Souris
Dérégulation des phosphoinositides et myopathie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Sur 224 souris, 72 reçoivent dans un muscle de la patte une injection de notexine, une toxine qui déclenche la régénération du muscle, et sont suivies 3, 12 ou 24 jours, 48 reçoivent dans ce même muscle un virus porteur d'un gène, suivies cinq semaines, et toutes sont marquées par tatouage des phalanges et génotypées par un prélèvement de queue. Le projet étudie deux lignées qui reproduisent un dérèglement de lipides en cause dans la myopathie myotubulaire, où les souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour disséquer leurs muscles. Un lot de souriceaux de deux semaines est en outre exploité pour établir des cultures de cellules musculaires. Le porteur écrit que la toxine "pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons)", et précise dans le même passage que le muscle injecté "retrouve sa fonction normale" au bout d'une vingtaine de jours.
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.
Procédures
Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.
Impact sur les animaux
Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.
Devenir
A l'issue des procédures 1 2 et 3, les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.
Remplacement
En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.
Raffinement
L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).
Conséquences neurobiologiques et comportementales d’un stress précoce en deux temps chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Séparées de leur mère trois heures par jour pendant quatorze jours puis soumises à une agression sociale et aspergées d'urine de mâle, elles passent six tests comportementaux, des prises de sang et deux chirurgies d'injection virale et d'implantation de fibre optique. Le porteur reconnaît une gêne durable, anhédonie, anxiété et apathie, "qui ne peut être soulagée", et n'euthanasie qu'au-delà de points limites. Il vise à distinguer souris vulnérables et résilientes et affirme que ces troubles ne peuvent être reproduits sans animaux vivants.
Objectifs
La dépression est une maladie psychiatrique extrêmement répandue et représente la première cause d’invalidité dans le monde. Elle est précipitée par des évènements de vie néfaste, notamment la maltraitance infantile, qui est le plus grand prédicteur pour le développement de dépression et de suicide à l’adolescence et à l’âge adulte. Cette adversité est par ailleurs associée à une forte résistance aux traitements utilisés en clinique. Par ailleurs, la dépression est majoritairement précipitée par l’expèrience de plusieurs évènements stressants qui arrivent à différents moments de la vie. Cependant, les conséquences à long terme de la maltraitance infantile varient d’un individu à l’autre et certains vont présenter la capacité de s’adapter en réponse au stress et éviter ses conséquences néfastes, c’est le concept de résilience au stress précoce. Comprendre les mécanismes neurobiologiques qui contribuent à la résilience est primordiale afin de mettre en évidence des facteurs de protection face au développement de psychopathologies qui serviront de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces patients. Le système noradrénergique du locus-coeruleus joue un rôle majeur dans la résilience au stress chez l’adulte. Par ailleurs, si certaines études ont montré une dérégulation de ce système dans des modèles animaux de stress précoce, son rôle dans la résilience au stress précoce n’est pas connu. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle murin de stress précoce en deux temps chez la souris. Nous associerons un modèle de séparation maternelle avant le sevrage avec un stress juvénile d’agression sociale à l’adolescence afin de dissocier des groupes d’animaux susceptibles vs résilients en fonction de leur phénotype comportemental à l’âge adulte et d’étudier si des altérations différentielles sur le système nerveux apparaissent. Pour cela nous utiliserons une approche comportementale dans le but d’étudier les conséquences du stress précoce sur le développement de comportement anxio-depressif à l’âge adulte ainsi que des techniques d’immunohistochimie, de biologie moléculaire et d’imagerie pour étudier les conséquences du stress précoce en deux temps sur le système noradrénergique en fonction de la susceptibilité au stress. Les résultats de ce projet serviront de base pour développer des modèles de manipulation génétique ou fonctionnelle de ce système dans le but d’enrayer les conséquences à long terme du stress précoce et de promouvoir la résilience.
Bénéfices attendus
L’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de coût et d’efficacité. Ce projet a un intérêt majeur puisqu'il permettra d'améliorer la compréhension de la neurobiologie de dépression et de la résilience afin de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
- Stress précoce en deux temps : un stress de séparation maternelle de 3h par jour pendant 14 jours et un stress juvénile d’agressions sociale de 5 minutes pendant 2 jours. Au cours du stress d’agressions, les souris seront espergées d’urine de mâles. Les souris seront ensuite testées dans 6 paradigmes comportementaux anxio-depressif de 5 à 10 minutes sur une période de 3 semaines à l'âge adulte. Chaque souris n'est exposé qu'une seule fois à chaque test de comportement. Par la suite, les souris recevront 3 prélèvements de sang sur une période de 3 heures. - 2 procédures chirurgicales : une première procédure d'injection de virus sera réalisée suivie d’une deuxième procédure d'implantation de fibres optique, entre 2 à 3 semaines suite à l'injection de virus. Chaque procédure chirurgicale aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune.
Impact sur les animaux
La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie). Lors de la procédure de stress juvénile de défaite sociale, les animaux sont mis en contact avec une souris agressives 5 minutes par jour pendant 2 jours. Des blessures ou lésions induites par les agressions physiques lors de cette procédure peuvent être observées. Toutes les attaques sont surveillées et stopées si elles perdurent afin d’éviter la formation de lésions. Les souris agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.
Devenir
A l'issue des 4 procédures, les animaux seront mis à mort et les cerveaux utilisés pour des analyses immunohistologiques ou de biologie moléculaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet nécessite l’emploi de plusieurs techniques expérimentales. Compte tenu de la littérature et de notre expérience, nous utiliserons les tests statistiques pour analyser nos données. Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées . D’après notre expèrience, une grande variabilitée individuelle peut être observée lors des enregistrements en imagerie calcique en fonction de l'expression virale et du site d'implantation. Basé sur la littérature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté . C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles en considérant ici le sexe comme une variable d’analyse supplémentaire.
Raffinement
La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance selon les critères définis, alors, il sera euthanasié. Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton). Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitués à l’expérimentateur, au dispositif et à la pièce d’expérimentation pour éviter un stress supplémentaire. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et des protocoles analgésiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont été établis pour chaque procédure. Nous incluons ici une procédure pilote sur un petit nombre d’animaux, pouvant donner lieu à un arrêt total des expériences. Cette phase du projet combinant le stress en deux temps et deux procédures de chirurgies sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux conditions sans les chirurgies.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser des souris Génétiquement modifiées. L’objectif du projet étant d’étudier les conséquences comportementales et neurobiologiques à long terme du stress précoce tel que la maltraitance infantile, dans notre modèle de stress précoce en deux temps, la séparation maternelle sera réalisée sur des animaux non sevrés et le stress juvénile d’agression sociales 1 semaine après le sevrage . Les tests comportementaux et analyses neurobiologiques seront réalisés à l’âge adulte.
Analyse d‘une protéine d‘intérêt et de ses variants dans la prolifération de l’ovaire et du testicule chez la souris embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent une injection intrapéritonéale, précédée pour une partie d'un gavage, puis sont tuées quatre heures plus tard pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Le porteur signale un stress de contention et des altérations possibles au site d'injection, sans autre nuisance déclarée. Il cherche à identifier les gènes de la détermination du sexe et affirme que les cultures cellulaires ou organoïdes ne reproduisent pas le développement dynamique de l'organe, ces modèles n'existant "que chez la souris".
Objectifs
Chez l’homme (et la souris) l’appareil génital comprend différents organes, dont les gonades qui sont les organes producteurs des cellules reproductives ou gamètes. Au cours du développement, les gonades indifférenciées vont se différencier en testicule ou en ovaire selon le sexe de l’embryon grâce au processus de détermination du sexe, initiant ainsi tout le développement sexuel de l’individu. Tandis que le gène SRY, responsable de l'initiation du développement testiculaire, a été identifié il y a plus de 30 ans, le déterminant ovarien reste inconnu. Cela montre notre méconnaissance des mécanismes qui contrôlent la détermination du sexe. Notre objectif est d’avancer dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la détermination du sexe. Chez l’homme, les mutations de certains gènes induisent des anomalies du développement de la gonade suggérant qu’ils sont impliqués dans la détermination du sexe. Cependant leur mécanisme d’action reste à élucider. Nous analyserons l’impact des mutations des gènes impliqués dans le déterminisme sexuel sur la prolifération et la différenciation cellulaire des gonades de souris portant les mêmes mutations. Cela va permettre d’approfondir notre connaissance des gènes impliqués dans la détermination du sexe mais aussi d’identifier les causes de certains des nombreux cas de troubles du développement sexuel qui n'ont pas encore trouvé d'explication à ce jour.
