Souris
Étude métabolique et fonctionnelle en imagerie in vivo d’un modèle de gliomes chez la souris (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe intracérébrale de cellules humaines de glioblastome lors d'une chirurgie stéréotaxique, suivie de trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur attend une neuroinflammation, un état fébrile temporaire, une perte d'appétit et une léthargie après l'injection. Il caractérise un biomarqueur d'imagerie du gliome et qualifie le recours à des animaux vivants d'"indispensable" pour le caractère translationnel des lignées humaines.
Objectifs
Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquent. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelé IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester et d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie en tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures. Une douleur pendant la chirurgie et post-chirurgicale peut apparaître et sera anticipée, évaluée et traitée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure, afin de permettre des analyses post-mortem in vitro seront réalisées sur les échantillons de cerveaux. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.
Remplacement
Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en sous-groupes expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en sous-groupes (de 5 à 7 souris) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque sous-groupe. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (anti-inflammatoires), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultra-sons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonor est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.
Méthode d’identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 1000
75 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est contenu quelques secondes pour un tatouage et une biopsie d'oreille destinée au génotypage, sous isoflurane au-delà de quatorze jours. Le porteur réutilise environ 1 100 animaux pour d'autres projets ou pour la formation, et fait tuer les autres, notamment les génotypes non souhaités et les animaux d'élevage trop âgés. Il caractérise génétiquement quatre-vingts lignées de son animalerie et affirme qu'identifier les individus est "nécessaire" à leur utilisation scientifique.
Objectifs
L'objectif est de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre animalerie pour gérer nos élevages et être utilisés dans des projets scientifiques (ex: identifier des biomarqueurs de l'hypoxie, étudier des gènes de l'infertilité, étude de l'arthrite, étude de cancérologie pour trouver et mettre au point des traitements, ...).
Bénéfices attendus
Notre établissement utilise en routine pour l'élevage des lignées génétiquement altérées: l'identification par tatouage des phalanges et la biopsie d'oreille pour le génotypage. Ce projet permettra de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre élevage de souris et rats génétiquement altérées nécessaires à différents projets de recherche.
Procédures
L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
La contention pouvant engendrer un stress et des douleurs légères au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d'oreille), nous serons vigilant à effectuer cette méthode d 'identification de façon rapide et avec précision. L’anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés. Le geste sera réalisé par du personnel dûment formé ayant suivi un tutorat relatif à ce geste technique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour les génotypes non souhaités, les animaux d'élevage trop âgés, les animaux au cours de leur élevage fin d'éviter des situations de souffrance. Gardés en vie pour une utilisation continue pour l'élevage ou vers les projets prévus pour ces animaux et réutilisation vers les projets non prévues pour ces animaux pour la formation.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs à des fins scientifiques nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique le cas échéant. L’identification permet de repérer un animal parmi ses congénères et de le suivre tout au long de sa vie expérimentale. En plus de cette identification, une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. De plus ,il n'est pas possible dans le cadre de l'expérimentation des chercheurs de la plateforme de remplacer le modèle animal par un autre (in vitro, in silico,..)
Réduction
Une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. Seuls les animaux ayant besoin d'etre génotypés subiront une biopsie d 'oreille , les autres seront identifiés uniquement par technique du tatouage aux phalanges. La gestion des élevages se fait de façon raisonnée afin d'éviter au maximum la génération d'animaux surnéméraires non utilisés par la suite dans les expérimentations.
Raffinement
Le geste technique sera réalisé rapidement à l'extrémité de l'oreille ,afin de réduire supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse nous pratiquerons une anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane lors du tatouage et de la biopsie de tissu pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de produire et d'identifier des lignées de souris et rats génétiquement modifiées par croisement et ceci afin de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche des instituts comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives , sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant les organes. Les animaux seront identifiés à partir du 5ème jours jusqu'au 14ème jour, au dela la biopsie et l'identification par tatouage pourra se faire uniquement sous anesthésie volatile à l'isoflurane.
Validation de l’irradiation à ultra-haut débit de dose chez la souris: expérience pilote
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont anesthésiées à l'isoflurane puis irradiées à ultra-haut débit de dose lors d'une expérience pilote de radiothérapie FLASH. Le porteur indique qu'aucune nuisance n'est attendue et que l'irradiation est imperceptible, mais que les souris ne peuvent être gardées vivantes en raison des effets secondaires à long terme et seront tuées par dislocation cervicale. Il cherche à valider la faisabilité des irradiations avant une étude à plus grande échelle.
Objectifs
La radiothérapie FLASH est une nouvelle méthode d'irradiation à très haut débit de dose. Elle est décrite pour déclencher moins d'effets secondaires sur les organes sains tout en conservant la même efficacité anti-tumorale. Cependant, de nombreux aléas demeurent, parmi lesquels le type de particules ou encore la structure du faisceau. Nous disposons d'un cyclotron (accélérateur de particules) capable de contrôler certains de ces paramètres et ainsi permettre la validation à différents niveaux de la radiothérapie FLASH.
Bénéfices attendus
Ce projet validera la bonne réalisation des irradiations et la maitrise de la sécurité des animaux avant de passer à l'étape d'expérimentation à plus large échelle. Les procédures sont complexes au sein du cyclotron. Cette mise en oeuvre test permettra d'écarter ou corriger tout problème logistique imprévu pendant le parcours des animaux. Il n'y cependant aucun risque d'accident d'exposition.
Procédures
Les animaux seront transportés (30 min), anesthésiés (isoflurane, 12 min total) et irradiés (imperceptible).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n'est attendue. L'irradiation est imperceptible et il n'y a pas de procédure invasive.
