Souris
Détermination du temps de demi-vie et de l’efficacité de molécules permettant de développer une stratégie thérapeutique ciblée pour traiter la thrombose artérielle et l’AVC ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 120 en souffrance modérée. Elles reçoivent des injections et un cathéter, des prises de sang répétées et un modèle de thrombose artérielle, certaines subissant en plus une chirurgie. Le porteur indique que les souris sont tuées sous anesthésie à la fin, les lésions étant trop importantes pour envisager un réveil sans souffrance. Il teste des anticorps censés cibler le caillot, renvoie l'amélioration de la prise en charge de l'AVC au "long terme" et juge impossible de remplacer la souris par des modèles in vitro.
Objectifs
L’hémostase permet l’arrêt des saignements suite à une blessure. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui vont former un agrégat pour limiter le saignement. Ce processus peut aussi être pathologique dans une artère malade, conduisant à la formation d’un caillot dans le vaisseau, appelé thrombose artérielle. Ce caillot peut aller jusqu’à boucher le vaisseau. Ce type de pathologie peut induire un AVC ischémique par exemple. Concernant les AVC ischémiques, un des traitements consiste à injecter une molécule en intraveineux pour dissoudre le thrombus. Cependant, à cause des risques hémorragiques, cette approche doit impérativement être réalisée très rapidement après l’apparition des premiers symptômes de l’AVC, ce qui limite fortement le nombre de patients pouvant être traités. Le but de ce projet est de tester un nouveau traitement ciblé qui permettrait de limiter le risque de saignement. Il est basé sur le développement d’anticorps qui vont apporter les molécules nécessaires à la destruction du caillot, en ciblant spécifiquement celui-ci, limitant ainsi les effets indésirables. Ce projet vise à déterminer le temps que ces nouvelles molécules mettent pour être éliminées complètement du sang chez la souris. Il vise également à évaluer l’efficacité de ces molécules sur la thrombose artérielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur 2 aspects : • La cinétique de ces molécules : on déterminera le temps que ces molécules mettent pour être éliminées. Elles pourraient avoir une cinétique similaire aux molécules de référence, mais être plus efficaces ou induire moins d’effets indésirables puisqu’elles ciblent spécifiquement le thrombus. • La thrombose artérielle : on pourrait mettre en évidence une réduction de la taille du caillot dans ce modèle expérimental. L’identification de tels résultats pourraient déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle ou un AVC ischémique ainsi qu’à une réduction des impacts à long terme de ces maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections et la pose de cathéter réalisées sur animal anesthésié. Des prises de sang répétées seront effectuées (maximum 3 d’une durée de 1 minutes) et un prélèvement sanguin terminal (durée 5 minutes). Les animaux seront soumis à un modèle de thrombose artérielle. Certains modèles nécessitent des procédures chirurgicales, celles-ci seront de maximum 15 min.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site d’injection, de pose de cathéter, de prélèvement ou au site chirurgical. Si le saignement observé dure trop longtemps la souris sera sacrifiée afin de limiter toute douleur ou inconfort.
Devenir
Pour toutes les procédures de cette saisine, les souris sont mises à mort sous anesthésie à la fin de la procédure du fait des lésions qui sont trop importantes. Les souris seraient en souffrance si nous devions les réveiller.
Remplacement
Le but de ce projet est de tester un nouveau traitement ciblé basé sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. La pathologie étudiée étant un processus particulièrement complexe, il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro.
Réduction
Un des modèles (prise de sang au niveau des jugulaires) a été spécifiquement pensé pour diminuer le nombre d’animaux utilisés puisque plusieurs prises de sang à des temps différents sont possibles pour un même animal. De plus, nous ferons les procédures expérimentales de prise de sang par étape, pour déterminer s’il est nécessaire ou pas de passer à l’étape suivante. Pour évaluer l’efficacité de la molécule dans la thrombose artérielle, le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures expérimentales. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’administration d’un anti-douleur pendant chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’études in vivo y sont largement répandus et maitrisés. La souris est un modèle couramment utilisé pour évaluer la formation de thrombus. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Rôle des plaquettes sanguines dans le développement anormal de tissu, la fibrose, lors de la pathologie rénale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie abdominale avec ligature de l'uretère ou l'injection d'un composé, puis des prélèvements de sang et d'urine avant d'être tuées à sept ou vingt et un jours pour analyser les reins. Le porteur signale une douleur possible à la cicatrice et une perte de poids, et prévoit un analgésique si la douleur est avérée. Sur le remplacement, il affirme que la fibrose rénale ne peut pas être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de travailler sur un animal vivant.
Objectifs
Un développement anormal de tissu, ou fibrose, dans le rein est fréquent dans de nombreuses pathologies rénales. Le rôle des plaquettes sanguines dans ce processus a été montré dans différents modèles mais dépend des tissus et des lésions. Ainsi, nous avons découvert un rôle critique de deux facteurs plaquettaires dans des pathologies présentant une fibrose dans le poumon et dans le coeur. Cependant, rien n'a été étudié dans le rein. Notre objectif est donc d'étudier le rôle de ces deux facteurs plaquettaires dans le développement de la fibrose rénale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étudier l'implication de deux protéines plaquettaires sur le développement de la fibrose rénale et ses conséquences sur le fonctionnement du rein. Il permettra de définir si cibler ces protéines pourrait être pertinent en thérapeutique chez l'homme.
Procédures
Deux modèles seront utilisés. Dans le premier, les animaux subiront une chirurgie (incision abdominale) qui permet la ligature de l'uretère, d'une durée totale de 30 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Dans le deuxième modèle, une injection d'un composé est réalisé en une fois au niveau de l'abdomen (voie intraperitoneale) et dure moins d'une minute. Dans les deux modèles, les animaux auront un à deux prélèvements sanguins intraveineux sous anesthésie et pour le deuxième modèle, deux prelèvements d'urine, émise spontanément en pressant la vessie pour évaluer la fonction rénale. A la fin des procédures, après 7 et 21 jours ,un prélèvement de sang intraveineux sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale, l'urine sera prélevée directement dans la vessie et les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien être de l'animal. La maladie rénale est associée à la présence de protéines dans les urines, et un gonflement du ventre (oedeme rénal) modéré peut apparaitre avec le temps. La chirurgie peut entrainer une douleur et une irritation au niveau de la cicatrice qui seront cependant attenués par les analgésiques. Les animaux sont également anesthésiés une à deux fois pour le prélèvement sanguin qui peut générer une douleur modérée. Ils peuvent également perdre du poids au cours des procédures et être moins actifs.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir analyser les reins.