Bénéfices attendus
De nombreuses pathologies de la détermination du sexe restent incomprises en raison de notre méconnaissance des réseaux génétiques contrôlant ce processus, et les cliniciens restent souvent sans réponse quant au diagnostic et à la prise en charge de bébés atteints d’anomalies du développement sexuel. Ce travail permettra à terme d'avancer dans la compréhension de ces pathologies et de proposer des solutions thérapeutiques et un suivi appropriés des problèmes d'insuffisances hormonales, d'infertilité (devenue un problème majeur en santé publique) et des prédispositions aux cancers gonadiques des patients.
Procédures
Des femelles gestantes seront injectées une seule fois dans la cavité abdominale avec un produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire puis mises à mort 4 heures après l’injection pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Cela concerne 240 souris. Dans d’autres cas les femelles (54) seront d’abord soumises à l’administration d’un produit par gavage oral (pour inactiver des gènes spécifiquement dans les gonades embryonnaires) à deux reprises à 24 heures d’intervalle puis à l’injection du produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire avant d'être mises à mort 4 heures après l’injection pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Aussi bien l’injection que le gavage oral sont réalisées en 20 à 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le gavage oral nécessite une contention, qui peut induire un stress temporaire. Cette procédure est utilisée en routine au laboratoire, ce qui limite le temps de contention. Les injections par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, ...).
Devenir
Toutes les femelles gestantes traitées seront mises à mort afin de prélever les embryons aux stades embryonnaires précoces nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étiologie de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ou organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats reproductibles nous estimons que nous aurons besoin de 8 embryons par expérience et par génotype, ce qui correspond à trois réplicats pour l’histologie et cinq réplicats pour les analyses d’expression des gènes. En cas d’imprévus, nous anticipons de collecter 10 embryons par expérience et par génotype. Cependant dès que nous obtiendrons des résultats statistiquement significatifs, nous arrêterons nos expériences.
Raffinement
La qualité de la contention, l’usage d’un matériel autoclavable permet d’assurer une un gavage une injection intra-péritonéale efficaces et rapides, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel a été formé pour cela. Les solutions pour injection intra-péritonéale et pour gavage sont maintenues à la température corporelle de 37°C pour éviter tout inconfort de la femelle. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Tout comportement anormal indiquant une souffrance constitue un point limite et entrainera la mise à mort immédiate. Les animaux seront hébergés par deux ou par trois dans des cages comportant différents types d’enrichissement comme des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier ces modèles d’ablation/gain-de fonction conditionnelle inductible dans la souris. Ces modéles n’existent que chez la souris. Les femelles gestantes en procédure seront mises à mort à différents moments de la gestation : 10.5 jpc (jours post conception) (début de la différenciation gonadique), 11.5 jpc (détermination du sexe gonadique et début de la différenciation des cellules testiculaires), 12.5 jpc (début de la morphogenèse testiculaire et différenciation des cellules ovariennes), 13.5 jpc (initiation de la méiose chez la femelle). C’est seulement dans les lignées conditionnelles inductibles que nous étudierons la prolifération des cellules germinales à 13.5 jpc (1 stade de plus que dans les autres lignées).
Evaluation de probiotiques pour contribuer à l’établissement approprié du microbiote précoce chez le nouveau-né 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
539 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Colonisées avec des fèces humaines puis réparties entre régimes riches et pauvres en fibres, elles subissent des gavages répétés et des prélèvements de fèces sur quatre générations, pour tester une souche probiotique. Le porteur les fait tuer parce que leur microbiote fortement modifié les rend inéligibles à d'autres essais. Il affirme que le transfert multigénérationnel du microbiote ne peut pas être simulé in vitro.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la capacité d’une bactérie à améliorer la récupération du microbiote intestinal altéré par un régime pauvre en fibres sur plusieurs générations. La colonisation microbienne du nouveau-né joue un rôle fondamental en santé humaine car elle est un facteur clé dans la mise en place des systèmes digestif, métabolique et immunitaire. Lorsque ce processus est perturbé, il peut y avoir une prédisposition à développer des maladies dites ‘non transmissibles’ telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), les allergies et l'obésité plus tard dans la vie. Cette colonisation est fortement influencée par la transmission du microbiote mère-nouveau-né. Les modifications du microbiote accumulées au cours de la vie d'une mère peuvent être transmises à sa progéniture. Une étude récente a montré que des souris ayant reçu un régime pauvre en carbohydrates accessibles au microbiote (microbial accessible carbohydrates, MAC, c’est-à-dire des fibres), une caractéristique des régimes occidentaux, affiche une capacité réduite à transférer les bactéries digérant les MAC d'une génération à l'autre. Ceci entraine un appauvrissement du microbiote intestinal, qui peut alors présenter une fonctionnalité dégradée. Au cours des premières générations, la réintroduction de MAC alimentaires peut restaurer le microbiote ; en revanche, après quatre générations, une telle récupération n'est possible que si ces bactéries manquantes au sein du microbiote sont introduites aux côtés des MAC. Ce projet propose de tester une souche probiotique candidate, isolée de fèces de bébé sain afin d’évaluer sa capacité à limiter ou restaurer l’appauvrissement du microbiote. Pour cela, nous allons coloniser des souris libres de germes en délivrant une solution de fèces humaines provenant de donneurs adultes sains. Les souris seront séparées en 3 groupes : régime riche en fibres, un régime pauvre en fibres et régime pauvre en fibres mais avec un traitement probiotique. Des souris vont être utilisées pour obtenir des portées de souriceaux sevrés sous les régimes respectifs de leurs parents. Cette stratégie d’élevage sera répétée pendant quatre générations. Dans une deuxième partie de projet, le probiotique candidat sera administré à la quatrième génération de souris (ayant consommé un régime pauvre en fibres afin d’évaluer sa capacité à restaurer les bactéries perdues lorsqu’il est réintroduit avec des MAC.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’évaluer la capacité d’une potentielle souche probiotique à améliorer la résilience du microbiote intestinal altéré par un régime pauvre en fibres sur plusieurs générations, lorsqu’elle est réintroduite en même temps que les MAC. De manière plus générale ce projet nous permettra d’apporter de nouvelles connaissances concernant le processus d’acquisition du microbiote intestinal et sa transmission à travers les générations.
Procédures
Gavages (- de 5 minutes par administration sur animal vigile): - 3 au total par souris sur 5 jours : 92 souris. - 1 jour sur deux pendant 3 semaines (11 au total) : 110 souris - 1 jour sur deux (3 au total) : 22 souris Prélèvement de fèces (environ 5 minutes par prélèvements, sur animal vigile) : - 2 fois par semaine : 4 prélèvements (92 souris) - 1 fois par semaine : 15 prélèvements (92 souris) 16 prélèvements (100 souris) 16 prélèvements (123 souris) 23 prélèvements (66 souris)
Impact sur les animaux
Les administrations intragastriques génèrent une douleur légère brève, pendant quelques secondes. Le transport d’une animalerie à l’autre peut générer un peu de stress pendant le transport (quelques minutes entre les animaleries) et après celui-ci, le temps que les animaux s’acclimatent. Les prélèvements de fèces peuvent causer aussi un peu de stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car, ayant subi d’importantes modifications du microbiote, ils sont inéligibles pour être inclus dans d’autres essais
Remplacement
Notre projet porte sur la primo colonisation et le transfert multigénérationnel du microbiote intestinal, ceci met en jeu des interactions complexes qui ne peuvent pas être simulées in vitro.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. En se basant sur notre paramètre principal, l’alpha-diversité du microbiote, nous voulons mettre en évidence une différence du même ordre de grandeur que celle de l’écart-type. Dans ce cas, les tables pour comparer deux groupes de moyennes pour une variable continue (Snedecor et Cochran 1989) indiquent un besoin de 22 animaux par groupe.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés quotidiennement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger. Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre se fait sur un temps de quelques minutes (500m à parcourir). Les animaux seront placés dans des containers opaques contenant un peu de leur litière d’origine et leur nid pendant ce transport afin de limiter le stress occasionné. Les containers sont généralement portés, ce qui génère peu de vibrations. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Le besoin de travailler en environnement axénique (complètement stérile), principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent des facteurs imposant le choix de cette espèce animale. La lignée de souris utilisée a été sélectionné car elle a de fortes performances de reproduction et a une bonne taille de portée (6.4 nouveaux nés en moyenne). Les animaux libres de germes seront utilisés entre 5-7 semaines quand il s’agit de reproduire les souris àun âge optimal après les changements successifs de régime alimentaire . Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte, durant la gestation, le sevrage et l’allaitement quand il s’agit de l’élevage.