Devenir
Il n'est pas possible de réutiliser ou conserver un animal irradié en raison des risques d'effets secondaires à long terme. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
Le bénéfice de la radiothérapie FLASH n'est pas visible in vitro. Il n'existe donc pas de procédure de remplacement possible.
Réduction
Le nombre de 6 animaux est le strict minimum possible afin de répéter l'irradiation pour s'assurer que le processus est reproductible (2 animaux seulement par condition). Il n'est pas possible de réduire.
Raffinement
La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie isoflurane à 4% pour l'induction et 2% pour le maintien dans le but d'immobiliser l'animal, la radiothérapie étant imperceptible. Le réveil des animaux s'effectue sous contrôle visuel avec équipement chauffant à 37°C. Les animaux seront hébergés en groupes de 3 à 5/cage avec enrichissement (tunnel, dôme ou frisottis), accès à l'eau et la nourriture à volonté, et cycle jour-nuit 12h/12h. La dominance est observée et un groupe est recomposé uniquement en cas d'incompatibilité entre deux individus.
Choix des espèces
La souris, par son faible encombrement et sa vitesse de reproduction/développement, est le modèle de mammifères le plus pratique au laboratoire et le plus décrit en cancérologie. Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. Les organes d'intérêt pour notre étude sont particulièrement ressemblant à l'homme. De plus, la souris tolère l'homozygotie et permet de travailler sur des lignées pour des résultats scientifiques reproductibles. Les modèles immunodéficients tolèrent la greffe de cellules tumorales humaines. Enfin, ce modèle est accepté dans les phases de validation thérapeutique pré-clinique à visée humaine. De surcroit, la souris est un modèle qui a déjà été validé en radiothérapie FLASH ce qui permet d'effectuer un comparatif inter-études. Aucun pré-requis pour l'âge et le sexe. Les animaux seront récupérés de surplus d'élevage tels qu'ils sont pour éviter un suremploi.
Effets d’une alimentation riche en cholestérol pendant plusieurs générations chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
832 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Nourries au cholestérol sur plusieurs générations, elles subissent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec injections et prélèvements sanguins à la queue, avant d'être tuées à cinq mois pour prélever aorte, cœur, foie et autres organes. Le porteur indique avoir d'abord utilisé un petit ver, Caenorhabditis elegans, pour limiter le recours aux vertébrés. Il étudie l'hérédité épigénétique paternelle des maladies cardiométaboliques et renvoie au conditionnel les retombées thérapeutiques.
Objectifs
La prévalence de l'obésité s'est accrue de manière épidémique dans les pays développés. Compte tenu du lien étroit entre l'obésité et les maladies cardiovasculaires, l'une des premières causes de mortalité en France, cela pose un grave problème de santé publique. Bien qu'une mauvaise alimentation et la sédentarité sont des facteurs de risques importants pour le développement des maladies cardiovasculaires, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se "souviennent" de l'hygiène de vie de nos parents ou en d'autres termes d'un phénotype nouvellement acquis. Dans le présent projet, il s'agit d'un désordre métabolique, peut être transmis via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d'hérédité non-génétique est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes "épigénétiques" qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées directement par l’ADN. Depuis plusieurs années, nous avons développé un modèle d'hérédité où l'obésité paternelle induite par une alimentation riche en graisse est transmise par le père via les spermatozoïdes. Cependant, faute de modèles expérimentaux adéquats, très peu de données existent concernant l'hérédité épigénétique des maladies cardiométaboliques et les éventuels mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d'hérédité sont très mal connus.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer si la susceptibilité à développer des pathologies cardiométaboliques (notamment les cardiopathies coronariennes et maladies du foie gras) est modulée par l'héritage épigénétique paternel. Les bénéfices susceptibles d’émerger de notre projet consiste essentiellement en une meilleure compréhension des facteurs de risques héréditaires des maladies liées à un taux trop élevé de cholestérol (comme l’athérosclérose) qui pourra éventuellement déboucher sur une prise en charge thérapeutique améliorée de ces maladies.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Au total, les souris subiront 2 injections intrapéritonéales, à savoir une injection de glucose et une injection d’insuline. Pour réaliser ces injections, seules quelques secondes (5-10s) suffisent. Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.
Impact sur les animaux
L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (Aortes, Coeur, reins, tissus aadipeuc, pancréas, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analysies moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique des maladies cardio-métaboliques.
Remplacement
L'hérédité transgénérationnelle est un mécanisme complexe d'interaction pour lequel il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèles in vitro. L'emploi d'un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie des maladies cardiovasculaires (notamment les cardiopathies coronariennes) chez le mammifère est donc essentiel.
Réduction
Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et nonparasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire (15 animaux/groupe), nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ.
Raffinement
Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur sevrage. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT. • Les souris seront identifiées par punch au sevrage. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle en raison de ces similarités génétiques, et physiologiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peutt être modifié et analysé. C'est, par ailleurs, la raison pour laquelle l'ensemble des techniques de transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. En plus, nous pourrons avoir d’une façon relativement rapide les 5 générations indispensables pour achever l'étude. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 3 semaines jusqu'à l'âge de 5 mois. L'âge de 3 semaines correspond à la puberté la souris. A cet âge, les cellules qui génèrent les spermatozoïdes sont très sensibles à divers stress environnementaux. A l'âge de 4 mois, les mâles seront croisés afin d'obtenir les futures générations. En maintenant une nourriture riche en cholestérol pendant 4 mois, nous pensons que des marques non-génétiques peuvent être induites par l’alimentation et sont susceptibles d’être transmises à la nouvelle génération. Les croisements seront effectués comme suit: un male préalablement nourri en HCD sera croisé avec une femelle C57BL/6J. Lors du croisement la nourriture sera la nourriture standard. Le lendemain après le croisment si un bouchon vaginal est observé le mâle sera remis dans sa cage avec ses comparses sous un régime HCD. Après avoir été croisés, les animaux agés alors de 4 mois 1/2 subiront les tests de GTT et ITT.
