Souris
Dexmedetomidine: nouvel agent anti-tumoral contre le mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe un mélanome par injection de cellules sous anesthésie, puis on administre un anesthésique testé comme agent anti-tumoral et on réalise des prélèvements de sang. Le porteur affirme que l'étude des interactions entre traitements et système immunitaire rend "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier". Les retombées annoncées, un possible usage en chirurgie du cancer chez l'humain, restent au conditionnel.
Objectifs
Des études rétrospectives ont suggéré un possible rôle anti tumoral des anesthésiques après observation d’une diminution de récidives métastasiques et une meilleure survie chez les patients ayant reçu ces produits. Le but du projet est donc d'étudier si un anesthésique utilisable en chirurgie oncologique induit une réponse anti-tumorale in vivo en diminuant la croissance tumorale. C'est aussi de démontrer si les effets antitumoraux de cet anesthésique peuvent être potentialisés par les traitements anti-cancéreux conventionnels et en fin de démontrer si cet anesthésique diminue le stress glucocorticoïde. Le dernier objectif est de démontrer si les effets anti-tumoraux médiés par cet anesthésique, s'ils existent, impliquent une réponse du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Démontrer si l'anesthésique étudié pourrait être un nouvel agent anti-tumoral in vivo. Ce résultat pourrait amener à des essais cliniques randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement cet agent est utilisé comme complément analgésique per-opératoire et n'a aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique
Procédures
Génération de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes) -traitement par injection (1 fois, durée 1 minute) -prélèvements sanguins sous anesthésie (2 fois, durée 3 minutes) -
Impact sur les animaux
Greffe et croissance de tumeurs : gêne physique légère à modérée. Injections: stress et contrainte temporaire et légère.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour des analyses en cytométrie, biologiques ou histologiques.
Remplacement
Les effets des traitements anticancéreux seuls ou en association impliquent des processus multiparamétriques avec des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier (échnge de cellules et d'information (humorales) entre les différents organes et tissus de l'organisme). On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro, il est indispensable d'avoir recours à un organisme vivant entier. Notre hypothèse est que l'association de la dexmedetomidine aux traitements anticancéreux conventionnels potentialiserait la réponse anti-tumorale. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable pour étudier l'immunité et l'efficacité des traitements combinés sur la réponse anti-tumorale. La compréhension de cette potentialisation et sa reproduction in vivo ouvriraient la possibilité d'associer systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction potentialisée des cellules tumorales résiduelles.
Réduction
Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de souris déterminés en nombres par calcul de puissance et pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront analysés selon des méthodes de statistiques non paramétriques.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris et les tumeurs seront mesurés plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids (sizzlenests), de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Nous souhaitons prouver l'efficacité d'une association de traitements anti-cancéreux afin d'augmenter la réponse antitumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitements. Le modèle souris est le modèle mammifère de choix en oncologie préclinique. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, mimant la population de patients.
Phénotypage d’un nouveau modèle murin transgénique de la mutation KCC2 trouvée chez l’homme et liée à un trouble neurodéveloppemental.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de mutations reproduisant un cas familial de trouble autistique, elles subissent des crises déclenchées par un gaz convulsivant, des injections, une ablation de phalange et des tests comportementaux en labyrinthe, y compris sur des souriceaux. Le porteur décrit des points limites entraînant la mise à mort, et une lidocaïne appliquée avant les injections sous-cutanées. Les bénéfices annoncés se limitent à comprendre le mécanisme et à présélectionner des composés candidats.
Objectifs
L’objectif final de ce projet est de comprendre les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires responsables des troubles du spectre autistique (TSA) et de mettre au point des traitements thérapeutiques efficaces pour les patients atteints de TSA. Une théorie récente stipule que les perturbations de l'homéostasie neuronale des ions chlorure sont l'un des principaux facteurs contribuant à la formation de la pathologie, mais il n'existe pas de preuves directes de cette théorie. Récemment, un groupe de cliniciens du CHU-Lyon a identifié une famille (ci-après dénommée Dylan) comptant quatre enfants atteints de TSA associés à deux variants faux-sens (ci-après dénommés "D1" et "D2") dans le gène SLC12A5, hérités chacun d'un des parents. La mère et le père, qui ne portent chacun qu'une seule mutation (D1 et D2, respectivement), ne présentent aucune pathologie évidente. Le gène SLC12A5 code pour le co-transporteur potassium-chlorure KCC2 qui contrôle dans les neurones la concentration intracellulaire de chlorure. Notre hypothèse est que les mutations D1 et D2 du gène SLC12A5, lorsqu'elles sont combinées dans un organisme, modifient l'activité du transporteur KCC2 et changent la concentration de chlorure dans les neurones. Pour vérifier cette hypothèse et étudier les mécanismes moléculaires conduisant aux TSA, nous avons créé deux souris transgéniques imitant le génotype des parents de Dylan. La souris ressemblant à la mère porte dans un allèle la mutation D1 et la souris ressemblant au père porte la mutation D2. L'objectif du projet est de générer une souris ressemblant au patient, en combinant les mutations D1 et D2, et d'étudier le phénotype de cette souris. En particulier, nous nous concentrerons sur l'analyse du métabolisme neuronal, de l'activité du réseau neuronal et du comportement animal. Une fois caractérisés, ces paramètres seront utilisés pour cribler des composés ciblant KCC2 et visant à atténuer les symptômes des TSA.
Bénéfices attendus
Compréhension du mécanisme de formation des TSA dépendant du KCC2 et présélection de composés diminuant la gravité des symptômes des TSA.
Procédures
Il y aura deux types de traitements nocifs. Le premier comprend un traitement au gaz flurothyl produisant des convulsions. Le but de ce traitement est de vérifier si les souris transgéniques D1/D2 expriment une plus grande susceptibilité à générer des crises (trois patients Dylan sur quatre ont des crises spontanées), 140 souris. Traitement pendant 3 à 5 minutes. Le deuxième traitement susceptible de produire un effet nocif est la procédure d'injection sous-cutanée du composé anti-leptine. Le composé anti-leptine a montré une grande efficacité pour traiter certaines pathologies chez l'homme et réduire la sévérité de la pathologie dans le modèle murin du symptôme RETT. Dans le présent projet, le traitement anti-leptine sera utilisé pour déterminer son efficacité curative potentielle sur la souris D1/D2. 400 souris, trois injections aux âges postnataux de 8, 12 et 16 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux seront sujets de différents traitements qui peuvent causer de la douleur ou d'autres effets indésirables : i) douleur et nuisance causées par la phalangectomie et/ou par les injections sous-cutanées d'un composé anti-leptine. La phalangectomie et les injections sous-cutanées seront effectuées à l'aide d'instruments chirurgicaux correspondant le mieux à la procédure donnée et destinés à entraîner l'effet indésirable le plus court possible. Après les manipulations, les animaux seront examinés pour détecter des changements de comportement, de mobilité et de perte de poids. Dès les premiers signes d'effets indésirables les animaux seront euthanasiés. ii) crises tonico-cloniques produites par l'exposition au flurothyl, un gaz convulsivant. Après l'exposition au flurothyl, toutes les souris seront euthanasiées. iii) les nuisances causées par le retrait des souriceaux de la portée pour les tests comportementaux. Les cages contenant les portées seront placées dans la salle d'expérimentation 20 minutes avant le début de l'expérience. Les souriceaux seront délicatement pris et manipulés pendant le temps le plus court possible par le technicien expérimenté. Le même technicien pour le même type d'expériences (mesure du poids, tests ultrasoniques, autres repères de développement...). iv) les nuisances causées par les tests comportementaux appliqués à des souris juvéniles (>20 jours). Les animaux seront manipulés quotidiennement dans la salle d'expérimentation par le même technicien afin de les habituer à l'expérimentateur et au dispositif expérimental. Pendant l'expérience, l'animal sera placé dans le labyrinthe expérimental pendant une durée bien définie. Avant et après l'expérience, tous les animaux auront un accès illimité à l'eau et aux aliments et seront hébergés dans des cages ventilées avec une température et un cycle de lumière jour/nuit contrôlés.