Facteurs de non-réponse aux antibiotiques dans un modèle murin de prostatite (infection urinaire masculine)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
3 984 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une sonde introduite dans l'orifice urinaire sous anesthésie, puis reçoivent des injections répétées d'antibiotiques avant d'être tuées pour prélever vessie et prostate. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe extérieur d'infection ni de douleur, tout en reconnaissant un stress lié aux administrations répétées. Il présente l'étude des organes comme "impossible sans modèle animal" et oppose l'"organisme entier" aux analyses en tube à essai jugées "trop simplistes".
Objectifs
Les infections urinaires masculines (IUM) sont fréquentes et difficiles à traiter. Elles sont différentes des infections urinaires survenant chez la femme car chez l’homme, en plus de l’infection des urines et de la vessie il y a également une infection de la prostate. Malgré le traitement par antibiotique, les prostatites (infection de la prostate) récidivent très fréquemment, dans 20% des cas. Il a été montré que dans la grande majorité des cas, ces récidives sont dues à des bactéries qui n’ont pas été tuées par l’antibiotique et qui persistent donc dans la prostate. Ces rechutes vont être à l’origine d’une altération de la qualité de vie des patients et de la prescription de nouveaux antibiotiques qui peuvent provoquer des effets indésirables et sélectionner des bactéries résistantes au traitement antibiotique, rendant ainsi les infections plus difficiles à traiter. Il est donc urgent de comprendre pourquoi ces bactéries persistent dans la prostate, pour en améliorer le traitement. Pour cela, l’étude directe de la prostate est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans la prostate) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire de souris provoquant une infection de la prostate.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’améliorer le traitement des infections urinaires masculines pour éviter les rechutes.
Procédures
Tous les animaux sont infectés sous anesthésie générale. Les produits anesthésiants sont injectés dans le ventre de la souris à l’aide d’une petite aiguille. Les bactéries sont injectées à l’aide d’une petite sonde rentrée dans l’orifice urinaire. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 4 à 12 heures) ainsi que la durée du traitement (24 heures à 5 jours) dépendent de l’antibiotique utilisé. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée. -L’animal est mis à mort par surdosage en médicament anesthésiant administré sur animal vigile par une piqûre dans le ventre. -La vessie et la prostate sont ensuite prélevés stérilement après la mort de l’animal. -La durée de l'infection est variable de 48 heures à 21 jours.
Impact sur les animaux
Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans ce modèle. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotiques pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, prostate ) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.
Remplacement
L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire masculine (prostate et vessie) en dehors des urines reste très limitée chez l’homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les prostates et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.
Réduction
Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Nous étudierons des souris adultes de 8 à 12 semaines et uniquement de sexe masculin car la prostatite ne survient que chez les hommes adultes.
Rôle de CD44 dans l’absorption du fer par les cellules érythroïdes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Selon les groupes, elles subissent des saignées, des injections lysant les globules rouges, une amputation du bout de la queue rouverte plusieurs semaines, une inflammation induite par le LPS ou un cancer du foie provoqué par injections répétées, et des femelles gestantes sont tuées pour prélever les embryons. Le porteur qualifie la procédure d'hépatocarcinome de plus lourde et euthanasie les animaux dégradés selon des points limites. Il cherche à établir le rôle d'un récepteur dans l'absorption du fer et juge les modèles de souris "incontournables".
Objectifs
Les globules rouges ont un important besoin en fer afin d’assurer leur fonction de transport d’oxygène aux organes. Ils utilisent le récepteur à la Transferrine (TfR1) pour acquérir le fer depuis la circulation sanguine. Plusieurs études ont déjà suggéré que les globules rouges utilisaient potentiellement un autre système pour l’absorption du fer, indépendamment de TfR1. Notamment, une étude récente a démontré pour la première fois que le récepteur à l'acide hyaluronique CD44 permettait l’absorption du fer par les cellules cancéreuses. Nous avons alors réalisé des expériences préliminaires in vitro qui suggèrent un mécanisme similaire dans les cellules érythroïdes (c’est-à-dire, les globules rouges et leurs précurseurs), dans lesquelles CD44 est très fortement exprimé. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle de CD44 dans l’absorption du fer par les globules rouges in vivo, en conditions physiologiques, et en conditions pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois le récepteur CD44 comme transporteur de fer dans les cellules érythroïdes, et ainsi permettre une découverte majeure dans la compréhension du métabolisme du fer. De plus, démontrer que CD44 permet le transport du fer dans les cellules érythroïdes en conditions pathologiques permettrait de l’utiliser comme cible thérapeutique pour les pathologies de surcharge en fer et d’érythropoïèse inefficace qui touchent des dizaines de milliers de personnes dans le monde. Enfin, il est estimé que près d’un million de personnes seront atteintes d’un cancer du foie en 2025, et étant donné l'importance de CD44 dans l'absorption du fer dans les cellules cancéreuses, ce dernier pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique intéressante.
Procédures
ANEMIE : Afin de mimer les conditions d'anémie, nous utiliserons deux méthodes disctinctes. Un groupe d'animaux aura un prélèvement sanguin de 500µl. Ce prélèvement ne sera réalisé qu’une seule fois et les souris seront euthanasiées 0 - 24h - 48h - 72h - 96h après. Un autre groupe d'animaux recevra deux injections d'un produit permettant la lyse des globules rouges. Les animaux seront sacrifiés 1 jour à 1 semaine après la deuxième injection. GLOBULES ROUGES : Pour mesurer la durée de vie des globules rouges, nous réaliserons une injection intraveineuse d'un marqueur fluorescent permettant de marquer les globules rouges. Afin de suivre l'évolution de la fluorescence, nous récupérerons quelques gouttes de sang au niveau de la queue le lendemain de l’injection du produit suite à une petite amputation (0.1mm). Ensuite, la plaie sera gratée 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines et 1 mois après pour récupérer du sang. INFLAMMATION : Pour induire une inflammation aigue et passagère nous injecterons du LPS (produit dérivé bactérien). Les souris seront mises à mort 0 - 1h - 6h - 12h - 24h - 48h - 1 semaine après. HEPATOCARCINOME : Pour induire un cancer hépatique chez les souris, nous injecterons une fois par semaine un facteur pro-fibrotique pendant 6, 12, 18 ou 24 semaines selon les groupes de souris. Les souris sont euthanasiées à la fin des injections. ETUDE DES EMBRYONS : Accouplement des souris, puis euthanasie des femelles gestantes au jour embryonaire E14.5 afin d'étudier l'anémie des embryons.