Remplacement
La fibrose rénale ne peut pas être modélisée in vitro en raison de la complexité des mécanismes mis en jeu. Il est donc nécessaire de travailler sur un modèle animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 3 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score et l'évaluation de la fonction rénale. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés. La chirurgie et les prélèvements sanguins seront effectuées sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, les modèles utilisés sont bien établis chez la souris adulte. Les souris de 8-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier les facteurs plaquettaires impliqués, avec de surcroit la disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les facteurs plaquettaires étudiés.
Méthotrexate pour le traitement de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
21 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. L'arthropathie est provoquée par trois ponctions du genou, puis les souris reçoivent des traitements pendant six semaines, subissent une IRM des genoux de deux heures sous anesthésie et des prises de sang, avant d'être tuées et disséquées. Le porteur justifie la mise à mort par un prélèvement d'un millilitre de sang "non compatible avec le maintien en vie". Il fonde le recours à l'animal sur le "besoin d'un modèle vivant" et présente la souris comme un modèle "éprouvé et fiable".
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX) et dont la sévérité est définie par la quantité de FIX restant dans le sang. La forme la plus sévère, où le taux de FIX est in détectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Ces saignements spontanés peuvent se répétés au niveau des articulations et conduire à la présence de sang dans le liquide articulaire, induisant une inflammation et une dégradation de l’articulation qui est handicapante pour le patient. Cette atteinte répétée porte le nom d’arthropathie hémophilique (AH) et est une complication grave de la maladie. L'AH partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) dont une inflammation importante au stade précoce de la maladie. A ce jour, le traitement de l’hémophilie comprend des injections de facteur manquant pour éviter tous saignements donc ceux responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire qui apparait au stade précoce de l’AH. Dans le cadre du traitement de la PR, le méthotrexate est largement utilisé en tant que médicament de première intention. Le méthotrexate est un médicament visant à contrôler l’inflammation qui à montrer 34% de rémission et 50% d’amélioration de la PR dans des études conduites chez des patients atteints de PR. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de l’articulation chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la PR. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité du méthotrexate pour traiter l’AH et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B. l'étude s'effectue dans deux animalerie distincxtes avec : l'induction de la maladie et le traitement qui se font à l'UE1 (animalerie 1) et l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qui se font à l'UE2 (animalerie 2).
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique. le méthotrexate est un médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montre une efficacité suffisante du méthtrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Au sein de l'UE1 Au sein de l'UE1, l’arthropathie hémophilique est induite chez des souris hémophiles B par 3 ponctions articulaire (J1, J15 et J30) avec une surveillance et mesure du diamètre du genou les 15 premiers jours. Par la suite, le premier groupe reçois un traitement anti-hémophilique de référence tous les 4 jours et ce durant 6 semaines. Le deuxième groupe reçois également le traitement anti-hémophilique de référence (même durée et fréquence) mais également un traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde une fois par semaine. Une prise de sang est réalisée à J0, J15 et J30 pour surveiller la possible toxicité du traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde. Après 6 semaines de traitement, les souris sont transférées à l'EU2 où elles bénéficieront d’une IRM des genoux pour évaluer l’atteinte articulaire. Ensuite, une prise de sang sera réalisée pour la mesure des marqueurs inflammatoires ainsi que les marqueurs d’atteinte cartilagineuse et osseuse. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale après administration d’un médicament anti-douleur. Les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min) (UE1), une prise de sang (1 min) (UE1), la mesure du genou (30 sec) (UE1), une injection seule ou double (1-2 min)(UE1), une IRM du genou (120 min)(UE2), un prélèvement total de sang et mise à mise à mort (3-5 min)(UE2).
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments anti-hémophiliques et d’étudier l’arthropathie hémophilique. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins analogues à nos facteurs anti-hémophiliques est un prérequis pour l’induction de l’hémarthrose et pour la mesure de l’activité des molécules prophylactiques testées. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette altération génétique, n’est pas victime de saignement spontané et tout saignement provoqué sur la souris hémophile est résolutif sans prise en charge particulière. Souris matures (8-9 semaines) de 25-30g. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car les cartilages sont en cours de maturation durant la croissance et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible des taux de certains facteurs de coagulation avec l’âge, comme le fibrinogène, facteur Willebrand et le FVIII qui peuvent modifier la capacité hémostatique globale du modèle et par conséquent la tendance hémorragique.
Evaluation de nouveaux traitements dans un modèle de maladie neurologique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
3 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fractions issues de patients, jusqu'à deux chirurgies, puis un traitement administré une à deux fois par jour pendant un maximum de trente semaines, avec prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur décrit une activité préclinique de service destinée à tester des composés, et renvoie le bénéfice à une "meilleure compréhension" et à l'identification de traitements. Il affirme que la souris a un système nerveux "identique" à celui de l'homme et conclut que le recours à l'animal vivant est "nécessaire".
Objectifs
Les maladies neurologiques se définissent par un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Elles revêtent plusieurs formes et touchent un nombre important de personne dans le monde. L’origine de ces maladies est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de différents modèles murins de maladies neurologiques qui permettent d’en reproduire les symptômes afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action via l'observation de l'activité neuronale en temps réel. Ces modèles sont générés soit par injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fraction protéique purifiée issus de patients soit par un traitement systémique via une neurotoxine. Elles peuvent concerner des souris normales et des souris transgéniques. Aucune de ces lignées transgéniques ne montre de phénotype dommageable. Les approches mises en œuvre sont une chirurgie intracérébrale et l’administration chronique d’un traitement. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d’un traitement chronique à différentes doses sur la composante comportementale et cellulaire. La mesure des effets des traitements se fait par des analyses biochimiques et cellulaires sur les cerveaux et les tissus biologiques prélevés après la mise à mort des animaux. Des prélèvements de sang pourront aussi être réalisés tout au long du traitement.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. La génération de modèle expérimentaux de maladie neurologique chez la souris est donc nécessaire afin de tester différents composés thérapeutiques. Le bénéfice attendu est l'identification de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée maximale d'une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 2 semaines. L'administration de traitement (30 secondes) pourra être réalisée une à deux fois par jour pour une durée de 1 jour et au maximum de 30 semaines. Prélèvements sanguins à la queue (1 minute) sur l'animal vigile (1 prélèvement/semaine ou par mois selon la durée de l'étude). Prélèvements de liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière (1 prélèvement à la fin de l'étude, durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
L’injection de virus entraine peu de nuisances chez l’animal. L’injection de toxines entraine un suivi spécifique. Les injections peuvent entrainer une perte de poids et une diminution de la mobilité. L’implantation nécessite un suivi spécifique, la pose de ciment afin de maintenir l’implant peut être douloureux les premiers jours. Les maladies neurologiques peuvent induire un déclin cognitif et des altérations motrices modérées. Aucune des lignées transgéniques utilisées ne montre de phénotype dommageable. Si l’administration de traitement entraine des effets indésirables, le traitement sera interrompu et l’animal surveillé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de souris pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire pour reproduire les symptômes de la maladie en vue de tester des nouveaux traitements. D’autre part, l’étude du cerveau sur animal en mouvement, nécessite le recours à l’animal vivant.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum de 14 animaux par groupe soit 70 souris par étude incluant les groupes expérimentaux (4 doses différentes de composé) et leur contrôle. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le LCR (liquide céphalorachidien), le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. En effet, tous les animaux transgéniques produits seront utilisés. L’analyse de l’activité neuronale in vivo nous permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal étant son propre contrôle. Des analyses statistiques seront effectuées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (3 à 5 par cage). Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée via une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d’analgésique et d’anesthésique local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 5 jours (dépendant de la gravité de la procédure) est mis en place avec une pesée quotidienne et l’observation de critères de bien être. Chaque critère est scoré. Des mesures spécifiques peuvent être prises : si l’animal manque de tonus, une injection intrapéritonéale de solution saline sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort est prise par l’expérimentateur. Si l’animal a bien récupéré, un suivi visuel journalier et une pesée hebdomadaire seront effectués. Administration du traitement : les administrations sont réalisées quotidiennement et les animaux sont habitués à la contention. Pour le traitement induisant des mouvements involontaires anormaux, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante et plus douce afin d’éviter d’éventuels problèmes d’irritations aux pattes et à la queue. Si le traitement provoque des effets indésirables, le traitement peut être interrompu et l’animal surveillé.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est identique à celui de l’homme. Ces modèles ont un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus, l’injection de toxine ou de virus dans le cerveau est bien établie dans notre équipe et les travaux sur la souris sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. L’utilisation de la souris permet également de générer des modèles transgéniques pertinents et bien caractérisés permettant de tester des candidats médicaments pour différentes pathologies. Les maladies neurologiques apparaissent préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 6 semaines jusqu'à l'âge adulte. En effet, à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.
