immunitaire anti-tumorale. Ceci nécessite l’utilisation d’animaux pour analyser les tumeurs dans leur environnement. Toutes les procédures chez l’animal seront précédées d’une validation in vitro de l’efficacité des molécules. La procédure 1 sera précédée par une validation in vitro de la capacité des molécules à inhiber la signalisation intracellulaire pro-tumorale et la croissance des cellules tumorales. Seules les molécules montrant une activité anti-proliférative seront évaluées chez l’animal. Nous avons actuellement 2 molécules remplissant ces critères. Au maximum les 6 molécules seront analysées. La molécule la plus efficace sera ensuite utilisée dans la seconde et troisième série d’expériences (procédure 2 et 3). La procédure 3 sera précédée par une analyse in vitro de la capacité des molécules ou de la combinaison molécule-chimiothérapie à induire une mort immunogène. Seules les combinaisons efficaces seront testées in vivo.
Réduction
La première série d’expériences (5 souris / groupe) permettra de définir les concentrations efficaces et de choisir les molécules utilisées dans la seconde série d’expérience. Pour les 2 molécules les plus efficaces, nous répèterons l’expériences 2 fois de manière indépendante. La répétition permettra d’ajuster les concentrations si besoin. Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, la seconde et troisième séries d’expériences seront réalisées sur des groupes de 5 souris. Nous répèterons les expériences 2 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques.
Raffinement
Les injections sous-cutanées de cellules tumorales, intrapéritonéales ou intraveineuses des molécules ou agents thérapeutique seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés. Les souris auront une phase d’adaptation d’une semaine avant le début de l’expérimentation afin de les habituer à la manipulation et à la contention. Aucune douleur associée à ces gestes n’est attendue. Concernant les points limites adaptés les plus prédictifs, il s’agira des modifications de l’apparence physique, de la perte de poids, de l’apparition d’inflammation, du volume et de l’aspect des tumeurs, et des modifications du comportement L’arbre décisionnel ci-après sera suivi pour la prise en charge des animaux : 1. Si des changements de comportement ou d’apparence physique sont observées, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. 2. Si une légère inflammation au moment de l’injection des composés est observée, un anti-inflammatoire non stéroïdien pourra alors être administré de manière ponctuelle aux animaux. 3. Si des nécroses apparaissent sur les tumeurs, leur aspect et douleur seront évalués. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Dans tous les cas, si les animaux présentent une perte de poids ou une taille de tumeur définie comme point limite, ou si l’aspect des tumeurs le nécessite (nécroses douloureuses ou creuses) ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance telle qu’une inflammation persistante, les animaux seront euthanasiés selon les bonnes pratiques.
Choix des espèces
Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. Nous utiliserons des souris immunodéficientes nude (NMRI) pour la première série d’expérience permettant d’implanter des cellules exprimant cIAP1 ou un mutant invalidé de cIAP1. Lors de la seconde série d’expériences, nous utiliserons des souris immunocompétentes pour l’implantation de cellules cancéreuses d’origine murine et des souris immunodéficientes pour l’implantation des cellules cancéreuses humaines. Pour la troisième série d’expérience, des cellules cancéreuses coliques seront injectées à des souris immunocompétentes pour l’expérience de vaccination. Ensuite, l’analyse de la capacité des molécules ou des combinaisons de traitement à sensibiliser les tumeurs à une immunothérapie se fera sur des tumeurs faiblement immunogènes développées dans des souris immunocompétentes. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).
Comparaison de deux voies d’injection intraveineuse par fluorescence chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit une injection dans la veine de la queue, l'autre une injection derrière l'œil, suivies de trois séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux techniques d'injection et deux traceurs fluorescents. Les souris sont ensuite tuées au CO2 pour analyser la distribution du produit. Le porteur affirme que la validation d'une injection systémique "ne peut être réalisée que sur un organisme entier".
Objectifs
L'administration de médicament chez la souris peut être réalisée par voie oral (dans l'eau de boisson ou par gavage) ou par injection (sous cutanée, intra péritonéale ou intraveineuse). La voie la plus directe et la plus utilisé en clinique est la voie intraveineuse, puisque le composé injecté passe dans tout le corps très rapidement. Pour l'intraveineuse, toujours chez la souris, il existe deux techniques couramment mises en œuvre qui sont l'injection dans la veine caudale (au niveau de la queue) sans anesthésie où les souris sont mises dans un système de contention indolore et rétro orbitale (derrière l'œil) où les souris seront anesthésie. La première permet des injections répétées et nécessite d'immobiliser la souris durant l'opération. Elle peut être compliquée à réaliser sur des animaux de petite taille ou ayant une peau foncée. Dans le cas de l'injection rétro orbitale, la souris est maintenue en contention légère après l'avoir anesthésié et injectée en passant à côté de l'œil. Cette injection ne doit pas être répétée sous peine de causer des lésions à l'animal. Dans notre institut, ces injections sont régulièrement mises en œuvre. Depuis quelques mois, nous sommes équipés d'un appareil de lecture de fluorescence/bioluminescence dans notre service. La lecture de fluorescence sur animal permet de suivre des composés fluorescents en temps réel dans l'animal. Lors d'expériences, nous avons constaté une fluorescence persistante au niveau de la queue lors d'injection en intraveineux caudale. Afin de garantir nos résultats scientifiques, nous devons connaitre précisément la quantité injectée à l'animal que ce soit de cellules ou de médicaments. Dans le cas d'injection en intraveineuse rétro orbitale, nous avons constaté sur un faible nombre d'animaux (1 sur 4 injectées) un échec de l'injection (le liquide ne s'est pas diffusé dans le sang mais est resté localisé au niveau de l'œil). L'objectif de ce projet est de quantifier pour 30 souris (15 souris pour chaque type d'injections) la perte éventuelle de liquide lors d'injection intra caudale et de quantifier le taux d'échec lors d'injection rétro orbitale. Par la même occasion, nous pourrons comparer la distribution de fluorescence entre ces deux techniques et comparer l'efficacité de deux fluorophores que nous utiliserons en parallèle comme traceurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une amélioration de nos techniques d'injection en intraveineuse et du choix des fluorophores dans nos futures études et ainsi l'amélioration continue de la qualité des résultats scientifiques.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir les résultats d'imagerie, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. La moitié des animaux seront soumis à une injection unique le jour même au niveau de la queue avec maintien en contention dans une boite prévue à cet effet durant une période de 3 à 5 minutes selon la difficulté de l'injection. L'autre moitié des animaux seront maintenu en contention et auront une injection unique en rétro orbital (moins d'une minute). Tous les animaux seront soumis à trois séances d'imagerie sous anesthésie générale (durée de 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par CO2.