Impact sur les animaux
Tout d'abord, pour limiter le stress induit par les manipulations chez les animaux, nous allons pour chacun d'entre eux, réaliser des habituations aux expérimentateurs pendant une souris (prise en main des souris, habituation à la voix et à l'odeur...). Les effets indésirables de son projet seront légers et modérés. Tout d'abord, le prélèvement sanguin va induire une légère anémie passagère chez les souris, ainsi qu'une faible douleur due au prélèvement jugulaire. L'injection du produit lysant les globules rouges va entrainer la perte d'une partie de ces cellules, mais les animaux récupèrent la quantité normale de globules rouges 1 semaine après l'injection. Il est nécessaire de placer les souris dans des boîtes de contention pour réaliser l'injection intraveineuse, ce qui entraine un stress chez les animaux. L'induction de l'inflammation systémique, atteint son pic entre 4h et 8h après l’injection, mais est rapidement résolue, avec un retour à la normale 48h après injection. La procédure d'étude de l'hépatocarcinome est la plus lourde, puisqu’elle entraine le développement d’un cancer du foie. L’état général des souris sera évalué quotidiennement et les animaux souffrants seront euthanasiés (prostration, poils ébouriffés, perte de poil…).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures, pour effectuer des prélèvement d'organes. Pour étudier le métabolisme du fer, il est nécessaire de récupérer le sang, pour réaliser des analyses des paramètres hématologiques ; ainsi que plusieurs organes impliqués dans l'homéostasie du fer (foie, rate, duodénum, moelle osseuse, rein). Ils seront récupérés pour analyse ultérieure en laboratoire : expression génique, protéique, histologie, par exemple.
Remplacement
Notre équipe a déjà pu établir que le transporteur CD44 permettait l'absorption du fer dans des cellules érythroïdes en culture. Les modèles in vitro ne permettent cependant pas de reproduire la complexité des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer. Les modèles de souris sont donc incontournables pour étudier précisément les mécanismes mis en place in vivo.
Réduction
L’expérience de la porteuse du projet dans les procédures que nous allons mettre en place nous permet d’optimiser le nombre d’animaux à analyser pour chacune de nos questions de recherche et le nombre de souris sera calculé a minima en tenant compte de la variance biologique des résultats. D'après l'anayse de la variance ANOVA univariée, suivie d'une analyse d'une comparaison multiple de Sidak, nous devrions utiliser 15 souris par lots afin d'obtenir une significativité statistique. De plus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous allons prélever un maximum d’organes qui seront stockés à -80°C afin de pouvoir être réutilisés sans avoir à répéter les expériences in vivo. Nous sommes dans l'obligation d'utiliser des souris contrôle pour chacun de nos élevages car les fonds génétiques sont différents.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure, des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale qui permet de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines, et notamment c'est l'espèce qui reproduit le mieux le métabolisme du fer humain. De plus, cette espèce présente de nombreux intérêts pratiques qui justifient son utilisation comme modèle dans nos projets de recherche, notamment, de faibles coûts, un cycle reproductif court, une croissance rapide, une facilité de transport, une facilité de manipulation, et enfin une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Enfin, notre projet de recherche est basée sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées et aucune autre espèce animale n'est disponible. Nous utiliserons des souris adulte, âgées de 8 à 32 semaines selon les procédures. Nous étudierons également le développement embryonnaire.
Génération d’hybridomes à partir de lymphocytes de souris immunisées pour des applications de recherche, de détection et de diagnostic.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes et des prises de sang, et une partie une injection de cellules d'hybridome déclenchant un épanchement liquidien abdominal prélevé après mise à mort. Le porteur décrit une douleur abdominale de plusieurs jours liée à cette ascite, avec un poids pouvant atteindre 150 % du poids initial avant euthanasie. Il indique privilégier la production in vitro et ne recourir à l'ascite que pour les hybridomes "réfractaires", jugeant l'immunisation des souris "indispensable".
Objectifs
Le projet vise à la génération et à la production d’anticorps monoclonaux de souris dirigés contre différentes cibles notamment des antigènes de microorganismes pathogènes ou de toxines. Ces anticorps servent développer des tests de détection des cibles et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines responsables de maladies infectieuses et d’intérêt dans le domaine de la maitrise et la détection des risques biologiques. Ce type de tests est particulièrement adapté à un suivi de l’émergence ou de la ré-émergence de certaines maladies infectieuses (ex : Ebola, ZIKA, Covid-19, Variole du singe, etc.). Les anticorps monoclonaux sont utilisés depuis plusieurs décennies dans ce type d’application et de nouveaux tests rapides de diagnostic et de détection doivent régulièrement être mis au point pour suivre les émergences des maladies infectieuses, de différentes pathologies, pour la bio sécurité et la bio sureté. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique. Pratiquement, cette génération d’anticorps se fait en deux étapes : -D’abord une étape d’immunisation d’un animal avec un antigène pour recueillir ses lymphocytes immuno-stimulés par l’antigène; -Ensuite ces lymphocytes sont immortalisés in vitro par fusion cellulaire pour obtenir des cellules appelées « hybridomes » capables de produire un seul anticorps (anticorps monoclonal). Une étape de production massique des anticorps est ensuite réalisée in vitro, en cultivant les lignées d’hybridomes dans des bioréacteurs. Néanmoins, il peut arriver, dans de rares cas, que la culture de certains hybridomes ne soit pas réalisable de la sorte. Le recours à un animal est alors nécessaire, avec injection de cellules d’hybridome dans l’abdomen de souris qui entraine en quelques joursun épanchement liquide dans l’abdomen. Ce liquide est appelé « liquide d’ascite » et contient les anticorps qui nous intéressent..
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des autorités de santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes avec une seringue pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois. Les animaux seront soumis à 3 ou 4 prises de sang (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois. Certains animaux seront soumis à une injection d’une substance immunostimulante et de cellules hybridomes (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) déclenchant la formation d’un liquide abdominal dont le prélèvement est réalisé après euthanasie des animaux. Les animaux pourront également être identifié par pose d’une puce electroniqueélectronique (durée totale 30 secondes) Certains animaux pourront aussi être irradiés à faible dose pendant 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévisibles sont : -douleur au point d’injection induite par l’injection de substances (non pathogènes) destinées à immuniser les animaux contre un antigène. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. -Douleur abdominale induite par l’injection d’une substance induisant l’apparition d’un liquide d’ascite abdominal. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée est de l’ordre de quelques heures. -Douleur induite par l’accumulation d’un liquide d’ascite intra abdominal. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques jours (5 à 6 jours). -Douleur au point d’injection (veine caudale) ou de prélèvement (sous mandibullaire). -Douleur lors de la pose de la puce électronique. -Stress de la contention avant décapitation. -Possible anorexie post irradiation
Devenir
Tous les animaux inclus dans une procédure sont euthanasiés en accord avec les protocoles scientifiques publiés pour la génération et la production d’hybridomes et d’anticorps monoclonaux de souris.
Remplacement
Le développement d’hybridomes à des fins diagnostiques ou de détection nécessite d’atteindre un niveau d’immunisation très élevé. Les méthodes d’immunisation in vitro avec des lymphocytes naïfs ne permettent pas, en l’état actuel des connaissances, d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes. Le recours à .l’immunisation d’animaux afin d’obtenir les lymphocytes immuno-stimulés par l’antigène est nécessaire Que ce soit pour l’étape de production de petites quantités d’anticorps pour leur sélection ou de production massique d’anticorps, nous recourons systématiquement en première intention à des méthodes in vitro de cellules en culture. Les autres technologies in vitro (utilisation de phages par exemple) ne permettent par la génération d’anticorps de qualité suffisante pour leur emploi final dans des tests diagnostiques répondant au niveau d’exigence attendu par les autorités de santé. Uniquement dans les cas où l’hybridome d’intérêt sera «réfractaire » à la production in vitro, nous serons amenés à recourir à l’induction d’ascite chez l’animal. Dans une vision moyen terme, le laboratoire souhaite débuter des études visant à mettre au point des organoïdes en culture permettant la maturation de lymphocytes, avec l’objectif dans plusieurs années, de pouvoir obtenir des réponses immunitaires in vitro de haute affinité. Dans l’immédiat l’immunisation des souris reste indispensable.
