Souris
Caractérisation d’un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'étude porte sur des nouveau-nés porteurs d'une mutation du syndrome d'Ondine, une maladie qui perturbe le contrôle de la respiration, et le porteur compte comme intervention le fait que ces animaux meurent de leur pathologie. Chaque nouveau-né est tatoué, séparé de sa mère pour enregistrer sa respiration, puis anesthésié pour les prélèvements. Le porteur espère que ce modèle sera moins sévère que les précédents mais indique ne pas pouvoir exclure une mortalité précoce.
Objectifs
Chez l'Homme, le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare conduisant à une augmentation du taux de CO2 dans le sang par perte du contrôle automatique de la respiration et une absence des signaux d'alerte à un trop haut taux de CO2. Il est le plus souvent lié à des mutations dans le gène PHOX2B conduisant à une protéine trop grande. Les différents modèles murins de ce syndrome générés jusqu'à présent présentent un défaut de réponse à l’augmentation du CO2 en post natal conduisant à une mortalité précoce, dans les premières heures ou jours de vie. Notre projet a pour objectif de caractériser un nouveau modèle murin que l'on espère plus proche des patients, à savoir moins drastique. L’intérêt général du modèle souris, utilisée comme un modèle préclinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats) afin d'élaborer de nouvelles thérapies géniques translationnelles.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur le gène PHOX2B qui produit la protéine PHOX2B. Cette protéine est exprimée dans une population de neurones indispensable à la réponse respiratoire à l’augmentation du taux de CO2 dans le sang. Ces souris à la naissance ne présentent pas de réponse à cette augmentation de CO2 dans le sang et n'adaptent pas leur respiration en conséquence. Ce déficit est partiellement restauré chez les souris adultes si les animaux survivent. Les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre la pathologie du syndrome d’Ondine.
Procédures
Le fait que nos souris issues du croisement des deux lignées meurent de leur pathologie est considéré comme une intervention. Les animaux seront soumis à des manipulations et des tests non invasifs dès les premiers jours après la naissance. Les nouveau-nés seront tatoués sous une patte afin de pouvoir les distinguer. Ils seront également séparés de la mère pour l'enregistrement des paramètres respiratoires pendant 10 minutes 3 fois par semaine. Des anesthésies terminales seront réalisées pour réaliser les prélèvements.
Impact sur les animaux
Les autres modèles murins du syndrome d’Ondine présentent un défaut de réponse à l’augmentation du CO2 dans le sang en post natal conduisant à une mortalité précoce, dans les premières heures ou jours de vie. Nous espérons que notre modèle sera plus proche des patients et présentera un phénotype moins sévère. Nous ne pouvons cependant pas exclure des anomalies respiratoires conduisant à une mortalité prématurée des animaux. Les nuisances principales sont la séparation de la mère et les injections pour les anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'Humain, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons un croisement d'animaux reproducteurs nous permettant d’obtenir théoriquement 50% d'individus sains et 50% malades. Des souris malades mâles et femelles seront étudiées pour réduire le nombre car la pathologie et identique chez les deux sexes. Notre étude consiste à comparer deux groupes d’animaux génétiquement différents. Nous montrons qu'il nous faut au moins 17 souris par groupe pour avoir des résultats statistiques. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15% et arrivons à un total de 20 souris par groupe. Dans la procédure, nous étudierons les animaux avec 2 types d’analyse. Nous aurons donc besoin de 80 animaux (2 génotypes x 2 analyses x 20 animaux).
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. L'hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux. Ils sont hébergés dans des cages avec enrichissements, eau et nourriture ad libitum. La température, la luminosité, l'environnement sonore et l'hygrométrie sont contrôlés. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress. Le prélèvement pour génotypage par PCR est réalisé par biopsie à l'oreille et nous permet en même temps d'identifier nos souris afin de réduire la douleur et le stress. Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussées des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la SBEA. La semaine avant la date prévue de mise bas, la souris gestante sera habituée aux odeurs qu’elle pourra sentir sur les nouveau-nés. Les nouveau-nés seront isolés de la mère dans une cage avec un tapis chauffant et un morceau du nid pour faire les enregistrements de la respiration avant de retourner avec leur mère.
Choix des espèces
Les rongeurs sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. La création de modèles génétiquement altérés permet de modéliser les mutations rencontrées chez les patients. Plusieurs modèles murins du syndrome d'Ondine existaient mais le phénotype est sévère et l'étude des nouveau-nés compliquée. Nous espérons que notre modèle murin sera moins sévère afin que l'on puisse étudier la respiration. Les souris seront utilisées dès le stade nouveau-né et dans les jours qui suivent afin de suivre la fonction respiratoire dès les stades les plus précoces de la pathologie.
Evaluation de l’efficacité de l’inhibition d’un gène pour le traitement du mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules de mélanome sous la peau, jusqu'à dix gavages et six injections dans l'abdomen, pour tester une molécule censée resensibiliser les tumeurs aux traitements. Le porteur indique que la tumeur au flanc peut gêner les déplacements et que le gavage peut irriter la trachée. Les retombées pour les patients atteints de mélanome résistant restent formulées comme une perspective, l'objectif immédiat étant de démontrer l'effet de la molécule chez la souris.
Objectifs
Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Nous avons identifié, à travers l’étude de cellules de patient, un gène fréquemment altéré et impliqué dans la résistance aux traitements. Nous avons identifié une molécule capable d'inhiber l'action de ce gène et de resensibiliser les cellules tumorales de patients, initialement résistantes, aux traitements conventionnels. Ce projet a pour but de démontrer chez la souris l’efficacité de cette molécule sur la sensibilité des cellules de mélanome, dans un organisme vivant complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra potentiellement de mettre en évidence l’effet thérapeutique de notre molécule sur le mélanome et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.
Procédures
Tous les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales, un gavage par jour ou tous les deux jours pendant deux semaines soit 6 ou 10 gavages et pour certains animaux. Certains subiront aussi 6 injections de traitement dans l'abdomen. Tous les animaux seront soumis à de la contention, qui durera moins d'1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra potentiellement les gèner dans leur déplacement. Le gavage peut provoquer une irritation de la trachée, entrainant des difficultés pour l'alimentation. La contention va également leur générer du stress. Aussi, les injections peuvent induire des plaies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole, au maximum 1 mois après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date. Les tumeurs seront récupérées pour être analysées.
Remplacement
Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de notre molécule. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé grâce à des outils statistiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique et moléculaire de la tumeur).
Raffinement
Des points limites précis ont été définis pour identifier le plus précocément possible toute souffrance de l'animal. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et tous les jours lorsque le traitement par gavage débutera. Après traitement, les souris seront suivies 3fois par semaine jusqu'à leur mise à mort. Pour le gavage, nous utiliserons l’excipient CornOil, le moins irritant et le mieux toléré pour la souris. Nous avons également choisi des lignées non métastatiques car nous n'évaluerons pas cette donnée dans nos procédure. Aussi, le phénotype dommageable des souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire.
Impact d’un régime gras sur les rythmes circadiens et la mémoire chez la souris jeune
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une puce sous-cutanée, est logé seul pendant deux mois et demi, soumis pour la moitié d'entre eux à un régime gras, puis à des tests comportementaux et à un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement crée un stress chez cette espèce grégaire et que les tests peuvent provoquer anxiété et douleur modérée. L'étude cherche à relier chez le mâle et la femelle les effets d'un régime gras sur les rythmes de 24 heures, le métabolisme et la mémoire.
Objectifs
Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles. AVENANT: Notre hypothèse tertiaire est qu'un accès du régime gras et sucré chronomodulé (c'est-à-dire ici limité à la période habituelle d'alimentation chez la souris) pourrait, comme chez les individus mâles, réduire l'impact nutritionnel sur les fonctions cognitives des souris femelles.