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger (maximum 3 minutes) lié à la cage de contention et une douleur légère (moins d’une minute) liée à l’injection. Après injection, les souris subiront une anesthésie gazeuse ce qui représentera aussi un stress léger lié aux anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution.
Remplacement
La validation d'une injection systémique ne peut être réalisée que sur un organisme entier. Nous ne disposons pas de méthode alternative.
Réduction
Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Cependant, les éventuels problèmes d'injections (échec du manipulateur ou formulation du produit) ne permettent pas de descendre sous le nombre d'une quinzaine d'animaux par groupe. Afin de diminuer le nombre d'animaux, l'injection simultanée de deux fluorophores a été privilégié à des injections sur des animaux différents. Afin d'observer un échec d'injection en rétro orbitale ou calculer une éventuelle perte de produit injecté au niveau caudale demande un effectif important de 15 animaux par groupe. D'après nos observations lors d'une étude précédente sur un très faible effectif d'animaux (un échec d'injection sur 4 souris injectées), ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir une statistique fiable sur l'apparition de ce type d'événement.
Raffinement
Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (5% à l'induction et 2% en entretien). Afin d'éviter l'hypothermie pendant l'anesthésie, l'appareil d'imagerie est équipé d'une plaque thermostatée. De plus, les animaux seront placés dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d'imagerie. Des points limites généraux avec établissement d'une grille d'évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout le long de l'étude ont été établis pour surveiller l'état général de l'animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur.
Choix des espèces
La souris est le modèle principalement utilisé dans nos études. Ce modèle est le plus pertinent pour le test d'injection intraveineuse que nous effectuerons à l'avenir. Nous utiliserons des souris blanches de taille adulte entre 12 et 20 semaines d'âge. On sera dans des conditions optimales pour la taille de la queue des animaux adultes qui permettra une insertion d'une aiguille de 30 G (la mieux adapté pour les injections IV caudal) et pas trop âgées pour que la peau de la queue ne soit pas durcie.
Caractérisations et comparaisons de différents hydrogels prévascularisés chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur pratique une implantation sous-cutanée puis une ouverture du crâne, avec des injections dont une en rétro-orbitaire et des séances de scanner, pour étudier la vascularisation dans la réparation d'os de la face. Il décrit des douleurs postopératoires modérées pendant 72 heures, avant la mise à mort pour l'imagerie et l'histologie. Il affirme utiliser des souris immunodéprimées porteuses de cellules humaines et qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" in vitro ou in silico.
Objectifs
L'os est un tissu dur vascularisé qui se renouvelle continuellement pour s'adapter aux exigences mécaniques et métaboliques du corps. Les maladies inflammatoires, infectieuses ou les traumatismes entraînent d'importants défauts osseux craniofaciaux, aux conséquences esthétiques et fonctionnelles. Des substituts osseux synthétiques ou biologiques ont été développés et sont actuellement utilisés pour traiter ces défauts avec des résultats encore inconstants et perfectibles. La vascularisation joue un rôle important dans la réparation osseuse. L’objectif de ce travail est d'arriver à caractériser et comprendre le rôle de la vascularisation puis d'en déterminer son rôle dans la réparation osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux et mieux comprendre le comportement des vaisseaux implantés essentiel à toute survie d'un tissu greffé. Il s’attaque à un problème de santé majeur par le biais d’une stratégie d’ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble.
Procédures
Procédure 1 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale d'implantation sous-cutanée (5min), des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (2 acquisitions, 10min) Procédure 2 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale de craniotomie (10min) et des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (5 acquisitions, 25min)
Impact sur les animaux
A l'anesthésie, une dépression respiratoire peut très rarement être observées. Lors de la chirurgie, une complication hémorragique peut survenir. En post opératoires des douleurs modérées pendant 72h, hématomes, oedèmes et réouverture de la plaie par désunions des sutures peuvent être rarement observées. Concernant l'injection en rétro-orbitaire, un léger gonflement de l'oeil est rarement observé durant quelques minutes.
Devenir
Mise à mort pour permettre les analyses d'imagerie et d'histologie.