Réduction
La production par induction d’ascite est remplacée à partir de cette saisine par la production in vitro par culture de cellules. Néanmoins, compte tenu de l’absence de recul suffisant, nous estimons qu’une quinzaine de pourcent des hybridomes générés n’auront pas de capacité de prolifération suffisante pour être produit in vitro. Ces hybridomes « réfractaires » seront produits par induction d’ascite sur un nombre minimal de souris. Huit projets maximum sont planifiés sur 2 ans, représentant un total possible de 160 hybridomes. Le besoin est donc à ce niveau estimé à 64 souris maximum sur les 2 ans du projet. Un nombre de 50 souris maximum doit également être prévu sur les 2 ans pour éventuellement produire un lot d’anticorps dans le cadre d’une urgence sanitaire. Ces prévisions représentent une diminution du nombre d’animaux utilisés annuellement pour l’induction massique de 93% par rapport à notre précédente projet.
Raffinement
Les prise de sang seront réalisées après anesthésie des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe avec cycle diurne-nocturne de 12 heures. L’eau et la nourriture seront fournies à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel sous la supervision permanente du responsable du bien-être animal.. Les mesures spécifiques prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales seront : -Une analgésie continue dans l’eau de boisson. -Une injection sous-cutanée d’un antidouleur réalisée aussi souvent que de besoin. -Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane 3% avant chaque prélèvement sanguin ou ponction du liquide d’ascite. Pour la production d’anticorps par induction d’ascite, les animaux sont surveillés quotidiennement et de façon renforcée à partir du 7ème jour post-injection des hybridomes. Les souris sont pesées au moment de l’injection des hybridomes puis quotidiennement (week-end compris) à partir du 7ème jour post injection, la prise de poids résultant de l’accumulation du liquide d’ascite dans l’abdomen ne doit pas dépasser 150% du poids initial de l’animal (selon la recommandation du CNREEA du 28 juin 2017). Si lors de la surveillance, apparaissait un signe pouvant traduire un stress ou une souffrance de l’animal, une observation plus poussée sera alors pratiquée, à l’aide d’une « grille de scoring ». Si l’examen conclut à la souffrance de l’animal alors celui-ci sera euthanasié sans délai.
Choix des espèces
Les souris sont un choix obligatoire car l’immortalisation des lymphocytes issus des souris immunisées se fait par fusion cellulaire avec les cellules de myélome de souris (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules). Il n’est techniquement pas possible de réussir cette étape si les lymphocytes et le myélome ne sont pas issus de la même espèce (souris en l’occurrence). Différentes souches de souris pourront être utilisées en fonction des antigènes injectés car elles peuvent avoir un répertoire immunologique différent qui peut modifier le niveau de réponse immunitaire. Ces choix seront faits selon les données bibliographiques et l’expérience passée du laboratoire. Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires. Jeunes adultes (6 à 8 semaines). Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
3 613 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère, la plupart tuées à l'issue. Le modèle exprime une protéine humaine qui s'accumule dans le système nerveux et provoque une paralysie progressive, dont le porteur bloque l'apparition par antibiotique pendant l'élevage puis la laisse se développer pour tester des candidats médicaments. Les souris malades présentent perte de poids, atrophie musculaire et déficits moteurs, suivies par un score clinique jusqu'à leur mise à mort, les reproducteurs étant conservés pour la lignée. Le porteur qualifie le "besoin médical" d'"immense" et juge le modèle animal "indispensable et non substituable".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative neuromusculaire à évolution rapide qui conduit au décès des patients dans les 3 à 5 ans qui suivent le diagnostic. Elle se caractérise par une disparition progressive et irréversible des neurones moteurs (les cellules qui commandent les muscles), provoquant une perte progressive des capacités vitales par paralysie des muscles: locomotion, alimentation, respiration,… Bien que les recherches, réalisées ces dernières années, aient permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes mis en jeu au cours de l’évolution de la maladie, les origines de la maladie restent inconnues dans la plupart des cas. Il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Seuls deux composés (qui ralentissent modestement la progression de la maladie dans certains cas) ont été approuvés. Le besoin médical est donc immense et totalement insatisfait. Le modèle murin choisi dans ce projet exprime très fortement une protéine humaine qui va s’accumuler dans le système nerveux central et la moelle épinière. Cette accumulation va entraîner la mort des cellules nerveuses. Ce modèle reproduit la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA à travers ses caractéristiques moléculaires - L’accumulation toxique de protéines dans les cellules nerveuses du cerveau et de la moelle épinière, est très représentatif des formes cliniques de SLA (plus de 90% des cas de SLA). - Les signes cliniques sont engendrés par la mort progressive des cellules nerveuses, induite par l’accumulation de protéine, et qui conduit un déficit moteur puis une paralysie musculaire.
Bénéfices attendus
A ce jour il n’existe aucun traitement curatif de la SLA. En parallèle de la prise en charge multidisciplinaire des patients pour diminuer et soulager les symptômes, il existe que deux molécules approuvées qui permettent, au mieux, de ralentir modestement la progression de la maladie. La SLA est une maladie multifactorielle et complexe, dont la plupart des mécanismes sont encore très mal connues. Ce projet permettra : - de mieux comprendre la physiopathologie de la SLA - de développer de nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la SLA. - La mise en perspective des signes cliniques et des analyses moléculaires effectuées sur les prélèvements de sang permettra de comprendre les mécanismes complexes conduisant à la maladie.
Procédures
Durant l’élevage, tous les souriceaux seront identifiés avec un microtatouage au niveau des doigts puis analysés par génotypage via un prélèvement d’un petit bout de queue. Durant cette phase, aucun animal n’aura de signe clinique, ils seront tous en parfaite santé. Aucun autre prélèvement ne sera réalisé sur ces animaux. Pour l’évaluation des médicaments, les animaux présenteront les signes de la SLA (déficit moteur progressif) et par conséquent seront suivis de manière étroite et rigoureuse afin d’évaluer de manière objective mais non invasive l’évolution de la maladie : - Observation quotidienne des signes cliniques - Evaluation des capacités motrices hebdomadaires (force et endurance musculaire) Les candidats médicaments seront administrés soit par voie oral soit par voie intraveineuse en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques qui seront déterminées. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. A l’issu de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Durant l’élevage, aucun animal ne développe de signes cliniques dommageables. En effet, le développement des signes cliniques est bloqué par un traitement antibiotique. Tous les animaux seront donc en parfaite santé. Durant la phase de test, les animaux présentent la quasi-totalité des signes cliniques de la SLA après l’arrêt de l’antibiotique : - Perte de poids progressive des animaux - Mort progressive des cellules nerveuses et perte des liaisons nerveuses avec les muscles qui se traduit par des déficiences motrices (tremblements, perte de la coordination des mouvements, pattes postérieurs qui se recroquevillent), une perte de poids et une atrophie musculaire. La toxicité et la tolérance des candidats médicaments seront préalablement déterminées dans des études de tolérance et de pharmacologie. Dans ce projet, aucun effet indésirable n’est donc attendu. Lorsque le produit est administré par voie oral, aucune nuisance n’est attendue. Lorsque le produit est administré par voie intraveineuse, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. Au cours de la procédure des prélèvements de faibles volumes de sang (quelques gouttes) seront réalisés au niveau de la veine à l’aide de capillaire, la nuisance est uniquement liée à la piqûre. A la fin de la procédure, les animaux recevront une anesthésie profonde durant laquelle un dernier échantillon de sang sera réalisé. La nuisance est uniquement liée à la piqûre lors d’injection de l’anesthésie par voie intrapéritonéale.
Devenir
A l'issue de la phase d’élevage : - Certains animaux seront utilisés comme reproducteurs pour maintenir la lignée. Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Certains animaux ne pouvant pas développer la maladie à cause de leur patrimoine génétique seront utilisé dans le groupe contrôle pour les tests d’efficacité (195 animaux). Les animaux surnuméraires seront euthanasiés. - Les animaux développant les signes cliniques de la SLA seront utilisés pour les tests d’efficacité. A l'issue des tests d’efficacité, tous les animaux seront euthanasiés. Ils ne peuvent pas être réutilisés à cause de leur phénotype et l’issue fatale de la maladie.