Bénéfices attendus
La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h (approches de nutrition chrono-modulée).
Procédures
Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les souris recevront une puce électronique sous-cutanée, ce qui pourrait provoquer une légère inflammation au site d'injection. Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental. AVENANT: Le régime chonomodulé devrait limité le surpoids des animaux.
Devenir
L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.
Raffinement
Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.
Induction d’arthrite dans un modèle murin de production d’autoanticorps
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit treize injections et sept prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse pour déclencher une arthrite des pattes, décrite par le porteur comme la nuisance sévère du protocole. L'objectif est de mettre au point un modèle combinant production d'auto-anticorps et arthrite, en vue de tester de futurs traitements de la polyarthrite rhumatoïde humaine. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'autre alternative" et revendique le "besoin" d'un modèle réunissant les deux caractéristiques.
Objectifs
Ce projet permettra de développer un modèle d'arthrite « auto-immune ». Ce modèle murin permettra d'analyser la production d'auto-anticorps, la genèse de l'arthrite et potentiellement d'évaluation des solutions thérapeutiques destinées à la polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Avoir un modèle murin qui combine la production d’autoanticorps et l’arthrite nous permettra de tester de nouvelles thérapies chez l’homme qui visent à éliminer les cellules B productrices des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
Les souris vigiles seront injectées : 3 fois en sous cutané dans le dos avec une protéine ou la solution saline. 1 fois en sous cutané dans le dos ou en intrapéritonéal avec un composant bactérien. 9 fois en sous cutané dans le dos ou en intrapéritonéal avec des anticorps Les souris seront prélevées 7 fois dans la veine mandibulaire d’un volume de 0.1 ml de sang après une anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Des nuisances modérées comme des difficultés à se déplacer pendant quelques minutes, des démangeaisons sur le dos et la joue pendant quelques secondes peuvent se produire suite aux interventions (13 injections de composés pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 7 prélèvements de sang de 10 secondes). La nuisance sévère est l’arthrite des pattes. L’ensemble des interventions listées ci-dessus est susceptible d’induire une arthrite chez les souris pendant quelques jours.
Devenir
A la fin du protocole, les 360 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.
Remplacement
Il n’existe pas d’autre alternative à l’expérimentation animale qui permettrait d’analyser globalement la production des autoanticorps et le développement de l’arthrite. Chez l’homme, il est difficile d’analyser l’apparition des autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Nous développons des traitements susceptibles de bloquer la production des autoanticorps et le développement de l’arthrite mais pour les tester nous avons besoin d’un modèle où les souris font à la fois des autoanticorps et une arthrite.
Réduction
Nous allons suivre pendant 60 jours ou 70 jours l’effet de l’injection de molécules susceptibles d’induire une arthrite sur des souris de 2 fonds génétiques. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Nous allons tester 6 groupes de 30 souris pour chacun des 2 fonds génétiques. Le nombre total de souris sera de 360.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une plateforme de gestion et d'acquisition du matériel d'animalerie pour les équipes de recherche. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens quotidiennement pour suivre l’apparition d’arthrite. Une mesure systématique du gonflement des pattes sera faite à l’aide d’un pied à coulisse sur la souris. Un score de gravité sera attribué en fonction de l’inflammation et/ou de la déformation de chaque doigt et paume de l’animal. Les signes de souffrance seront aussi chiffrés de manière hebdomadaire dans une grille de score. De la nourriture et de l’eau gélifiée seront mis à disposition dans la cage si les souris montrent des difficultés à atteindre la nourriture et le biberon d’eau positionnés en haut de la cage. En cas d’atteinte des points critiques, la souris sera immédiatement retirée de l’étude et euthanasiée. Une anesthésie gazeuse sera réalisée pour les prélèvements de sang dans la veine mandibulaire. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole.
Choix des espèces
Nous allons choisir des souris qui ont des fonds génétiques à risque de développer une arthrite. Chez l’homme, les deux allèles HLA-DR qu’il exprime déterminent le risque pour un individu de développer une polyarthrite. C’est la raison pour laquelle nous souhaitons développer un modèle chez des souris BL6 qui expriment HLA-DRB1*04:01, allèle de susceptibilité à la polyarthrite ou des souris C3H dont les molécules H-2 ressemblent à HLA-DRB1*04:01. Des souris adultes âgées de 7 semaines d’un poids moyen de 25g seront testées dans un modèle murin de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle tente de reproduire la polyarthrite et cette maladie touche plus fréquemment les adultes.
Détection de l’oxy-myoglobine pour quantifier l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
10 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit deux chirurgies espacées de trois heures, une ouverture du thorax avec ligature d'une artère du cœur d'environ 140 minutes puis la pose d'un cathéter, avant la mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique que ces interventions peuvent provoquer des douleurs modérées à sévères pendant les quatre heures d'anesthésie. L'objectif immédiat reste de valider une méthode d'imagerie de l'infarctus, le transfert vers les patients étant renvoyé au conditionnel et au long terme.
Objectifs
L'infarctus du myocarde touche environ 80 000 personnes en France (2019) et le taux de mortalité à 1 an est encore de 15% malgré une nette amélioration du diagnostic et des soins. Parmi les pistes d'amélioration de la prise en charge, une meilleure quantification de la taille de l'infarctus lors de la phase aiguë pourrait permettre une personnalisation de la prise en charge suite à l'angioplastie (intervention permettant de rétablir la circulation sanguine dans une artère qui a été obstruée). L'objectif principal du projet général est la preuve-de-concept d'une nouvelle méthode d'imagerie permettant la détection et la quantification précoce du degré d'intensité de l'infarctus du myocarde. Il s’agit ici d’une « étude complémentaire » venant compléter et consolider ce projet afin de confirmer manière robuste notre hypothèse de travail.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice de cette étude consiste à renforcer notre démonstration (permettant sa publication et diffusion dans la communauté scientifique) de la pertinence de l’imagerie photonique dans la quantification précoce de la taille de nécrose post-infarctus. Par effet de conséquence et à plus long terme, nous pensons que notre étude ouvrira un futur champ de développement technologique afin de tenter de transposer notre méthode de quantification du niveau d'oxydation tissulaire, ex vivo, en une méthode applicable in vivo dans un modèle expérimental. In fine, nous espérons que cette stratégie conduira au transfert de notre concept vers l'application clinique pour l'Homme.
Procédures
Deux interventions chirurgicales, espacées de 3h (sans réveil de l’animal entre les deux), seront réalisées sur l’animal, sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée : - Une chirurgie thoracique (sous assistance respiratoire) permettant d’induire la ligature transitoire d’une artère (durée estimée : 140mn) - La mise en place d’un cathéter de perfusion dans l’artère carotidienne (durée estimée : 10mn) suivi de la mise à mort de l’animal pour permettre l’analyse des tissus
Impact sur les animaux
La chirurgie thoracique et la chirurgie de pose de cathéter (l’ensemble réalisé sous anesthésie et assistance respiratoire) peuvent induire, sur toute la durée d’anesthésie (4h), des douleurs modérées à sévères localisées (thorax et cou), prises en charges par ailleurs. En dehors de la chirurgie, aucun acte pouvant engendrer de nuisances n’est pratiqué sur l’animal.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur pour analyse 3D de l’organe (microscopie photonique).
Remplacement
Notre démonstration initiale du rôle de la myoglobine a été initiée par une approche d’imagerie in vitro. Nous avons ensuite mise en évidence une corrélation entre la présence de la myoglobine et notre signal mesuré par imagerie dans des cardiomyocytes (cellules cardiaques) isolées de souris. L'étude de ce projet va permettre de valider définitivement le rôle majeur de la myoglobine en démontrant que son absence (chez des animaux qui en sont dépourvus) corrèle avec la perte du signal mesuré par imagerie.