Remplacement
Ce projet s'intérêsse à la prévascularisation de greffon pour améliorer leur intégration in vivo et leur survie. Cela nécessite donc un modèle in vivo capable de supporter l’implantation de cellules humaines, comme la souris athymique nude. De plus, nous visons à transposer ce modèle de pré-vascularisation à la régéneration osseuse, qui présente une biologie complexe que l’on ne sait pas reproduire par ingénierie actuellement et dont la complexité ne peut être mimée in vitro ou in silico. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été limité grâce à une approche statistique de manière à déterminer la taille des groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par quatre par cage et disposeront d’un espace suffisamment complexe pour leur permettre d’exprimer leur comportement normal (enrichissement). Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pendant 7 jours après la chirurgie puis 2 fois par semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un score de points limites de 3 dans une sous-catégorie ou si un indice total de 6 est atteint, l’animal sera alors mis à mort.
Choix des espèces
La souris est une espèce de laboratoire appropriée, dont la biologie (vasculaire et osseuse) est proche de celle de l’homme. De nombreux outils d’analyses d’imagerie et d’histologie sont donc disponibles et adaptés à ce modèle. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéprimées du fait de l’implantation de cellules humaines. Des souris de 8 semaines à 5 mois seront utilisées, les animaux étant alors de jeunes adultes et sont alors les plus à même de pouvoir procéder à une régénération tissulaire.
Modulation de l’activation lymphocytaire T par une enzyme immunosuppressive
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
126 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une irradiation, une injection de lymphocytes et une vaccination, puis des prélèvements de sang, pour étudier une enzyme qui freine la réponse immunitaire contre les cancers. Le porteur indique une perte de poids transitoire, puis les souris sont mises à mort au huitième jour pour prélever les organes lymphoïdes. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro l'activation d'un répertoire de lymphocytes du fait de leur rareté.
Objectifs
La molécule que nous étudions est une enzyme immunosuppressive, c’est-à-dire qu’elle freine la réponse immunitaire. La production de cette molécule au cours du cancer rend donc la réponse immunitaire moins efficace à éliminer les cellules cancéreuses, ce qui accélère la croissance des tumeurs de souris. Chez l’homme, la production de cette molécule dans les tumeurs réduit la survie. Nous savons déjà que sa production par des cellules immunitaires appelées « cellules présentatrices » limite l’activation des « lymphocytes T », qui sont les acteurs de la défense de l’organisme contre les infections et les cancers. La rencontre avec la cellule présentatrice est l’étape essentielle qui permet au lymphocyte de reconnaitre la cible à attaquer, sous forme d’un fragment moléculaire appelé antigène. Lors du développement d’un cancer, les lymphocytes T activés par la reconnaissance des antigènes des cellules cancéreuses ont pour fonction de les tuer. Nous cherchons à comprendre comment la molécule que nous étudions freine l’activation des lymphocytes T. Nous pensons que la force de l’interaction entre l’antigène et le lymphocyte joue un rôle important. En effet, dans le vaste répertoire de lymphocytes T d’un individu, certains lymphocytes T peuvent reconnaitre un antigène particulier, mais très peu ont la capacité de le reconnaitre fortement tandis que beaucoup plus le reconnaissent plus faiblement. Il est important de déterminer quel type d’interactions la molécule que nous étudions peut freiner, car les conséquences sur la qualité de la réponse immunitaire (et donc la capacité à éliminer les cellules cancéreuses) ne sont pas les mêmes. Ce projet est donc important pour comprendre le rôle de la molécule que nous étudions dans l’échappement des cellules du cancer à la réponse immunitaire. Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro les conditions d’activation d’un répertoire physiologique de lymphocytes T
Bénéfices attendus
Nous souhaitons démontrer que la molécule que nous étudions restreint le répertoire des lymphocytes T capables de répondre à une stimulation par une cellule présentatrice d’antigène. En présence de cette molécule (souris qui l’expriement), seuls les lymphocytes T reconnaissant fortement l’antigène sont probablement capables de s’activer et donc secondairement tuer des cellules malades, par exemple cancéreuses. Bien que cela puisse être suffisant pour faire cesser une infection aigue, au cours de laquelle la réponse est de brève durée, cela n’est pas souhaitable dans le cas du cancer. En effet, du fait de la grande rareté dans l’organisme des lymphocytes de forte affinité pour les antigènes du cancer, cette restriction est contre-productive au maintien à long terme d’une réponse anticancéreuse active. L’immunothérapie connait un développement fulgurant dans le traitement du cancer, car elle permet de réactiver la réponse du système immunitaire contre les antigènes du cancer. Néanmoins l’efficacité des immunothérapies actuelles reste limitée à certains types de cancer et un pourcentage restreint de patients. La molécule que nous étudions représente une cible potentielle pour de nouvelles stratégies d’immunothérapie. Afin de permettre le développement de traitements visant cette molécule, il est nécessaire de comprendre ses mécanismes d’action sur l’activation des lymphocytes T, acteurs clés de l’élimination des cellules tumorales.
Procédures
Irradiation en 1 séquence de 5,8 minutes. Le lendemain, injection d’une suspension lymphocytaire et vaccination (moins de 30 secondes chacun). Les animaux sont endormis à l’isoflurane lorsque les deux injections sont couplées. Trois jours après les deux injections, ponction de sang (animaux vigiles, anesthésie locale, moins de 20 secondes). Avant mise à mort (jour 8) : prélèvement de sang dans les mêmes conditions.
Impact sur les animaux
Concernant l’axe peur/détresse : il existe un stress lié aux manipulations. En effet, l’irradiation nécessite de regrouper les souris dans une boite pendant quelques minutes. Concernant l’axe de stress physique/thermique : pas de stress spécifique à l’expérimentation car l’irradiation est indolore. Concernant l’axe douleur, lésions et maladie : on s’attend à observer une perte de poids transitoire et modérée (
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les organes lymphoïdes utiles à l’analyse.