Développement d’un vaccin thérapeutique dans le mélanome à l’aide de longs peptides synthétiques artificiels (aSLP).
- Recherche appliquée
- Cancers
186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous-cutanées et une greffe de cellules tumorales qui forme une tumeur sur le flanc, puis sont suivies trois fois par semaine pendant près de trois mois avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le projet teste un vaccin fait d'un peptide couplant un antigène tétanique et un antigène de mélanome, avec l'espoir de freiner la croissance de la tumeur. Le porteur indique que l'évaluation du bénéfice vaccinal passe "nécessairement" par l'animal et vise à terme un brevet et un développement clinique.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer in vivo l'efficacité d'un nouveau type de vaccin contre le cancer. Ce vaccin est constitué d'un long peptide synthétique qui comprend un antigène de la toxine tétanique contre lequel la plupart les individus ont déjà été vaccinés et un antigène spécifique de la cellule tumorale. L'avantage attendu de ce type de vaccination est de profiter de la réponse préexistante contre la toxine tétanique pour augmenter l'efficacité de l'immunisation contre l'antigène tumoral et ainsi générer une réponse des lymphocytes T qui puissent détruire la tumeur. Nos résultats préalables ont démontré l'efficacité de ces vaccins synthétiques pour stimuler les cellules immunitaires in vitro et nous devons désormais valider notre approche in vivo pour pouvoir espérer la mettre en œuvre ensuite chez l'homme. Notre modèle d'étude est un modèle de souris vaccinées contre le tétanos auxquelles nous transplanterons une tumeur exprimant un antigène de mélanome bien caractérisé et qui seront ensuite vaccinées avec notre vaccin synthétique (toxine tétanique +antigène de mélanome). Nous espérons démontrer ainsi l'efficacité de ce vaccin pour limiter la croissance tumorale chez ces souris.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d’obtenir, à l’aide de modèles pré-clinique in vivo, des preuves de concept justifiant la mise en place d’immunothérapies par vaccination à l'aide de longs peptides synthétiques optimisés dans le traitement des mélanomes. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront permettre d'aller vers un dépôt de brevet et un développement clinique du produit.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections par voie sous-cutanée de peptides formulés en émulsion (composition proche d'un vaccin). Les animaux reçoivent au maximum 5 injections de peptides, une toutes les 2 semaines. L'injection en elle-même dure 3-5 secondes. Certains animaux reçoivent aussi par voie sous-cutanée une petite quantité de cellules tumorales qui vont générer une tumeur sur le flanc de l'animal. Cette injection se fait sous anesthésie générale. Le suivi de la croissance tumorale et le poids des animaux est effectué 3 fois par semaine, les souris sont donc manipulées régulièrement. La durée de l'expérience n'excède pas 87j.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont identifiées: - douleur intrinsèque à la piqûre (toutes les injections, de peptide et de cellules tumorales sont réalisées en sous-cutané). Selon les lots, les souris subiront au maximum 6 injections (2 pre-immunisations, 1 injection de cellule tumorale, 3 vaccinations). - développement d'une tumeur de type sarcome sur le flanc.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux sont sacrifiés par dislocation cervicale. Des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem (sur les tumeurs et la rate).
Remplacement
Les résultats attendus dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures in vitro. L'évaluation du bénéfice thérapeutique de la vaccination thérapeutique passe nécessairement par l'utilisation de modèles animaux. Ce projet s'appuie sur des données préliminaires in vitro attestant l'immunogénicité du produit. Notre étude permettra d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T induits par la vaccination sur le site tumoral). Ces résultats auront une importance capitale lors de la valorisation du produit et de son transfert espéré en clinique.
Réduction
Le nombre de lot d'animaux est réduit le plus possible: 2 lots pour évaluer l'immunogénicité (peptide vaccin comparé à peptide contrôle) et 2 lots pour évaluer le bénéfice thérapeutique (1 lot vacciné et 1 lot non vacciné). Le nombre total d'animaux prévoit l'évaluation de 4 peptides vaccinaux qui seront testés en séquentiel selon l'avancée du projet. Les expériences préliminaires ne seront pas répétées pour chaque vaccin testé.
Raffinement
Le recours à des expériences préliminaires réalisées sur un petit nombre de souris nous permet de valider les paramètres expérimentaux et de prendre en main le modèle expérimental. Cette précaution doit nous permettre de réduire la variabilité sur les procédures complètes (procédures 2 et 4) et doit également limiter le risque de résultats non concluants. Les souris qui vont recevoir les cellules tumorales sont rasées la veille de l'injection et l'injection se fait sous anesthésie gazeuse ce qui permet une implantation tumorale plus précise, avec une croissance plus homogène et donc une évaluation de la taille tumorale plus précise. Nous raffinons également nos procédures expérimentales par la définition de points limites adaptés à un modèle de croissance tumorale, ce qui permet un arrêt de la procédure si des souffrances sont suspectées.