Réduction
S’agissant ici d’une validation terminale de l’hypothèse de travail et compte tenu de la nature de la réponse attendue (i.e. perte majeure du signal mesuré par imagerie) nous avons pu réduire les effectifs au maximum, sans préjudice pour le résultat scientifique, mais de sorte à pouvoir réaliser un test statistique sur les données.
Raffinement
- Le modèle d’infarctus du myocarde utilisé ici fait appel à l’approche chirurgicale impliquant deux raffinements que nous avons récemment mis au point et validés au laboratoire, permettant de consolider en outre la pertinence de ces raffinements pour les futurs projets. - En accord avec l’objectif du projet, la durée entre les deux interventions (24h habituellement) a pu être réduite ici à 3h. Ceci nous a permis d’envisager un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure, évitant ainsi les contraintes et conséquences, pour l’animal, d’un réveil post-opératoire de quelques heures entre les deux interventions.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires : Malgré certaines différences physiologiques notables, la souris est en effet un modèle qui a fait ses preuves dans l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde. De plus, la question posée dans ce projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiées, et la lignée transgénique pour le gène d’intérêt est déjà en cours d’élevage (évitant une phase de création de lignée spécifiquement pour ce projet). Les animaux participant à ce projet devront préférentiellement être de jeunes adultes (8 à 20 semaines) afin d'homogénéiser cette dernière étude avec l'ensemble du projet.
Dialogue Foie-Tissu Adipeux dans les Maladies Métaboliques: Régulation par les Récepteurs Nucléaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
6 588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, des injections intraveineuses, des prélèvements de sang après incision au scalpel, parfois une irradiation, un régime gras jusqu'à vingt-quatre semaines et, pour certaines, un choc infectieux provoqué. L'objet est d'étudier le dialogue entre le foie et le tissu adipeux dans l'obésité et le diabète. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne rendent pas compte des interactions entre organes.
Objectifs
L'obésité est un problème de santé publique important, car elle accroit considérablement le risque de développer de nombreuses pathologies graves telles que le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et les cancers. Face à l’épidémie d’obésité dans le monde, il est primordial de trouver les moyens thérapeutiques de lutter contre ce fléau. Lors d’une obésité, on constate des adaptations marquées de plusieurs organes, notamment les tissus adipeux et le foie. Cependant, la capacité d’adaptation de ces organes est limitée et elle peut être dépassé quand l'obésité est présente de façon chronique. Ces dernières années, nombreuses équipes de recherche ont mis en évidence un dialogue important inter-organe et inter-cellulaire au sein du même tissu. Ce dialogue a une forte impacte sur le fonctionnement de chaque tissu, mais aussi l'homéostasie métabolique de l'individu. Ce projet a pour but d'identifier les facteurs conduisant au dysfonctionnement métabolique dans le contexte de l'obésité. Dans nos études, nous nous focaliserons sur les voies métaboliques qui servent pour l’énergie de l'organisme (glucides, gras) et pour synthétiser les composants de la cellule (protéines, lipides, etc.).
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que ce projet conduit à l'indentification des mécanismes pathophysiologique de l'obésité et de ses complications ainsi que l'identification de plusieurs cibles thérapeutiques potentiellement capable de prévenir l'induction des pathologies tels que le diabète de type 2, l'athérosclérose ainsi que la stéatose hépatique. Ceux seront des bénéfices importants pour la santé humaine réalisables à long terme.
Procédures
Les animaux seront identifiés par prélèvement d’une biopsie (~4 mm) de la queue et la pose d'une bague à l'oreille, une fois. Ensuite, ils subiront une injection intraveineuse et un prélèvement de sang à la queue après incision avec un scalpel stérile. En option, certains animaux seront irradiés (2 fois, 20 minutes dans la boîte) pour détruire les cellules immunitaires afin de les reconstituer par transfert adoptif des cellules de la moelle osseuse. Ensuite, certains animaux seront soumis à un régime alimentaire pendant une durée allant jusqu'à 24 semaines pour induire une pathologie telle que l'obésité, l'athérosclérose ou la stéatose hépatique, nécessitant un prélèvement sanguin préalable pour la randomisation des souris. En alternative, les animaux subiront une procédure permettant d'induire un choc endotoxémique : injection d'un composant de la paroi cellulaire des bactéries, suivi d'un prélèvement sanguin d'environ 50 µL à la queue. Ensuite, les animaux seront soumis à une ou plusieurs analyses du métabolisme du glucose ou des lipides : gavage oral ou injection, 5 prélèvements sanguins à la queue espacés d'au moins 15 minutes, pour une durée totale de test de 2 à 4 heures. En alternative, les animaux subiront une chirurgie pour poser un cathéter, puis des prélèvements de sang et une infusion continue par le cathéter pendant au maximum 4 heures. Enfin, pendant une analyse du métabolisme en cages métaboliques, les animaux seront hébergés individuellement, puis éventuellement exposés à des températures élevées (thermoneutralité) ou basses (froid) pendant jusqu'à 4 semaines. À la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés après un prélèvement sanguin sous anesthésie par inhalation pour étudier les organes cibles.
Impact sur les animaux
Certaines procédures peuvent engendrer une douleur liée à la manipulation, telles que l'incision avec un scalpel, les injections à l'aide d'une seringue, la pose d'une bague d'identification et la biopsie de la queue pour le génotypage. En ce qui concerne le choc endotoxémique, il provoque une forte induction de l'inflammation. Pendant certaines procédures, les animaux seront mis à jeun pendant jusqu'à 24 heures, mais ils auront toujours un accès ad libitum à l'eau potable. En ce qui concerne le suivi du métabolisme dans les cages métaboliques, l'hébergement des animaux à la thermoneutralité ou dans un environnement froid peut induire un stress thermique. Pour l'infusion des composés par voie intraveineuse, la chirurgie pour la pose du cathéter est une source de stress et peut entraîner une douleur supplémentaire.
Devenir
À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer des tissus en vue de réaliser des analyses histologiques et moléculaires supplémentaires, lesquelles nous fourniront des informations cruciales sur les adaptations des tissus adipeux et du foie au cours de l'obésité.
Remplacement
Il existe des modèles in vitro pour étudier les hépatocytes, les adipocytes et les cellules immunitaires. Cependant, ces modèles ne permettent pas d'étudier les interactions intercellulaires et interorganes. Pour cette raison, nous ne pouvons pas nous passer de l'utilisation de modèles animaux. En complément des modèles in vitro, nous avons mis en place plusieurs modèles, tels que les hépatocytes et les adipocytes primaires, qui permettent de remplacer certaines expériences, mais nécessitent tout de même l'utilisation d'animaux (1 à 2 par génotype par expérience au lieu de 10 à 15). De la même manière, nous avons choisi des procédures d'évaluation de la progression de la physiopathologie qui permettent d'atteindre les objectifs scientifiques sans sacrifier les animaux, afin de combiner les différentes procédures sans multiplier explicitement les lots d'animaux utilisés
Réduction
Quand il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par un autre modèle, la réduction peut se faire à travers trois moyens principaux : (1) Optimisation des élevages pour éviter la production d'animaux inutiles. (2) Utilisation d'analyses statistiques (réalisées avec des logiciels spécifiques) afin de déterminer préalablement le nombre d'animaux nécessaire pour nos expériences. (3) Formation approfondie pour ceux qui manipuleront les animaux, visant à maîtriser les gestes techniques et à minimiser le stress pour les animaux. La maîtrise technique contribue à réduire la variabilité inter-animale et permet de diminuer le nombre d'animaux nécessaire pour confirmer statistiquement un effet biologique. Enfin, nous avons mis en place plusieurs modèles in vitro, tels que les hépatocytes et les adipocytes primaires, qui nécessitent beaucoup moins d'animaux par expérience (1 à 2 par génotype par expérience au lieu de 10 à 15).