Manipulation pharmacologique de canaux mis en jeu lors d’un challenge hypercapnique chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
698 souris vont être utilisées, une majorité tuée sans réveil, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Des nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie du système nerveux central, tandis que des adultes reçoivent des solutions par aérosol ou par voie intranasale sous anesthésie. Le porteur souligne que ces souris mutantes, modèles du syndrome d'Ondine, présentent une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque de défaillance respiratoire, l'arrêt cardiorespiratoire figurant parmi les points limites. Il teste des agents pharmacologiques sur des canaux respiratoires et affirme que cette fonction ne peut être étudiée que sur des souris vivantes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré), cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Des cellules du système nerveux sont sensibles à l’hypercapnie, par le biais de canaux présents à la surface de leur membrane. Ces canaux sont sensibles aux variations d’acidité (trop de CO2). Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC et leurs congénères sauvages. L’approche utilisée chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettra d’identifier l’agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité le plus efficace, elle nécessitera une chirurgie permettant d’isoler la partie du système nerveux central comportant la commande respiratoire. Chez les souris adultes, l’approche utilisée est non invasive, elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’un agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment ces canaux sensibles à l’acidité peuvent moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie (chémosensibilité au CO2/H+). A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie, cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. Le blocage des canaux sensibles aux protons pourrait potentiellement 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes, 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des canaux sensibles aux protons au niveau de la commande centrale respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les canaux sensibles aux protons peuvent moduler la commande centrale respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
L’identification par tatouages et les prélèvements de bout de queue pour identification génétique des souris juvéniles mutantes et contrôles sont réalisés par un personnel formé et ne dure que quelques secondes. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes seront exposées via un système d’aérosol à une solution contrôle et une solution contenant un agent bloquant (10 minutes à chaque fois) avant la mesure non invasive des variables ventilatoires. 48h séparent l’administration de la solution contrôle par aérosol de celle de l’agent pharmacologique. Les autres souris adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale de la solution contrôle et de l’agent bloquant (faible volume) sera réalisée. 48 heures séparent les 2 anesthésies. La mesure des variables ventilatoires chez les souris adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 70min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu.
Impact sur les animaux
L’identification et le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale du solvant ou de l’agent bloquant, peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des canaux sensibles aux protons sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par des agents bloquants des canaux sensibles aux protons ne peut être réalisée que sur des souris adultes vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 698 (349 souris mutantes utilisés). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ainsi, 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20 pour cent de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène sur des neurones impliquées dans la sensibilité au dioxyde de carbone. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes ; étude de l’influence par les canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude sur des tranches de tissu des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la ventilation chez l’animal adulte vigil et de l’influence de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone appliqués par aérosol ou par administration intranasale.
Physiopathologie, neuromodulation et métabolisme dans des modèles expérimentaux de la maladie d’Alzheimer et de Tauopathies (version3)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
17 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés, de vecteurs viraux ou d'anticorps, parfois par voie intracérébroventriculaire sur animal vigile, subissent un régime obésogène de vingt semaines, des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, des biopsies de queue et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur annonce qu'aucun animal ne sera réutilisé ni adopté. Il étudie des modèles de la maladie d'Alzheimer et des tauopathies et qualifie le recours à l'animal de "stricte nécessité".
Objectifs
L’objectif général des projets de notre laboratoire et de la présente demande vise à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la MA. L’objectif de nos études est d’une part d’appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement de la pathologie Tau dans la MA et les tauopathies ; et d’autre part, de définir des preuves de concepts permettant une translation vers le patient tant sur le plan diagnostic (biomarqueurs) que thérapeutique. Cette stratégie expérimentale a fait ses preuves par le passé avec le développement de start-up, de transfert de nouveaux biomarqueurs vers le CHU ainsi que la mise en place de différents essais thérapeutiques chez patients atteints de maladie d’Alzheimer et de tauopathies. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA mais répond également à des besoins cliniques en terme de diagnostic, pronostic et thérapeutique.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre différentes avancées scientifiques permettant de faire progresser la connaissance de la physiopathologie de la MA et des tauopathies. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement séquentiel de la pathologie Tau dans la MA et les possibilités de les bloquer par des approches à bases d’anticorps et de nanobodies. Ces études se doublent d’approches visant à développer les nanobodies en tant que biomarqueurs en imagerie cérébrale. Le laboratoire a également découvert de nouvelles formes pathogéniques de la protéine Tau qui semblent précocement impliquées dans la maladie d’Alzheimer vs. d’autres tauopathies. Notre projet vise donc à mieux comprendre les mécanismes conduisant aux espèces pathogénique de Tau et à développer des outils immunothérapeutiques permettant leur clairance et des stratégies améliorant ces immunothérapies avec à terme, la possibilité d’initier des essais cliniques. Par ailleurs, notre projet s’intéresse également au rôle de Tau dans la régulation de l’homéostasie glucidique, dont la dérégulation augmente le risque de développer la MA. Enfin, notre projet s’intéresse aux effets de la caféinede mieux comprendre le rôle respectif de ses récepteurs centraux dans ses effets bénéfiques. Là encore l’intérêt clinique est évident. La compréhension de l’impact de drogues approuvées par la FDA sur le développement de la pathologie Tau mais également du passage d’anticorps thérapeutiques dans le cerveau est de nature à implémenter les approches cliniques existantes et de susciter des essais cliniques ultérieurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes injections de composés pharmacologiques, de vecteurs viraux ou d’anticorps réalisées entre 1 à 6 fois pour des durées variant de 1 à 10 minutes. Dans certains protocoles les animaux seront soumis à un régime obésogène pour une durée de 20 semaines et leur caractéristiques métaboliques évalués (glycémie, tolérances au glucose et à l’insuline). Des prélèvements de sang ou de liquide céphalorachidien seront réalisés entre 1 et 4 fois pour des durées de 1 à 30 min); de même que des biopsies de queue, réalisées 1 fois durant moins d’une minute. Le cerveau de certains animaux sera prélevé à des ages précoces afin de réaliser des cultures cellulaires ou de cultiver des tranches de cerveaux, procédure unique durant moins de 5 secondes. Nous réaliserons également des tests de comportement (entre 1 et 2 fois avec des durées variant de 10 min à 8 jours) afin d’évaluer les performances cognitives des animaux ainsi que de l’imagerie cérébrale par IRM (1 fois durant 30 min) et PET (1 fois durant 30 min) pour évaluer la morphologie et l’activité cérébrale.