Remplacement
Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale d’un individu (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro notre hypothèse. En effet, les outils de détection dont nous disposons ne permettent pas d’analyser de façon robuste un très faible nombre de cellules. De plus, les conditions expérimentales in vitro sont très éloignées de la physiologie.
Réduction
Pour chaque expérience, 3 tests indépendants devront être effectués pour assurer la validité des observations. Chaque test devra indépendamment permettre d’observer une différence statistiquement significative entre les lymphocytes des souris exprimant ou non notre molécule pour une même condition expérimentale. En effet, les résultats varieront très probablement trop d’une expérience à l’autre pour qu’ils puissent être accumulés dans une même analyse statistique. Du fait de la variabilité individuelle accentuée par les différentes étapes de la manipulation, il est souhaitable d’inclure plusieurs animaux par groupe de souris exprimant ou non notre molécule. Trois animaux par groupe seront inclus dans les expérimentations sans vaccination, et 5 animaux par groupe lorsqu’une étape de vaccination est ajoutée. Dans les expérimentations sans vaccination, deux types de transfert de lymphocytes T seront effectués (lymphocytes monoclonaux et polyclonaux). Il y aura donc 6 souris par expérience (3 souris exprimant notre molécule et 3 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes, effectuées avec deux types de transfert lymphocytaire, soit 36 animaux. Dans les expérimentations avec vaccination, trois conditions de transfert des lymphocytes T seront testées. Il y aura donc 10 souris par expérience (5 souris exprimant notre molécule et 5 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes effectuées avec trois types de transfert lymphocytaire, soit 90 animaux. Au total pour les deux types d’expérimentation, il y aura donc 126 animaux.
Raffinement
L’hébergement se fait dans les conditions habituelles de l’animalerie locale : cinq souris sont hébergées par cage et le milieu est enrichi par des carrés de coton et fibres végétales permettant la formation de nids et des maisonnettes pouvant servir de refuge aux animaux. L’irradiation (une seule séquence de 5,8 minutes sur animaux vigils) est effectuée dans une boite de contention adaptée pouvant contenir 11 souris au maximum, isolées les unes des autres. Pour limiter le stress qui accompagne la manipulation au moment de l’irradiation, l’injection de lymphocytes sera réalisée le lendemain. Lorsque cette injection sera couplée à une vaccination, les souris seront endormies avec de l’isoflurane sur une plaque préchauffée à 37°C. Les prélèvements de sang seront précédés d’une anesthésie locale. Les animaux seront manipulés par du personnel expert de l’équipe de recherche. Les souris élevées dans notre animalerie seront transférées en zone d’expérimentation au minimum 48h avant d’être manipulées. Les souris achetées dans un élevage extérieur seront installées en zone d’expérimentation au minimum une semaine avant d’être manipulées.
Choix des espèces
Nous disposons de trois modèles de souris : 1. Transgéniques : tous les lymphocytes T de ces animaux reconnaissent le même antigène. Elles seront mises à mort sans manipulation et leurs lymphocytes T seront extraits de la rate afin de préparer une suspension injectable aux souris des deux modèles décrits ci-dessous. 2. Génétiquement déficientes pour la production de notre molécule. 3. Exprimant naturellement notre molécule. Souris âgées de plus de 6 semaines. Le travail s’intéresse à l’activation des lymphocytes T dans un organisme adulte
Traitement des thromboses par des particules nanométriques ciblantes délivrant des médicaments dans un modèle de thrombose veineuse chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
185 souris vont être utilisé·es dans une procédure unique menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur ouvre l'abdomen pour exposer le mésentère, provoque un caillot dans une veine à l'aide d'une solution chimique, puis injecte des nanoparticules censées mieux cibler le traitement d'un accident vasculaire cérébral. Après une imagerie de trente minutes, les souris sont euthanasiées sous anesthésie, au plus tard soixante minutes après le début de l'opération. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas" de modèle non animal capable de simuler la distribution des nanoparticules dans la circulation.
Objectifs
Cette étude est un projet fondamental dans le domaine de la santé publique. L’accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause mondiale de mortalité. En particulier, 80% des cas d’AVC sont caractérisés par la formation d’un caillot (thrombose) dans une artère cérébrale provoquant une diminution voire une suppression du flux sanguin dans une région du cerveau. L’hétérogénéité des causes de ces thromboses, la complexité et la sensibilité du cerveau font encore de l’AVC une pathologie complexe à traiter et des règles standards de traitements sont difficiles à établir. La première action thérapeutique consiste à rétablir le flux sanguin le plus rapidement possible afin d’éviter des séquelles irréversibles. Le traitement de référence reste le même depuis les années 1980 ; l’injection d'un médicament qui entraine la destruction du caillot. Toutefois, les critères d’inclusion des patients restent très limités, notamment à cause des effets secondaires: saignements, toxicité cérébrale. Le but de ce projet est d'étudier des nanoparticules (particules de taille nanométrique) pour apporter des médicaments directement au caillot, et ainsi éviter ces effets secondaires et diminuer les doses employées. Les tests sur modèle animal permettraient de valider le ciblage, l'action thérapeutique améliorée et l'innocuité du traitement proposé en comparaison avec la ligne actuelle de traitement.