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans un environnement non anxiogène et absent des pathogènes qui peuvent impacter la santé des animaux. Les conditions utilisées sont favorables à leur bien-être : température régulée, un nombre d'animaux par cage limité, un cycle normale de lumière/obscurité, nourriture et eau ad libitum, enrichissement de la cage avec de petites maisons. Les vérifications journalières des animaux sont faites et un registre de bien-être animale est à disposition pour coordonner les efforts autour de l'amélioration des conditions d'hébergement des animaux. NOUS SERONS VIGILANTS SUR L'ETAT DE SANTE DES ANIMAUX ET NOUS PRENDRONS EN COMPTE LES PARAMETRES SUIVANTS 1) PERTE DE POIDS SUPERIEURE A 15% (FAIM, SOIF, MALNUTRITION) 2) APPARENCE PHYSIQUE EXTERNE (POIL HIRSUTE, DOS ROND, SIGNES D'INFECTION OU BLESSURES) 3) SIGNES CLINIQUES MESURABLES (DIMINUTION DE TEMPERATURE RECTALE) 4) CHANGEMENT DE COMPORTEMENT (PROSTRATION, VOCALISATION) 5) REPONSE COMPORTEMENTALE AUX STIMULI EXTERNES LE SUIVI DES ANIMAUX SERA FAIT QUOTIDIENNEMENT PAR CAGE ET DEUX FOIS PAR SEMAINE LORS DES ETUDES DE REGIME. POUR LES PROCEDURES DURANT MOINS D'UNE JOURNEE, SEULS LES CHANGEMENTS DE COMPORTEMENT ET D'APPARENCE PHYSIQUE SERONT EVALUES CAR LA PERTE DE POIDS NE S'APPLIQUE PAS. EN REVANCHE, LA TEMPERATURE CORPORELLE PEUT TOUJOURS ETRE EVALUEE A LA MAIN. SI CES LIMITES SONT ATTEINTES, UN EFFORT SERA FAIT POUR AMELIORER LE BIEN-ETRE DE L'ANIMAL SELON LE CAS. PAR EXEMPLE, SUITE A UNE PERTE DE POIDS SUPERIEURE A 10%, UN SUIVI INDIVIDUEL PLUS FREQUENT SERA FAIT POUR VOIR SI L'ANIMAL REPREND OU MAINTIEN CE POIDS. SI LA LIMITE DE 15% DE PERTE DE POIDS EST ATTEINTE, L'ANIMAL SERA EXCLU DE L'EXPERIENCE ET IL SERA EUTHANASIE. POUR UNE TEMPERATURE CORPORELLE REDUITE (MESUREE PAR UNE SONDE RECTALE), L'ANIMAL SERA SURVEILLE PLUSIEURS FOIS DANS LA JOURNEE AFIN D’ETABLIR L’AMELIORATION OU PAS DE SON ETAT. DANS TOUS LES CAS, UNE PERIODE PROLONGEE (JUSQU'A 3 JOURS POUR LA PERTE DE POIDS OU LE CHANGEMENT DU COMPORTEMENT, OU UNE JOURNEE COMPLETE POUR UNE BAISSE DE TEMPERATURE CORPORELLE) NECESSITE L'EUTHANASIE DE L'ANIMAL.
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour la recherche en métabolisme et physiologie. Elles ont un temps de génération relativement court et, selon la souche choisie, elles peuvent développer les pathologies comme l'obésité, l'insulino-résistance et encore la maladie du foie gras (non-alcoholic fatty liver disease) avec les caractéristiques assez proches à ces pathologies chez l'homme. Enfin, il existe un grand nombre de lignées génétiquement modifiées disponibles et ile est relativement facile d’en créer de nouvelles pour mieux investiguer les pathologies métaboliques. Les souris seront utilisées au stade adulte (âge > 8 semaines). Les pathologies métaboliques sont des pathologies de l'adulte.
Utilisation de modèles d’infections et d’élimination microbiennes chez les souris associées à une évaluation thérapeutique d’un candidat médicament
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par des bactéries après mise en narcose, puis tuées 72 heures plus tard pour un prélèvement sanguin et tissulaire terminal. L'objet est d'étudier la réponse immunitaire à des bactéries responsables de sepsis et de tester une molécule candidate. Le porteur qualifie la souris de modèle "incontournable" et affirme que le recours à l'animal est "inéluctable".
Objectifs
Les infections chez les patients atteints de mucoviscidose ou de la maladie granulomatose chronique (CGD :Chronic Granulomatous Disease) et âgés sont en recrudescence en raison de l'acquisition par les bacteries de mecanismes de resistance aux antibiotiques. C’est particulièrement vrai pour les bactéries P. aeruginosa, B. cenocepacia, C. violaceum ou S. Typhimurium responsables de sepsis. Afin de comprendre et d'étudier les aspects par lesquels ces pathogènes altèrent la réponse immunitaire et la physiologie de l'hôte, nous souhaitons utiliser un modèle d'infection chez des souris sauvages et génétiquement invalidées pour des gènes de la réponse antibactérienne. L'ensemble de ces gènes est commun a l'Homme et la souris. L'utilisation de modèles génétiquement invalides pour des effecteurs de la réponse immune nous permet d'isoler les cibles essentielles quant à l'élimination des bactéries pathogènes par l'organisme mais également de pouvoir, à terme, moduler la réponse antibactérienne de manière appropriée. Compte tenu de la susceptibilité aux infections microbiennes des patients, nous avons identifié́ une molécule qui permet de limiter in vitro les effets inflammatoires induits par les pathogènes. Ce projet vise à la fois à étudier et approfondir les connaissances quant à la dérégulation de la réponse immune mais également évaluer le potentiel anti-inflammatoire et antibactérien d’une molécule prometteuse.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous distinguons deux types de bénéfices : - Scientifique : les connaissances générées seront utiles quant à la compréhension de notre immunité au regard des bactéries étudiées - Santé : Notre molécule pharmacologique d’intérêt pourra démontrer son efficacité quant à la réduction de l’inflammation pathologique induite par ces bactéries dans nos modèles infectieux.
Procédures
Durant cette étude, les animaux seront prétraités à la molécule d’intérêt ou avec l’excipient seul (dose unique pour laquelle l’administration nécessite une dizaine de secondes de manipulation). 3 heures post traitement, après avoir provoqué un état de narcose, les animaux seront infectés. La dose infectante sera administrée en 1 fois. La durée de l’opération est de l’ordre de 30 s. Après infection, les individus seront transférés dans leur cage et le réveil sera vérifié. 72h post infection, tous les animaux seront anesthésiés par injection afin de procéder au prélèvement sanguin terminal et tissulaire.
Impact sur les animaux
Du stress pourra être engendré lors de la préhension et la contention des animaux afin de procéder aux administrations (10 à 30s). Concernant la fréquence des nuisances, il y aura une nuisance modérée due à l’injection unique de bactéries d’une durée de 10 à 30 secondes et une nuisance due à l’injection du traitement d’une durée de 30 secondes. L’infection en tant que telle peut produire une nuisance chronique légère en lien avec la réaction inflammatoire générée durant 3 jours (temps maximal de suivi du protocole).
Devenir
Tous les animaux seront, après anesthésie, mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sanguins et de tissus.