Impact sur les animaux
Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue -Stress associé aux investigations comportementales et aux injections intracérébroventriculaires d’oligomères réalisées sur animal vigile en contention -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiques/prélèvements de LCR et douleurs/infections post-opératoires -Impact oculaire suite aux injections dans le plexus retro-orbital -Douleur associée aux prélèvements à la veine caudale -Stress métabolique suite au traitement par un régime riche en graisse -Stress hypoglycémique dans le test de tolérance à l’insuline -Douleur lors de la perfusion intracardiaque Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.
Devenir
En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire sur les 5 ans à venir est estimé à 17480. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront euthanasiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (lésions amyloïdes, pathologie Tau, perte de fonction de Tau…). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’administration de drogues, l’injections de préparations humaines, l’expression cérébrale de différents gènes via différents vecteurs viraux ou le croisement avec d’autres lignées permettant de faire varier les phénotypes pathologiques et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 1 mois à 12 mois. Certaines expérimentations se feront aux stades embryonnaires ou jeune après la naissance.
Maintien de lignées murines mutées pour le gène Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour entretenir une lignée mutée pour le gène Apc qui développe spontanément des tumeurs intestinales. Elles sont identifiées par tatouage et biopsie d'oreille avant sevrage. Le porteur indique que les mâles servent une fois à la reproduction puis sont tués pour éviter la souffrance liée aux tumeurs, que les souris sauvages sont tuées et que les femelles mutées partent vers d'autres protocoles. Il maintient ce modèle pour tester le pouvoir pro-carcinogène de bactéries et affirme que le recours à l'animal reste "nécessaire".
Objectifs
De plus en plus de données de la littérature suggèrent que les bactéries du microbiote intestinal (c’est-à-dire des bactéries hébergées dans notre tractus digestif) pourraient être impliquées dans le développement du cancer colorectal (CCR). En collaboration avec le service hospitalier de chirurgie digestive, le laboratoire a identifié des bactéries retrouvées à haute fréquence au sein des tumeurs colorectales humaines. Des expérimentations menées in vitro nous ont permis de sélectionner des bactéries potentiellement pro-carcinogènes. Nous souhaitons valider ces souches dans un modèle murin. Cependant, les souris ne développent aucun CCR de façon spontanée. Le modèle murin de CCR disponible est le modèle Apc/Min. Ces animaux présentent une mutation génétique induisant le développement spontané d’un cancer intestinal. Le but de cette demande est d'entretenir la lignée Apc/Min de manière à pouvoir tester régulièrement le pouvoir pro-carcinogène de différentes souches bactériennes d'intérêt. Par ailleurs, nous nous intéressons également au rôle de l'autophagie (un processus cellulaire permettant de dégrader entre autres, les bactéries ayant pénétré à l’intérieur de la cellule) dans le développement du CCR lors d'infections bactériennes. En effet, ce processus semble impliqué dans l'initiation/progression de plusieurs cancers dont les CCR. Pour cela, nous devons entretenir une lignée Apc/Min dans laquelle un gène crucial pour la mise en place de l'autophagie a été délété. Ce projet nous permettra de répondre à plusieurs questions : (i) nous déterminerons quelles bactéries sont potentiellement pro-carcinogènes et (ii) nous déterminerons si l'autophagie joue ou non un rôle dans ce processus.
Bénéfices attendus
Notre demande a pour objectif de pouvoir maintenir dans notre animalerie des souris Apc/Min et Apc/Min déficientes pour l'autophagie soit dans les cellules épithéliales intestinales soit dans la lignée myéloïde. Cette demande s'inscrit dans un projet qui a pour but de tester le pouvoir pro-carcinogène de diverses souches bactériennes (cette seconde partie faisant l'objet d'une demande spécifique d'autorisation APAFiS). Nous espérons ainsi identifier quelles sont les souches et éventuellement leurs toxines qui aggraveraient la pathologie et comprendre si l'autophagie est impliquée. Ainsi, sur le long terme, nos travaux pourraient permettre de comprendre comment les bactéries impactent le développement du cancer colorectal mais également d’identifier des bactéries à surveiller plus particulièrement chez les patients susceptibles de développer un cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront identifiés par un tatouage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Une biopsie d'oreille sera prélevée de manière à effectué le génotypage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Ces 2 interventions se feront sur animaux vigiles âgés de 20 jours maximum.