Choix des espèces
Le modèle animal dont nous avons besoin ici est un modèle de souris dont le génome a été modifié pour produire des réponses immunitaires contre des antigènes humains. Nous travaillons sur des souris adultes mâles et femelles car les traitements de vaccination anti-tumorale dans le mélanome sont proposés à des hommes et des femmes adultes.
Utilisation de souris humanisées pour évaluer la survenue de tempête cytokinique consécutive à la thérapie par cellules CAR-T
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
188 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de tumeur, quatorze injections et plusieurs prélèvements sanguins, plus des séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux types de cellules CAR-T dans un cancer du sang et un cancer du pancréas. Le porteur renvoie les retombées pour les patients, une immunothérapie mieux tolérée, au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de mesurer les effets secondaires chez la souris. Sur le remplacement, il affirme que ses résultats doivent être validés dans un "organisme vivant entier", seul système qui montrerait cette baisse des effets indésirables.
Objectifs
Les cellules CAR-T représentent une avancée majeure en immunothérapie du cancer. Cependant, si ce traitement donne des résultats remarquables dans le contexte des cancers du sang, 30% des patients traités rechutent. De plus, ce type de traitement induit très fréquemment des effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, notamment une tempête cytokinique et une toxicité neurologique. Ces effets secondaires découlent d’une hyperactivation de la réponse innée induite par les cellules CAR-T. L’analyse de ces processus nécessite donc l’utilisation de modèles de souris humanisées, dans lesquelles les cellules CAR-T pourront interagir avec notamment un compartiment myéloïde également humain autologue. Nous avons récemment établi un nouveau protocole permettant de générer des cellules CAR-T ayant un potentiel antitumoral fortement augmenté. Le projet proposé consiste à comparer la survenue de ces effets secondaires après l’injection de cellules CAR-T classiques ou des cellules CAR-T obtenues suivant notre protocole. Nous comparerons la survenue de ces effets secondaires dans deux modèles tumoraux : un modèle de cancer du sang et un modèle de cancer du pancréas.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre à terme d’établir les bases expérimentales permettant le repositionnement du médicament anti-diabétique en immunothérapie. En effet, initialement décrit dans la prise en charge du diabète, ce traitement pourrait être à la base d’un protocole permettant d’obtenir une nouvelle génération de cellules CAR-T . Ces cellules, en levant les verrous liés à la faible persistance et l’anergie induite par le microenvironnement tumoral mais également en minimisant la survenue d’effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, pourraient induire une nette amélioration de la prise en charge des patients traités par l’immunothérapie basée sur l’utilisation de cellules CAR-T.
Procédures
Suivant les conditions expérimentales, les animaux seront soumis à une irradiation légère (durée 3 minutes), 7 injections (
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger consécutif aux manipulations fréquentes (suivi de croissance tumorale, suivis par prises de sang). Les souris subiront des injections sous anesthésie locale engendrant un stress temporaire léger. Les souris subiront une irradiation légère sans effet retardé et des séances d'imagerie sous anesthésie générale ayant un impact léger (préhension, déplacement). Enfin, la croissance tumorale elle-même peut induire une gêne physique légère ou modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses sur organes nécessaires à l'étude.
Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’un nouveau protocole d’élaboration de cellules CAR-T que nous avons mis au point, notamment la minimisation de la survenue d’effets secondaires délétères pour la santé du patient. Nous avons, en amont des expériences exposées ici, réalisé un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une diminution de l'activation de certaines cellules en présence de cellules CAR-T obtenues suivant le protocole que nous avons développé par comparaison avec des cellules CAR-T classiquement obtenues. Nous avons notamment pu établir que des monocytes cultivés en présence ces cellules CAR-T produisent moins de cytokines pro-inflammatoires et présentent un phénotype moins activé que ceux cultivés en présence de cellules CAR-T classiques. A présent, afin d'obtenir des résultats au plus proche d'un essai clinique, nos résultats doivent être validés dans un organisme vivant entier, seul système qui puisse montrer que cette moindre activation du compartiment myéloïde se traduit par une diminution des effets secondaires (perte de poids, fièvre, atteinte neuronale).
Réduction
Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie par bioluminescence afin de réduire le nombre d'animaux utilisés (l'animal est son propre témoin pour certains paramètres, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux) . Les groupes d'études sont mis en oeuvre le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées dans chaque procédure a été établi sur la base de l'experiences acquise au cours de 20 années de travaux antérieurs. Au cours de ce projet, nous utiliserons le nombre de souris minimal requis pour obtenir des résultats statistiquement représentatifs.
Raffinement
Les animaux sont hébergés avec un enrichissement constitué de sizzlenests et de maisonnettes en carton. Les interventions seront faites sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal et non invasif de la croissance tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Ceci permettra aussi de détecter au plus tôt les tumeurs pour arrêter le plus tôt possible les procédures. Les souris seront surveillées quotidiennement (examens cliniques) pendant toute la durée de la procédure expérimentale afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Afin de minimiser les douleurs lors des injections sous cutanée et intraveineuse au niveau de la veine caudale ou faciale, les souris seront anesthesiées localement par apllication d'un spray lidocaïne. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le modèle de souris est humanisable ce qui permet de suivre les conséquences d'interactions complexes de nombreux partenaires cellulaires autologues au sein d'un organisme vivant. Il constitue donc le modèle le plus adéquat aux études précliniques. Pour générer les cellules d'intérêt pour l'humanisation, il est indispensable d'utiliser des souris âgées de moins de 2 jours. En effet, des travaux recents montrent que passé cet âge, la reconstitution de la lignée lcellulaire d'intérêt est fortement altérée. Pour les tests sur souris humanisées, les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines en début d'expérience: âge optimal pour obtenir une reconstitutton du système immunitaire inné.
Etude du rôle de différents signaux pro-inflammatoires dans l’accouchement prématuré
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
55 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, les femelles tuées et les mâles réutilisés. Les femelles gestantes reçoivent une injection de LPS déclenchant un accouchement prématuré, puis sont tuées pour prélever cornes utérines et placenta. Le porteur indique attendre une douleur liée aux spasmes abdominaux, avec des saignements utérins possibles, et administre un antalgique au-delà d'un score clinique. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules et tissus humains in vitro et vouloir confirmer ces résultats sur un modèle vivant, malgré des mécanismes de parturition différents entre l'humain et la souris.