Remplacement
Les candidats médicaments testés feront l’objet d’une sélection minutieuse avant leur utilisation. Les substances sont préalablement testées, caractérisées et auront fait la preuve de leur efficacité in vitro, avant d’être utilisé sur des animaux. Cependant, aucune étude vitro ou ex-vivo ne peut permettre de faire un lien entre les mutations génétiques, les mécanismes moléculaires et les signes cliniques. La SLA est une maladie multifactorielle complexe. Elle ne peut donc en aucun cas être réduite à une simple mutation ou à un simple mécanisme, le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour : •Etudier, analyser les paramètres physiologiques tels que la réponse immunitaire, le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’évolution des biomarqueurs au cours de la maladie ou la correspondance avec les signes cliniques observés. •Valider l’effet thérapeutique sur le phénotype et en confirmer le mécanisme d’action chez l’animal vivant. •Mettre en perspective les effets moléculaires avec les signes cliniques observés et ainsi, comprendre les mécanismes conduisant à la maladie.
Réduction
La phase d’élevage va permettre la génération de souris qui développeront la SLA nécessaire à l’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux utilisé sera déterminé mathématiquement pour n’utiliser que le strict minimum d’animaux nécessaire mais néanmoins suffisant pour des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. D’après les calculs, le nombre d’animaux à utiliser est de 13 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux est inférieur aux effectifs communément utilisés (± 15 animaux par groupe) dans le cadre des recherches académiques ou dans les ou dans les laboratoires de recherche privés. Pour l’élevage, nous utiliserons la méthode proposée par les éleveurs agréés dans le but de déterminer de manière précise le nombre minimal nécessaire et suffisant de souris reproductrices à la conduite du projet et à la préservation de la lignée.
Raffinement
Pour l’élevage, les animaux seront hébergés en trio de reproducteurs. Dans cette procédure, aucun animal ne développe aucun signe dommageable car l’expression des signes cliniques est bloquée par un traitement antibiotique administré dans l’eau de boisson. Durant la phase de test d’efficacité, les animaux seront observés quotidiennement. Les observations cliniques seront évaluées selon un scoring strict et validé par un grand nombre de laboratoire. Afin de renforcer le suivi des signes cliniques, nous allons donc utiliser plusieurs méthodes de mesures indépendantes : - Score basé sur l’observation clinique - Poids qui reflète l’évolution de la maladie - Evaluation de la force musculaire qui permettra de détecter les signes de faiblesse musculaire et de paralysie - Evaluation de la coordination des membres et des performances motrices Ces mesures permettent de garantir une évaluation précise de l’évolution de la maladie. Le croisement des informations facilitera les analyses et d’étayer les conclusions par plusieurs variables. Cette analyse associée à la parfaite connaissance du modèle, permettra de prévenir de manière plus précoce l’apparition du phénotype dommageable. De plus, une attention particulière sera prêtée à l’environnement local, étant donné que les animaux ayant contracté la SLA présenteront des déficits moteurs significatifs. Les cages comporteront un sol en dur, une litière de sciure, des refuges et des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger. Des croquettes mouillées disposées sur le fond de la cage ainsi qu’une supplémentation en nourriture enrichie humide (complément alimentaire gélifié) sera apportée aux animaux pour faciliter la nutrition et l’hydratation.
Choix des espèces
Pour les maladies neurodégénératives, les signes cliniques dépendent essentiellement de la localisation des lésions (cerveau, moelle, …) et l’efficacité d’un médicament dépend de sa capacité à atteindre les lésions. Le modèle animal est donc indispensable et non substituable pour évaluer l’efficacité d’un médicament notamment : -la capacité à accéder à la zone d’intérêt (comme franchir la barrière hémato-encéphalique pour accéder au cerveau) - son action au niveau moléculaire et son impact sur les signes cliniques observés. Le modèle animal de souris a été choisi à cause de ses similitudes avec la pathologie humaine : - Au niveau moléculaire : l’accumulation « toxique » d’une protéine humaine dans les neurones du cerveau et de la moelle qui représente, en clinique, 90% des cas de SLA - Signes cliniques: mort des cellules nerveuses de la moelle épinière et perte de la connexion musculaire qui a pour conséquence un déficit moteur progressif menant à la paralysie totale des muscles. Pour l’élevage, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’être en capacité de se reproduire. Pour les tests d’efficacité, nous cherchons à nous rapprocher au plus près du contexte physiopathologique de la maladie qui touche des adultes afin de pouvoir transposer nos résultats à l’Homme. Les animaux des 2 sexes seront utilisés. En effet, d’après les études ayant permis le développement du modèle, les mâles et les femelles développent des signes cliniques comparables, ils peuvent donc tout deux être inclus dans des analyses groupées.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Elles subissent des ponctions du genou provoquant des saignements articulaires répétés, des injections, une IRM de deux heures et des prises de sang, avant dissection des pattes arrière. Le porteur décrit comme seule nuisance une gêne locomotrice et applique un point limite de perte de poids de 20 %. Il vise à étudier le rôle d'une protéine dans la destruction articulaire et justifie le recours à l'animal par le "besoin d'un modèle vivant, dynamique et doté d'un système vasculaire et locomoteur".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car des prélèvements terminaux pour analyses histologiques et immunohistochimies sont prévus.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Encapsulation de principes actifs pour l’administration locale et la libération prolongée pour les traitements des cancers en intratumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis l'implantation de microcapsules chargées d'un anticancéreux et jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour tester une libération locale prolongée du médicament. Le porteur décrit une gêne modérée liée à la croissance tumorale et une toxicité possible des principes actifs, avec des amaigrissements. Il annonce au conditionnel des bénéfices pour les patients et affirme qu'aucune méthode substitutive ne reproduit le corps entier, jugeant l'usage d'animaux vivants "indispensable".
Objectifs
La plupart des agents anticancéreux sont administrés en intraveineuse : l'agent anticancéreux empreinte donc la circulation sanguine pour atteindre sa cible. Ce mode d’administration est limité entre autres par sa toxicité pour les tissus sains, ces derniers recevant également du sang contenant l'agent anticancéreux injecté. Une solution pour améliorer la réponse des patients et limiter les effets secondaires délétères est d’administrer l'agent anticancéreux localement dans les zones à traiter (dans ou proche de la tumeur). On peut ainsi contrôler précisément les tissus en contact avec l'agent anticancéreux. Notre objectif est de faire la preuve de concept d'une technologie s'inscrivant dans cette approche. Il s'agit de microcapsules remplies d’une substance active d'intérêt, et qui comprennent une ouverture permettant une libération locale prolongée et controlée au niveau de la tumeur. Ces microcapsules seront implantées dans les tissus entourant la tumeur et/ou à l'intérieur de celle-ci. Nous émettons l'hypothése que cette technologie peut s'avérer supérieure à l'injection seule par voie intraveineuse, à la fois en termes d'efficacité antitumorale et de toxicité au niveau du reste de l'organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus chez le patient sont les suivants : - Diminuer les risques de toxicité systémique (cardiaque notamment) liés à une dose trop élévée, en détournant le médicament des organes non-cibles. - Les microcapsules ne demanderaient qu'une seule implantation, ce qui diminue la géne occasionnée par rapport à une chimiothérapie classique nécéssitant plusieurs rendez-vous. Dans le cas de tumeurs profondes, les microcapsules éviteraient également aux patients de devoir subir plusieurs interventions chirugicales potentiellement invasives. Les microcapsules présentent également plusieurs bénefices par rapport à l'administration intraveineuse ou locale : - Une absorption biopharmaceutique de la molécule d'intéret plus élevée. - Une plus grande stabilité biologique (la molécule est "protégée" à l'intérieur de la microcapsule). - Une spécificité et une précision plus élevées dirigées contre les cellules cancéreuses. - Une plus longue demi-vie, une amélioration de l'absorption des molécules cibles et une diminution des doses efficaces.
Procédures
Au démarrage de toutes les procédures, injection de microcapsules, une fois. L'implantation durera environ 15 min par animal. Des prélèvements de sang seront fait sur certains animaux sous anesthésie locale (maximum 3 prélèvements). Chaque prélèvements durera environ 5 min. Certains animaux seront aussi greffés avec des cellules tumorales sous anesthésie locale, une fois, durée 2 minutes.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures impliquent l’injection chez la souris de lignées tumorales ou de microcapsules en sous-cutanée, ainsi que de principes actifs en intraveineux ou intratumoral. L’injection des lignées tumorales va conduire à la croissance de tumeurs. Ces tumeurs peuvent induire une gène modérée. Il existe également une possibilité de toxicité systémique ou locale des principes actifs utilisés (chimiothérapie), avec des amaigrissements possibles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses et études sur leurs organes et tissus.