Impact sur les animaux
Les souris Apc/Min sont des souris mutantes (suite à une exposition à des radiations) qui développent spontanément des tumeurs intestinales. En règle générale, ces animaux développent en moyenne 2 tumeurs colorectales. Ces animaux peuvent vivre 5-6 mois sans être affectés par le développement des tumeurs. Ceci implique néanmoins un taux de renouvellement « élevé » des mâles reproducteurs. Ils serviront 1 fois à la reproduction puis seront mis à mort pour éviter toute souffrance due au développement de la tumeur. D’expérience ce renouvellement permanant des mâles Apc/Min reproducteurs prévient totalement la gêne/souffrance occasionnée par le développement tumoral. Cependant, nous suivrons attentivement les animaux et un système de score a été mis en place de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites (cf annexe).
Devenir
Cette demande vise à maintenir dans notre animalerie le modèle Apc/Min que nous utilisons dans des protocoles expérimentaux. Les mâles Apc/Min seront utilisés pour remplacer les anciens reproducteurs. Les souris sauvages seront mises à mort. Les femelles Apc/Min seront utilisées à des fins expérimentales.
Remplacement
Le but de cette demande s'inscrit dans une démarche visant à déterminer le pouvoir pro-carcinogène de souches bactériennes ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu (notamment l'autophagie). De manière à limiter au maximum l’utilisation d’animaux, les souches bactériennes potentiellement d’intérêt sont testées in vitro. Nous recherchons des signatures pouvant laisser penser à un effet pro-carcinogène et plus précisément les dommages dans l’ADN et/ou des modifications significatives du cycle cellulaire. Uniquement des souches validées pour ces paramètres seront testées chez l’animal. Le recours à l’animal reste nécessaire car il nous permet de valider si effectivement la bactérie favorise le développement du cancer colorectal et d'apprécier l'impact d'une autophagie fonctionnelle ou non sur le développement de la pathologie.
Réduction
Le nombre de cages de reproduction est réduit au maximum de manière à nous assurer le maintien de la lignée.
Raffinement
Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton ou en plastique. Les animaux ne seront jamais isolés et toujours en groupe. Lors des reproductions nous mettrons 1 mâle en présence de 2 femelles. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués à ce modèle sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score (présenté en annexe) dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
L'étude du CCR en modèle animal se fait toujours sur des souris. Cependant, ces animaux ne développent pas spontanément de CCR. Deux grands modèles existent : -modèle génétique : mutation du gène Apc. C'est ce modèle que nous avons choisi car ces animaux présentent une mutation du gène Apc comme les patients, en faisant de ce fait un bon modèle. -modèle inflammatoire : AOM/DSS. Association d'un carcinogène (AOM) et d'un agent induisant une inflammation colique: le DSS. Ce modèle sert surtout pour mimer le développement d'un CCR chez les patients souffrant de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (une population à haut risque de développer un CCR). Pour la reproduction, nous utiliserons des animaux matures sexuellement. Les mâles Apc/Min seront sacrifiés après leur première reproduction de manière a éviter que le développement du cancer n'affecte leur bien être
Formation aux procédures expérimentales
- Formation professionnelle
Rats : 300
Hamsters dorés : 75
Lapins : 30
Poissons zèbres : 210
4 715 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance de sans réveil à modéré. Environ 4 100 souris, 300 rats, 210 poissons zèbres, 75 hamsters dorés et 30 lapins servent à entraîner des expérimentateurs aux prélèvements, injections, gavages et actes chirurgicaux. Le porteur précise que les animaux sont tués pour apprendre aussi la mise à mort et le prélèvement d'organes. Il mobilise des animaux surnuméraires ou réutilisés, commence l'apprentissage sur des peluches et des cadavres, et qualifie le recours aux animaux vivants de "nécessaire" et "essentiel".
Objectifs
Les personnes souhaitant pratiquer des actes techniques ou de chirurgie sur les animaux de laboratoire doivent suivre une formation réglementaire selon l’arrêté du 1 er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques. Cette formation comprend différents modules imposés par la réglementation. Le nombre d’heures de pratique dans les formations réglementaires est insuffisant pour la bonne maitrise de ces gestes. La mise en place des formations continues et de travaux pratiques (TP) in vivo pour les expérimentateurs a pour but de bien les former afin qu’ils maitrisent les actes qu’ils vont appliquer dans leurs projets et de répondre aux exigences de la législation française qui impose de : Tenir à jour un tableau de suivi permettant de s’assurer que le personnel dispose d’un niveau d’études, de compétences et d’une formation continue adéquats et vérifier que l’adéquation entre les compétences et les missions est effective lors de la prise de poste afin de définir, le cas échéant, un programme de formation adaptée à la personne et à la fonction exercée. La personne nominativement désignée pour cette tâche par le responsable de l’établissement tient à la disposition des agents de contrôle habilités tous les éléments permettant de vérifier que les compétences des personnels correspondent à la fonction exercée. Notre projet est donc éducatif. Il s’agit d’accompagner et de suivre les expérimentateurs pour des actes techniques et chirurgicaux : - préhension, contention, et manipulation, adaptées aux différentes procédures de routine ; - marquage individuel ; - administration et prélèvements de routine ; - anesthésie fixe et gazeuse ; - asepsie ; - mise à mort ; - actes chirurgicaux : sutures, vagotomie, prélèvement d’organes (thyroïdectomie, splénectomie…), ischémie rénale, cathéterisation…sur des animaux anesthésiés.