Devenir
À la fin de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de disséquer les cerveaux pour des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif de comprendre les origines de l'incapacité sociale et l'organisation du réseau neuronal dans le modèle de souris du cas humain d'autisme, avec la perspective de développer un traitement. Les études que nous proposons portent sur l'organisation des réseaux neuronaux et le comportement animal, lesquels ne peuvent être reproduits dans des modèles de cultures neuronales ou lignées cellulaires in vitro.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, chaque animal servira à plusieurs évaluations comportementales et/ou ex-vivo. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres (comportementaux et ex-vivo (électrophysiologiques ou biochimiques ou histologiques), réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements électrophysiologiques, 3 chercheurs seront mobilisés. Pour les analyses biochimiques et histologiques plusieurs protéines et/ou ARN seront étudiés par échantillons prélevés et par animal. Pour les expériences d’électrophysiologie, nous enregistrerons plusieurs cellules par tranche, plusieurs tranches par animaux, ce qui permettra d’avoir une puissance statistique importante. Les tests statistiques utilisés seront non-paramétriques, adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Un raffinement sera rigoureusement appliqué tout au long de la procédure d'étude, en commençant par le mode d'hébergement et d'élevage, en poursuivant par les manipulations expérimentales avec les animaux et en terminant par l'exploitation optimale des données expérimentales. L'hébergement se fera dans l'animalerie INMED récemment rénovée, avec une température contrôlée et un cycle jour/nuit inversé. Les animaux sont élevés dans des cages ventilées comprenant des éléments d'enrichissement et avec un accès illimité à la nourriture et à l'eau. Les animaux sont habitués à être manipulés par l'expérimentateur et sont habitués avec le matériel destiné aux études de comportement. En particulier, trois jours avant le début des expériences de comportement, la souris sera placée quotidiennement dans l'arène expérimentale pour s'habituer. Par la suite, au cours de la journée expérimentale, le même expérimentateur placera délicatement l'animal dans l'arène et commencera à surveiller le comportement de l'animal par vidéo et audio. Le même jour, une seule tâche sera effectuée avec une souris donnée. Après le test de comportement, l'animal sera remis dans sa cage. Une application de lidocaïne sera réalisée avant les injections sous cutanées pour réduire la douleur. Les animaux (injectés ou non) seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être prenant en compte l'apparence de l'animal, des difficultés respiratoires sévères et prolongées, une léthargie de l'animal (immobile, ne répondant pas aux stimuli), et une prise ou perte de poids excessive (supérieure à 20 % de son poids initial). Les animaux présentant des signes de souffrance seront euthanasiés. L'anesthésie à l'isoflurane (5%) sera utilisée pour minimiser la douleur des animaux avant les manipulations désignées pour isoler le cerveau pour les études post-hoc.
Choix des espèces
Les expériences sont réalisées sur des souris car ces petits rongeurs sont largement utilisés dans les laboratoires de neurobiologie en raison de leur petite taille et de leur cycle de reproduction court. Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neurosciences rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. D'autre part, le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, c'est donc une espèce privilégiée pour l'obtention d'OGM, elle est facile à élever (reproduction rapide des animaux et conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes) et elle permet une possible application à l'homme des résultats obtenus (proximité physiopathologique avec l’Homme et donc transférabilité des résultats). Le principal sujet d'étude est la souris transgénique D1/D2, un nouveau modèle de TSA imitant le génotype du patient atteint de TSA comorbide avec l'épilepsie. Des études antérieures ont montré que des changements majeurs dans le réseau de la souris ASD-like se produisent au cours du premier mois postnatal. Nous analyserons donc la plupart des paramètres caractérisant le réseau neuronal et le comportement social à différents stades de développement. Les résultats seront ensuite regroupés et comparés pour différentes tranches d'âge (par exemple P6-P8 ; P12-P15 ; P18-P22 ; P28-P32 ; P45-P50).
Effet de composés anti-inflammatoires dans des modèles d’inflammation intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
8 032 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles destinées aux prélèvements étant tuées et les reproducteurs gardés pour l'élevage. On leur inflige deux modèles de colite chimique provoquant perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles, avec des gavages quotidiens et des administrations intra-rectales sous anesthésie, pour tester des bactéries et composés anti-inflammatoires. Le porteur indique que ces composés sont d'abord criblés in vitro, mais que la complexité immunitaire rend les modèles cellulaires "pas suffisants". Les retombées annoncées pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin sont placées à court et long terme.
Objectifs
L’objectif final de ce projet est de pouvoir proposer des alternatives ou des compléments aux traitements actuels de pathologies du tube digestif : maladie de Crohn et rectocolite ulcéreuse, qui forment le groupe des MICI (Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin). Les traitements actuels sont encore imparfaits puisqu’ils ne permettent pas une guérison complète. L'un des axes possibles pour améliorer la qualité des traitements est l'utilisation d'éléments capables de moduler la réponse inflammatoire de l'hôte en lien avec son microbiote. Nous cherchons à explorer la piste d'utilisation de bactéries entières, de composés bactériens ou de composés autres (type prébiotique, de natures plus diverses et souvent dérivés de plantes) capables de moduler la composition du microbiote en ce sens. Cette étude nécessite de reproduire l’inflammation liée aux MICI et pour ce faire, nous utiliserons deux modèles d’inflammation intestinale induite par des composés chimiques chez la souris. Le premier génère une inflammation très localisée au niveau du colon. Nous utilisons un protocole que nous déclinons sous forme classique « aigue » ou sous forme chronique (avec une alternance de phases inflammatoires et de phases de rémissions). Le second modèle possède la capacité d’altérer l’intégralité du tractus digestif. Ces deux modèles sont complémentaires vis-à-vis de la diversité des symptômes retrouvés dans les MICI. Les objectifs de ce projet sont de : - Evaluer la capacité anti-inflammatoire de bactéries ou composés bactériens ou de substances anti-inflammatoires dans ces deux modèles d’inflammation. Cette évaluation passera par le suivi de la reprise de poids et par la mesure de plusieurs paramètres. Les substances testées auront toutes été criblées au préalable via des tests in vitro sur cellules, qui auront mis en avant leurs capacités anti-inflammatoires. - Affiner nos connaissances sur les interactions entre hôte/micro-organismes ou composés et plus précisément sur les mécanismes d’actions de potentiels probiotiques ou prébiotiques sur des inflammations intestinales. Le cœur des projets de recherche de notre équipe est l’évaluation des propriétés anti-inflammatoires de composés, à des visées de complémentation pour des patients atteints de MICI. Les procédures décrites ici sont très utilisées au sein de notre équipe et servent pour plusieurs projets scientifiques. Les composés testés sont systématiquement validés in vitro avant d’être testés in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront à court terme de permettre une validation des propriétés anti-inflammatoires de composés dans des modèles murins pré-cliniques. Des études cliniques humaines pourront ainsi être menées par la suite sur ces composés, en cas de résultats probants. A long terme, ces composés pourront ainsi être proposés aux patients atteints de MICI en tant que compléments aux traitements actuels, pour soulager les patients de symptômes liés aux pathologies du tube digestif et améliorer ainsi leur qualité de vie. Un autre bénéfice de ce projet sera une meilleure compréhension des mécanismes d’action des bactéries ou composés bactériens sur l’inflammation intestinale. Cela peut passer par exemple par la mise en évidence de molécules produites par les bactéries testées qui pourront être purifiées et étudiées plus en détail par la suite. Les interactions de ces composés avec l’hôte et plus particulièrement avec le microbiote intestinal pourront également être étudiées, ce qui permettra d’avancer dans la compréhension de mécanismes plus globaux, à l’échelle de l’hôte. Des approches par imagerie sur des animaux vivants seront également mises en œuvre afin de disposer de données supplémentaires.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions/prélèvements suivants : - Prélèvements de fécès fraiches : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés. Un prélèvement = maximum 10 minutes. Pour 2 496 animaux, il y aura des prélèvements quotidiennement sur 14 jours consécutifs (donc 14 collectes pour 2 496 animaux); pour les autres animaux (4 896) ce sera 3 ou 4 collectes en tout. - Gavages : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés. Un gavage par jour prévu pour chaque souris sur la durée des procédures. Leurs durées varient entre 4 et 22 jours. Un gavage = 5-10 secondes. - Anesthésies générales: sur animal vigile, 4 896 animaux concernés (une ou deux fois selon le modèle). Une anesthésie = une piqûre réalisée en 15-20 secondes environ. - Administrations intra-rectale : sur animal anesthésié, 4 896 animaux concernés (une ou deux fois selon le modèle). Une administration = 20 secondes. - Anesthésies gazeuses: sur animal vigile, 7 440 animaux concernés (tous les deux jours pendant 5 ou 14 jours, selon le modèle). Une anesthésie = 5 minutes. - Injections sur animal anesthésié : 4 896 animaux concernés 3 fois et 2 496 concernés 8 fois. Une administration = 15 secondes. - Prélèvements de sang : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ. - Biopsies à la queue sous anesthésie locale pour génotypage: 640 animaux. Une biopsie = quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement des colites. En effet, les deux produits chimiques induisent une inflammation de l’intestin. Les principaux symptômes attendus sont pour les deux modèles : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée, yeux mi-clos. Spécifiquement pour le second modèle : une diarrhée transitoire (2 à 3 jours) et présence éventuelle de sang dans les fécès.