Bénéfices attendus
A travers ce projet, la pertinence d'un nouveau traitement pour les AVCs dus à des caillots sanguins pourra être évaluée, avec en particulier: la mise à disposition des médecins d'un traitement plus complet pour résorber les caillots à l'origine de l'accident, avec une minimisation des effets secondaires (saignement, toxicité cérébrale), une diminution des doses employées et donc une utilisation potentielle pour plus de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Après induction de l'analgésie puis de l'anesthésie, les animaux subiront une incision abdominale pour exposer le mésentère (tissu rattachant les intestins à la cavité abdominale). Après une injection visant à marquer les plaquettes et globules blancs, une veine sera mise au contact d'un papier avec une solution chimique pour créer un caillot, puis une seconde injection avec les traitement sera faite. Après un suivi par imagerie jusqu'à 30 min, les animaux seront euthanasiés (60 min maximum après début de la procédure).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont donc: - douleur liée à l'injection de l'analgésique et de l'anesthésique - douleur liée à l'opération si réveil de l'animal (évité par surveillance et maintien de l'anesthésie).
Devenir
Afin d'éviter toute souffrance inutile des animaux suite à cette procédure chirurgicale, et vu qu'un maintien en vie n'est pas nécessaire post-opération pour des observations dans ce protocole, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie à la fin de la procédure. Pour un nombre limité d'animaux, des prélèvements d'organes post-mortem permettront des analyses des tissus biologiques.
Remplacement
Des études préliminaires ont permis de cibler les médicaments et les doses à tester pour détruire des caillots sanguins. Cependant, Il n'existe actuellement pas de modèles non animaux permettant de simuler la distribution des nanoparticules dans le corps, ni de récapituler le circuit complexe de circulation dans lequel doivent évoluer les nanoparticules pour cibler le caillot. Ainsi, les modèles in vivo permettent donc de répondre à la question: les nanoparticules chargées peuvent-elles, dans la circulation sanguine, résorber un caillot de manière plus efficace que le traitement actuellement utilisé?
Réduction
Les études in vitro préliminaires ont permis de déterminer le meilleur candidat en termes de nanoparticules et de leur chargement respectif (concentration) des médicaments, afin de diminuer le nombre d'animaux nécessaires. Le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminé d’après une analyse statistique: un nombre de 15 animaux par groupe est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents.
Raffinement
Les animaux avant la procédure bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de bien-être. L'anesthésie se fera avec analgésie pour réduire la douleur durant la procédure, et suivis durant la procédure: en cas de signe de réveil, une re-injection d'agent anesthésiant permettra de garder l'animal anesthésié; et en cas d'incident chirurgical (saignements, etc.) l'animal sera sacrifié.
Choix des espèces
Les modèles de thrombose veineuses et artérielles sur la souris sont abondamment décrits dans la littérature, et en particulier celui-ci dans l'étude de médicaments pour les AVCs humains avec caillots sanguins. Des adultes (5-8 semaines) seront utilisés pour que les veines mésentériques puissent être facilement visualisées par macroscopie intravitale. Des stades plus âgés risqueraient de présenter des zones grasses autour des veines, ce qui gênerait l’imagerie.
Etude du rôle du gène p16 dans les cellules épithéliales pulmonaires lors d’un emphysème.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
576 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit un emphysème par une injection d'élastase dans la trachée, via une incision au cou refermée par suture, et active un modèle génétique par des injections de tamoxifène. Les souris sont ensuite mises à mort pour prélever et étudier leurs poumons. Il reconnaît disposer de modèles d'organoïdes humains, mais affirme qu'ils ne peuvent "pas se substituer complètement" au modèle murin.
Objectifs
L’emphysème est une maladie pulmonaire impliquant une destruction irréversible des alvéoles, sans médicament disponible actuellement. Dans les poumons de patients ayant un emphysème, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Ces cellules peuvent sécréter différents facteurs bloquant la prolifération et la différenciation des cellules voisines. Nos données préliminaires montrent que l'absence de p16 répare l'emphysème chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules souches épithéliales des alvéoles, ou pneumocytes 2 sont à l'origine de ce processus de régénération alvéolaire lorsque p16 est absent. Ainsi, l’objectif du projet est d'étudier si l'absence du gène p16 spécifiquement dans les pneumocytes 2 pourrait mener à une réparation des alvéoles pulmonaires. Pour se faire, nous allons utiliser des souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. L’emphysème sera évalué par des analyses sur coupes de poumon. Pour tenter de comprendre les mécanismes impliqués dans la réparation, nous étudierons la composition cellulaire des poumons de ces souris avec des analyses de l’expression génique de cellules individuelles. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous utiliserons le modèle de formation d'organoïdes (structure d’auto-assemblage de cellules épithéliales et mésenchymales en 3 dimensions).
Bénéfices attendus
Nous anticipons : i) de montrer que les cellules responsables de la régénération dans le poumon emphysémateux en l'absence de p16, sont les pneumocytes 2, ii) d'identifier une ou plusieurs sous-populations de cellules épithéliales issues de la différenciation des pneumocytes 2, ayant des capacités régénératives modulées par la délétion de p16. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée.
Procédures
Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Un modèle de souris génétiquement modifiée sera utilisé pour induire l’absence de p16 dans les pneumocytes 2. Ce phénotype n'est pas dommageable pour les animaux. Pour activer ce modèle génétique, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen par voie intrapéritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l'injection (aiguille). Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. L'injection d’élastase se fait dans la trachée, à l’aide d’une aiguille. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.