Bénéfices attendus
La mise en place des formations continues et de travaux pratiques (TP) in vivo pour les expérimentateurs a pour but de bien les former afin qu’ils maitrisent les actes qu’ils vont appliquer et le suivi des animaux dans leurs projets et de répondre aux exigences de la législation française. En matière de 3R, le bon apprentissage de ces techniques permettra de réduire les échecs des futurs expérimentateurs dans leurs projets et par conséquent le nombre d’animaux utilisés. Il permettra également l’amélioration de raffinement pour les différents gestes appliqués sur les animaux.
Procédures
Prise de sang sur animaux vigiles ou anesthésiés, quelques secondes, une fois. Administrations : intra-péritonéales, intra-musculaire, sous-cutanée, intra-dermique sur animaux vigiles ou anesthésiés, quelques secondes, une fois. Administrations : intra-veineuse sur animaux anesthésiés (rétro-orbitaire) ou vigiles (veine caudale), quelques secondes. Administrations : nasales, intra-trachéales, intrathécales, interosseuses sur animaux anesthésiés, quelques secondes, une fois. Gavage sur animaux vigiles, quelques secondes, une fois. Acte chirurgical, 30 à 60 min selon le geste, une fois
Impact sur les animaux
Ce projet inclut des actes chirurgicaux occasionnant des douleurs et un inconfort modéré. Ces actes seront réalisés sous anesthésie gazeuse/injectable et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire par le vétérinaire formateur afin d’éviter/minimiser la douleur et l’inconfort. Les différents actes d’administrations et de prélèvements n’occasionnent qu’une douleur, une souffrance ou une angoisse légère de courte durée ainsi que celles sans incidence significative sur le bien-être ou l'état général des animaux. Une partie de ces gestes sont réalisés sur des animaux anesthésiés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont utilisés pour la formation à la mise à mort et à la réalisation de prélèvement d'organes.
Remplacement
Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux expérimentateurs le bon apprentissage des techniques appliquées sur les animaux en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants en plus des autres méthodes alternatives. L’apprentissage commence par l’utilisation des peluches et des cadavres.
Réduction
Ce projet utilisera des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage ou des animaux réutilisés d’autres projets. Le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité d’appliquer deux ou 3 gestes légers sur le même animal. Le nombre d’animaux a été déterminé selon le nombre de personnes à former. Plusieurs sessions de travaux pratiques sur souris, rats, poisson zèbres, hamsters et lapins seront organisées par an, chaque session accueille en moyenne 5-10 participants En général, 1 animal est prévu pour la démonstration et 4 souris, 2 rats, 4 poissons zèbres, 1 hamster et 1 lapin par participant sont prévus pour chaque session.
Raffinement
La procédure expérimentale modérée de ce projet implique une anesthésie, une analgésie, un suivi quotidien des animaux, et des points limites précoces et spécifiques liés à l’acte chirurgical ainsi que les actions à mettre en place pour chaque point limite.
Choix des espèces
L’utilisation de souris s’impose pour former à la pratique de procédures expérimentales sur souris qui est l'espèce la plus utilisée dans l'établissement utilisateur. Certaines procédures ne sont applicables que sur les rats, hamsters, lapins et poissons zèbres d’où la nécessité d’utiliser ces espèces. Souriceaux et adultes pour les souris et adultes pour les autres espèces correspondant aux animaux utilisés classiquement lors des procédures expérimentales
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans la sensibilité gustative
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales, sont hébergées isolées pendant quatorze jours et mises à jeun, avant des mesures gustatives au gustomètre et au lickomètre présentées comme non invasives. Le porteur les fait tuer pour prélever le cerveau et en réaliser l'histologie. Il étudie le rôle de l'inflammation cérébrale postprandiale sur le goût et rattache au conditionnel des retombées sur les troubles du comportement alimentaire.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, PIR) systémique est maintenant bien documentée mais, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques après consommation d’un repas gras. Pour démontrer cela, nous avons éteint la PIR cérébrale chez la souris et observer les conséquences de cette extinction, en comparant le comportement alimentaire de souris modifiées génétiquement (sans la PIR) et de souris normales. L’objectif désormais est d’explorer la sensibilité gustative de ces animaux. Il s’agit de déterminer si la PIR agit sur les préférences alimentaires et/ou l’appréciation alimentaire. Pour évaluer cette possibilité, nous allons mesurer les performances gustatives chez des souris dont la PIR cérébrale a été abolie ou non. L’approche de perte de fonction est possible grâce à l’étude d’animaux mutants ne pouvant pas déclencher la PIR au niveau cérébral. Ces performances seront mesurées grâce à des dispositifs appelés gustomètre et lickomètre. Des animaux non mutants seront les témoins de l’expérience. Les animaux seront étudiés sous régime standard ou gras pendant 48 heures. A la fin des études, les animaux seront mis à mort et les cerveaux seront collectés post-mortem pour analyses moléculaires. Au total, 90 souris seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les fonctions de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur les mécanismes cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété et du métabolisme énergétique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
les animaux seront isolés et des mises à jeun de durée differentes à des temps differents seront réalisées. Certains animaux recevront des injections d'un composé pour induire l'expression de leur gène muté.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances sont liées aux 5 injections IP du composé entrainnant l'expression du gène muté des animaux à 5 semaines (douleur liée à une injection Intrapéritonéale) et aux conditions d’hébergement isolées pendant 14 jours. Ue stress métabolique léger sera induit par la mise en jeun pendant 5 heures. Enfin, la contention des animaux (pour mesurer le poids des animaux) représente aussi des nuisances de faible intensité pour les animaux.
Devenir
Les 90 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses métaboliques et comportementales fines.
Réduction
La procédure décrite (contrôle des conditions nutritionnelles et métaboliques) a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Une étude pilote sera réalisée afin de s’assurer de l’optimisation des procédures. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits.