Remplacement
Dans ce projet, nous étudions l'activité anti-inflammatoire et anti bactérienne d’une molécule d’intérêt dans un système complexe. Les études in vitro ont déjà été réalisées sur des cellules de patients et ont montré une activité antibactérienne et anti inflammatoire prometteuse. Il n'existe, aujourd’hui, aucun modèle alternatif et le recours à l’utilisation de l’animal est inéluctable afin d’étudier l’impact des infections au niveau tissulaire et organique.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 1680 souris sera utilisé. Nous utiliserons des cohortes d'individus réduites à la taille minimum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos tests statistiques à l’aide de modèles murins déjà validés par plusieurs publications au sein de notre équipe, à savoir 10 individus par groupe (7 pour les analyses anti inflammatoires/antibactérienne et 3 pour les analyses histologiques). L’étude sera réalisée en tripliquât afin de reproduire et confirmer les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans une structure zootechnique adaptée et répondant aux normes règlementaires en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Ils sont hébergés selon les normes réglementaires et éthiques en vigueur et bénéficient d'un enrichissement pendant la stabulation. Une surveillance quotidienne des animaux et une inspection de leur état général (posture, pelage) seront effectuées tout au long de l'expérience par des membres du personnel formés de l'équipe zootechnique et par le personnel de l’équipe scientifique, Nous disposons d’une structure en charge du bien-être animal avec un vétérinaire, qui assiste les expérimentateurs notamment pour gérer le stress et/ou la douleur des animaux.
Choix des espèces
La mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire est extrêmement développé chez la souris adulte car le modèle murin (de par son utilité, sa versatilité, la présence de modèles génétiques proches de l'humain et les équipements scientifiques disponibles) demeure alors incontournable. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique un grand nombre des observations faites chez l’humain. De plus, de par la présence de nombreux outils génétiques développés chez la souris, la diversité des modèles utilisés ne peut être obtenue que dans l’espèce murine. Cependant les modèles cellulaires sont couramment utilisés au sein de notre laboratoire et constituent un préalable avant la mise en place de modèles animaux. Néanmoins, ces modèles cellulaires sont limités quant à l'information obtenue sur la complexité et l'intégration de la réponse immune dans son ensemble.
Rôles de Rev-erba dans la réponse métabolique de l’intestin aux nutriments : conséquences sur le développement de l’obésité, du diabètest et de leurs complications métaboliques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime obésogène pendant vingt-quatre semaines, des prélèvements sanguins répétés à la queue, des injections et un gavage. L'objet est d'étudier le rôle de la protéine d'horloge Rev-erba dans l'intestin au cours de l'obésité et du diabète. Le porteur s'appuie sur des travaux in vitro mais affirme devoir valider les mécanismes sur l'animal entier.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 peuvent s’expliquer par une consommation excessive de lipides mais aussi par des anomalies de leur métabolisme dans l’intestin. Ils exposent à un risque accru de maladies cardiovasculaires et hépatiques. L’intestin grêle représente à la fois la porte d’entrée des nutriments et une barrière sélective active séparant la lumière intestinale du milieu intérieur. C’est aussi un carrefour métabolique en communication permanente avec d’autres organes tels que le foie, le système nerveux, le tissu adipeux, par des communications humorales et nerveuses. En outre, les activités de l’intestin varient au cours de la journée et la protéine d’horloge Rev-erba pourrait moduler nombre de ces fonctions comme nous avons commencé à le démontrer récemment en utilisant des souris totalement déficientes en Rev-erba. Les questions de la contribution physiologique spécifique de Rev-erba intestinal à différents moments du cycle jour/nuit et des mécanismes de régulation du métabolisme lipidique intestinal par Rev-erba sont donc posées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du Rev-erba intestinal dans la réponse intestinale à un repas riche en graisse dans un contexte métabolique d’obésité ou de diabète. 2) Investiguer le fonctionnement du Rev-erba au niveau du métabolisme lipidique intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires placées sous son contrôle. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement altérées, n’exprimant pas Rev-erba spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le Rev-erba au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant Rev-erb pour évaluer leur action inhibitrice (ou non) sur l’absorption des lipides alimentaires.
Bénéfices attendus
La mise en place de ce projet de recherche va permettre de mieux comprendre le rôle du Rev-erba exprimé dans l’épithélium intestinal dans le maintien de propriétés métaboliques majeures de cet organe, l’absorption des lipides alimentaires en premier lieu, dans les fonctions endocrines et de barrière active sélective. Il permettra aussi d’évaluer dans quelle mesure les propriétés de Rev-erba s’exercent en lien ou non avec le rythme horaire des repas au cours de la journée. Ce projet prévoit d’évaluer l’efficacité d’approches pharmacologiques ciblant Rev-erba. Si les hypothèses sont validées, alors la compréhension du rôle et du mécanisme d’action de Rev-erba permise par l’utilisation combinée de modèles murins, de lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux, permettra de valider Rev-erba comme une potentielle cible thérapeutique dans le cadre de l’obésité et du diabète de type 2.
Procédures
256 souris recevront un régime alimentaire spécifique (standard ou obésogène) sous forme de bouchon pendant 24 semaines et seront soumises à un suivi de masse corporelle hebdomadaire. Des prélèvements sanguins (1 goutte) à la queue seront réalisés chaque 2 à 3 semaines après 4h de jeun, et après une légère anesthésie induite par des vapeurs d’isoflurane (durée : quelques secondes). Au bout de 18 à 22 semaines de régime, ces animaux seront évalués au regard de la dégradation de l’homéostasie glucidique. Cela implique, sur animaux vigiles, un prélèvement de sang à la queue (1 goutte), une injection dans l’abdomen (piqure) ou une administration orale (canule de gavage - contention durant environ 30 secondes et injection ou gavage durant quelques secondes) et au maximum 8 prélèvements de sang à la queue (une goutte à chaque fois) en 2 heures. Lors de ces prélèvements, chaque souris sera posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang sera effectué en quelques secondes. 448 souris seront employées pour des tests pharmacologiques. Les composés seront injectés (piqure dans l’abdomen ou sous la peau), à raison d’une injection par jour pendant 15 jours (contention durant environ 30sec – injection ou gavage quelques secondes). Afin d’étudier la réponse métabolique, 608 souris seront soumises à un test de tolérance à l’huile. Cela implique deux administrations (canule de gavage) d’huile d’olive par voie orale (contention durant environ 30sec – gavage quelques secondes) en 8 heures, une injection dans l’abdomen (piqure - contention durant environ 30 secondes et injection durant quelques secondes) et un prélèvement de sang à la queue 6 fois en 9 heures, réalisés sur animaux vigiles. Lors de la phase terminale, un dernier prélèvement de sang sera réalisé (voie rétro-orbitale) au cours d’une anesthésie profonde induite par des vapeurs d’isoflurane. Les animaux seront euthanasiés (dislocation cervicale) avant leur réveil puis les organes seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les modèles murins utilisés dans ce projet comprennent la délétion de Rev-erba, codant pour une protéine de l’horloge de la classe des récepteurs nucléaires exprimée dans de nombreux organes, soit constitutive « corps entier », soit restreinte aux cellules de la muqueuse intestinale. Une lignée exprimant une forme mutante de Reverba qui ne possède pas le domaine de liaison à l’ADN nous permettra de disséquer les mécanismes mis en jeu en discriminant les effets génomiques et non génomiques. Ces invalidations/surexpression/mutation de Rev-erba n’engendrent, par elles-mêmes, aucune souffrance. Ces souris sont viables, fertiles et ne présentent pas de phénotype ou de comportement dommageables. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en oeuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. L’utilisation du régime gras (high fat) pour induire l’obésité et le diabète n’entraîne aucune douleur ni stress. Le gavage gastrique peut entraîner un certain stress, des irritations ou une gêne de courte durée. Les prélèvements sanguins à la queue nécessitent une contention légère des souris et ne dure pas plus de 30 secondes. Pour les injections en intra péritonéale (i.p.), il peut y avoir une douleur au point d'injection. Les produits injectés sont indolores (insuline, glucose, inhibiteur de lipoprotéine lipase) et de faibles volumes.