Remplacement
La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une déletion de p16 dans les pneumocytes 2 permettra d’étudier directement si les cellules responsables de la régénération sont les pneumocytes 2, dans l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles d'organoïdes chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfontion des celules épithéliales chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variablilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 576, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 576 souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2 seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l’élastase vs 20 souris au PBS (contrôle), ii) la composition cellulaire des poumons de ces souris sera analysée à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 8 souris seront injectées à l’élastase vs 8 souris au PBS (contrôle) iii) le modèle d’organoides alvéolaires permettra d'étudier les propriétés des pneumocytes 2 à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l'elastase et 20 souris a PBS (contrôle). Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris injectés soit à l'élastase, soit au PBS, la moitié des souris seront injectées au Tamoxifen permettant d'avoir des souris contrôles (ayant une expression de p16 dans les pneumocytes 2) et des souris présentant une absence p16 dans les pneumocytes 2. Chaque expérience sera réalisée de manière préventive (Tamoxifen administré 3 jours avant l'injection) et de manière curative (Tamoxifen administré à partir de 21 jours, lorsque l'emphysème est déjà constitué).
Raffinement
Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie. Il y aura une présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constitueront des critères d'arrêt et conduiront à la mise à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.
Validation de l’efficacité in vivo de molécules anti-tumorales dans des modèles syngéniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
252 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans le pancréas, puis des injections trois fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester des molécules contre le cancer du pancréas. Le porteur décrit des signes possibles comme la cyphose, la prostration, la perte de poids ou l'automutilation, les souris atteignant un score de souffrance élevé étant mises à mort. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour prouver un effet antitumoral dans un modèle "proche de l'être humain".
Objectifs
Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Actuellement, il n'existe aucun traitement efficace, et cela constitue une urgence pour la recherche. Dans nos efforts pour lutter contre cette maladie, notre équipe de recherche a réussi à identifier une voie de signalisation qui conduit à l'expression de gènes pro-inflammatoires. En conséquence, nous avons développé des molécules qui interviennent dans cette voie de signalisation et qui se sont révélées très efficaces sur plusieurs organoïdes dérivés de patients. Les résultats prometteurs obtenus in vitro montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous avons l'objectif d'évaluer si les molecules, sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal. Notre objectif final est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre des essais précliniques.
Procédures
Après une semaine de l'injection initiale de cellules tumorales par voie intrapancréatique, l'intervention durera environ 5minutes. Aprés, les animaux seront traités 3 fois par semaine par une injection intrapéritonéale d'une solution à l'aide d'une seringue pendant 4 semaines. L'intervention durera environ 20 à 30 secondes. Deux fois par semaine, la taille des tumeurs sera mesurée à l'aide d'un échographe. Cette intervention de mesure prendra environ 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Nous pourrions observer un certain inconfort ou des lésions après l'injection des cellules tumorales. Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées pourraient générer des lésions cutanées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que les composés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 126 individus par modele celullaire (2 modeles: 4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris contrôle pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne développeraient pas de tumeur) conformément à la règle de réduction. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection des cellules intrapancréatiques pour le modèle d'allogreffes, celles-ci seront réalisées sous anesthésie et analgésie, et le gel échographique ainsi que la solution seront chauffés avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux. Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie de tumeur cancéreuse (utilisation de souris développant un adénocarcinome pancréatique). Le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules puis encore 1 à 2 semaines d’attente pour obtenir une tumeur visible par échographie. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 8 semaines.
Etude du taux mitotique des astrocytes dans l’hypothalamus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
72 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection intra-péritonéale d'un marqueur des cellules en division, puis est mis à mort pour prélever du tissu cérébral profond. Le porteur cherche à savoir si des astrocytes d'une région du cerveau liée au sommeil se divisent, en travaillant sur des souris de 4, 30 et 80 jours. Il affirme qu'aucune modélisation ne simule un cerveau et que le modèle murin est "la seule approche possible".
Objectifs
Ce projet vise à étudier un type d'astrocyte (les cellules non neuronales du système nerveux les plus abondantes chez les mammifères) décrit dans une région du cerveau importante dans la régulation du sommeil. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle ces cellules correspondent à des cellules en cours de division, ce qui ferait de cette zone une zone de prolifération astrocytaire importante compte tenu de la densité observée de ces cellules. La mise en oeuvre de ce projet permettrait de caractériser le taux de division des astrocytes au cours de la période post-natale En effet, les astrocytes de notre région d'intérêt n'ont encore jamais été caractérisés malgré leur rôle dans la régulation du sommeil lent.
Bénéfices attendus
Ce projet servira à mieux caractériser le noyau préoptique ventrolatéral de l'hypothalamus, notre région d'intérêt impliquée dans le déclenchement et le maintien du sommeil lent ainsi que dans la thermorégulation, et s'inscrit dans le cadre d'un projet visant à étudier le rôle des astrocytes de cette région. Des études récentes soulignent l'importance des astrocytes de cette région dans la régulation du sommeil lent. Or les troubles du sommeil concernent 30% de la population générale et sont associés à de nombreuses pathologies telles que l'hypertension artérielle, le diabète, la dépression ou encore les accidents vasculaires cérébraux. Une meilleure compréhension du rôle des astrocytes et des interactions neurone-astrocyte dans la régulation du sommeil est donc nécessaire pour faire face à cet enjeu de santé publique.