Raffinement
Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé pour étudier le comportement des animaux pendant leur période nocturne d'activité. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et des carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés de construction du nid et permettent aux animaux de s'exposer au milieu extérieur de leur propre volonté . Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les principaux dispositifs instrumentaux utilisés dans ce projet (gustomètre et lickomètre) permettent des mesures non-invasives.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Endodontie régénérative par l’utilisation d’un cône électrospinné et fonctionnalisé avec de l’acide tannique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris nude subit une chirurgie de trente minutes créant une poche sous-cutanée dans le dos pour y implanter une racine de dent humaine de dix millimètres. Le porteur attend une douleur post-opératoire modérée et une gêne liée à la dent implantée. Il teste un dispositif de régénération de la pulpe dentaire, développe des cultures en bioréacteur mais affirme que le modèle animal reste le "seul" à permettre de vérifier la formation d'une pulpe vascularisée.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester un dispositif médical implantable pour permettre la régénération de la pulpe dentaire. Le dispositif est un cône qui peut être inséré dans la racine d'une dent à la fin d'un traitement de racine lorqu'un saignement aura été provoqué dans le canal par le chirurgien-dentiste pour former un caillot sanguin. Ce cône permettra la prolifération du tissu nouvellement formé, comme lors d'un processus de cicatrisation, sur la longueur totale du canal c'est-à-dire jusqu'à la couronne dentaire. Ce cône permet également la libération d'un agent antibactérien, l'acide tannique, pour assurer la désinfection totale du canal. Le projet a donc également pour objectif de vérifier l'innocuité de l'agent antimicrobien sur la régénération tissulaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est la validation d'une nouvelle approche de traitement des nécroses pulpaires. Le traitement permettrait de ne plus utiliser de matériaux pour une obturation canalaire à la fin d'un traitement de racine qui a encore un taux d'échec de 10%. La régéneration du tissu permettra une réponse biologique à des agressions futures de la dent (carie ou fracture) et favorisera donc le maintien de la dent sur l'arcade sur une période plus prolongée.
Procédures
La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes. Le geste proposé dans cette demande est la création d’une poche sous-cutanée dans le dos de la souris pour l’implantation d’une racine d’une dent humaine. L’idée ici est de permettre la mise en place de phénomènes de vascularisation pour étudier la mise en place d’un néo-tissu pulpaire dans le canal radiculaire de la racine implantée.
Impact sur les animaux
La procédure employée est peu invasive puisqu’il s’agit de réaliser une poche sous-cutanée dans le dos de l’animal. On peut donc s’attendre à une douleur post-chirurgicale d’intensité modérée. L’insertion d’une dent (longueur 10 mm) va générer une gène mais qui ne devrait pas avoir de retentissement sur l’activité de la souris. La procédure peut néanmoins générer un stress au moment de l’acte chirurgical.
Devenir
Les animaux utilisés sont des souris nude qui ont un phénotype dommageable. Ces animaux ne peuvent dont pas être adoptés. Aux vues du type d’expérience menée, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable non plus. L’ensemble des animaux qui seront utilisés seront donc mis à mort. Ceci a été discuté avec le vétérinaire en charge de l’animalerie dans laquelle se passera l’expérimentation.
Remplacement
Nous développons actuellement des dispositifs de culture tridimensionnelle en bioréacteur pour permettre de recréer l’environnement du canal radiculaire d’une dent humaine. Mais les processus de formation du tissu ne peuvent être étudiés jusqu’au bout car le volume du tissu empêche l’oxygénation et l’élimination des déchets de l’activité métabolique cellulaire. Ceci n’est possible que dans un modèle animal. Le modèle choisi ici d’implantation ectopique d’une dent humaine est déjà très couramment utilisé dans le monde et est le seul qui permet à ce jour de vérifier la formation d’une pulpe dentaire vascularisée (Ling Lei et al. Mesenchymal stem cell characteristics of dental pulp and periodontal ligament stem cells after in vivo transplantation, Biomaterials 35(2014) 6332-6343; Qian Li et al. Multifunctional peptide-conjugated nanocarrieres for pulp regeneration in a full-length hman tooth root. Actac Biomaterialia 17 (2021) 252-265).
Réduction
Les premières étapes du projet ont été conçues pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés. Elles doivent permettrent en effet d'affiner la formulation du dispositif médical pour n'avoir à en tester qu'un seul type, avec une dose d'acide tannique (agent antimicrobien) définie comme efficace et non toxique. Les premières phases de la régénération tissulaire (cicatrisation) induites par notre procédure ont été testées in vitro pour s'assurer du potentiel de réussite de cette expérimentation. Etant donné le nombre d'analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques...) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d'animaux a été évalué à 54 souris pour 2 ans. De plus, uniquement l'implant validé in vitro, sera testé en implantataion sous cutanée. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l'infiltration éventuelle de cellules inflammatoires. Le n a été déterminé pour avoir une triplicat par temps d'implantation.
Raffinement
Afin de nous assurer du bien-être des animaux au cours de ce protocole nous avons mis en place les mesures suivantes : - la chirurgie sera réalisée sous anesthésie/analgésie en prenant garde que la température de l'animal soit maintenue tout au long de la procédure. De plus un traitement analgésique pos-opératoire sera mise en place. - L'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement en période post-opéraoire puis tous les 3 jours jusqu'à la fin de la procédure. - Des points limites pédictifs ont été mis en place pour interrompre la procédure et soulager les animaux. Enfin comme nous utilisons des animaux immunodéprimés, il est prévu que l'hébergement se fasse en portoirs ventilés permettant de préserver la qualité de l'air de la cage et ainsi d'éviter aux animaux d'être infectés par des pathogènes ambiants potentiels.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris. Le modèle murin d’implantation sous cutanée est lui très simple et favorise donc une diminution drastique de l’inconfort de l’animal (procédure rapide, avec peu de dommage tissulaire associé). De plus cela permet d’utiliser des modèles pour lesquels la réponse immunitaire a été altérée ce qui est essentiel dans notre cas puisque la source d’agent chimiotactique est humaine. Nous utiliserons des souris nude. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.