Devenir
Tous les animaux qui doivent subir des prélèvements d'organes/tissus seront mis à mort. Les animaux reproducteurs seront gardés en vie.
Remplacement
A l’heure actuelle, l’étude in vitro des effets de bactéries, de composés bactériens ou d’autres substances sur l’inflammation intestinale comporte encore des limites. Des modèles cellulaires existent et sont bien décrits : ils seront d’ailleurs utilisés en amont de notre projet pour effectuer un premier criblage de composés candidats (lignée cellulaire en monocouche et/ou organoïdes intestinaux). Cependant, ces modèles in vitro ne reflètent pas de manière idéale la complexité des interactions entre le microbiote intestinal et les bactéries ou composés candidats. L’intérêt d’un modèle in vivo est également d’étudier la réponse du système immunitaire de l’hôte à l’administration de ces bactéries ou composés bactériens. Malgré le fait que certains paramètres peuvent être évalués à partir de modèles in vitro, la complexité des mécanismes immunitaires chez l’hôte fait que ces modèles in vitro ne sont pas suffisants pour permettre de valider des composés ayant pour visée une complémentation chez l’humain.
Réduction
Les bactéries ou composés bactériens testés seront issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. Ces criblages auront pour but d’identifier des composés potentiellement intéressants. Ainsi seuls les composés les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Pour les analyses, nous effectuerons des tests statistiques de comparaison adaptés à nos effectifs et à nos questions. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fécès dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre). Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin, à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’éventuelle douleur. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies impliquant un temps d’endormissement supérieur à 15 mn, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads chauffants seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques pourront aussi être utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est par ailleurs un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, notamment car il est possible d’induire une colite chez la souris dont les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Les animaux sont utilisés à un âge de 6 à 12 semaines. Cet âge constitue un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données. De plus, les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits.
Suivi de la biodistribution et de la toxicité de liposomes chez la souris gestante
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
78 souris femelles gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, parfois par chirurgie de la veine jugulaire, six séances d'imagerie sous anesthésie et une ponction cardiaque terminale, pour suivre la distribution de liposomes destinés à traiter des femmes enceintes. Le porteur indique que les procédures peuvent provoquer des avortements spontanés, et que les fœtus sont tués par décapitation pour analyse. Le recours à un "organisme entier" est présenté comme nécessaire pour étudier la mère et les fœtus.
Objectifs
Le développement de médicaments lors de la grossesse est complexe, car il faut à la fois éviter le passage des médicaments du côté du bébé et les concentrer au niveau du placenta pour limiter les effets secondaires chez la mère. Ainsi ce projet s’articule autour du développement de médicaments de tailles nanométriques, qui sont fabriqués pour aller spécifiquement dans le placenta.
Bénéfices attendus
Développement de nouvelles stratégies thérapeutiques disponibles pour la femme enceinte.
Procédures
Tous les animaux vont être soumis à des interventions suivantes : une seule injection dans la veine de la queue (30 secondes), la souris étant maintenue dans une cage de contention sur une durée totale de 3 minutes, ou injection dans la veine jugulaire qui nécessite une chirurgie (durée 30min), 6 séances d’imageries sous anesthésie générale d'une durée totale de 10 minutes au maximum par séance, une anesthésie profonde avant de procéder au prélèvement sanguin sur les animaux endormis par ponction cardiaque (geste d’une durée d’une minute environ). Les animaux seront ensuite mis à mort dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal. Les embryons seront mis à mort par décaptitation pour l'analyse de ceux-ci.
Impact sur les animaux
La pose de cathéter au niveau de la veine jugulaire nécessite une chirurgie sous anesthésie. Ce projet utilise des femelles gestantes, les procédures pourraient induire des avortements spontanés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution et la toxicité éventuelle des molécules utilisées sur ceux-ci. Les foetus sont euthanasiés pour évaluer la toxicité des molécules utilisées et s’il y a présence de ces molécules dans les tissus fœtaux ou non pour évaluer un potentiel passage des molécules à travers du placenta.
Remplacement
Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations par des expériences réalisées en laboratoire pour ne tester chez l’animal, que les formulations optimales. Il nous est nécessaire de disposer d’un organisme entier, car nous souhaitons étudier les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse sur la mère et les bébés. Nous ne disposons pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions.
Réduction
Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Nous utiliserons des tests statistiques afin de définir le nombre minimum d'animaux à étudier pour mettre en évidence les effets de l’administration de nos molécules lors la grossesse. Ainsi, pour l’étude pilote 3 femelles non gestantes par condition seront utilisées. Nous utilisons une technique d’imagerie optique, non invasive, pour évaluer le profil de distribution en fonction du temps. Cela permet de faire plusieurs mesures sur un même animal et donc in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. En effet, il ne sera plus nécessaire d'euthanasier l’animal pour localiser les molécules fluorescentes puisque leur localisation peut être évaluée en fonction du temps, grâce à l’utilisation de l’imagerie. Pour la deuxième partie des groupes de 15 souris gestantes par conditions seront suffisants.
Raffinement
Les animaux seront placés dans les conditions optimales d’hébergement et auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. La souris est placée sur un tapis thermostaté pendant l’imagerie. De plus, elle sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d’imagerie. Des points limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis, surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînerait l'euthanasie anticipée de l'animal.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer, la distribution des molécules de tailles nanométriques, dans les différents tissus de l'organisme, après injection. La souris est le modèle le plus approprié de par sa physiologie proche de l’homme ainsi que la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Nous analyserons des souris femelles adultes âgés de 10 semaines au moment de l’injection. Les souris femelles gestantes seront en deuxième semaine de gestation. Cette chronologie de gestation est choisie, car c’est le moment où le placenta est le mieux développé et c’est un moment encore assez éloigné pour ne pas risquer un accouchement prématuré.