Remplacement
Le but de ce projet est de maximiser l'efficacité des microcapusles et des principes actifs en mi,nimisant toutes les formes de toxicité afin d'aboutir à une méthode thérapeutique utilisable chez l'homme plus efficace et moins toxique que les injections locales ou systémiques. Comme il n’est pas possible à ce jour de reproduire toutes les fonctions du corps entier par des méthodes substitutives, l’utilisation d'animaux vivants est indispensable.
Réduction
Nous ne mettrons pas en oeuvre pas les conditions qui ne se justifieraient pas suite aux résultats des premières expériences, ce qui pourra permettre de réduire le nombre de souris indispensables à la réalisation du programme expérimental. Dans toutes les expériences, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le logiciel G*Power a été utilisé pour déterminer combien d'animaux sont strictement nécessaires à la réussite statistique des expériences.Les résultats seont analysés par comparaison entre plusieurs groupes faite par une analyse de variance suivie d’un post-hoc test pour les comparaisons entre 2 groupes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement.
Raffinement
Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). Toutes les injections (sous-cutanées, microcapsules et cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Les souris seront suivies 4 à 5 fois par semaine afin de suivre différents signes de douleurs et d’inconfort (perte de poids, hypothermie, voussure du dos, pelage souillé). Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un point de colle chirugicale sera appliqué sur la cicatrice cutanée provoquée par le passage de la seringue contenant les microcapsules, afin d'aider à la cicatrisation et de minimiser la gêne pour l'animal.
Choix des espèces
Le modèle murin (souris), avec son génome similaire au génome humain à 99%, constitue un modèle de référence pour les pathologies humaines. Le choix de cette espèce pour ce projet se base sur 2 arguments : - les principes actifs envisagés dans le projet ont tous été validés et testés dans la littérature sur des souris, nous permettant de minimiser les inconnues (efficacité, doses, toxicité etc), les risques et donc le nombre d'animaux utilisés. - les lignées cellulaires tumorales répondant aux principes actifs envisagés ont été développées dans cette espèce. Les animaux commandés seront des adultes de 5 à 6 semaines, ce qui correspond à des animaux à un stade de développement mature. Cet âge est celui qui est traditionnellement utilisé dans la littérature sur ce type de principes actifs/tumeurs. Ces animaux seront acclimatés durant une semaine avant d'être inclus dans le protocole.
Approche thérapeutique de la néphropathie induite par la Vancomycine chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de vancomycine déclenchant une insuffisance rénale aiguë, des prélèvements d'urine par pression abdominale, et pour une partie une incision dorsale pour microscopie in vivo. Le porteur indique que l'atteinte rénale peut provoquer une perte de poids et une déshydratation, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il cherche à comprendre puis à prévenir cette toxicité et affirme que l'étude de la fonction rénale rend l'usage de la souris "indispensable".
Objectifs
L’insuffisance rénale aiguë médicamenteuse est une cause fréquente de morbi-mortalité et d’hospitalisations. La vancomycine est un antibiotique largement utilisé dans la prise en charge des infections bactériennes à germes multirésistants. Malgré le développement de formules purifiées, le risque de toxicité rénale reste élevé et se manifeste par une insuffisance rénale aiguë . Aucune approche thérapeutique de l'insuffisance rénale provoquée par la vancomycine n’a actuellement été mise au point. Le seul mécanisme généralement proposé était la toxicité directe de la vancomycine sur un type particulier de cellules rénales. Or l'action de la vancomycine sur le rein semble plus complexe . Il a été montré un nouveau mécanisme de toxicité médiée par l'accumulation de l’antibiotique et de protéines dans le rein. Un modèle animal de souris a permis de valider la formation après une injection rapide de vancomycine de dépôts dans les cellules rénales et de caractériser ce nouveau mécanisme de toxicité. Cependant, le rôle d'autres protéines dans l'accumulation de la vancomycine reste inconnu. Une meilleure compréhension mécanistique de cette toxicité rénale ainsi que la recherche de stratégies thérapeutiques innovantes visant à la prévenir ou la prendre en charge constitue un enjeu important. Le projet vise à répondre à ces questions en explorant plusieurs hypothèses : 1) Quel est le rôle des protéines dans l'accumulation rénale de vancomycine? 2) La modulation de l'entrée et de la sortie de vancomycine dans les cellules rénales peut elle modifier la toxicité de la vancomycine? 3) La modification de l'acidité urinaire peut elle diminuer l'accumulation de vancomycine et la toxicité rénale en conséquence?
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer une approche thérapeutique innovante actuellement inexistante dans la néphropathie induite par la vancomycine et avancer dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de cette néphropathie afin d'en réduire les conséquences. Même s’il est résolutif, un épisode d’insuffisance rénale aiguë sévère s’accompagne d’un surrisque d’évolution vers l’insuffisance rénale chronique et constitue un réel problème de santé publique. Une meilleure prise en charge de ces insuffisance rénale aiguë peut également réduire les coûts liés aux hospitalisations prolongées et le nombre de patients évoluant vers l’insuffisance rénale chronique qui est associée à une baisse de la qualité de vie et des coûts élevés de prise en charge. Enfin, ces nouvelles stratégies thérapeutiques obtenues grâce à nos résultats pourront être mises à l’épreuve ultérieurement lors d’études cliniques.
Procédures
1- Injections intra péritonéales de médicaments dilués dans du serum physiologique sur animal vigile : dans une procédure, maximum trois fois par jour pendant un maximum de 2 jours consécutifs plus une dernière injection pour l'anesthésie finale. Ce qui fait un total de 7 injections sur 3 jours. Dans les autres procédures, 3 injections sur 3 jours. l'injection est rapide(quelques secondes). 2- Un prélèvement d'urine par pression abdominale sur animal vigile pendant quelques secondes. Un prélèvement d'urine est prévu à J0 ou J1 et J3, ce qui fait deux prélèvements en tout. 3- Pour la microscopie in vivo (6 animaux par lot de 20) réalisée une seule fois, une incision dorsale est pratiquée après une analgésie et une anesthésie générale. Cette étape est réalisée sur un plateau thermostaté à 37 degrés. La préparation et l'observation durent 20 minutes environ 4- Prélèvement du sang sous anesthésie ( 30 secondes environ), sur un plateau thermostaté; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analsyes necéssaires.
Impact sur les animaux
Le stress généré par les injections intrapéritonéales (contention et douleur au site d'injection) . Stress lié aux traitements dans l'eau de boisson (néophobie du rongeur). L'incision cutanée (pour une partie des animaux) et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : - douleur provoquée par l'incision cutanée - altération de l'état général : perte de poids, déshydratation. - stress induit par des manipulations quotidiennes. Complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.
Remplacement
Une partie des expériences concernant la précipation de la vancomycine selon le pH a pu être effectuée in vitro mais pour étudier l'impact des différents traitements proposés sur la fonction rénale, l'utilisation de la souris est indispensable. Il est nécessaire de suivre le comportement de la vancomycine du compartiment sanguin au compartiment rénal qui est un système tissulaire complexe composé de plusieurs types cellulaires.