Comment mesurer l’efficacité de nouveaux traitements contre une mycobactérie (Mycobacterium abscessus).
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont infectées par la mycobactérie Mycobacterium abscessus en intraveineuse, puis reçoivent des injections quotidiennes d'antibiotique ou trois injections vaccinales, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique que les souris sont euthanasiées avant que l'infection ne se développe trop dans les reins. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" et affirme qu'"il n'existe pas d'alternative non animale".
Objectifs
Nous avons déjà travaillé sur le modèle souris, afin d’évaluer plusieurs cibles vaccinales ou traitements antibiotiques développés au laboratoire. Nous souhaitons poursuivre ce travail en étudiant cette réponse vaccinale ou face aux traitements antibiotiques sur des souris C3HeB/FeJ. Ces souris sont sensibles aux infections par les mycobactéries, famille de bactéries à laquelle appartient Mycobacterium abscessus. Cela nous permettra d’étudier en détail la réponse immune au cours de l’infection et la réponse protectrice liée à l’administration d’un vaccin ou d’un antibiotique dans le cadre de la lutte contre les infections chez les personnes atteintes de mucoviscidose, sensibles à ce type d'infections.
Bénéfices attendus
La réussite de ce modèle nous permettra dans le cadre de collaborations scientifiques d’évaluer toute approche thérapeutique afin de guérir les infections à la bactérie Mycobacterium abscessus, ce qui sera une avancée majeure dans le domaine de la prise en charge des patients atteints de mucoviscidose.
Procédures
Les animaux subiront une injection en intraveineuse (une fois par animal pour toute l’expérimentation) et, dans le cadre des essais d’antibiothérapie, une injection quotidienne en sous-cutanée de la solution à tester ou d’une solution saline témoin, et cela durant deux semaines. Dans le cadre des essais vaccinaux, il y aura trois injections en sous-cutanée de la solution vaccinale ou de la solution témoin, espacées de 15 jours chacune, en amont de l’infection en intraveineuse. Tous ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La bactérie utilisée ici est naturellement éliminée des organes de la souris (sauf les reins). Les effets indésirables sur les animaux sont minimes puisqu’ils seront euthanasiés avant que l’infection ne devienne trop importante dans les reins, ce qui est relativement long par rapport à nos temps d’expérimentation. Les infections, en intraveineuse, et les traitements (solutions aqueuses) par voie sous-cutanés ne génèrent que des contraintes de manipulations de courte durée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la dernière procédure afin de prélever les organes.
Remplacement
Le recours à des animaux est indispensable à ce stade du processus d’évaluation préclinique dans une perspective de développement réglementaire des antibiotiques et vaccins envisagés. Il n’existe pas d’alternative non animale ; aucun médicament ou vaccin n’a jamais été mis sur le marché (AMM) sans avoir été auparavant testé chez l’animal. Les approches in vitro (mesures de concentrations minimales inhibitrices -CMI-) et ex vivo (mesures de l’efficacité des antibiotiques vis-à-vis de la croissance des bactéries après infection de macrophages par ces bactéries) ont déjà été réalisées auparavant afin de choisir des antibiotiques qui présentent une bonne efficacité.
Réduction
Nous avons déjà beaucoup travaillé sur le modèle d’infection des souris par Mycobacterium abscessus depuis 2002, et avons donc optimisé le nombre de souris nécessaire par point, permettant d’obtenir des analyses statistiques amenant à une significativité. Nous utilisons 5 souris par point, et réalisons test statistique pour montrer s’il y a des différences significatives ou pas entre les groupes traités ou non traités.
Raffinement
Enfin, concernant le bien-être des animaux : - aucun effet délétère n’est attendu jusqu’à leur euthanasie (utilisation de doses non létales de Mycobacterium abscessus et euthanasie au plus tard 45 jours après l’inoculation de M. abscessus, temps inférieur à celui nécessaire à cette mycobactérie pour se développer dans les reins) ; - Le bien-être proprement dit des animaux sera assuré à tous les stades des expériences, qu’il s’agisse de l’espace d’hébergement, des soins ou des modes opératoires. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu (carrés de cellulose et de la frisure). Les soins et les gestes opératoires seront effectués par du personnel expérimenté et qualifié. La surveillance des animaux reposera sur une évaluation quotidienne utilisant une grille de scoring.
Choix des espèces
Comme précisé ci-dessus, une infection avec Mycobacterium abscessus chez les patients atteints de mucoviscidose est péjorative pour la survie des patients. Nous souhaitons mettre en place des protocoles d’infections chez la souris, sur la base d’expériences réalisées dans notre équipe depuis de nombreuses années afin de découvrir de nouveaux moyens d’éradiquer cette bactérie chez les patients atteints de mucoviscidose. Cela ne peut être réalisé que chez la souris, car elle possède tous les types de réponse immunitaire qui nous permettront d’évaluer de nouveaux vaccins ou traitements antibiotiques.
Etude de l’impact d’une exposition chronique au PFOS sur la réponse immunitaire à la vaccination anti-grippale chez des souris B6C3F1.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.
Objectifs
De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.
Bénéfices attendus
Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.
Procédures
Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.
Impact sur les animaux
Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.
Remplacement
La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.
Réduction
Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.
Raffinement
Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.