Objectifs
La menace d’accouchement prématuré représente la première cause de mortalité néonatale et d’hospitalisation en cours de grossesse. Les médicaments actuellement utilisés pour éviter un accouchement prématuré présentent une efficacité limitée et de nombreux effets indésirables. Il est donc impératif de développer de nouveaux traitements plus efficaces et moins toxiques. Pour cela, la compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en route du travail et l’identification de nouvelles cibles sont indispensables. Il a été démontré que des cytokines pro-inflammatoires sont impliquées dans l’activation du travail. Ces cytokines sont, entre autres, générées par l’intermédiaire de l’inflammasome. Compte tenu du rôle majeur de ces cytokines dans la mise en route du travail, il apparait donc essentiel d’étudier le rôle de l’inflammasome dans ces mécanismes. Notre hypothèse de travail est que la mise en route prématurée du travail est associée à une augmentation, entre autres, de la production d’IL1β consécutive à l’activation de l’inflammasome dans le myomètre. Nos résultats préliminaires in vitro, réalisés sur un modèle validé de stimulation des cellules musculaires utérines au LPS, montrent que la cytokine IL1β est produite en réponse à cette stimulation et est capable d’induire les mécanismes cellulaires associées au travail. Nous avons également pu montrer que l’inhibition de l’inflammasome est associée à une inhibition des mécanismes cellulaires associés au travail. Nos résultats in vitro impliquent donc la cytokine IL1β et l’inflammasome dans différentes étapes de l’accouchement prématuré. Afin d’étudier les mécanismes de l’accouchement prématuré in vivo, nous souhaitons utiliser un modèle d’accouchement prématuré couramment utilisé. Ce projet permettrait alors d’étudier l’effet sur l’accouchement prématuré du blocage de la cytokine IL1β et de l’inhibition de l’inflammasome en utilisant des traitements pharmacologiques. L’ensemble de ces résultats permettrait le développement d’un nouveau traitement de la menace d’accouchement prématuré.
Bénéfices attendus
L’accouchement prématuré est la première cause d’hospitalisation au cours de la grossesse et représente la première cause de mortalité néonatale. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes de mise en route du travail et d’identifier de nouvelles cibles pour le développement de médicaments. Avec ce projet, nous pourrons donc mieux comprendre les mécanismes de mise en route du travail liés à la cytokine IL1-β et à l’inflammasome. Nos travaux pourront ensuite servir à d’autres équipes pour développer de nouvelles molécules qui pourront agir sur les cibles que nous aurons identifiées.
Procédures
Les souris recevront une injection unique de LPS par voie i.p. ou s.c. (selon les données obtenues lors de la procédure 1). Si les scores « analgésie » sont dépassés, les souris recevront une injection unique de buprénorphine en sous-cutanée. Aucun prélèvement ne sera effectué sur animaux vigiles. Les interventions dureront moins d’une minute
Impact sur les animaux
L’injection de LPS va induire une mise en route du travail précoce mimant un accouchement prématuré. D’après nos précédentes études et la littérature, nous nous attendons à ce que les souris traitées au LPS ressentent de la douleur qui pourra se manifester par différents signes cliniques (transpiration, poils hirsutes, prostration, tremblement) liés aux spasmes abdominaux qui s’installent au cours de l’accouchement. Les souris pourront également avoir des saignements utérins.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, nous souhaitons récolter différents tissus (cornes utérines, placenta) et vérifier l’absence de fœtus resté dans les cornes utérines. Pour cela, toutes les femelles seront mises à mort à la fin de l’étude. Les mâles seront réutilisés dans d’autres études.
Remplacement
Le rôle de l’inflammasome et de l’IL1 dans la menace d’accouchement prématuré a été démontré in vitro en utilisant des cellules primaires humaines et ex vivo sur des explants tissulaires humains. Nos résultats préliminaires, sur les tissus humains, montrent que l’IL1 est produite dans le tissu utérin au cours d’une pathologie inflammatoire (chorioamniotite) ou à la suite d’un traitement par le LPS. In vitro, nous avons montré que la cytokine IL1induit des modifications des cellules myométriales (morphologie, fonction) nécessaires à la mise en route du travail. Enfin, nous avons démontré, dans un modèle in vitro d’accouchement prématuré, que le blocage pharmacologique de l’IL1et l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome sont associés à une inhibition des mécanismes cellulaires associés au travail. Ces études in vitro de remplacement nous ont donc permis de mieux connaitre la physiologie et les acteurs impliqués dans la menace d’accouchement prématuré. L’objectif est maintenant de confirmer ces résultats dans un modèle in vivo qui reproduira la physiopathologie de l’accouchement prématuré. Même si les mécanismes de parturition sont différents entre l’Homme et la souris, nous nous plaçons ici dans un cadre pathologique d’inflammation induite avant terme et la chute hormonale observée au cours de la parturition chez les souris n’interviendra pas. Ainsi, nous pourrons extrapoler les résultats obtenus sur la souris à l’Homme. Nous pourrons donc évaluer l’effet du blocage de l’IL1 et l’inhibition de l’inflammasome. Nos résultats permettront donc d’identifier une nouvelle cible thérapeutique, l’inflammasome, dans la menace d’accouchement prématuré. De plus, aucune étude in vivo n’a encore été réalisée avec un inhibiteur de l’inflammasome dans cette pathologie.
Réduction
Afin de réduire les biais expérimentaux, les souris gestantes seront randomisées après l’accouplement. Le travail se fera également en aveugle : une personne induira l’accouchement prématuré par injection de LPS et une seconde suivra le délai entre l’accouchement et l’injection. Les souris non traitées au LPS seront réutilisées pour un second accouplement et un traitement au LPS.
Raffinement
Avant le début de la procédure, les animaux seront entraînés à être manipulés afin de limiter le stress qui pourraient survenir au cours de la procédure expérimentale et qui pourraient fausser les résultats. Afin de réduire au maximum les nuisances causées aux animaux, les souris gestantes seront hébergées deux par deux pour leur permettre d’être au calme et seront pesées tous les 2 jours après accouplement pour suivre la gestation. Du matériel sera également apporté dans les cages pour permettre la construction du nid (une poignée de sizzle-dri lanières de papier kraft et 4 cylindres de coton par femelle) la nourriture non enrichie et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’étude préliminaire de la voie d’injection du LPS nous permettra d’envisager une voie d’administration moins douloureuse pour les animaux. Après l’injection de LPS, les souris seront surveillées toutes les deux heures pour vérifier la parturition et contrôler le bon état des souris. Des points limites « analgésie » seront établis en utilisant une grille de score clinique et les souris dépassant ces points limites seront traitées avec un antalgique non stéroïdien en injection sous-cutanée. Les souris ne seront pas pré-médiquées puisque les signes cliniques de mise en route du travail seront un des paramètres étudiés dans ce projet. En dernier recours, si les point limites « mise à mort » sont dépassés, les souris seront mises à mort pour limiter la souffrance.