Evaluation du potentiel thérapeutique de différentes Nanoparticules en cancérologie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
10 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des tumeurs du sein ou du mélanome et des métastases pulmonaires, avec des injections répétées de nanoparticules et des séances d'imagerie sous anesthésie, pour sélectionner les particules les plus prometteuses. Le porteur décrit des signes comme la prostration, la détresse respiratoire et des réactions du greffon, et annonce des souris tuées "immédiatement" aux premiers signes. Il expose ses objectifs et bénéfices en quelques lignes, pour un projet portant sur plus de dix mille souris.
Objectifs
L’objectif du projet est de sélectionner les meilleures Nano-Particules (assemblage chimique de très petite taille, inférieur à 1/10 de mm) pour une possible utilisation thérapeutique dans les cancers du sein et du mélanome.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'améliorer les traitement des cancers du sein et du mélanome. L'utilisation des meilleures Nano-Particules devrait permettre de réduire les effets secondaires des chimiothérapies actuelles.
Procédures
Injections des Nano-Particules sur des souris anesthésiés, durée 1mn/souris. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, quelques minutes, fréquence 5 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, quelques minutes, fréquence 5 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, fréquence 10 fois. Imagerie en bioluminescence sur des souris anesthésiées, durée quelques minutes, fréquence 7 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, fréquence 10 fois. Imagerie en bioluminescence sur des souris anesthésiées, durée quelques minutes, fréquence 7 fois. Injection de cellules, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Prélèvement de sang, sur des souris anesthésiées, 100µl, une seule fois. Injections des Nano-Particules, sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris une seule fois.
Impact sur les animaux
La majorité des effets délétères attendus seront dû à la formation de tumeurs mammaire, de mélanome et de métastases pulmonaires donc avec des signes cliniques comme prostration, troubles du comportement, agressivité, détresse respiratoire, troubles métaboliques. Pour certains modèles, il pourrait y avoir une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, de possible lésions cutanés (irritations, sècheresse localisée). Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé. Les injections répétées pourraient entrainer localement une inflammation.
Devenir
Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire la complexité d'un environnement tumoral. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler les étapes complexes de la progression tumorale.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence et bioluminescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux prennent en compte les conséquences l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les animaux ne rentrent en phase d'expérimentation qu'au minimum 15 jours après leurs arrivés. Les animaux sont pratiquement systématiquement manipulés sous anesthésie gazeuse. Quand des procédures d'injections ou de chirurgies sont mise en place, des analgésiques sont administrés. Les souris sont maintenues au minimum de 2 par cage pour maintenir une interaction entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition d'inconforts (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) elle serait euthanasiée immédiatement. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : • nombreux protocoles bien établis pour cette espèce • possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés • modèles mimant très bien les cancers mammaires et de mélanomes humain et récapitulent toute la cascade métastatique en peu de temps et ont déjà fait l'objet de nombreuses publications dans le domaine. Ce seront des souris adultes entre 8 et 12 semaines, car les traitements envisagés s'adressent à ce type de population. Des animaux de 5 semaines seront employées pour l'analyse de l'impact des Nano-Particules sur le système immunitaire.
Approche pharmacologique pour la maladie Charcot-Marie-Tooth de type 2A
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections dans le péritoine six jours sur sept pendant deux mois, subissent des tests de locomotion, de démarche et de sensibilité à un filament appliqué sur la patte, puis une chirurgie terminale. Le porteur indique que ses données in vitro montrent déjà un effet du composé testé, mais qu'un passage in vivo reste une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain. Les retombées annoncées pour d'autres formes de la maladie sont renvoyées au long terme.
Objectifs
La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Les motoneurones des souris modèles de la CMT2A présentent des défauts dans les interactions entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que dans la dynamique et le transport des mitochondries. Le composé Pre-084 promeut les interactions entre le RE et les mitochondries en favorisant notamment le transfert de calcium. Le Pre-084 a déjà montré un effet thérapeutique dans de nombreuses maladies neurologiques liées à des défauts de contacts RE-mitochondries, telle que la maladie d’Alzheimer, la Sclérose latérale amyotrophique ou encore le syndrome Wolfram. Ce projet a pour but de tester une approche thérapeutique basée sur l'administration du composé Pre-084 dans un modèle murin modélisant de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A).
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si le traitement Pre-084 représente une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour la CMT.
Procédures
160 animaux subiront un traitement par injection dans le péritoine 6 jours sur 7. Les animaux seront contentionnés quelques secondes pour permettre ces injections. 320 animaux seront évalués par des tests de comportement pour mesurer la locomotion, démarche et réponse sensitive. Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais et entre chaque test (au moins deux jours). 160 animaux subiront une chirurgie terminale ayant pour objectif de réaliser une perfusion de paraformalédhyde.
Impact sur les animaux
Dans le cas de l'approche par voie intrapéritonée, les animaux subiront à l’âge adulte (soit avant soit après apparition des premiers symptômes) des injections dans le péritoine 6 jours par semaine pendant deux mois. Ces injections seront réalisées en quelques secondes (contention et piqûre compris) au moyen de fines seringues à insuline . Ces injections répétées sont généralement bien tolérées, néanmoins il peut apparaitre de petites inflammations locales ou légères irritations. Dans la suite de l'étude, le traitement dans l'eau de boisson ne devrait pas générer d’inconfort. Ce traitement a déjà été utilisé dans plusieurs études et ne provoquent pas d’effets indésirables chez l’animal. Au cours du traitement, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement) qui permettent d'analyser la locomotion, la démarche et la réponse sensitive des souris. Seule la mesure de la réponse sensitive entraîne un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris.
Devenir
A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT)
Remplacement
Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique du Pre-084 sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 20 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et en prenant en compte un risque alpha inférieur ou égal à 0.05, une puissance de test de 80% et un effet modéré de 30%. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous privilégions une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,4 et 5 mois ou 6,7 et 8 mois selon le début du traitement) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies. Au total nous utiliserons 320 animaux répartis de la manière suivante selon deux études: Pour l'approche 1 (traitement par injections intra-péritonéale), qui sera réalisée à deux temps: début du traitement (en pré-symptomatique de 3 mois à 5 mois) et début du traitement (en symptomatique de 6 mois à 8 mois). Il y aura (20 animauxX4groupes)X2temps=160 animaux. Le même nombre d’animaux (160) sera utilisé pour l’approche 2. A noter que l’étude 2 (traitement per os) ne sera mise en place que si on obtient un effet bénéfique du traitement dans l’étude 1
Raffinement
Afin d’améliorer le bienêtre animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe). L’environnement est enrichi à l’aide de maisonnettes en carton. Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Dans le cas du maintien de la lignée, les gestes de biopsies (perçage d’oreille) seront couplés à l’identification afin de limiter leur manipulation et gestes invasifs. Dans le cas d'apparition des petites inflammations locales ou légères irritations suite aux injections intra-péritonéales répétées, nous privilégierons soit une injection du côté opposé de l’abdomen, soit nous laisserons l’animal sans traitement quelques jours le temps de récupérer ou d’être soigné au besoin (Povidone Iodée- Vétédine®). Au cours des tests, nous mettons en place des temps de repos entre chaque essai pour limiter l’inconfort de l’animal. Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption.
Choix des espèces
La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez les patients souffrant de CMT2A telles qu'une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs et sensitifs modérés. Pour les deux études, les traitements seront réalisés à deux temps: avant (3mois) et après le déclenchement de la maladie (5mois) afin de déterminer si l'effet du traitement permettra d'empêcher le développement de la maladie et/ou de la ralentir une fois celle-ci déclarée. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 3 à 5 mois ou de 6 à 8 mois).