Procédures
Notre projet consiste à injecter un produit qui permettra de suivre les cellules en prolifération. Nous réaliserons donc une injection intrapéritonéale sur animal vigil (1min par animal). Les animaux seront enuite replacés dans leur cages jusqu'à leur mise à mort pour l'analyse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont ceux liés à l'injection en elle-même. Le produit utilisé n'est cependant pas nocif et dilué dans du PBS, donc pas irritant non plus. La contention peut, elle, induire un stress léger.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour notre projet car nos expériences demandent que nous puissions prélever du tissu cérébral profond fixé afin de visualiser au microscope les cellules en prolifération marquées par le produit injecté.
Remplacement
Un modèle animal est nécessaire pour étudier le comportement de ces cellules tout en prenant en compte l'ensemble des variables intervenants au cours du développement de l'animal. La visualisation des astrocytes, qui permettra de confirmer que les cellules marquées sont bien des astrocytes, est rendue possible par l’utilisation d’une lignée de souris transgénique. Le fait d’utiliser des souris transgéniques qui nous permettent de visualiser l’ensemble de leur anatomie est crucial. Aucune modélisation ne permet de parfaitement simuler un cerveau, ses cellules et les différentes interactions entre elles. Toutefois, le modèle souris a été choisi pour les raisons évoquées plus haut.
Réduction
Afin de mesurer le taux de division des astrocytes de notre région d'intérêt, nous devons réaliser ces mesures dans une région contrôle. Le cortex moteur primaire (une aire du cortex cérébral qui participe à la planification, au contrôle et à l'exécution des mouvements volontaires des muscles du corps) n'a jamais été décrit comme une zone où les astrocytes se divisent, et servira donc de région contrôle dans notre étude. De plus, le cortex moteur primaire et notre région d'intérêt sont colocalisés sur les coupes de cerveau sur lesquelles nous travaillerons, ce qui permet de minimiser le nombre de coupes nécessaires. De même, nous travaillerons sur les deux hémisphères de chaque coupe réalisée de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les injections seront réalisées par du personnel habitué, réduisant ainsi le temps de manipulation et donc le stress éventuel des animaux.Des points limites ont été prévus. Si malgré la prise en charge par des analgésiques, le niveau de douleur de l’animal, évalué par des critères quantifiables adaptés, reste trop élevé, nous procèderons à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée aux souris les plus jeunes de manière à diminuer l'impact de leur manipulation.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, à développement rapide, modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités avec l'homme en terme de mécanismes moléculaires et cellulaires. De plus, toutes les études que nous avons réalisées jusqu’à présent sur ces morphologies astrocytaires ont été effectuées chez la souris. Nous devons à présent démontrer que l’origine de ces doubles, mis en évidence chez la souris, viennent de divisions cellulaires récentes. Il n’y a donc aucun intérêt à changer de modèle à ce niveau. Pour notre projet, l'utilisation d'un modèle murin est la seule approche possible. Les trois groupes d'animaux correspondent à des animaux utilisés 4, 30 et 80 jours après leur naissance. L'objet de notre étude étant de caractériser la fonction des astrocytes "en doublets" du noyau préoptique ventrolatéral, en testant l'hypothèse selon laquelle il s'agirait d'astrocytes en division ou récemment divisés, nous travaillerons 4 jour après la naissance des animaux (mise en place du réseau astrocytaire), à 30 jours post-natal (stade de référence pour l'étude du sommeil), et à 80 jour post-natal (stade mature chez la souris, auquel nous avons réalisé d'autres études complémentaires de celle-ci). L'intérêt de travailler avec des souris à ce dernier stade est de pouvoir comparer les données obtenues à ce stade avec celles obtenues chez les souris à 4 et 30 jours post-natal, et ainsi étudier la mise en place du réseau astrocytaire au cours du développement post-natal et son impact sur le comportement de sommeil.
Etude in vivo chez la souris des effets immunitaires produits par l’exposition à des micro-ondes modulées et pulsées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
628 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par des trypanosomes, exposées à des ondes radiofréquences huit heures par jour pendant cinq jours et prélevées au sang à la queue, pour tester un effet immunostimulant des ondes contre cette parasitose. Toutes les souris étant infectées, elles sont mises à mort avant que leur parasitémie n'atteigne un seuil jugé irréversible. Le porteur affirme qu'il "n'y a pas de substitution possible au modèle animal" pour étudier l'évolution d'une parasitose.
Objectifs
Les maladies parasitaires ou parasitoses représentent un lourd fardeau pour les populations des pays en émergence. Elles constituent des affections multifactorielles dépendant de la constitution génétique de l’hôte, de son alimentation et de son environnement physique et chimique. Toute modification d’un des facteurs peut avoir des répercussions sur la charge parasitaire. Les études des relations hôte-parasite ont mis en évidence le rôle essentiel du système immunitaire de l'hôte dans la protection contre ces maladies. Ce système peut être stimulé par des molécules chimiques ou des moyens physiques dont certains ont montré leur efficacité. Cette deuxième possibilité considérée comme moins toxiques pour l'organisme que l'introduction de molécules étrangères doit être privilégiée, non seulement pour son intérêt éventuellement thérapeutique, mais également pour approfondir nos connaissances sur le système immunitaire. Les ondes électromagnétiques ont déjà montré un effet immunostimulant dans différentes situations. De plus, leur innocuité vis-à-vis des mammifères aux doses proposées a également été démontrée. Le projet présenté vise à identifier et optimiser les caractéristiques d’ondes électromagnétiques susceptibles d'avoir un effet protecteur dans un modèle de parasitose appelée trypanosomose expérimentale .Pour cela, des souris infestées par des trypanosomes seront exposées à des ondes électromagnétiques et le suivi de leur parasitémie (nombre de parasites circulants dans le sang) sera considéré comme un indicateur de la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Une réponse positive aux ondes avec diminution de la charge parasitaire sera étudiée au niveau immunitaire. Cet effet peut permettre de mettre en évidence un moyen de défense encore mal connu dans les maladies infectieuses. De plus, de nombreuses stimulations physiques se sont révélées intéressantes et dénuées de toxicité dans différentes conditions pathologiques chez l’homme, en particulier en cancérologie.