Choix des espèces
L’étude de l’accouchement prématuré nécessite l’utilisation de mammifères dont la durée de gestation est courte et connue. Le modèle choisi est largement décrit dans la littérature et couramment utilisé dans cette thématique. Nous utiliserons des souris âgées d’environ 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte et de maturité sexuelle de l’animal.
Évaluation de l’exposition paternelle chronique à de faibles doses de polluants environnementaux persistants sur le développement embryonnaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles reçoivent par voie orale de faibles doses de polluants pendant trente-cinq jours, passent un test comportemental, puis sont croisés avec des femelles dont les embryons sont analysés, tous les animaux étant tués pour prélever testicules, cerveau et foie. Le porteur annonce un stress minimal lié à l'administration et surveille le risque de fausse route, avec un point limite de perte de poids de 10 %. Il cherche à évaluer des effets épigénétiques de l'exposition paternelle et affirme que la spermatogenèse et le développement embryonnaire ne sont possibles qu'in vivo.
Objectifs
L'objectif de l'étude est de révéler les effets de l'exposition chronique à faible dose sur le système reproducteur mâle en mettant l'accent sur les mécanismes épigénétiques. 1) Analyser les effets des polluants sur le nombre de spermatozoïdes et la méthylation de l'ADN. 2) Révéler les effets sur la méthylation de l'ADN dans le cerveau, le foie et les testicules embryonnaires. 3) Analyser les modifications du comportement de la descendance des animaux traités.
Bénéfices attendus
Nous répondrons à plusieurs questions. Nous chercherons à savoir si l'exposition à de faibles doses de polluants environnementaux persistants modifie la santé reproductive des souris mâles, le nombre de spermatozoïdes et si elle induit des altérations épigénétiques. Nous nous demanderons si les éventuels effets induits chez les mâles influencent le développement embryonnaire des futurs embryons tels que le cerveau, le foie et les testicules et, enfin, si le comportement des animaux adultes est altéré.
Procédures
Les animaux recoivent, par administration orale (0.1ml), des polluants à faible dose, 1 fois par jour, tous les 2 jours, pendant 35 jours. Cette intervention dure 30 secondes en moyenne. Le test de comportement durera 5 minutes et ne sera pas répété.
Impact sur les animaux
Les concentrations des polluants utilisés sont faibles et les composés seront dissous dans l'eau. Le stress lié à l'administration sera minimal. La fausse-route lors de l'administration est un risque qui sera surveillé. Le test de comportement peut générer une anxiété, un stress qui seront observés mais non répétés.
Devenir
Tous les animuax sont mis à mort à la fin de la procédure: nous analyserons les organes cibles de l'étude (testicules, cerveau et foie).
Remplacement
Le modèle de souris est couramment utilisé dans les études toxicologiques. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire très complexe et qui n’est possible qu’in vivo.
Réduction
Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant, pour les trois groupes de composés téstés, un seul groupe d'animaux contrôles. Cependant, l’utilisation de souches non consanguines nécessite 12 animaux par lot en raison de la forte variation entre les animaux, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les composés seront administrés par voie orale, par des personnes formées et compétentes pour ce geste technique. Les souris seront traitées seulement tous les deux jours, ce qui aidera à réduire le stress. Les polluants testés sont dissous dans de l'eau. Application de points limites : perte de poids de 10% maximum, les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lot de 4.
Choix des espèces
La souche Swiss RjOrl, souche non consanguine, est un modèle de choix pour les études. Les souches non consanguines sont utilisées dans de nombreuses études toxicologiques. Pour comprendre comment des facteurs toxiques influencent la gamétogenèse au cours du développement, le modèle de la souris est judicieux car très utilisé dans l’étude du développement chez les mammifères. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets de la pollution. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes. Lorsque le traitement sera terminé, les animaux auront atteint l'âge de deux mois, de sorte que les mâles seront capables de féconder les femelles. Pour l'étude embryonnaire, nous croiserons ces animaux mâles avec des femelles âgées de 8 semaines (à cet âge les femelles sont fertiles) et les embryons de 15 jours seront analysés.
Validation préclinique de séquences d’IRM multiparamétriquesur un modèle murin de sarcome des tissus mous EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
22 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, vingt tuées et deux réutilisées. Elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau, puis deux IRM dont une avec injection d'un marqueur d'hypoxie, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur décrit une gêne liée à la protubérance tumorale au flanc sans entrave à la mobilité, et justifie la mise à mort par le risque infectieux propre à ces animaux immunodéprimés. Il présente l'IRM comme non invasive, ce qui autorise la réutilisation de deux souris, et affirme que la mesure du flux sanguin est impossible sur cultures cellulaires.
Objectifs
Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.
Procédures
Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.
Impact sur les animaux
Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.
Devenir
Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.
Remplacement
Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.
Réduction
L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.
Raffinement
Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.
Rôle de l’inflammation dans l’obtention d’un modèle animal pertinent du Moyamoya, une maladie vasculaire cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 087 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Porteuses de mutations liées à la maladie de Moyamoya, elles reçoivent dès l'âge de huit jours, sur animal vigile, des injections mimant une infection, puis des prélèvements sanguins avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur décrit un stress de séparation, une douleur transitoire et des tremblements possibles si la maladie se développe, et ajoute vingt souris pour la formation de deux expérimentatrices. Il cherche à obtenir le premier modèle animal de cette maladie et juge l'étude "envisageable qu'in vivo".
Objectifs
L’angiopathie de Moyamoya (MMA) est une maladie rare des vaisseaux du cerveau. Cette maladie se définie par : 1/une diminution progressive du diamètre des gros vaisseaux qui apportent le sang au cerveau (artères localisées à la base du cerveau) qui peut atteindre l’occlusion et qui provoque un manque d’oxygène dans le cerveau, 2/la présence d’un réseau de petits vaisseaux fins et anormaux à la base du cerveau, qui se sont probablement formés pour compenser le manque d’oxygène cérébral entrainé par l’occlusion des artères cérébrales atteintes d’anomalie de MMA. Les patients MMA peuvent avoir des accidents vasculaires cérébraux. Les mécanismes de développement de la maladie sont encore largement inconnus aujourd’hui et aucun modèle animal n’existe. Une vingtaine de gènes ont déjà été identifiés comme responsables du MMA chez l’homme. En parallèle de ces données génétiques, de récentes études suggèrent qu’une infection virale ou bactérienne pourrait être un élément déclencheur du MMA chez les patients. Pour avancer dans la compréhension des mécanismes responsables du développement du MMA, l’obtention d’un modèle animal est cruciale aujourd’hui. L’objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de MMA chez des souris qui porteront des mutations dans deux gènes déjà identifiés chez des patients MMA. Une infection bactérienne ou virale sera mimée (pour provoquer une inflammation) chez ces souris mutées pour comprendre si cela déclenche ou non le développement du MMA comme suggéré dans les études cliniques chez l’homme. Ce projet propose de caractériser les vaisseaux cérébraux chez ces souris mutées et soumises à une inflammation à la recherche d'une anomalie des vaisseaux du cerveau qui ressemblerait à celle qui se développe chez les patients atteints de MMA. La définition de ce qui serait alors le premier modèle animal de MMA permettrait de faire avancer la compréhension des mécanismes responsables du développement de cette maladie et d’envisager de nouvelles approches pour stopper l’évolution de la maladie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les mécanismes responsables du développement de la maladie sont largement inconnus aujourd’hui. Il n’existe aucun modèle animal de MMA. L’obtention d’un modèle de MMA chez la souris permettrait : 1-d’étudier comment se développent des lésions MMA au niveau des vaisseaux du cerveau en suivant leur évolution au cours du temps et 2-de mieux comprendre les mécanismes responsables du développement de la maladie. Il est par exemple important de comprendre si l’inflammation provoquée par une infection virale ou bactérienne peut déclencher la maladie. A plus long terme, comprendre comment se développent les lésions des artères du cerveau chez les patients MMA permettra d’envisager des approches médicamenteuses pour limiter voire stopper le développement de la maladie chez les patients.