Nouveau modèle non-Invasif d’infarctus du myocarde et d’ischémie reperfusion chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un infarctus du myocarde par deux techniques présentées comme moins invasives, puis on suit leur cœur par échographie, pour réduire la variabilité des modèles chirurgicaux existants. Le porteur indique que la douleur liée à l'infarctus est maximale pendant vingt-quatre heures et qu'un analgésique est alors administré. Les bénéfices annoncés, des thérapies plus efficaces contre l'infarctus chez l'humain, restent à démontrer.
Objectifs
Malgré les progrès des traitements interventionnels et pharmacologiques des infarctus du myocarde (lorsqu’une artère coronaire irriguant la paroi cardiaque se bouche), les cardiopathies qui en résultent restent la principale cause de décès dans le monde. Il y a donc nécessité à continuer la recherche dans ce domaine pour optimiser les traitements et sauver des vies. Étant donné la complexité du cœur qui assure une fonction de pompe pour le système circulatoire qui s’adapte à la demande de l’organismes et la pression artérielle et dont la régulation du rythme est contrôlée par un système neuro-hormonal complexe, les modèles animaux sont indispensables pour cette recherche, aucun système in vitro ne pouvant reproduire cette complexité. Le modèle rongeur est le plus utilisé. Le modèle actuel est basé sur la technique chirurgicale sous anesthésie qui induit un infarctus du myocarde. De multiples variables affaiblissent le pouvoir translationnel de la méthode. Bien que de nombreuses tentatives aient été faites pour améliorer cette technique en réduisant au minimum la taille de l'incision, la variabilité dans un même groupe d'animaux et entre différents groupes est restée significativement élevée. Cette incohérence est probablement attribuée aux détails techniques de la procédure chirurgicale, ce qui entraîne une diminution de l'efficacité et un manque de reproductibilité des résultats. L'étude présente vise à produire deux modèles non invasifs. Ces deux méthodes utiliseront des souris de type sauvage.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est de développer des techniques innovantes et transposables à l’homme pour étudier le remodelage indésirable du tissu du cœur après infarctus. Ce projet améliorera les méthodes conventionnelles en améliorant la qualité de la chirurgie effectuée pour induire un infarctus en limitant l'intubation, les saignements, la taille de la plaie, l’inflammation et d'autres facteurs. Les techniques proposées réduiront considérablement la variabilité dans un seul groupe d'animaux et favoriseront des résultats plus applicable à la situation clinique chez l’homme ou la femme. Ces techniques moins invasives aideront les scientifiques à développer des thérapies efficaces pour l'infarctus du myocarde.
Procédures
L'électraucotérisation : 22 souris SHAM et 22 opérées; durée de l'opération 10 minutes. La magnétisation de nanoparticules: 34 SHAM et 34 opéréés; durée de l'opération 30 minutes. Procédure d’échocardiographie: pour tous les animaux; analyses réalisées en 30 minutes en moyenne.
Impact sur les animaux
L’infarctus du myocarde peut entrainer plusieurs effets indésirables chez la souris. La douleur attribuable à l'infarctus du myocarde est maximale jusqu'à 24 h chez la souris. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir une légère déshydratation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure afin récupérer les différents tissus pour des analyses de biologie moléculaire et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. L'utilisation d'animaux se justifie également par l'incapacité d'obtenir une lignée cellulaire stable de cardiomyocytes.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux par groupe une analyse statistique poussée a été réalisée. Le calcul du nombre d'animaux nécessaires pour pouvoir conclure définitivement sur les résultats, est très important car il serait aussi grave de limiter de façon excessive le nombre d'animaux à inclure que d'en inclure un trop grand nombre. Utiliser des animaux pour une expérience qui ne sera pas conclusive par manque d'animaux et donc par manque de puissance statistique est aussi grave qu'en utiliser trop. Pour rentabiliser l’utilisation des animaux à des fins expérimentales, les organes sont prélevés, partagés et congelés pour des expériences de biochimie et de biologie moléculaire ultérieures.
Raffinement
L'opération chirurgicale est induite en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre sous lampe chauffante. Après son réveil complet (environ 10 minutes), il est remis dans sa cage. La douleur propre à l’infarctus étant observé 24 h après opération les souris seront traitées avec un analgésique au cours de cette période. Les yeux sont protégés du dessèchement par un onguent ophtalmique et de la lumière par une compresse humidifiée. Pour faciliter l’accès à la nourriture des boites de gels ou une litière surélevée seront mises en place afin que les souris ne perdent pas trop de poids.
Choix des espèces
Le protocole d'éléctrocoagulation de l'artère coronaire a été publié originalement sur la souris et requiert en effet une sonde ultrasonore de haute fréquence pour la visualisation qui est adaptée à la souris plutôt qu'au rat. Les souris seront opérées à l'âge de 1 ou 2 mois pour avoir la taille minimum pour procéder à la ligature de la coronaire.
Identification et caractérisation préclinique de conopeptides antalgiques (CONIDOL)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 986 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 3 020 un niveau modéré. On leur induit des douleurs inflammatoires, post-opératoires, arthrosiques et neuropathiques pour mesurer leur seuil de douleur et tester des peptides tirés de venins de cônes marins. Le porteur indique que la nécessité d'évaluer la douleur empêche de mettre en place un traitement antalgique, les souris atteignant une perte de poids de 20 % ou d'autres points limites étant alors tuées. Les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre la douleur chronique, sont formulées comme une perspective.
Objectifs
La dernière Classification Internationale des Maladies (CIM-11) réalisée par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) reconnait enfin la douleur chronique. C’est une avancée importante pour des millions de personnes : on estime en effet à l’échelle mondiale qu’une personne sur 5 souffre de douleurs chroniques, et que 2 personnes sur 3 ne sont pas satisfaites par leur traitement. Les coûts directs et indirects résultant sont importants pour nos sociétés. Face à ce constat, le nombre réduit de molécules antalgiques à la disposition des praticiens et leur ratio bénéfice/risque insuffisant motivent la recherche de nouveaux candidats médicaments. Dans cette quête, les substances d’origine naturelle ont démontré leur potentiel. En particulier, la diversité et l’efficacité des toxines contenues dans les venins de cône marin représentent une opportunité. Le ziconotide, un analogue synthétique de conotoxine bénéficie d'ailleurs d'une autorisation de mise sur le marché en 2004 pour le traitement des douleurs réfractaires à la morphine, mais son utilisation est restreinte en raison d’un mode d’administration contraignant. L'objectif de ce projet est donc d'identifier de nouveaux conopeptides ou d'améliorer des conopeptides connus (optimisation chimique, formulation, mode d'administration) pour le développement d'antalgiques innovants, efficaces et bien tolérés.
Bénéfices attendus
Notre objectif est l'identification et la caractérisation de conopeptides naturels ou modifiés ayant de bonnes propriétés antalgiques tout en étant bien toléré par les animaux. Ces composés pourront devenir des candidats-médicaments et faire l'objet d'études précliniques ultérieures plus approfondies. De plus, le mode d'administration actuel du ziconotide (intrarachidien), seul conopeptide antalgique sur le marché, est risquée et contraignante. Nous nous intéressons particulièrement à cette problématique et évaluerons des modes d'administrations plus sûrs et confortables.