Procédures
Les souris seront exposées, libres de leurs mouvements, 8 h/ jour, 5 jours consécutifs pendant 1 semaine à différents signaux radiofréquences. Trois prélèvements de sang seront réalisés pour évaluer la parasitémie. Pour cela, une goutte de sang d'un animal parasité est prélevée à la queue, après section fine à l'extrémité, avec un capillaire (5 µl) pour comptage des parasites .
Impact sur les animaux
L’exposition aux ondes ne sera pas elle-même source de souffrance des animaux et de leur mort. Aucun effet biologique négatif de l’exposition aux radiofréquences n’a été confirmé sur la souris pour des niveaux de puissance reçus inférieurs ou égaux à 4 W/kg. A ce niveau de puissance, le potentiel échauffement des tissus induit par l'exposition aux radiofréquences est compensé par la thermorégulation physiologique et n'implique aucune souffrance chez les souris. La charge parasitaire des souris trypanosomées est très bien supportée, et les animaux ne présentent pas de signes cliniques. L’animal est euthanasié lorsqu’il présente des signes de souffrance ou lorsque la parasitémie atteint un seuil jugé irréversible (200 000 parasites par μl) antérieur à l’apparition des signes cliniques. Chaque souris subit 3 prises de sang réparties sur 2 jours. Elles sont réalisées très rapidement par une personne expérimentée et représentent un stress léger.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Toutes les souris sont infestées par des trypanosomes ce qui impose leur mise à mort avant l’atteinte du seuil jugé irréversible de la parasitémie.
Remplacement
Remplacer le modèle animal n’est pas possible pour ce projet qui étudie des processus dynamiques du système immunitaire qui ne peuvent pas être recréés sur des modèles in vitro. Ainsi, l’évolution d’une parasitose ne peut être étudiée que sur un modèle animal et ne peut être remplacée en aucun cas par d’autres méthodes alternatives expérimentales : in vitro, peu de parasites survivent, et les conditions de culture des parasites, modifiant la majorité de leurs propriétés, ne sont pas satisfaisantes pour atteindre les objectifs requis. Il n’y a pas de substitution possible au modèle animal
Réduction
Nous utiliserons le nombre d'animaux qui nous permettra de réaliser tous les tests, soit des groupes de 10 souris (7 exposées et 3 non exposées) par niveau d'exposition pour l'identification de la dose la plus active (24 testées) soit 24 X10 = 240 souris en duplicata soit 240 X2 =480 souris , plus 148 souris pour entretenir la souche parasitaire (260 semaines d’expérimentations , relance de la souche toutes les 7 semaines avec 2 souris en duplicata) et donc un total maximal de 628 souris. Si une condition s’avère efficace statistiquement, nous mettrons l’accent sur sa duplication. En l’absence d’effet, la condition d’exposition ne sera pas répliquée.
Raffinement
Les souris seront placées dans des cages en plexiglass utilisées dans l’animalerie, avec 7 souris par cage maximum. Les souris seront exposées aux ondes dans ces mêmes cages, ce qui supprimera la manipulation et évitera donc de les stresser. Elles bénéficieront d’un enrichissement avec une hutte en polycarbonate rouge, ainsi que du matériel de nidification et du matériel à ronger. Les conditions d'hébergement dans l’animalerie et dans la salle dans laquelle seront exposés les animaux présentent une ambiance contrôlée. Une surveillance quotidienne sera assurée par le personnel de l’équipe. Une fiche de suivi des animaux permettra d’évaluer l’atteinte de points limites et la mise en place de mesures adaptées (observation, analgésie conseillée pour score signe de douleur légère, observation accrue et analgésie obligatoire pour score correspond à une souffrance avérée et un score signe de douleur sévère entrainera la mise à mort de l’animal). Les points suivants seront vérifiés : - l’apparence physique externe, par exemple l'absence de signes d'agression (sang, morsure, lésions de la peau), les caractéristiques de la fourrure, qui doit être lisse et propre (blanche) - les changements du comportement et de l'interaction avec les partenaires, par exemple l'agitation, la prostration, etc. - les réponses comportementales aux stimuli externes, par exemple, la réaction au bruit, l'émission de cris anormaux - De plus, la variation du poids de l'animal sera surveillée avec une pesée quotidienne si les souris présentent des signes de souffrance. Des femelles seront utilisées, permettant ainsi d’éviter l’agressivité entre des groupes de mâles.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée dans ce type d’étude, ce qui a permis de constituer une base importante d’informations permettant de guider la conception de nos protocoles. De plus, il existe des analogies entre le système immunitaire des souris et celui des autres mammifères, rendant ces études pertinentes. Nous utiliserons les femelles pour s’affranchir des risques de blessures dans les groupes mâles. Nous commanderons des animaux âgés de 6 semaines afin d’avoir une habituation à l’animalerie de 2 semaines avant le début des expérimentations. Ils entreront ensuite dans les protocoles d’étude, à l’âge de 8 semaines, qui correspond à leur maturité immunitaire.