Procédures
L’ensemble des animaux du projet sera soumis à deux injections en intra-péritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) d’un composant mimant une infection virale ou bactérienne à 8 jours et 15 jours de vie. L’injection est rapide (30 secondes/souriceau) et réalisée sur animal vigile (c’est-à-dire conscient, en éveil) et sans anesthésie. Les animaux analysés au 15ème jour après la naissance seront euthanasiés et le sang et les organes seront prélevés en post-mortem. Les autres animaux seront analysés à 1, 2, 4 et 6 mois. Un à 3 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés entre l’âge de 1 et 6 mois, au niveau de la veine faciale (manipulation totale d’1 min/animal). A la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera soumis à une analgésie et à une anesthésie générale. Un petit groupe de souris recevra une injection dans le sinus veineux situé à côté de l’œil, d’un marqueur fluorescent de l’intérieur des vaisseaux après l’anesthésie. Puis, une surdose d’anesthésie sera administrée. Le sang sera récupéré dans la cage thoracique avant de débuter une perfusion intracardiaque de liquide pour éliminer le sang contenu dans les vaisseaux. Les organes seront prélevés post-mortem.
Impact sur les animaux
La séparation des petits de leur mère au 8ème et au 15ème jour après la naissance pour procéder à leur injection peut entrainer un stress transitoire. Les injections réalisées chez ces souriceaux peuvent causer une douleur transitoire et locale. L’inflammation induite peut entraîner une déshydratation transitoire des petits. Si la maladie de moyamoya se développe, les animaux atteints pourraient présenter des tremblements.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort à l’issu de la procédure, soit au maximum 1067 animaux. 20 animaux supplémentaires ont été ajoutés pour permettre la formation de deux expérimentatrices au prélèvement sanguins en sous-mandibulaire. Ces 20 animaux seront euthanasiés à l’issu de la réalisation du prélèvement sanguin.
Remplacement
Ce projet consiste à étudier les liens potentiels existants entre la présence de mutations dans certains gènes, l’inflammation et le développement de la maladie cérébro-vasculaire de MMA. Il requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet possédant à la fois un système immunitaire et des vaisseaux sanguins dans le cerveau dans un environnement physiologique normal. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux total nécessaire a été prévu pour être limité au maximum. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs statistiques appelés tests de puissance, issus des résultats déjà connus d’études précédentes. Deux petits d’intérêt seront obtenus par portée et les autres petits des mêmes portées seront tous considérés comme des animaux contrôles. Afin de pallier l’éventuelle mortalité induite par le protocole d’inflammation chez le souriceau, 10% d’animaux supplémentaires sont ajoutés par groupe. Ce taux ne sera sans doute pas atteint dans ce projet puisque le protocole d’induction d’inflammation est plus modéré et réalisé à un stade de développement plus tardif que ceux utilisés pour calculés ces 10% dans des travaux déjà publiés. La caractérisation des vaisseaux cérébraux et rétiniens sera réalisée en priorité dans les groupes de 1 mois et 6 mois. Si aucune anomalie vasculaire n’est observée à 6 mois, les autres groupes ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les mères gestantes sont isolées avant la mise-bas, des mouchoirs en papier sont mis à leur disposition pour la confection du nid. Avant chaque manipulation des petits, la mère est isolée dans une cage le temps strictement nécessaire à la procédure. Les gants des expérimentateurs sont passés dans la litière sale pour atténuer leur odeur avant la manipulation des petits. Le nid confectionné par la mère n’est pas détruit, les petits sont manipulés un par un sont tous redéposés dans le nid avant réintroduction de la mère. Le sevrage est effectué après 21 jours de vie, avec un maximum de 6 animaux du même sexe par cage. L’identification des animaux d’intérêt et des animaux contrôles se fait par la technique de génotypage (technique permettant de déterminer la présence ou l’absence de mutations dans les gènes étudiés) réalisée sur des poils prélevés au moment du sevrage des animaux. L’enrichissement de chaque cage est systématique avec du papier absorbant et la présence de petites maisons. Tous les animaux concernés par les procédures sont observés quotidiennement. Ils feront également l’objet d’un examen détaillé hebdomadaire par une personne responsable du projet. L’aspect général (qualité du pelage, absence de larmoiements des yeux, gonflement de l’abdomen), le comportement de l’animal (déplacement, prostration, agressivité) et le poids seront analysés pour déceler précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (suivi définit en fonction de l’âge). En cas de signes de souffrance décelés, un traitement antalgique sera administré. Dans le cas d’une persistance au-delà de 2 jours, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les vaisseaux du cerveau chez la souris sont très proches de ceux trouvés dans le cerveau humain. Par ailleurs, différentes lignées de souris mutées dans l’un des gènes responsables du moyamoya chez l’homme sont disponibles. Les animaux seront utilisés à différents âges au 8ème et 15ème jours de vie (pour correspondre au moment de la naissance et au jeune enfant chez l’homme) pour l’induction et la caractérisation de l’inflammation et à 1, 2, 4 et 6 mois pour la caractérisation des vaisseaux cérébraux/rétiniens pour pouvoir suivre le développement au cours du temps des anomalies vasculaires. Les groupes 1 mois et 6 mois seront réalisés en premier. En l’absence d’anomalie des vaisseaux ressemblant aux anomalies vasculaires des patients Moyamoya les autres points ne seront pas réalisés.