Procédures
486 souris feront l'objet d'une euthanasie (anesthésie sans réveil) pour prélèvement de tissus post-mortem. 120 souris feront l'objet d'enregistrements électrophysiologiques in vivo sous anesthésie générale et terminale. Une inflammation plantaire sera induite chez 1600 souris (injection carragénine) pendant 6h30. Un peptide sera administré chez ces animaux par voie intrapéritonéale, intrathécale, intraplantaire, intra-articulaire ou topique. Une mesure de seuils de douleur sera réalisée chez ces animaux pendant 3h après traitement. 200 souris seront soumises à des tests de locomotion après administration de peptide. Un modèle de douleur sera induit chez 1400 souris (post-opératoire : 24h, arthrose : 7 jours, neuropathique : 14 jours). Le peptide sera administré chez ces animaux le dernier jour et les seuils de douleur des animaux seront suivis pendant 3h. 300 souris seront incluses dans un protocole de pharmacocinétique impliquant des prélèvement de sang, cerveau et peau, qui seront réalisés après euthanasie.
Impact sur les animaux
Les conopeptides n'ont pas de toxicité centrale dû à leur incapacité à passer la barrière hémato-encéphalique. Ils peuvent cependant induire une toxicité périphérique, notamment musculaire ou cardiaque. La toxicité cardiaque sera évaluée chez l'animal anesthésié avant toute administration à un animal vigil. Des échelles de doses seront réalisées pour observer d'éventuelles modifications du comportement et déterminer la tolérance aux produits. Ce projet nécessite l'induction de modèles de douleur neuropathique et inflammatoire. Ces procédures, de fait, constituent une nuisance pour les animaux. Les animaux seront donc euthanasiés immédiatement après l'expérience, dont la durée sera réduite au minimum (fonction du temps nécessaire à l'induction). Seuls des tests comportementaux visant à atteindre le seuil de douleur de l'animal sans le dépasser seront utilisés. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des expérimentations car les traitements réalisés ne permettent pas leur réutilisation. De plus, les procédures impliquent l'induction d'un modèle de douleur, ce qui rend leur euthanasie obligatoire en fin d'expérience.
Remplacement
Les peptides seront sélectionnés par une approche in vitro, favorisant l'utilisation de lignées cellulaires et les cellules souches différenciées. Nous utiliserons également des cultures primaires de neurones pour confirmer les résultats obtenus sur les lignées. Ces cultures nécessitent l'euthanasie d'animaux, mais permettent d'obtenir une grande quantité de résultats par animal (42 peptides ou concentrations différentes peuvent-être testés grâce aux neurones obtenus d'une souris).
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Certaines procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux (par exemple test de nociception, puis test de sédation et enfin mesure de la température rectale).
Raffinement
Les premiers tests in vivo seront réalisés sous anesthésie (enregistrement de l'activité nerveuse sensorielle périphérique sous anesthésie kétamine/xylazine, 1 mg/kg intrapéritonéal), et couplés à un monitoring cardiaque. Cela permettra de ne tester chez l'animal vigil que les toxines ayant un effet avéré sur l'hyperexcitabilité neuronale et n'ayant pas de toxicité cardiaque. En raison de la nécessité d'évaluer la douleur chez les animaux, nous ne pouvons pas mettre en place de traitement pharmacologique de la douleur. Cependant, afin de prévenir une éventuelle souffrance qui irait au delà du modèle de douleur utilisé, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et euthanasiés si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié. Les animaux seront au maximum 6 par cage en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale et électrophysiologique ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. C'est également le modèle pour lequel nous disposons du plus de données dans la littérature. Enfin, notre animalerie est une animalerie petit rongeur concue pour l'hébergement des souris, modèle sur lequel notre personnel a le plus d'expertise. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (8-12 semaines). Si la douleur touche essentiellement des personnes âgées, travailler sur la souris âgée représenterait un risque et surcoût extrêmement important qui mettrait en péril le projet dans son ensemble (coût d'achat d'animaux âgés et surmortalité de ces animaux). L'animalerie et son personnel ne sont pas en mesure d'accueillir à grande échelle des animaux âgés demandant une surveillance et des soins accrus et adaptés. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes.
Évaluation des propriétés antiépileptiques de composés nouvellement identifiés dans un modèle murin du syndrome de Dravet
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 576 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de Dravet, elles reçoivent des injections, subissent des crises d'épilepsie déclenchées par hyperthermie et des tests comportementaux d'exploration et de nage, pour évaluer trois composés antiépileptiques. Le porteur indique que le modèle entraîne des crises spontanées et une mort subite chez 40 % des souris, qu'il décrit comme survenant "sans aucune souffrance". Il justifie la souris par le fait qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les crises d'un "organisme entier", et annonce une transposition possible à l'humain au conditionnel.
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une épilepsie génétique sévère qui se développe avant l'âge de 1 an. Outre les crises d'épilepsie, ce trouble se caractérise par des comorbidités comportementales, telles qu'un déficit cognitif et une déficience motrice. Dans 80% des cas, ce syndrome est causé par une mutation d'un gène codant pour un canal sélectif au sodium. Ces canaux sont principalement localisés dans les neurones inhibiteurs du cortex et de l'hippocampe et jouent un rôle clé dans la régulation de leur excitabilité. Plusieurs équipes ont montré que les mutations de ces canaux identifiées chez des patients atteints du syndrome de Dravet provoquaient une hypoexcitabilité des neurones inhibiteurs induisant un déséquilibre excitation/inhibition qui conduit à des crises d'épilepsie. Une grande partie des patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises avec les traitements pharmacologiques actuels. Les souris reproduisant la mutation humaine ont un phénotype qui récapitule les symptômes observés chez les patients atteints du syndrome de Dravet. Nous allons tester 3 composés qui ont montré un potentiel antiépileptique, réduisant efficacement la fréquence des crises dans un modèle d'épilepsie chez le poisson zèbre. Notre projet de recherche vise à évaluer l'efficacité d'un traitement pharmacologique précoce avec les 3 composés sur le développement de différents symptômes dans un modèle de souris du syndrome de Dravet, confirmant, espérons-le, les résultats prometteurs obtenus à partir d'un modèle de poisson zèbre.
Bénéfices attendus
Nous présentons une nouvelle approche expérimentale, ainsi qu'une nouvelle version de la ligne de traitement existante, l'une ou l'autre pouvant améliorer la résistance aux médicaments observée chez les patients atteints du syndrome de Dravet. La majorité des traitements pharmacologiques actuellement disponibles se sont avérés peu ou pas efficaces dans le syndrome de Dravet. Nos traitements proposés ont déjà montré des résultats prometteurs dans un modèle de poisson zèbre du syndrome de Dravet, réduisant efficacement la fréquence et la gravité des crises. Nous nous attendons à observer un effet similaire dans notre modèle de souris, en testant en outre l'effet du traitement sur les anomalies comportementales, ce qui, dans l'état actuel, n'est pas possible chez les poissons. De plus, si les résultats sont confirmés chez un mammifère comme la souris, le potentiel thérapeutique a plus de chance d'être transférable à l'homme.
Procédures
A 6 jours les animaux sont biopsiés pour analyse du génotype, puis les souris entrent en procédure à l'age de 15 jours. La totalité des souris recevra une injection en intrapéritonéal ou intranasal (durée 3 à 5 s) qui peut provoquer une inflammation locale. 6 groupes de 23 souris mutantes subiront une induction de crise induite par l'hyperthermie. Il s'agit d'une procédure unique qui dure environ 20 minutes et se termine lors d'une crise tonico-clonique généralisée ou lorsqu'elle atteint 43 degrés. La majorité des tests comportementaux, qui seront utilisés sur 363 souris, sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront en une seule séance (5 à 30 min). Un test d'apprentissage qui consiste à faire nager les souris pendant au maximum 1 minute est réalisé sur 5 jours.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons une lignée de souris avec une modification génétique du gène codant pour un canal sodium qui provoque des crises tonico-cloniques spontanées à partir de l'âge de 3 semaines environ. Ces crises peuvent provoquer une mort subite chez 40% des animaux sans aucune souffrance (cette mortalité est également observée chez les enfants atteints du syndrome de Dravet). Les crises durent peu de temps (entre 20 et 30 s) et les souris récupèrent rapidement (2 à 5 min). En d'autres termes, les souris reprennent lentement conscience et recommencent à bouger sans aucun signe de douleur (pas de posture, de cri ou d'expression faciale de douleur). La fréquence moyenne des crises spontanées dans ce modèle de souris est de 1 crise tous les 2 jours.