Réduction
Les expériences précédentes qui ont mis en évidence la précipitation de la vancomycine dans les cellules rénales ont permi d'évaluer l'hétérogénéité de certains paramètres étudiés. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence des différences entre les groupes et s'assurer de la reproductiblité des résultats d'une série à l'autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants chez des mâles. Puis nous confirmerons les résultats sur un troisième lot de 10 souris femelles. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des test statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie au moins une semaine avant le début de la procédure. L’animalerie est agréée par le ministère de l'agriculture. Elle dispose d’un système de ventilation et de traitement de l’air avec une hygrométrie et une température contrôlées quotidiennement. Hygrométrie 55 plus ou moins 10 pour cent et température 20-24 degrés. Cycle d’éclairage rongeurs 12heures par jour. Isolation phonique. Les animaux seront hébergés dans des cages en portoir ventilées (5 souris maximum par cage) avec un enrichissement par litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes tels que des morceaux de bois pour leur permettre de ronger, et des billes de cellulose pour les obliger à les déployer pour faire des nids. Une surveillance quotidienne du bien-être animal (pesée et comportement) sera réalisée par le personnel de l’animalerie et le porteur de projet. Le critère d'arrêt est la perte de poids de plus de 20 pour cent par rapport au poids initial (avant traitement). La durée du traitement par la vancomycine est très court et ne devrait pas engendrer une insuffisance rénale trop sévère et dommageable pour les souris. Pour assurer le bien être des animaux, les étapes les plus délicates que sont l'imagerie in vivo et l'euthanasie seront réalisées sous anesthésie générale avec une antalgie en plus pour l'incision dorsale nécéssaire à l'observation au microscope.
Choix des espèces
Ce modèle animal de souris déja utilisé a permis de valider antérieurement la formation de dépots dans les cellules rénales après un bolus de vancomycine et de caractériser le phénomène obstructif conduisant à l'insuffisance rénale. Afin d'assurer la reproductibilité des résultats, il apparait préférable de poursuivre la recherche sur ce même modèle de souris. Un modèle in vitro ne permet pas de modéliser la néphropathie à la vancomycine du fait de la complexité et diversité cellulaire du rein. 8-12 semaines d'age, période d'acclimatation d'une semaine. Etat adulte de maturation du rein chez la souris et âge avec lequel le modele a été validé.
Evaluation de la capacité de souches recombinantes de BCG, pro-autophagie, à mieux protéger contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Vaccinées avec des BCG recombinants, quatre-vingt-quatre d'entre elles sont ensuite infectées par la tuberculose en aérosol, maintenues en chambre de contention pendant quarante minutes, l'infection provoquant une inflammation pulmonaire et des lésions tissulaires. Le porteur les fait toutes tuer, faute de replacement possible en contexte infectieux. Il teste si l'induction de l'autophagie améliore la protection vaccinale et affirme que ce travail ne peut être envisagé que sur un modèle animal.
Objectifs
Le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) est un vaccin utilisé dans la lutte anti-tuberculeuse depuis un siècle. Cependant son efficacité chez l’adulte est modérée et doit être accentuée par l’utilisation de nouvelles stratégies. Une de celles-ci, qui sera évaluée dans cette étude dans un modèle murin, est d’induire l’autophagie, un mécanisme physiologique de défense de l'hôte. L'objectif du projet est donc d’utiliser des BCG produisant un peptide inducteur de l’autophagie (BCG recombinants) et de comparer leur pouvoir immunogène et leur capacité à protéger des souris infectées avec le bacille tuberculeux par rapport au BCG. Une augmentation de la protection antituberculeuse est escomptée. Si tel est le cas, l'innocuité (absence d’effet toxique) des BCG recombinants sera évaluée également chez la souris.
Bénéfices attendus
La tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis, demeure un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale, avec plus d’un million de décès par an. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG chez l’adulte, la co-infection avec le virus de l'immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques. L'amélioration du vaccin et la découverte de nouvelles voies thérapeutiques, notamment celles basées sur l’immunité de l’hôte, demeurent donc une priorité. L'autophagie est un mécanisme fondamental de défense de l'hôte notamment impliqué dans la lutte contre les infections. Des résultats expérimentaux obtenus in vitro et in vivo suggèrent fortement que l’autophagie pourrait augmenter l’efficacité de la vaccination par le BCG. Ainsi si les souches de BCG recombinants, qui vont être utilisées dans ce projet, augmentent l’immunogénicité et/ou la protection des souris contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis, cela démontrera le rôle bénéfique de l’autophagie dans la vaccination. A plus long terme, si l’innocuité de ces souches est démontrée, leur utilisation en vaccination humaine pour la protection anti-tuberculeuse pourra être envisagée et pourrait donc augmenter la protection contre l’infection tuberculeuse.
Procédures
Une seule injection, d’une durée inférieure à 2 minutes, des différentes souches de BCG sera réalisée sur toutes les souris. 84 souris seront infectées par voie aérosol avec 100 bacilles tuberculeux. Cette infection sera réalisée sur animaux vigiles placés dans des chambres de contention pendant 40 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux seront induits à deux niveaux : 1) Lors de la réalisation des procédures 2) Par la pathologie induite par l’infection Lors de la réalisation des procédures, il s’agit d’un stress faible et de courte durée généré par les gestes techniques tels que la contention et les injections lors de la vaccination et l’infection des animaux. La vaccination des souris par le BCG sera effectuée par injection sur animal vigile après une légère contention. Cette opération indolore induit un léger stress de courte durée. Lors de l’infection par les bactéries par aérosol les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres avec le nez pointant vers le flux d’air. Cette opération d’une durée d’environ 40 minutes (introduction et sortie des animaux des chambres et temps d’exposition à l’aérosol) induit un stress modéré. Suite à l’infection des souris par le bacille tuberculeux, les bactéries se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Pour les animaux immunocompétents, les effets attendus sont une gêne respiratoire modérée et un léger affaiblissement de l’animal se traduisant par des signes cliniques d’aspect (pelage) et de comportement (posture, mobilité). Ces signes cliniques apparaissent tardivement au cours de la procédure, et seront donc de courte durée de l’ordre de quelques jours. Pour les animaux immonodéficients, en plus des nuisances précédemment citées, une perte de poids pourra être enregistrée. La pesée des animaux ne génère pas de nuisance.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort car il n’y a pas de possibilité de replacement vu le contexte infectieux.
Remplacement
Ce travail d’investigation ne peut être envisagé que sur un modèle animal. En effet il s’agit de démontrer que l’activation de l’autophagie permet d’accroitre l’effet de la vaccination et ainsi d’aider le système immunitaire à mieux combattre l’infection par une meilleure élimination des bactéries. Or la vaccination est un procédé qui consiste à stimuler le système immunitaire afin qu’il développe une réponse adaptée et spécifique à un agent infectieux. Cette réponse nécessite de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires dont le fonctionnement concerté ne peut se faire qu’in vivo. En amont de cette étude, des expériences in vitro et in vivo suggèrent fortement, mais sans le démontrer clairement, que l’autophagie pourrait avoir un effet bénéfique sur l’efficacité vaccinale du BCG.
Réduction
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont basées sur un nombre de 5 souris par condition. Dans ce modèle expérimental comme dans la plupart des modèles d’investigation in vivo, et bien que l’expérimentation soit réalisée sur des animaux issus d’une lignée, la variabilité inter individuelle en réponse à un stimulus est importante et ne nous permet pas de diminuer le nombre d’animaux par groupe en dessous de cette valeur afin d’obtenir une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux, deux souches de BCG recombinants, exprimant les peptides les plus efficaces pour activer l’autophagie, parmi ceux décrits dans la littérature, seront testées. De plus cela permettra également de limiter le nombre d’animaux utilisés comme témoin car ainsi toutes les souris peuvent être infectées en même temps limitant ainsi la variabilité.
Raffinement
Dans ces expériences, les souches de souris ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation. L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés. Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances : anesthésie, limitation des temps de contention au minimum, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d’une grille de scoring et de points limites précoces.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux de tuberculose humaine existent mais l’espèce murine est la plus utilisée dans la littérature. Les données préliminaires existantes suggèrent que l’autophagie pourrait être impliquée dans l’accroissement du pouvoir vaccinal du BCG ont été obtenues, in vitro, grâce à l’utilisation de cellules murines et, in vivo, avec des souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux âgés de 8 semaines. Il s’agit donc d’animaux adultes afin que leur système immunitaire soit totalement fonctionnel. En effet le but du projet est d’évaluer l’impact de l’autophagie sur le pouvoir vaccinal du BCG pour lutter contre l’infection tuberculeuse. La vaccination étant un procédé permettant à l’organisme de développer une protection spécifique vis-à-vis d’un agent infectieux grâce à son système immunitaire, les expériences doivent être réalisées avec des animaux ayant un système immunitaire parfaitement développé.