Un nouvel outil pour la thrombolyse ciblée de l’AVC ischémique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
459 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles subissent une chirurgie d'induction d'un accident vasculaire cérébral ischémique, une pose de cathéter et une perfusion de traitement, avec pour une partie une IRM. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, une perte de poids et des déficits fonctionnels liés à l'ischémie, et juge qu'il n'est pas éthique de garder ou réutiliser ces animaux, dont les tissus alimentent une biobanque. Il cherche à tester des microbulles censées cibler le caillot et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'étude in vivo de l'ischémie.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (r-tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (< 10%) peut être traitée, du fait des effets secondaires de l’injection de r-tPA (risques d’hémorragie cérébrale et de mort neuronale excitotoxique) et de la relative difficulté d’accès à la thrombectomie. L’investissement de la recherche et la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques semblent indispensables, dans ce cadre où l’AVC représente un enjeu de santé publique avec de forts impacts au niveau des populations, et où trop peu de patients ont accès à un traitement. Lors de la thrombolyse intraveineuse, une dose élevée de r-tPA est injectée dans toute la circulation générale afin de pouvoir thrombolyser le caillot lors de son passage au niveau de l'artère occlue. L'objectif de ce projet est de tester et caractériser différentes techniques de thrombolyse et de mettre en évidence leurs avantages et leurs inconvénients. Ce projet s’axera aussi surtout autour d’un outil prometteur de thrombolyse ciblée associé ou non à une sonothrombolyse (thrombolyse par ultrasons). L’outil de thrombolyse ciblé se présente sous la forme de microbulles de fucoïdane, ayant la particularité d’avoir une affinité naturelle pour la P-sélectine, une protéine d’adhésion exprimée lors d’un processus inflammatoire, comme un AVC. Ces microbulles une fois injectées se fixeraient au niveau du caillot où la cascade d’inflammation se déroule. En les chargeant de r-tPA, il serait alors possible d’acheminer directement le traitement au niveau du caillot, et donc de diviser la quantité totale injectée par 10 (vu in vitro). Cette réduction de la dose administrée permettrait de réduire le risque de survenue d’effets secondaires, afin d’élargir la fenêtre thérapeutique. Les bulles peuvent être éclatées à distance par des ondes ultrasonores, ce qui permettrait possiblement de libérer le r-tPA autour du caillot, et d’aider à la thrombolyse. Elles sont également fluorescentes ce qui permet de suivre leur parcours dans la circulation ainsi que leur recapture par les différents organes en charge de les éliminer.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant de proposer une nouvelle modalité de traitement thrombolytique ciblé, les bénéfices seraient de pouvoir réduire la dose de r-tPA actuellement administrée en clinique, et d'ainsi réduire le risque de survenue des effets secondaires (transformation hémorragique et mort neuronale excitotoxique) directement liés au r-tPA, et ainsi élargir la fenêtre thérapeutique, ce qui permettrait l'accès à la thrombolyse intraveineuse à plus de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie comprenant une pose de cathéter (5 minutes) et une induction d'ischémie (20 minutes), à une infusion de traitement par voie intraveineuse (40 minutes), et pour certains à une acquisition en IRM avec ou sans injection intraveineuse d'agent de contraste (8 à 20 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraients : Des douleurs post-opératoires après la chirurgie d'induction de l'ischémie ou à la craniotomie, une perte de masse corporelle après l'anesthésie et l'induction de l'ischémie, des déficits fonctionnels à la suite de l'ischémie, une gêne ou une douleur occasionnée par l'injection du traitement (changement de volémie, réaction au traitement), perte de l'intégrité de la Barrière Hémato Encaphalique (BHE) et donc hémorragie liée à la sonothrombolyse, une gêne liée au site d'insertion du cathéter après le réveil.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant, un degré de sévérité a été fixé pour les procédures 1 à 16, car les animaux seront réveillés en cours de procédure (entre la chirurgie et l'imagerie). Même si l'on observe une bonne récupération chez les souris après l'induction d'une ischémie, et que chaque douleur potentielle est prise en charge avant même sa survenue, il n'est pas jugé éthique de replacer ou faire adopter ces animaux, pour leur bien-être. La réutilisation dans d'autres procédures n'est également pas souhaitée, car ces animaux auront déjà subit une ischémie avant la mise à mort. Enfin, les tissus de chaque animal seront prélevés post-mortem afin d'alimenter une biobanque, et pourront être réutiliser pour des études ultérieure. Cela permet de respecter le principe de réduction et de raffinement des 3R.
Remplacement
Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal. Il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés survenant lors d'une ischémie. Les effets des molécules pharmacologiques sur l'ischémie et sur la lésion associée, ainsi que leur parcours in situ ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé en reprenant les données antérieures testant des molécules pharmacologiques sur le devenir des lésions ischémiques sur les souris, et ayant montré des effets significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire, dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. En prenant en compte les paramètres physiopathologiques attendus sur la base d'études antérieures et pour un seuil de significativité à 95% et une puissance de 80% (beta = 20%), 31 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe, d'autant plus que le nombre de groupes étant élevé, il est nécessaire d'avoir suffisamment d'animaux dans chaque groupe pour espérer voir un effet.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. La grégarité sera respectée en plaçant les souris par groupe de 5 dans des cages enrichies (maisonette, coton, craft, briquette de bois à ronger), avec de l'eau et de la nourriture ad libitum. Durant l'induction de l'ischémie, les souris seront sous anesthésie générale couplée à une analgésie, et sous anesthésie locale, adaptées à l'espèce et à l'intervention réalisée . Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de la souris durant chaque anesthésie générale afin d'éviter le dessèchement oculaire et la cécité. La température corporelle des souris sera assurée durant chaque anesthésie générale par un tapis chauffant rétrocontrôlé par sonde rectale, et les règles d'aseptie et d'antisepsie durant les chirurgies seront respectées. Après la chirurgie d'induction de l'ischémie, les souris disposeront de croquettes humides en purée dans une coupelle au sol afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort en accord avec la réglementation dans les 24 heures suivant l'observation d'un ou de plusieurs des points limites prévus. Si des signes de douleur modérées sont observés, un rappel d'analgésique adapté sera réalisée dépassé 6h de chirurgie. Avant ce délai, il sera observé si les souris s'alimentent et s'abreuvent correctement, et pourront être re placée en enceinte chauffante à 32°C si prostration.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l'espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L'ensemble des connaissances et des acquis à disposition au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce pertinente pour étudier l'efficacité d'un nouveau traitement dans le cadre de la recherche sur l'AVC ischémique. L'étude se déroulera sur une souche de souris (Swiss), qui est peu coûteuse et dont la maintenance et la manipulation est simple. Les souris utilisées seront de jeunes adultes entre 5 et 8 semaines (5 semaines lors de l'arrivée dans l'animalerie, et 8 semaines lors de la fin du protocole). Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d'ischémie. De plus, l'étude du développement ou du vieillissement n'est pas l'objet de ce projet.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.