Devenir
Toutes les souris prévues pour les procédures seront euthanasiées car elles ne peuvent pas être réutilisées dans une autre procédure à cause des effets possibles des molécules injectées .
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal in vivo mimant le phénotype clinique observé chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cruciale pour l'objectif de notre projet qui est de tester l'efficacité de nouveaux traitements pharmacologiques sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) qui surviennent dans ce syndrome. Aucun modèle in vitro ne peut récapituler les réponses d'un organisme entier en terme de crises d'épilepsie et leurs conséquences sur le comportement.
Réduction
Nous avons minimisé le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des procédures tout en nous assurant d'en avoir suffisamment pour faire l'analyse statistique de nos expériences (analyse de puissance a priori). Dans toutes les procédures, nous comparerons les souris mutantes avec les souris controles des mêmes portées. Dans toutes les procédures, nous utiliserons des femelles et des mâles issus des mêmes portées.
Raffinement
Nous prendrons toutes les mesures d'affinement appropriées pour éviter toute souffrance ou inconfort pour l'animal (anesthésie pendant les procédures et analgésie post procédure si nécessaire). Une grille de score permettra le suivi et la mise en place d'actions correctives en cas d'anomalie et les points limites. Ainsi, toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et nous manipulerons les animaux régulièrement pour réduire leur stress. L'induction des crises spar hyperthermie e fera une fois que les animaux se seront habitués à l'équipement et ils seront refroidis à la fin de l'expérience. Enfin, les souris mutantes ayant des crises tonico-cloniques spontanées, nous porterons une attention particulière aux critères de poids, de stress et d'hyper-réactivité comme le suggèrent les NC3Rs pour les modèles d'épilepsie avec crises spontanées.
Choix des espèces
Le modèle de souris portant une mutation humaine est très informatif car 1) les animaux présentent des symptômes quasiment identiques à ceux des humains et dans la même gamme d'âge, nous utiliserons les animaux à l'âge de développement de l'épilepsie et d'apparition des symptômes (entre 21 et 30 jours), 2) les animaux issus de la même portée mais sans la mutation sont d'excellents controles. La souris est une espèce très intéressante pour les expériences de comportement car ce sont des mammifères qui ont des capacités d'apprentissage, et pour l'observation des crises d'épilepsie car elles sont courtes et indolores comme chez les humains.
Caractérisation du rôle de ALPK1 et du microbiote intestinal dans le traitement des dérèglements métaboliques et des maladies inflammatoires chroniques intestinales dans des modèles murins de prédiabète ou de colites induites.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages quotidiens pendant deux à treize semaines, des prélèvements de sang à la queue et une colite déclenchée par un agent chimique, qui provoque perte de poids et lésions du côlon, pour tester des bactéries censées protéger contre le diabète et l'inflammation intestinale. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule le système digestif et son microbiote, et conclut que le recours aux souris est "nécessaire". Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements des maladies inflammatoires de l'intestin, restent à l'état d'objectif.
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes et des antigènes alimentaires. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d’un système immunitaire sain. Un déséquilibre du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Les MICI sont des maladies très invalidantes dont l’incidence est particulièrement importante dans les pays industrialisés. Ces dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre et les dépenses de santé liées au diabète dépassent les 850 trillions de dollars au niveau mondial. Il est donc essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements. Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans ces maladies. Nos travaux montrent l’impact de certaines souches bactériennes sur une voie de l’immunité innée associée à l’obésité. Nous émettons l’hypothèse que l’activation de cette voie par des bactéries intestinales pourrait impacter la santé, notamment la mise en place du diabète et le développement des MICI. L’objectif de notre projet est donc d’explorer les propriétés protectrices de souches bactériennes qui activent cette voie immunitaire sur: i) l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse, ii) l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite et dans ce même modèle de colite induite après un régime riche en graisse. Ces expérimentations seront réalisées à chaque fois sur deux lignées de souris : des souris transgéniques chez lesquelles la voie imunitaire étudiée a été inactivée (et des souris ne présentant aucune mutation qui seront utilisées comme contrôles. Sur 5 ans, nous testerons 6 bactéries sur des souris contrôle et modifiées pour la voie immunitaire d’intérêt, recevant un régime riche en graisses ou/et soumises à une colite.
Bénéfices attendus
Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans le développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Il est essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements.
Procédures
Pour mesurer la glycémie des 360 animaux, 6 goutes maximum de sang seront prélevées sur une durée de quelques secondes. Un prélèvement de sang sera effectué une seule fois au moment de la mise à mort sur une durée de 10 à 15 secondes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. La récolte de fèces sera réalisée lors de l’émission naturelle de fèces par la souris (avant traitement puis en fin de procédure) pour une durée de quelques minutes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. Les gavages, effectués quotidiennement sur une période de 2 à 13 semaines, nécessitent une contention pendant moins de 10 secondes et seront également réalisés sur l’ensemble des animaux.
Impact sur les animaux
Lors des gavages aucune nuisance n’est attendue hormis le stress dû à la contention (10 secondes maximum). Les animaux soumis aux tests glycémiques subirons un stress léger de très courte durée lors de l’incision au bout de la queue pour les prélèvements de sang (1 seconde). Le prélèvement de sang final sera réalisé juste avant la mise à mort en causant un stress modéré sur 10 à 20 secondes. Les effets indésirables dû à l’agent inducteur des la colite sont perte de poids, lésions coliques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de realiser les prelevements d'organes et de tissus necessaires.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, et la réponse immunitaire. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal, la composition en lien avec les données biologiques obtenues à partir du sang et des tissus intestinaux de l’hôte
Réduction
Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des tests statistiques (10 animaux par lot) sans nécessitée de répétition ultérieure de l’expérience.
Raffinement
Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés tous les jours durant la phase d’adaptation afin de diminuer leur stress lors des prélèvements. Toutes les souris auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l’ajout d’un abri obscur en polycarbonate. Les souris seront 5 par cage pour éviter l’isolement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de façon appropriée si un problème survenait. Les équipements utilisés sont adaptés à la physiologie du petit animal telle que l’utilisation de lecteur de glycémie performant (rapide et nécessitant un volume de sang faible). Enfin, des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie ainsi que sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles permettant une reproductibilité des résultats. De plus ce modèle nous permet d’appréhender la réponse immunitaire dans son ensemble et plus particulièrement la réponse de la voie d’intérêt. Des données publiées par un groupe britannique a montré l’importance du gène impliqué dans la voie immunitaire étudiée dans ce projet dans l’équilibre intestinal en utilisant ce modèle, justifiant de l’utilisation de ces mêmes souris pour nos expériences. Nous avons choisi de travailler sur des animaux en fin de croissance de 8-10 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.