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée à la fin des procédures. Le sang des animaux sera collecté et certains organes (côlon, intestin grêle, foie, tissus adipeux, cœur, muscle) seront également prélevés pour mesurer leur poids et leur taille, étudier leur histologie ou préparer des cultures d'organoïdes intestinaux. Il est alors impossible d’obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.
Remplacement
La demande d’utilisation des modèles murins pour étudier le rôle Rev-erba dans l’intestin lors du développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète se base sur de nombreuses expériences in vitro réalisées sur la lignée cellulaire Caco-2/TC7 et sur des cultures d’organoïdes intestinaux. Cependant à ce stade de l’étude, il est nécessaire d’utiliser des modèles complexes (animal vivant et non cancéreux) afin de valider dans un premier temps les résultats obtenus in vitro et dans un second temps de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de Rev-erba dans le développement de la pathologie. De plus, le diabète et l’obésité sont des pathologies complexes faisant intervenir les interactions entre différents organes (intestin, foie, tissus adipeux, cerveau) mais également entre les différents types cellulaires composant l’intestin lui-même. Ainsi le recours à des modèles in vivo reproduisant l’ensemble de ces interactions est indispensable pour mieux caractériser le rôle de Rev-erba dans le développement et la progression du diabète et de l’obésité.
Réduction
Le projet a été conçu avec un nombre minimal d’animaux nécessaires pour assurer la validité scientifique des expériences qui seront menées. Dans cette étude, animaux mâles et femelles seront utilisés afin de déterminer dans quelle mesure Rev-erba dans l’intestin est protecteur (ou non) dans les deux sexes, vis-à-vis du développement des maladies métaboliques. En se basant sur des précédentes expériences réalisées au laboratoire, il sera utilisé des groupes de 6 à 8 souris. En effet, les tests métaboliques (tolérance au glucose, tolérance à l’huile), les analyses de biochimie, protéiques et géniques nécessitent un minimum de 6 souris alors que les analyses histologiques nécessitent 8 souris par groupe de régime.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions d'hébergement dépourvu de stress, et dans un statut sanitaire SPF ou SOPF. Les souris cohabiteront par groupe de 4 par cage, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Le change de la litière s’effectue une fois par semaine. Lors de la mise sous régime des souris, la fréquence de change de la litière et de la cage est de deux fois par semaine. Le bien-être de l’animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte grâce à un environnement enrichi (présence d’abris et de jeux dans les cages), une surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux, et la prise en compte de tout signe physique de stress ainsi que de la hiérarchie sociale. L’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress des animaux durant l’expérimentation. La définition précise des points limites précoces associés à chaque procédure, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permettront de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de l’animal. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et seront mis à mort.
Choix des espèces
Cette espèce est choisie car la souris peut être génétiquement modifiée par transgénèse. De plus, il existe beaucoup d’outils pour étudier l’intestin dans cette espèce. Il existe aussi des données sur les gènes régulés par Rev-erba au sein de certains types cellulaires de l’épithélium intestinal. Ainsi, nous pourrons diminuer le nombre d’animaux employés en croisant nos données avec celles de la littérature. De plus, cette espèce permet de réaliser des gains- ou pertes-de fonction de Rev-erba spécifique à l’intestin afin de mieux disséquer son action. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (âge>10 semaines)
Etude dynamique de l’implication des interactions neurone-astrocyte dans la genèse de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Transgéniques et porteuses de mutations humaines de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une injection intraveineuse unique sous anesthésie, sont hébergées quatre semaines puis tuées. L'objet est d'étudier les interactions entre neurones et astrocytes aux stades précoces de la maladie. Le porteur affirme que ce réseau cérébral ne peut être remplacé par des cultures cellulaires.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure du cerveau impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Ceci nous a permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la maladie et nous souhaitons compléter cette étude par un aspect plus structural, permettant une étude morphologique à l’échelle nanométrique des structures impliquées dans la communication neuronale (synapses). Pour cela, nous avons besoin de visualiser les structures d’intérêt et donc d’injecter aux souris des constructions permettant cette visualisation, sans dommage pour l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les défauts structuraux accompagnant les défauts fonctionnels que nous avons précédemment mis en évidence. Il permettra une étude à l’échelle de la synapse de la communication cellulaire se produisant au sein du cerveau et des dysfonctions précoces associées à la maladie d’Alzheimer. Une compréhension globale de ces mécanismes précoces permettra de renforcer le développement de stratégies thérapeutiques innovantes neuroprotectrices.
Procédures
Injection intraveineuse unique sous anesthésie générale. Chaque injection dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal. Pour prévenir cela, ce geste sera réalisé sous anesthésie générale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront stabulés pendant 4 semaines puis mis à mort.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. Ce modèle ne peut être remplacé par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, la souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
L’injection intraveineuse en rétro-orbitale peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et une gêne pour l’animal. Pour prévenir cela, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane le temps de l’injection (quelques secondes). Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ainsi, les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé avec accès à volonté à l’eau et à la nourriture et présence d’enrichissements dans les cages. Les conditions d'hébergement vont être identiques et homogènes pour tous les groupes qui seront hébergés dans la même pièce. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des procédures. Des échelles de cotation de la souffrance basées sur des signes indicatifs de gêne et de douleur seront utilisées afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces asymptomatiques. Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus mnésiques, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront injectés dès 1 mois post-natal et jusqu’à 2 mois post-natal.
Etude du role du collagène XVIII dans la formation/fonction des plaquettes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections répétées, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des modèles de thrombose induits sans réveil. L'objet est d'étudier le rôle du collagène XVIII dans la formation des plaquettes et dans une forme de cancer de la moelle osseuse. Le porteur affirme que la thrombose met en jeu des interactions à étudier sur l'animal vivant.
Objectifs
Le collagène XVIII est une protéine de la matrice extracellulaire, notamment présente au niveau des vaisseaux sanguins. Elle participe à l'organisation des tissus. Par l'un de ses domaines pouvant être libéré, appelé endostatine, elle régule également les phénomènes de développement des vaisseaux sanguins, pouvant être mis en oeuvre dans diverses pathologies telles que l'athérosclérose ou les cancers. Ayant observé de façon inattendue une très forte augmentation de l'expression de ce collagène dans un modèle de souris développant de la myélofibrose primaire, un cancer qui chez l'homme entraine une dégénerescence de la moelle osseuse avec insuffisance médullaire , nous cherchons à comprendre comment la surexpression de ce collagène freine ou au contraire contribue au développement de la maladie. En outre, étant présent dans les vaisseaux sanguins, nous chercherons également un rôle éventuel dans les processus d'arrêt des saignements ou à l'inverse dans le développement des thromboses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compréhension des rôles du collagène 18 dans la formation plaquettaires, dans l'initiation ou le développement des myélofibroses, ainsi que dans l'hémostase et la thrombose. Si le collagène 18 est impliqué dans ces processus, cela constituera de nouvelles pistes pour moduler,chez les différents patients, la formation ou la fonction des plaquettes.
Procédures
Pour les expérimentations nécessitant un traitement d'un mois, celui-ce sera administré sur souris vigile, par injection unique 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Tous les prélèvements sanguins répétés seront effectués sur animal anesthésié, à J0, après 2 semaines et 4 semaines. Pour les expérimentations impliquant un traitement unique par chimiothérapie, le suivi de la numération sanguine sera effectué à J0, J5, J7, J8, J9, J12, J14. L'anesthésie et le prélèvement de sang dure entre 5 et 10 minutes pour chaque souris. Tous les modèles de thrombose seront mis en place sur animal anesthésié sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont essentiellement le stress de la contention qui précède l'injection ou l'anesthésie, ainsi que la piqure d'anesthésie ou de traitement par elle-même. Ce stress est minimisé par le recours dans tous les cas à un professionnel expérimenté et diplômé. Le prélèvement sanguin caudal est susceptible d'entrainer un petit saignement, qui est stoppé par un point de compression de 1 à 2 minutes lorsque la souris est toujours sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique et hémostatique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, la thrombose met en œuvre simultanément des interactions entre les plaquettes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Des études pilotes ont permis de déterminer le nombre minimum pour l’obtention de résultats statistiquement analysables. Un certain nombre de souris sont réutilisées au sein de ce même projet. De plus, une fois sacrifiées, les souris seront partagées afin d'utiliser différents organes pour d'autres expérimentations. Les lots sont optimisés afin d'utiliser mâles et femelles. Enfin, dès que possible, nous utilisons des cellules humaines pour nos expériences in vitro qui ne nécessitent pas l'environnement des tissus ou l'animal dans sa globalité.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de même sexe et sans défaire les groupes préformés pour éviter le développement de comportements agressifs. Des objets sont placés dans la cage pour enrichir le milieu et permettre une protection contre l'éventuelle agressivité des congénères. De la ouate est également disposée pour favoriser le comportement de fouissage et du coton cardé pour favoriser le maintien de la chaleur corporelle dans le nid. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduit au maximum, notamment par anesthésie pour toute procédure invasive. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites a été établie pour la procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire afin de limiter la souffrance.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris génétiquement modifiée n'exprimant plus le collagène 18 est un modèle unique et précieux pour étudier le rôle de cette protéine par comparaison avec les souris contrôles exprimant cette protéine. De plus, nous possédons une bonne connaissance de la physiologie de la souris et des similitudes avec l'homme, et nous disposons de nombreux modèles d’étude largement maitrisés chez la souris. Cette lignées de souris est donc parfaitement adaptée à cette étude et constitue un outil original et unique. L'absence de collagène 18 n’induit pas d’effet indésirable chez la souris au vu de leur comportement. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, soit entre 8 et 18 semaines et les mâles et femelle utilisés en quantité similaire, ce qui nous permettra à postériori de déterminer un éventuel effet différent selon le sexe.
Etude de la fonction des gènes de modification et d’aminoacylation des ARN de transfert (ARNt) dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
7 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie, leur utérus étant transpercé par un capillaire de verre pour injecter le cerveau de chaque embryon, puis les nouveau-nés sont tués à sept jours pour prélever leur cerveau. L'objet est d'étudier des gènes de modification des ARN de transfert dans le développement du cortex. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et met en avant l'efficacité de la souris, qui porte environ huit embryons par portée.
Objectifs
Le cortex cérébral est la partie superficielle du cerveau qui permet à l’homme d'effectuer des tâches complexes. Il est composé de différents types de cellules cérébrales spécialisées dont les neurones. Au cours du développement du cerveau chez l'embryon, un seul groupe de cellules progénitrices génère tous les types de cellules du cerveau qui doivent se former au bon endroit et au bon moment pour avoir un cerveau fonctionnel. Les processus qui régulent la création des différentes cellules du cortex ne sont pas encore entièrement connus et des perturbations dans ces processus pendant le développement conduisent à des maladies rares appelées troubles du neurodéveloppement. Notre équipe souhaite comprendre les processus qui régulent le développement du cortex cérébral et la production des différents types de cellules du cortex. Parmi les processus impliqués, le décodage de l'information génétique des cellules en une succession d'acides aminés formant les protéines, apparait comme un élément clé et sa molécule adaptatrice responsable du décodage, l’ARN de transfert (ARNt) comme une molécule décisive. Pour être pleinement actifs, les ARNt doivent être modifiés puis chargés avec leurs acides aminés. Ces modifications sont effectuées par des molécules appelées enzymes. A ce jour, 84 gènes de modification et 20 gènes de chargement des ARNt ont été identifiés. L'objectif de ce projet est d’étudier l’implication des enzymes de modification et de chargement des ARNt dans le développement cortical et d’identifier quelles enzymes influencent la génération et la diversité des cellules du cortex. Pour ce faire, nous allons utiliser une nouvelle approche chez la souris qui permet d’inactiver une des enzymes de modification des ARNt dans chaque cellule progénitrice du cortex chez l’embryon au début du développement du cortex et d’analyser les effets 7 jours après la naissance lorsque le développement des neurones est terminé. L’intérêt de cette approche est que nous pourrons tester toutes les enzymes de modification des ARNt en même temps chez un même embryon et observer les effets sur les cellules individuellement. Pour chaque cellule, nous identifierons quelle enzyme de modification a été inactivée et les conséquences sur la cellule. Ainsi, nous pourrons déterminer quelles modifications de l'ARNt sont importantes pour la génération et le développement des cellules du cortex.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre le rôle des molécules adaptatrices de la traduction, les ARNt, et de leurs modifications et leur chargement dans le développement du cortex cérébral. Il permettra d’identifier les gènes de modification des ARNt importants pour le développement du cortex et dont l’inactivation pourrait conduire à des malformations du cerveau. L’identification des tels gènes permettra de proposer de nouveaux gènes candidats dans la recherche des causes génétiques chez les patients atteints de malformations du développement cortical. Enfin, la compréhension des mécanismes pathologiques responsables peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’anti-douleur (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (consistant en l'ouverture de l'abdomen : laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon pour une durée de 1 à 10 secondes par embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes. Les femelles gestantes seront par la suite placées dans des cages isolées puis avec leur portée jusqu'à la mise à mort des souriceaux. Les embryons au stade embryonnaire E12.5 vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin (entre 1 et 10 secondes).
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates avec une aiguille très fine et cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Les femelles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait, privées de congénères. L'isolement sera uniquement physique (pas visuel, olfactif et auditif) car les souris verront, sentiront et entendront leurs congénères. Les embryons à 12.5 jours de gestations vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin. Depuis 8 ans que nous effectuons ce type d’injection dans le cerveau au laboratoire, nous n’avons pas observé de phénotypes dommageables chez les souris après la naissance ou à l’âge adulte.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles gestantes sont herbergées jusqu’à la mise à mort des nouveau-nés. Les nouveaux-nés sont herbergés 7 jours, puis mis à mort pour collecter leur cerveau.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les conséquences de l’inactivation de gènes sur le développement embryonnaire du cortex. Le projet vise à utiliser une approche groupée in vivo afin d’analyser les effets de la perturbation des différents gènes de modification et de chargement des ARNt simultanément sur le développement du cortex et sur la quantité et la diversité des neurones générés. Cette approche a déjà été utilisée chez la souris au cours du développement en 2020 par Jin et ses collaborateurs pour évaluer la fonction de 35 gènes candidats de troubles du spectre autistique et de retard du neurodéveloppement et elle a permis d’identifier des types cellulaires et des gènes communément affectés, justifiant la pertinence de cette approche et sa faisabilité dans le modèle murin.