Etude de pharmacocinétique et de pharmacodynamie de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
9 990 souris vont être utilisées, toutes classées en souffrance sévère, et chacune peut subir jusqu'à 13 microprélèvements de sang à la queue en neuf semaines, jusqu'à quatre prises de sang derrière l'œil sous anesthésie gazeuse, puis une prise de sang terminale. Selon les procédures, immunodéprimées ou non, elles sont greffées ou non de cellules tumorales sous la peau ou dans la veine, avec des risques cités de nécrose et d'ulcération des tumeurs ou de paralysie, et reçoivent un composé d'immunothérapie, parfois avec une molécule déplétante jusqu'à un jour sur deux pendant neuf semaines. Toutes sont tuées, au prélèvement d'organes, de tumeurs ou de sang terminal, au point limite ou en fin d'étude. L'étude dose ces composés dans le sang et mesure leur fixation sur leur cible, pour trier ceux qui passeront aux études d'efficacité d'autres projets, et le porteur invoque 10 millions de morts du cancer en 2020 et un "besoin médical" qu'il dit "considérable".
Objectifs
Chaque année, plus de 19 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 10 millions de décès. L'immunothérapie des cancers (immuno-oncologie) est une révolution dans le domaine du traitement des cancers. L'objectif est de réactiver les cellules du système immunitaire pour les conduire à reconnaître et à éliminer les cellules tumorales. Notre approche de l'immuno-oncologie vise à amplifier et améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales en exploitant les systèmes immunitaires adaptatif et inné. Nous développons des composés thérapeutiques visant à stimuler les cellules Natural Killer (NK) pour induire un contrôle durable des tumeurs par le système immunitaire. Pour exploiter l'activité anti-tumorale de ce dernier, nous concevons : • des anticorps monoclonaux conduisant soit au blocage de signaux inhibiteurs envoyés aux cellules NK soit à leur activation directe via l’engagement de certains de leurs récepteurs activateurs de surface (cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ou ADCC). • des « NK cell engager » multispécifiques capable de recruter simultanément un récepteur activateur des cellules NK et un antigène de surface exprimé par les tumeurs. Ce co-engagement induisant une forte activation des cellules NK et la lyse des cellules cancéreuses. • des anticorps conjugués à des toxines (Antibody Drug Conjugate ou ADC) capables d’amener des molécules cytotoxiques directement dans les cellules tumorales. L’objectif de ce projet consiste à évaluer la concentration plasmatique de composés thérapeutiques, la saturation de la cible d’intérêt et doser des facteurs solubles chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse (procédures 2 et 3) ou non de tumeur (procédure 1). Il permettra de caractériser les niveaux et la durée de saturation de la cible à différentes doses du composé et/ou d’affiner les doses et fréquences utilisées dans les études ultérieures d’efficacité. Il pourra également permettre d’identifier les cellules immunitaires ou les facteurs solubles impliqués dans la réponse induite par les composés.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès dans le monde en 2020. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Le projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques agissant sur la cible d'intérêt, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Administration de composé thérapeutique (1 injection, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 9 semaines, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (prélèvement d’un volume inférieur ou égal à 20 µL dans la limite de 25% du volume total de sang sur une période de 28 jours, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire, d’un volume inférieur à 7.5% du volume sanguin total avec un temps de récupération de 1 semaine minimum ou inférieur à 10% du volume sanguin total avec un temps de récupération de 2 semaine minimum (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire, d’un volume maximal de 800 µL (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque, d’un volume maximal de 1 mL, sous analgésie (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère, liés à l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Stress et douleur légère, liés à l’administration du composé en intra-péritonéal, intraveineux au niveau de la veine caudale, sous-cutané ou per os (1 injection, 15 s) ; Stress et douleur légère, liés à l’administration de la molécule déplétante/neutralisante en intra-péritonéal, sous-cutané, per os (maximum 1 jour sur 2 pendant 9 semaines, 15 s) ou en intraveineux au niveau de la veine caudale (maximum 1 fois/semaine pendant 9 semaines, 15 s) ; Stress léger lié à la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de : Tonte du flanc (1-3 fois, 10 s), pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s), mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse (4-5 fois pour les prélèvements sanguins en rétro-orbitaire et lors de l’injection intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital du composé ou de la molécule déplétante/neutralisante, 30 s avant endormissement). Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min ; Stress et douleur légère, liés au micro-prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale (13 prélèvements maximum jusqu’à 2 fois/jour pendant 9 semaines, 15 s) ; Prélèvements de sang dans la limite de 10% du volume sanguin total par prélèvement et limités à 25% de volume total de sang sur une période de 28 jours. Possibilité d’effets indésirables liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose / ulcération / inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux) ; Possibilité d’effets indésirables liés au composé thérapeutique : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, un minimum de 4 prélèvements par point temporel est nécessaire pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques et/ou pharmacodynamiques statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Pour étudier le devenir des composés de façon fiable au cours du temps, les prélèvements sont réalisés sur un maximum de 13 points temporels. 20 animaux maximum par groupe sont donc requis pour l’étude d’un composé dans une procédure. Dans le cas où l’étude permet le développement de méthodes de dosage adaptées à des micro-volumes de sang, le nombre d’animaux utilisés est considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées car l’ensemble des valeurs peuvent être obtenues sur un même animal. Dans ce cas, le nombre d’animaux par groupe peut être diminué à 4 minimum. Au cours de l’étude, les organes et/ou les tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux variables de 2 à 5 par cage, en fonction des impératifs liés à l’expérimentation avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des zones de statut SOPF, en portoir ventilé et manipulées sous hotte ou PSM, pour prévenir tout risque de contamination et permettre, dans le cas de souris immunodéprimées, de ne pas exprimer de phénotype dommageable. Des prélèvements de sang seront réalisés dans la limite de 10% du volume sanguin total par prélèvement et limités à 25% du volume total de sang sur une période de 28 jours. Un prélèvement terminal, sous anesthésie générale pourra également être réalisé. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé et/ou les cellules tumorales greffées en intraveineuse pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et l’activation du système immunitaire. Enfin, le modèle murin est un modèle de choix du fait de l’existence de souris immunodéprimées et de souris génétiquement altérées qui permettent d’évaluer le rôle de nos composés thérapeutiques sur le système immunitaire. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 252 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 982 impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par chirurgie abdominale, puis des séances d'imagerie qui les maintiennent endormies deux à quatre heures, pour étudier le rôle de cellules immunitaires dans les cancers solides de l'intestin. Le porteur affirme que les souris rencontrent "peu d'effets indésirables" liés à la tumeur, et que, faute de lignées cellulaires d'ILC, le recours au "modèle murin" est "essentiel". Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles approches contre le cancer, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Ce projet propose de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des cellules lymphoïdes innées (ILCs). Nous souhaitons identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur afin d'évaluer leur contribution directe ou indirecte dans la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons particulièrement aux réponses immunitaires impliquées dans les cancers « solides » qui représentent la majorité des cancers, et plus particulièrement ceux touchant l’intestin. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des ILCs dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer, au long terme à améliorer de la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et suite à un défi inflammatoire. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
La greffe tumorale consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes et les animaux seront sous surveillance quotidienne. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. L’injection de molécules que nous proposons d’étudier dans ce projet aura peu d’effets indésirables ou à court terme (24-72h).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
La validation de facteur des cellules lymphoïdes innées (ILCs) seront faites au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires tumorales pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de ces potentiels molécules. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier leur mode d’action. Néanmoins, les lignées cellulaires d’ILC humaines ou murines n’existant pas, les tests in vitro ne pourront pour le moment pas être réalisés. De plus, les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. De ce fait, nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec des statisticiens, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. La nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s). L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dans la mesure du possible, les expériences utilisant différentes techniques ex vivo seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis quotidiennement fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort afin de contrôler la pousse tumorale. Le nombre de cellules tumorales injectées est volontairement faible afin de prévenir une pousse tumorale trop importante. L’injection se faisant dans la partie externe de l’intestin, l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du gel hydrique et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées. Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>6 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.