Réduction
Les approches conventionnelles pour étudier les effets de l’inactivation d’une enzyme sur le développement du cerveau requiert de générer une lignée de souris pour chaque enzyme analysée, ce qui demande de produire un grand nombre d’animaux pour chaque enzyme. Nous avons choisi une stratégie qui nous permet d’utiliser une seule lignée de souris pour tester les effets de l’inactivation d’environ 30 enzymes simultanément dans un même embryon et donc de diminuer considérablement le nombre d’animaux manipulés. De plus, nous avons choisi de générer la lignée de souris utilisée sur un fond génétique présentant un faible taux de cannibalisme des nouveau-nés et un nombre important de nouveau-nés par portée permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux manipulés. Nos croisements de souris seront faits de manière à utiliser 100% des embryons générés pour les expériences. Nous avons prévu une phase de formation à l’injection dans le cerveau des embryons à 12.5 jours de gestation de 2 expérimentateurs sous la supervision de l’assistante ingénieure de l’équipe qui a acquis une très bonne maitrise de cette technique chirurgicale au long de ces 8 dernières années. L’objectif de cette formation est d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons afin de limiter le nombre de femelles gestantes manipulées. Pour cela, nous avons également investi dans un système de loupe équipé d’un écran afin de mieux visualiser les embryons et ainsi d’optimiser les conditions d’injections. De plus, nous utiliserons des nouveau-nés d’autres expérimentateurs de l’animalerie pour optimiser la collecte et la préparation des cellules au lieu d’élever des souris supplémentaires. Enfin, nous exploiterons les données publiées et l'analyse de puissance pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour notre étude et ses analyses statistiques. Les analyses statistiques sont effectuées par l’analyse différentielle au niveau des cellules individuelles. En optimisant le protocole au mieux de nos capacités, nous serons en mesure d'obtenir des cellules de haute qualité et en quantité suffisante pour chaque animal utilisé, augmentant ainsi la taille de notre échantillon pour les tests statistiques tout en maintenant un nombre d'animaux utilisés à un faible niveau.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien-être des animaux utilisés pour ce projet. Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Des nids et des tunnels seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Au début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'un anti-douleur 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation, les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la déshydratation par du gel pour les yeux. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes maximum sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie gazeuse. Un anti-inflammatoire est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relai de l’analgésie pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les femelles gestantes sont euthanasiés immédiatement et les embryons sont sortis de leur sac utérin et mis à mort.
Choix des espèces
L'approche utilisée a été mise au point chez la souris et dans le cerveau d'embryons de souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par femelles gestantes rend cette méthode efficace. De plus, la technique utilisée nécessite l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà existantes. Enfin, les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets de l’inactivation des gènes analysés dans le développement cortical.
Caractérisation de la contribution des neurones nés dans l’hippocampe à l’âge adulte dans l’apprentissage et le maintien d’informations de nature sociale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'environ deux heures avec trépanation, des injections et des tests comportementaux de mémoire spatiale, de reconnaissance d'objets et de mémoire sociale. L'objectif est de décrire le rôle de neurones formés à l'âge adulte dans l'hippocampe, chez des souris saines et des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'aborder cette voie neuronale de façon intégrée.
Objectifs
Nous avons deux objectifs principaux. Tout d'abord, nous voulons étudier comment les nouveaux neurones dans une partie spécifique du cerveau, sont organisés chez des souris normales et des souris atteintes de la maladie d'Alzheimer. Nous souhaitons découvrir s'ils se connectent uniquement à cette région ou s'ils établissent des connexions à la fois avec cette région et avec une autre région du cerveau. Pour ce faire, nous allons marquer ces nouveaux neurones avec des molécules fluorescentes afin d’identifier l’endroit ou ils se connectent. Ensuite, notre deuxième objectif est d'étudier comment ces nouveaux neurones, qui se forment à l'âge adulte, influencent la mémoire. Pour ce faire, nous allons manipuler ces neurones de manière à les activer ou les désactiver chez des souris normales et des souris atteintes d'Alzheimer, puis nous allons tester leur mémoire. Juste avant les tests de mémoire, nous activerons ou désactiverons ces neurones en utilisant des substances chimiques que nous injecterons aux souris. Nous essayerons également d’augmenter le nombre de nouveaux neurones en plaçant les souris dans un environnement stimulant, à la fois sur le plan cognitif, social et physique puis, nous testerons la mémoire des souris.
Bénéfices attendus
Le premier objectif du projet nous permettra de déterminer si les neurones nouvellement formés envoient des informations au niveau de deux régions de l'hippocampe, ou si les nouveaux neurones se connectent de façon spécifique soit à la première région, soit à la deuxième. Si tel est le cas, cela serait la première démonstration de l’existence d'une voie nerveuse specifique qui se connecte à une région liée à la cognition sociale. Si, en revanche, les nouveaux neurones contactent les deux régions, cela suggérerait que les informations contextuelles, spatiales, et sociales, sont intégrées et codées conjointement au sein des nouveaux neurones. Le deuxième objectif du projet permettra de révéler la contribution des nouveaux neurones projetant à cette région dans la mémoire sociale, et de déterminer si des manipulations de ces nouveaux neurones et/ou des neurones qui contribuent à leur survie sont en mesure de restaurer les capacités de mémoire sociale de souris modèles de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
La chirurgie dure environ 2h par animal. Une seule intervention chirurgicale par animal sera réalisée. Les animaux recevront une injection en aigue (une seule injection qui durera environ 10 secondes) d’agent pharmacologique. Pour cela, la souris sera maintenue en contention durant 15 secondes. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux n’excédant pas 1h30. Ces tests comportemenaux auront pour objectif d'étudier la mémoire spatiale, la mémoire de reconnaissance d'objets et la mémoire de reconnaissance d'individus (mémoire sociale).
Impact sur les animaux
Pour la chirurgie, l'incision de la peau ainsi que la trépanation osseuse peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24heures. La contention de l’animal lors des injections peut induire un stress modéré durant une dizaine de minutes. Les injections peuvent induire une douleur modérée lors de l’injection durant les 20minutes qui suivent la manipulation de l’animal. Les test comportementaux n'induisent pas de nuisances.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux et /tissus afin de réaliser des marquages immunohistochimiques sur coupes de tissus pour poursuivre les investigations anatomiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Les nouveaux neurones naissent dans le cerveau au niveau d'une zone appelé le gyrus denté et se connectent à différentes sous régions de l'hippocampe. Nous comptons explorer le rôle des nouveaux neurones qui se connectent à une sous région bien définie de l'hippocampe. Notre objectif est d'étudier l'impact de ces nouveaux neurones sur les capacités mnésiques des mammifères. De plus, nous nous intéressons à la mémoire sociale qui est altérée dans certaines maladies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. L’utilisation du modèle murin nous permet d’étudier les modulations de cette mémoire sociale chez des individus sains et présentant des troubles de mémoire sociale (souris modèles de la maladie d’Alzheimer). A ce jour, il n’existe pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de cette voie neuronale spécifique de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études comportementales et neurologiques visant à décrire les mécanismes mis en jeu dans les processus mnésiques.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante lors de la réalisation de tests statistiques, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis à partir de grilles de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent. De plus, nous réaliserons plusieurs tests sur les mêmes animaux pour limiter leur nombre.
Choix des espèces
Nous comptons explorer la fonction biologique des nouveaux neurones formés à l’âge adulte. Nous proposons que ces nouveaux neurones ont un effet sur le comportement de l’animal (mémoire). Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder l’impact de ces nouveaux neurones sur le comportement de l’animal. Nous comptons également faire une description anatomique des voies de projections des nouveaux neurones. Il nous faudra donc prélever des tissus pour voir l’organisation cérébrale. De plus, la souris appartient à la classe des mammifères ce qui la rend proche de l’Humain. Son utilisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux sous-tendant les processus mnésiques chez les mammifères. D’autre part, nous utiliserons des souris modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle nous permettra d’étudier les éventuels mécanismes à l’origine des troubles mnésiques dans un contexte pathologique. Les animaux que nous utiliserons seront âgés de 3 à 6 mois. En effet, la neurogénèse adulte diminue avec l’âge. Si nous voulons l’étudier nous devons nous placer à une fenêtre de temps ou elle est suffisamment abondante.